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DE2527068A1 - Verfahren zur herstellung von cholesterinesterase - Google Patents

Verfahren zur herstellung von cholesterinesterase

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Publication number
DE2527068A1
DE2527068A1 DE19752527068 DE2527068A DE2527068A1 DE 2527068 A1 DE2527068 A1 DE 2527068A1 DE 19752527068 DE19752527068 DE 19752527068 DE 2527068 A DE2527068 A DE 2527068A DE 2527068 A1 DE2527068 A1 DE 2527068A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
cholesterol
pseudomonas fluorescens
cultivation
activity
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE19752527068
Other languages
English (en)
Inventor
Osamu Terada
Takayuki Uwajima
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Publication of DE2527068A1 publication Critical patent/DE2527068A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
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Description

11 Verfahren zur Herstellung von Cholesterinesterase " Priorität: 17. Juni 1974, Japan, Nr. 68 160/74
Cholesterinesterase (EC 3.1.1.13) katalysiert die Hydrolyse von Cholesterinestern unter Bildung von Cholesterin und den entsprechenden Carbonsäuren. Das Enzym eignet sich zur quantitativen Bestimmung von Cholesterin im Serum; vgl. Clinical Chemistry, Bd. 20 (1974), Nr. 4, Seiten 470 Ms 475.
Bekanntlich findet sich Cholesterin in freier wie veresterter Form im Serum.
»Zur Bestimmung von Cholesterin wird eine Serumprobe mit Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase umgesetzt. Die Cholesterinester werden zu Cholesterin und Carbonsäuren gespalten, und das Cholesterin wird unter Entwicklung von Wasserstoffperoxid zu Cholestenon oxidiert. Das gesamte Cholesterin wird in üblicher Weise durch Messung der Sauerstoffaufnähme,
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der Cholestenon- oder Wasserstoffperoxidmenge bestimmt. Dieses Verfahren ist einfach in der Durchführung. Die Cholesterinesterase stellt jedoch ein teures Reagens dar.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technisch durchführbares, billiges Verfahren zur Herstellung von Cholesterinesterase zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas, insbesondere der Art Pseudomonas fluorescens, bei ihrer Züchtung in üblichen Nährmedien beträchtliche Mengen an Cholesterinesterase sowohl extracellular als auch intracellulär bilden.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstel* lung von Cholesterinesterase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas oder eine davon nach üblichen Methoden hergestellte Mutante oder Variante unter üblichen Bedingungen in einem Nährmedium züchtet und die Cholesterinesterase aus den Zellen und der Kulturflüssigkeit isoliert.
Figur 1 erläutert die Aktivität des erfindungsgemäß hergestellten Enzyms bei einem pH-Bereich von 4 bis 10. t
Figur 2 erläutert die Stabilität des erfindungsgemäß hergestellten Enzyms bei einem pH-Bereich von 1 bis 11.
Figur 3 erläutert die Aktivität des erfindungsgemäß hergestellten Enzyms bei einem Temperaturbereich von 30 bis 70 C und
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Figur 4 erläutert die Stabilität des erfindungsgemäß hergestellten Enzyms bei einem Temperaturbereich von O bis 6O°C, einem pH-Wert von 7,0 und einer Behandlungszeit von 30 Minuten.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann jeder Organismus eingesetzt werden, der Cholesterinesterase bildet und zur Gattung Pseudomonas gehört. Besonders bevorzugte Mikroorganismen gehören zur Art Pseudomonas fluorescens. Spezielle Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare Stämme sind Pseudomonas fluorescens KY 3955 (FERM-P Nr. 2611; ATCC 31156), Pseudomonas fluorescens KY 3956 (IAM 1051), Pseudomonas fluorescens KY 3975 (IFO 3903; ATCC 948), Pseudomonas fluorescens KY 4032 und Pseudomonas fluorescens KY 4033 (IFO 3081). Die mikrobiologischen Eigenschaften der Gattung Pseudcmonas und der Art Pseudomonas fluorescens sind in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, beschrieben.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium eingesetzt werden, sofern es die entsprechenden Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere Nährstoffe enthält. Beispiele für verwendbare Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, .wie Glucose, Fructose, Sucrose, Maltose, Mannose, Stärke, 1 mehrwertige
Stärkehydrolysate, Melassen, / Alkohole, wie Glycerin, Sorbit und Mannit, Carbonsäuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure und Citronensäure, Alkohole, wie Methanol und Äthanol, Glykole, wie Athylenglykol und Propylenglykol, Kohlenwasserstoffe, wie n-Paraffine, Aminosäuren und
ι Cholesterinester. ι
L . 509881/1022 J
Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat und Ammoniumacetat, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Harnstoff, Aminosäuren, Pepton, NZ-Amin, ein durch enzymatische Hydrolyse von Casein hergestelltes Produkt, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysate, Chrysalishydrolysate, Fischmehl, abgebautes Fischmehl, Sojabohnenmehl und abgebautes Sojabohnenmehl. Beispiele für verwendbare anorganische Verbindungen sind Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(Il)-sulfat, Mangansulfat, Kaliumchlorid und Calciumcarbonat.
