DE2610426A1

DE2610426A1 - Therapeutisches mittel zur behandlung der haemorrhagischen pneumonie von nerzen und der rindermastitis, hervorgerufen durch pseudomonas aeruginosa

Info

Publication number: DE2610426A1
Application number: DE19762610426
Authority: DE
Inventors: Yuzuru Homma
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 1975-03-12
Filing date: 1976-03-12
Publication date: 1976-11-25
Also published as: DE2610426C2; FR2303558B1; SE7601839L; FR2303558A1; US4083959A; JPS51106714A; GB1538932A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein therapeutisches Mittel aus einer bakteriellen Komponente (bezeichnet als OEP und früher als CViP), erhalten aus Pseudomonas aeruginosa, mit einer Vaccineaktivität (dessen wirksame Komponente Lipoprotein von Psudoraonas aeruginosa mit einer Vaecineaktivität ist) sowie die bakterielle Komponente, die Antibiotika enthält, das dazu geeignet ist, die Infektion von Nerzen (hämorrhagische Pneumo— nitis bzw. Pneumonie) und Rindermastitits durch Pseudomonas aeruginosa zu behandeln.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein therapeutisches Mittel zur Behandlung von Infektionserkrankungen (hämorrhagische Pneu monitis) von Nerzen oder von Rindermastitis, hervorgerufen durch Pseudomonas aeruginosa, sowie die therapeutische Methode. Die Erfindung betrifft insbesondere ein therapeutisches Mittel mit einer Komponente aus Pseudomonas aeruginosa (OEP), die im wesentlichen aus Protein und einer geringen Menge an Lipoid und Zucker besteht und eine infektionsverhütende Wirksamkeit besitzt, sowie die therapeutische Methode zur Behandlung der

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Infektion von Herzen (hämorrhagische Pneumonie) und Rindermastitis, die jeweils von Pseudomonas aeruginosa hervorgerufen werden.

.Es ist "bekannt, daß Pseudomonas aeruginosa natürlich resistent gegen fast alle üblicherweise verwendeten Antibiotika sind. Obwohl es einige wenige Antibiotika gibt, gegen die das Bakterium empfindlich ist, ist die Anwendung dieser Antibiotika für therapeutische Zwecke gegen die Infektionen durch Pseudomonas aeruginosa in den meisten Fällen, wo die Wirte physiologisch 'unreif in der Immunitätsreaktion sind oder in Fällen, wo die Wirte durch Verabreichung von Arzneimitteln in ihrem Immunmechanismus gestört sind, unwirksam.

Es ist bekannt, daS die Infektion von Nerzen durch Pseudomonas aeruginosa eine sogenannte hämorrhagische Pneumonitis bzw. Pneumonie hervorruft. Um Herze vor der ansteckenden Erkrankung zu schützen, wurden sie gewöhnlich mit den in Formalin getöteten Bakterien immunisiert, die aus Herzen isoliert wurden, die durch diese endemische Erkrankung getötet wurden. Jedoch ist die Wirkung dieser Vaccine zweifelhaft. Eine therapeutische Methode unter Anwendung von Antibiotika ist im allgemeinen nicht durchführbar, da die lediglich auf wenige Verabreichungen beschränkte Behandlung nicht wirksam genug zur Verhütung der natürlichen Entwicklung der endemischen Erkrankung ist und wiederhote Verabreichungen in Intervallen von 2 bis 3 Sagen unmöglich sind. Allgemein ausgedrückt sind auf einer Farm lausende von Herzen vorhanden und lediglich Spezialisten ist es möglich, die Herze zu fangen und die Impfungen zu verabreichen. Darüberhinaus sind die Antibiotika äußerst kostspielig.

Bei der Rindermastitis wurden früher Antibiotika kontinuierlich verabreicht, jedoch ist eine länger dauernde Behandlung nicht rentabel. Es können lediglich akute Fälle behandelt werden, jedoch nicht die meisten chronischen Fälle.