Sofern der eingesetzte Mikroorganismus spezielle Nährstoffe zum Wachstum oder zur Bildung der Cholesterinesterase benötigt, müssen dem Nährmedium entsprechende Mengen dieser Nährstoffe zugesetzt werden. Bisweilen können die als Stickstoffquelle vorstehend^ genannten stickstoffhaltigen Verbindungen auch als Quelle für die erforderlichen Nährstoffe dienen. Wenn das Nährmedium derartige Verbindungen enthält, ist ein weiterer Zusatz der Nährstoffe nicht erforderlich.
.Die verfahrensgemäß eingesetzten Stämme von Pseudomonas fluorescens bilden im erfindungsgemäßen Verfahren in einem übli chen Nährmedium nur geringe Mengen an Cholesterinesterase. Bei der Züchtung der Stämme in einem Nährmedium, das Cholesterinester enthält, nimmt die Menge der vom Mikroorganismus erzeugten Cholesterinesterase erheblich zu. Spezielle Beispiele für
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die dem Nährmedium zuzusetzenden Cholesterinester sind Cholesterinstearat, Cholesterinpalmitat, Cholesterinlaurat, Cholesterinoleat und Cholesterinlinoleat. Vorzugsweise enthält das Nährmedium mindestens 0,3 Gewichtsprozent, bezogen auf das Volumen des Nährmediums, eines Cholesterinesters.
Auch bei Verwendung von Sojabohnenmehl, gegebenenfalls zusammen mit einem Cholesterinester, werden gute Ergebnisse erhalten. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn das Nährmedium 0,3 bis 7, vorzugsweise etwa 2 Gewichtsprozent Sojabohnenmehl, bezogen auf das Volumen des Nährmediums, enthält. Ferner wurde festgestellt, daß noch wesentlich bessere Ergebnisse erhalten werden, wenn Sojabohnenmehl zusammen mit Fettsäuren oder Fettsäureestern, wie Stearinsäure, Linolsäure., Ölsäure, Triolein, Trilinolein, Sojabohnenöl, Reiskleienöl, Rapsöl oder Olivenöl, in Mengen von 0,3 bis 1,5 Gewichtsprozent, bezogen auf das Volumen des Nährmediums, verwendet wird.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, beispielsweise als Schüttelkultur oder belüftete Submerskultur bei
Temperaturen von 20 bis 40°C durchgeführt. Während der Züchtung wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8 gehalten. Nach etwa 1 bis 5-tägiger Züchtung hat sich die Cholesterinesterase sowohl extracellular als auch intracellulär in ausreichender Menge gebildet. Nach beendeter Züchtung wird die Cholesterinesterase aus der Zellmasse und dem Kulturfiltrat nach üblichen Methoden isoliert und gereinigt. Beispielsweise wird zunächst die Zellmasse von der Kulturflüs-
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sigkeit abfiltriert oder abgeschleudert. Das Filtrat wird bei Temperaturen unterhalb 40°C unter vermindertem Druck eingedampft und das Konzentrat mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von etwa 60 % unter Rühren versetzt. Das Gemisch wird stehengelassen. Die entstandene Fällung des Rohenzymes wird abfiltriert und in der 5- bis 10-fachen Volumenmenge eines 0,01 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 gelöst. Diese Lösung wird auf eine mit Sephadex G-25 gefüllte Kolonne gegeben, um Salze abzutrennen und das Produkt zu fraktionieren. Die aktiven Fraktionen werden an DEAE-Cellulose in einer Säule adsorbiert. Nach dem Waschen mit 0,01 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 wird die Säule mit 0,1 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0, der 0,1 molar an Natriumchlorid ist, eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird durch Dialyse gegen 0,01 molaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 entsalzt und gefriergetrocknet. Es wird ein gereinigtes Präparat der Cholesterinesterase erhalten.
Bei der Abtrennung und Isolierung der Cholesterinesterase aus der Zellmasse werden die aus der Kulturflüssigkeit beim Abfiltrieren oder Abschleudern erhaltenen Zellen in einer Kugelmühle aufgebrochen und in der entsprechenden Menge eines 0,01 molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 suspendiert. Die Suspension wird abgeschleudert und der Überstand in gleicher Weise, wie vorstehend im Zusammenhang mit der Isolierung und Reinigung der Cholinesterase aus dem Kulturfiltrat beschrieben, behandelt.
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Die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellte Cholesterinesterase zeigt folgende enzymatische Eigenschaften:
(1) Substratspezifität
Die Cholesterinesterase katalysiert die Hydrolyse verschiedener Cholesterinester. Eine besonders starke Wirkung zeigt sie bei Cholesterinlinoleat. Die enzymatische Aktivität der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Cholesterinesterase gegenüber Cholesterinlinoleat und verschiedenen anderen Cholesterinestern ist nachstehend in Tabelle I zusammengefaßt. Die Bestimmung der enzymatisehen Aktivität wird folgendermaßen durchgeführt:
Es wird ein Gemisch folgender Zusammensetzung hergestellt und
30 Minuten bei 370C geschüttelt:
Cholesterinlinoleat (Iprozentige Lösung 0,1 ml
in Äthanol
0,1 molarer Phosphatpuffer.(pH 7,5) 0,1 ml
Lösung von Cholesterinoxidase
(hergestellt durch Züchtung von Brevi- 0,05 ml bacterium sterolicum ATCC 21387) in 0,01 molarem Phosphatpuffer (pH 7,5); die Lösung enthält 20 ΙΕ/ml enzyraatische Aktivität
zu bestimmende Enzymlösung 0,1 ml
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Während der vorstehend beschriebenen Maßnahmen wirkt die Cholesterinesterase auf das Cholesterinlinoleat als Substrat ein. Der Ester wird zu Cholesterin und der Fettsäure gespalten und gleichzeitig wird das Cholesterin durch die Einwirkung der Cholesterinoxidase in Cholestenon überführt. Nach 3Öminütigem Schütteln wird restlicher, nicht umgesetzter Cholesterinester nach der Methode von Zurkowsky, Clinical Chemistry, Bd. 10 (1964), S. 451 bestimmt. Sodann wird das umgesetzte Cholesterinlinoleat berechnet. Eine Einheit der Enzymaktivität ist als diejenige Menge des Enzyms definiert, die 1 ^uMoI Cholesterinlinoleat in 1 Minute unter den beschriebenen Bedingungen spaltet. Die Enzymaktivitäten gegenüber anderen Cholesterinestern wurden in ähnlicher Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt. In der Tabelle ist die enzymatische Aktivität als relative Aktivität angegeben; die Aktivität gegenüber Cholesterinlinoleat wird mit 100 angesetzt.
Tabelle I rel. Aktivität
Substrat 100
Cholesterinlinoleat 93
Cholesterinoleat 80
Cholesterinacetat 58
Cholesterinstearat 26
'Cholesterinpalmitat
(2) pH-Oütimum
Die Enzymaktivität der Cholesterinesterase bei verschiedenen pH-Werten von 4 bis 10 wird nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Figur 1 wiedergege-
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ben. In Figur 1 ist die Enzymaktivität in Prozent relativ zur maximalen Aktivität angegeben. Aus Figur 1 ist ersichtlich, daß das pH-Optimum der Enzymaktivität bei etwa 7,3 liegt.