Die radikale Behandlung der durch Psudomonas aeruginosa Infektion erzeugten Mastitis konnte wegen des Wiederauftretens der Infektion nach temporärem Behandlungserfolg nicht lediglich durch Anti—

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biotika durchgeführt werden.

Die mit Eormalin getötete Vaccine hat - sofern sie verwendet wurde - Nachteile und ist nicht zufriedenstellend, da sie lediglich dazu geeignet ist, Infektionen durch Stämme vom homologen Serotyp, wie dem Stamm aus dem die Vaccine hergestellt wurde, zu behandeln bzw. zu verhüten. Da mehr als 13 Serotyparten (O-Antigen) von Pseudomonas aeruginosa bekannt sind und ein spezielles O-Antigen lediglich vor der Infektion durch den homologen O-Serotypstamm schützen kann, kann diese spezielle Vaccine nicht im voraus für prophylaktische bzw. therapeutische Zwecke hergestellt werden. Tritt einmal die endemische Erkrankung durch Pseudomonas aeruginosa auf, so sterben etwa 30 bis $ der Nerze einer Farm an hämorrhagischer Pneumonie.

Andererseits hat es sich gezeigt, daß ein Immunzustand eines Tieres ein sehr bedeutsamer Abwehrfaktor gegen die Infektion durch Psuedomonas aeruginosa ist. Was die Immunotherapie unter Verwendung von Vaccine und Plasma gegen die Infektion durch Pseudomonas aeruginosa betrifft, so wurde zahlreiche Literatur veröffentlicht, aus der hervorgeht, daß sowohl die aktive Immunisierung als auch die passive Immunisierung wirksam gegen Pseudomonas aeruginosa bei einigen Infektionstypen durch diesen Bazillus sind. Das Lipopolysaccharid (LPS), das sich von Pse.udomonas aeruginosa herleitet weist eine Schutzwirkung lediglich gegen die Infektion des Stammes vom gleichen Serotyp auf, von dem es eich herleitet. Daher mußten verschiedene LPS zusammengemischt werden, um eine Vaccine zur Anwendung gegen alle Typen der Pseudomonas aeruginosa-Infektion zu entwickeln.

Die vorliegende Erfindung beruht darauf, daß die Komponente OEP, die hauptsächlich aus Protein besteht, dazu geeignet ist, vor der Infektion durch Stämme aller Serotypen von Pseudomonas aeruginosa zu schützen.

Ein Gegenstand der vorliegendenErfindung ist die Schaffung eines therapeutischen Mittels gegen die Infektion von Nerzen (hämorrliagische Pneumonitis bzw. Pneumonie) und Rindermastitis durch Pseudomonas aeruginosa.

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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer Methode zur Behandlung der Infektion von Kerzen und der Rindermastitis, bewirkt durch Pseudomonas aeruginosa.

Weitere Gegenstände und Torteile der Erfindung sind aus dem folgenden ersichtlich.

Durch die vorliegende Erfindung wird ein therapeutisches Mittel zur Behandlung der Infektion von Iferzen und der Rindermastitis, durch Pseudomonas aeruginosa geschaffen, dessen wirksame Komponente OEP mit einer Yaceineaktivität ist.

Durch die Erfindung wird auch ein "Verfahren zur Verabreichung eines therapeutischen Mittels geschaffen, das im wesentlichen aus OEP "besteht, zur Bekämpfung der Infektion von Merzen und der Rindermastitis, hervorgerufen durch Pseudomonas aeruginosa.

Diese Yaccineaktivität von OEP ist repräsentativ für ihre Schutzwirkung gegen die Infektion durch Pseudomonas aeruginosa, ungeachtet des Serotyps von Pseudomonas aeruginosa und das OEP besitzt auch eine nicht spezifische Schutzwirkung gegen die Infektion durch Pseudomonas aeruginosa, sowie durch andere Bakterien und weist auch eine Antitumorv/irkung und eine Interferon induzierende (I.P.) Wirkung auf.