(3) Stabilität bei verschiedenen pH-Werten
Die Stabilität der enzymatischen Aktivität bei verschiedenen pH-Werten wird untersucht. Das Enzym wird in einer Menge von 0,1 mg/ml in Phosphatpuffern mit einem pH-Wert von 1 bis 11 gelöst. Die erhaltenen Enzymlösungen werden 30 Minuten bei 370C inkubiert. Die Aktivität des auf diese Weise behandelten Enzyms wird nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Figur 2 angegeben. Die restliche Aktivi-
in
tat ist/Prozent angegeben. Aus Figur 2 ist ersichtlich, daß
das Enzym in einem pH-Bereich von 4 bis 10 stabil ist.
(4) Temperaturoptimum
Die Aktivität des Enzyms bei verschiedenen Temperaturen von 30 bis 700C wird nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Figur 3 angegeben. In Figur ist die Enzymaktivität in Prozent relativ zur maximalen Aktivität angegeben. Aus Figur 3 ist ersichtlich, daß das Temperaturoptimum der Enzymaktivität bei etwa 600C liegt.
(5) Temperaturbereich der Stabilität der enzymatischen Aktivität
Das Enzym wird in einer Menge von 0,1 mg/ml in einem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst, und die Lösung wird 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen von 0 bis 60°C inkubiert. Hier-
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auf wird die Enzymaktivität nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Figur 4 angegeben. In Figur 4 ist die restliche Aktivität in Prozent angegeben. Aus Figur 4 ist ersichtlich, daß das Enzym sehr stabil bei Temperaturen unter 50°C nach 30minütiger Behandlung bei einem pH-Wert von 7,0 ist.
(6) Inhibitoren
Es wird die Hemmwirkung verschiedener Verbindungen auf die Enzymaktivität untersucht. Cholesterinesterase wird in 0,QL molarem Phosphatpuffer in einer Konzentration von 0,1 mg/ml gelöst. 0,1 ml der Lösung werden mit 0,1 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer und 0,1 ml einer 4 millimolaren Lösung der in Tabelle II angegebenen Verbindungen versetzt. Das Gemisch wird 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Sodann wird das Gemisch mit 0,1 ml einer Iprozentigen Lösung von Cholesterinlinoleat in Äthanol versetzt und 10 Minuten bei 370C inkubiert. Hierauf wird das Gemisch 3 Minuten auf 1000C erhitzt, um das Enzym zu desaktivieren, und sodann der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unterworfen. Die Entwicklung des Chromatogramms wird mit einem Gemisch von η-Hexan, Methanol und Aceton im Volumverhältnis 50 : 5 : 1 durchgeführt. Der Fleck für Cholesterin wird im
UV-Licht bei einem Rf-Wert von 0,8 gefunden. Dieser Fleck wird
abgekratzt und mit Äthanol extrahiert. Die Menge des Cholesterins wird nach der Methode von Zurkowsky bestimmt. Sodann wird die Menge des restlichen Cholesterinlinoleats be-
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rechnet. Der Hemmungseffekt ist ausgedrückt durch das Hemmungsverhältnis, das heißt das Mengenverhältnis von restlichem zu eingesetztem Cholesterinlinoleat. Die Ergebnisse sind in Ta belle II zusammengefaßt.
Tabelle II Inhibitor Hemmungsverhältnis,
%
AgNO3 20
HgCl2 100
CuSO4 100
p-Chloromercuribenzoesäure (p-CMB) ■ o
CaCl2 0
BaCl2 0
ZnCl2 0
PeSO4 0
MnCl2 0
Diisopropylfluorphosphat 0
Athylendiamintetraessigsaure 0
o-Phenanthrolin 0
2,2'-Dipyridyl 0
Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß Cholesterinesterase durch Schwermetallionen, wie Kupfer-, Quecksilber- und Silberionen, gehemmt wird.
(7) Analyse in der Ultrazentrifuge
Cholesterinesterase wird der Ultrazentrifugenanalyse nach der
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Methode von Schachman (Ultra-centrifugation in Biochemistry, Academic Press, London und New York, 1959) unterworfen. Das Sedimentationsbild zeigt, daß das Enzym in der Ultrazentri fuge sich praktisch einheitlich verhält.