Das OEP, ein wirksamer Bestandteil des erfindungsgemäßen therapeutischen Präparats, konnte durch Isolieren einer Proteinfraktion von Pseudomonas aeruginosa erhalten werden, enthält jedoch im Prinzip kein O-Antigen, das an dem sogenannten Endotoxin IPS beteiligt ist und ist daher im wesentlichen unterschiedlich von dem thermostabilen G-Antigen (LPS), das bisher bekannt war.

Im folgenden wird ein Beispiel für die chemisch analysierte Zusammensetzung von OEP gegeben:

ff 13,8 $

P 1,17

Anthron 0,01

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Hexosamin (Elson-Morgan)	0,05	5,2 0 (Mol)
EDO	0,5	8,7
Protein	85#.	6,9
Im folgenden wird auch, ein Beispiel für den analytischen Wert	9,8
einer Aminosäure angegeben:	5,1
Glycin	4,0
Alanin	4,9
Valin	5,8
!Leucin	4,7
Isoleucin	2,5
Serin	4,0
ihreonin	9,1
iCyrosin	14,5
Phenylalanin	2,4
Methionin	6,7
Prolin	7,4
Asparagin
Glutamin
Histidin
Arginin
Iiysin

Das vorstehende OEP ist beispielsweise nach der in der britischen Patentschrift 1 565 950 beschriebenen Methode erhältlich. Pas in der genannten britischen Patentschrift in abgekürzter Form bezeichnete CViP ist äquivalent zu dem erfindungsgemäßen OEP.

Ein therapeutisches Mittel, das im wesentlichen aus OEP besteht, kann beispielsweise hergestellt werden durch Zusatz der üblichen Verdünnungsmittel, wie Phosphorpufferlösungen und dergleichen. OEP allein kann zur Behandlung verwendet werden, ist jedoch wirksamer, wenn es in Verbindung mit Antibiotika wie G-entamycin, Panimycin, Colistin, Polymixin, Sulbenicillin, Carbenicillin und Cephalothin verwendet wird.

Wird das vorstehende therapeutische Mittel an Nerze verabreicht,

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so "beträgt die Basisdosis .^TPEP. Vbis 500 Jig/kg ';-. zusammen mit entweder KA (Kalialaun) oder PIA (Friend's Incomplete Adjuvant) pro 1 oder 2 Tage in Intervallen von 1 bis 4 Wochen.

Das Arzneimittel kann wiederholt verabreicht werden oder in einer einzigen Dosis von 5 bis 1000 ug/kg, ohne Zusatz von KA oder PIA am 3. Tag. Hinsichtlich der Anzahl der Verabreichungen besteht keine Grenze, jedoch müssen sowohl die Dosis als auch die Anzahl der Verabreichung.stage so eingestellt werden, daß ein ausreichender antigenetischer Wert im OEP-Hämagglutinationstest (OEP-HA-Test) erzielt werden kann und die Verabreichung unterbrochen werden kann, wenn der erwartete Wert erreicht wird. Jedoch kann - wie vorstehend beschrieben - ein ausreichendes Ergebnis in den meisten Fällen erzielt werden, wenn die Dosis zwei Mal verabreicht wird. OEP ist auch die Basisdosis, die bei der Infektion von Rindern in einer täglichen Dosis von 0,3-50 ug/kg wiederholt in Intervallen von wenigen Tagen verabreicht wird. Jedoch muß eine kontinuierlich zu verabreichende Menge derart liegen, daß keine Pyrexie oder andere Nebeneffekte auftreten. Obwohl der OEP-HA-Wert in diesem Falle nicht einbezogen wird, werden die vorstehend erwähnten Antibiotika vorzugsweise mit dem OEP zur therapeutischen Behandlung vereint.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Ein therapeutisches Präparat wurde zur Behandlung der Infektion von Herzen durch Pseudomonas aeruginosa verwendet.

Werden Herze durch Pseudomonas aeruginosa infiziert, so verlieren sie bald an Energie und Stimmung und sie nehmen nicht einmal mehr ihre Mahlzeiten ein. Einen oder wenige Tage später sterben sie an hämorrhagischer Pneumonie und Segtikämie, begleitet von Hämoptysis.

OEP wurde zuerst im Herbst 1974 in Japan zur Behandlung eines endemischen Ausbruchs der hämorrhagi sehen Pneumonie von Nerzen_;

6 0 9 8 4 8/0837 original inspected

aufgrund der Infektion durch Pseudomonas aeruginosa verwendet. Die Nerze wurden subkutan mit OEP in einer Dosis von jeweils 25 ug - 375 jag "behandelt. Die Impfung wurde 2 bis 3 Mal wiederholt. Es zeigte sich, daß Stämme von Pseudomonas aeruginosa, die aus inneren Organen von toten Herzen isoliert wurden, dem Homma-Serotyp 8 angehörten, wohingegen das OEP-Antigen aus dem Stamm isoliert wurde, der dem Serotyp 5 angehörte.

Die Anzahl von toten Herzen, die von jeder Farm vor und nach der Behandlung mit OEP gemeldet wurden, sind in der Tabelle aufgeführt.

Tabelle 1

Anzahl der toten Herze vor und nach der Beimpfung mit OEP.

Anzahl der Tage

Farm Beimpfung
Nr. -13- -6 -0 1-7 8-14 15-21 22-28 29-35 36-42 43-49 50-56

6	38	290.	238	13	1	1	0	0	0
7	3	9	202	257	20	0	0	0	0
1	0	2	20	33	14	0	0	-	-
2	p	0	o:	1	31	20	39	21	5
3	0	1	1	170	35	35	15	7	-
4	0	2	2	169	37	11	3	4	-
5	0	0	0	1	2	3	1	1	0

In der Tabelle 1 bedeutet .-13 13 Tage vor der Animpfung mit OEP.

Am 7. Tag nach der Imfpung mit OEP wurden OEP-HA.-Titer (reziproke Werte der untersuchten Serumverdünnung) in Herzseren von 80-bis 620-fach gefunden (während bisher alle in Seren vor der Impfung gefundenen negativ waren). Dementsprechend konnte angenommen werden, daß der therapeutsiehe Effekt der OEP-Impfung mindestens am 8. Tage nach der ersten Verabreichung auftritt, selbst wenn er gering ist.

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Von allen 6 Herzfarmen wurde die Infektion zunächst in der Farm Hr. 6 festgestellt, wo die Mortalität am größten war. In der vorstehenden Tabelle wurde die Mortalität bis zum 7.Tag nach der OEP-Impfung als Sterblichkeitsrate angesehen, falls das OEP nicht angewendet wurde und es wurde postuliert, daß eine äquivalente Anzahl von Nerzen, nämlich 45,2% in anderen Farmen sterben würden. So zeigt die Tabelle 2 den therapeutischen Effekt von OEP mit einem Verhältnis ($) zwischen der Anzahl der als überlebend durch Impfung mit OEP angesehenen Herze und der Anzahl der one Anwendung von OEP zu erwartenden toten Iferze-

Tabelle 2

Therapeutische Wirkung von OEP

Farm Anzahl Anzahl Anzahl d. Anzahl der Therapeutischer Hr. der auf- der ohne OEP- bei OEP- Effekt von gezogenen toten Behandlirg Behandlung zu OEP Herze Herze zu erwar- erwartenden _f * *

tenden überlebenden ^K toten Herze Herze

6	1240	581	544	53	9,7
7	1208	491	319	250	78,4
1	710	69	607	490	80,7
CVI	1351	117	517	201	38,8
3	1150	316	450	151	33,6
4	1000	299	421	411	97,6
5	936	10	(566)	in der Farm Hr.	6 (-13.-7. Tag)
*	Anzahl der	toten Herze		6 aurgezogenen .Nerze	U240;
	Anzahl der	in Ji'arm JNr,;	0,452.

Bei Annahme, daß die Herze in einem durch die vorstehende Formel erhaltenen Verhätnis sterben wurden, wurde die Rechnung durch Multiplikation der Anzahl der in jeder Farm aufgezogenen Herze mit 0,452 durchgeführt.

** Die Anzahl der in jeder Farm großgezogenen Herze χ 0,452

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- 9 minus der Anzahl der toten Nerze in jeder Farm.

In der Farm Ur. 7 v/ar der therapeutische Effekt nur 9,7$, betrug jedoch hei den Farmen 1, 2, 3, 4 und 5 78,4$, 80,7%, 38,8$, 33,6$ bzw.97,'

Basierend auf der Annahme, daß OEP seinen therapeutischen Effekt vom 15. Tage nach der Impfung zeigt, ergibt sich eine ansteigende Wirkung in jeder Farm, da er bei der Farm ITr. 7 13,456 und in den Farmen 1, 2, 3, 4 und 5 79,2$, 81,5$, 41,2$, 37,7$ bzw. 97,7$ betragt.

Bei den überlebenden Nerzen konnten Pseudomonas aeruginosa nicht festgestellt werden und bei den Tieren waren keine pathologischen Veränderungen festzustellen.

Beispiel 2

Anwendung eines therapeutischen Mittels gegen Rindermastitis, bewirkt durch Pseudomonas aeruginosa.

Wird die Euterregion von Pseudomonas aeruginosa infiziert, so zeigen Kühe zunächst Symptome wie Pyrexie und Anschwellen der Euter, Mangel an Milch und in den meisten Fällen eine wenig aktive Gangart, wonach die Euter hart werden und eine blutige oder geTblich-cremige Milch erzeugt wird. Nach gewissen chronischen Zuständen sterben die Kühe schließlich an Endotoxinen oder Nekrose. Bei wiederholter Verabreichung von OEP jedoch, bei derartigen Mastitiserkrankungen, wird unabhängig vom Serotyp der infizierenden Organismen eine beträchtliche Wirkung erzielt. In Kombination mit Antibiotika war OEP noch wirkungsvoller bei der therapeutischen Behandlung, was etwa aus den folgenden Beispielen ersichtlich ist.

Im Frühjahr 1974 trat ein Massenausbruch von Mastitis, hervorgerufen durch Pseudomonas aeruginosa in einer Rinder-Aufzuchtfarm in der Präfektur Chiba in Japan auf und es starben einige Kühe nacheinander. Daraufhin wurde an drei Kühe: , die

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- ίο -

stark erkrankt waren, sofort OEP in Kombination mit Antibiotika verabreicht. Die verabreichten Dosierungen sind in der folgenden Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle

Therapeutische Beispiele von Mastitis, hervorgerufen durch
Pseudomonas aeruginosa.

Medikation

Kuh Nr. J

3 6

OEP

GM*

CB-PC** OEP

KUhJr₁J Kuh Kr.

CB-PC OEP CB-PC

1 0.5mg 80mg χ 3 300mg χ 1 0.5mg 300mg χ 1 0.5mg 300mg χ 1

(Br.S.) (Mus.) (Br.) (Br.S.) (Br.) (Br.S.) (Br.)

40mg χ 2 300mg χ (

300mg χ 1 ( )

0.7mg ( ■ )

1.0mg („)

300mg χ ■( « )

0.7mg ( - )

1.0mg (.)

.0.7mg ( - )

1.0mg (-ι)

χ 3 300mg χ ) ( )

300mg χ 1 ( )

300mg χ ( )

1.7mg 40mg χ 2 300mg χ 1 1.7mg 300mg χ 1 1.7mg 300mg χ 1

12

15 16

21

2.5mg (Mus.)

2.5mg. (Mus.)

5mg 80mg χ 3 300mg χ 1 5mg 300mg χ 1 5mg 300mg χ 1

40mg χ 2 300mg χ 1 300mg χ 1 300mg χ 1

10mg

10mg ()

22 23 2Z

20mg

_ χ 3 300mg χ 40mg χ 2 300mg χ

25mg V " /

300mg χ 1

300mg χ 1
\ ^M J"

25m

\ Il

300mg χ 300mg χ

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Anmerkung; GM* = Gentamycin CB-PC** = Carbenicillin

Br.S. = subkutan ins Euter injiziert Mus. = muskulär injiziert Br. = ins Euter injiziert

Als Ergebnis hiervon waren in allen Fällen die meisten Symptome verschwunden und es ergaben sich keine Nebenwirkungen, die der Verabreichung von OEP zuzuschreiben waren. Bei der Tötung der Kuh Nr. 2 zu Untersuchungszwecken im 2. Monat nach der beendeten Medikation konnte nur in dem rechten hinteren Euterabschnitt eine leichte Schwellung festgestellt werden. Die Autopsie ergab, daß alle Organe, die drei weiteren Euter und ein 9-Monate alter Fötus normal waren. Obwohl eine gewisse Hypertrophie der Bindegewebsmembran des rechten rückwärtigen Euterabschnitts erkennbar war, konnten keine Bazillen in den vier Euterabschnitten festgestellt werden.

Die Kuh Nr. 3 gebar einen normalen Fötus im 3. Monat nach Beendigung der Medikation. Eine einen Monat später durchgeführte Autopsie zeigte keine Abnormalität von sämtlichen Organen, jedoch ein Wachstum der Bindegewebsmembran der zweiten Euterhälfte. Jedoch konnte in den vier Euterabschnitten kein einziger Bakterienstamm festgestellt werden.

Die Serum OEP-HA-Werte, die am Tag vor der Impfung mit OEP und 33 Tage nachher ermittelt wurden, waren 640-faofe. und 10240-fach im Falle der Kuh Nr. 1, 1280-fach und 1280-fach im Falle der Kuh Nr. 2 und 2560-fach und 10240-fach im Falle der Kuh Nr. 3.

Beispiele für erfindungsgemäß zur' Herstellung von OEP und anderweitig eingesetzte Stämme von Pseudomonas aeruginosa sind insbesondere: Der mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21726 beim Bureau of American Type Culture Collection hinterlegte Stami5, sowie die mit den Hinterlegungsnummern JFCC HD P1 bis P10, P12, P13 und P15 bis P23 bei der Japanese Federation of Culture Collections of Microorganisms, Tokyo, hinterlegten Stämme (vgl. JFCC Catalogue of Cultures, der Japanese Federation of Culture Collections of Microorganisms, Additional Edition 1968, insbesondere Seiten 115 und 116).

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Claims

Patentansprüche

1. Therapeutisches Mittel bzw. Arzneimittel "bestehend aus Lipoprotein von Pseudomonas aeruginosa mit einer Vaceineaktivität gegen die Infektion von ÜTerzen und die Rindermastitis durch Pseudomonas aeruginosa·

2. Therapeutisches Mittel bzw. Arzneimittel bestehend im wesentlichen aus Protein und einer geringen Menge an Lipold und Zucker von Pseudomonas aeruginosa, mit einer Taeclneaktivität gegen die Infektion von Herzen (hämorrhagische Piieumonitis) und Eindermastitis durch Pseudomonas aeruginosa.

3. !Therapeutisches Mittel bzw. Arzneimittel gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Antibiotikum enthält. *

4. Therapeutisches Mittel bzw. Arzneimittel gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum ausgewählt ist aus Panimyein, Colistin, Gentamycin, Polymyxin, Carbenicillin, Sulbenleillin und Cephalothin.

5. Therapeutisches Mittel bzw. Arzneimittel gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung der Infektion von Herzen und der Rindermastitis durch Pseudomonas aeruginosa in einer Eorm, die zur Verabreichung von 5 bis 500 ug/kg einer therapeutischen Zusammensetzung, die im wesentlichen aus dem Protein von Pseudomonas aeruginosa mit Vaccineaktivität gegenüber Kerzen und 0,3 bis 50 pg/kg gegenüber Rindern besteht, geeignet ist..

6. Therapeutisches Mittel bzw. Arzneimittel gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bestehend im wesentlichen aus Protein aus Pseudomonas aeruginosa mit Vaccineaktivität, In zur Injektion bzw. Einführung In das Euter während des Troekenstehens oder In zur intramuskulären Injektion in alle Körperteile, einschließlich das Euter, geeigneter Form.

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