(8) Molekulargev/icht
Das Molekulargewicht der Cholesterinesterase, bestimmt nach der Gelfiltrationsmethode (Biochemical Journal, Bd. 96 (1965), S. 595) unter Verwendung von Sephadex G 100 beträgt etwa 125 000.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Pseudomonas fluorescens KY 3955 (ATCC 31156) wird mit einer Platinöse in einen 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft, der mit Prallplatten ausgerüstet ist, und der 300 ml eines Nährmediums folgender Zusammensetzung enthält:
Cholesterinlinoleat 5 g/Liter
Maisquellwasser 2 g/Liter
NaNO3 2 g/Liter
K2HPO4 1 g/Liter
KCl 0,5 g/Liter
MgSO4.7H2O 0,5 g/Liter
Der pH-Wert des Nährmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,5. Die Züchtung wird 30 Stunden bei 300C unter Schütteln durchgeführt. Nach beendeter Züchtung wird filtriert. Das KuIturfiltrat (270 ml) zeigt eine Cholesterinesteraseaktivität
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von 4,5 Einheiten. Die Zellen (5 g Feuchtgewicht) werden mittels einer Kugelmühle zerstört. Die zerstörten Zellen werden in 0,01 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 suspendiert, und die Suspension wird zentrifugiert. Der erhaltene zellfreie Extrakt zeigt eine Cholesterinesteraseaktivität von 0,35 Einheiten.
Beispiel 2
Zur Herstellung einer Anzuchtkultur wird Pseudomonas fluorescens KY 3955 (ATCC 31156) 48 Stunden bei 300C in einem Fleischbrühmedium (pH-Wert 7,2) gezüchtet, das 10 g/Liter Fleischextrakt, 10 g/Liter Pepton und 5 g/Liter Natriumchlorid enthält. 750 ml der erhaltenen Anzuchtkultur werden in einen 30 Liter fassenden Fermenter überimpft, der 15 Liter eines Nährmediums folgender Zusammensetzung enthält:
Sojabohnenmehl . 20 g/Liter
Glucose 3 g/Liter
NaNO^ 2 g/Liter
K2HPO4 1 g/Liter
KCl 0,5 g/Liter
MgSO4.7H2O 0,5 g/Liter
Der pH-Wert des Nährmediums beträgt vor dem Sterilisieren 7,5.
Die Züchtung wird 24 Stunden bei 3O0C unter Einleiten von t
15 Liter Luft/Minute und mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min durchgeführt. Nach beendeter Züchtung zeigt das KuI-turfiltrat (15 Liter) eine Cholesterinesteraseaktivität von 253 Einheiten.
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Beispiel 3
14,6 Liter eines gemäß Beispiel 2 hergestellten KuItürfiltrats mit einer Cholesterinesteraseaktivität von 225 Einheiten werden bei einer Temperatur von unterhalb 400C unter vermindertem Druck auf 5 Liter eingedampft. Das Konzentrat wird mit 1,9 kg Ammoniumsulfat unter Rühren versetzt. Dies entspricht einer 60prozentigen Sättigung. Sodann wird das Gemisch 15 Stunden im Kühlschrank stehengelassen. Hierbei fällt das Rohenzym aus. Das Gemisch mit der Fällung des Rohenzyms wird mit 500 g einer Filtrierhilfe (Radiolite) versetzt und filtriert. Der Filterrückstand wird in 300 ml eines 0,01 molaren Phosphatpuffers (pH 7,0)suspendiert, um das Enzym aufzulösen. Die Filtrierhilfe wird abfiltriert. Das Filtrat wird auf eine mit Sephadex G-25 gefüllte, 1 m lange Säule mit einem Durchmesser von 10 cm gegeben. Das Sephadex G-25 war vorher mit einem 0,01 molaren Phosphatpuffer (pH 7,0) eingeschlämmt worden. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf eine mit DEAE-Cellulose gefüllte, 60 cm lange Säule mit einem Durchmesser von 7 cm gegeben. Die DEAE-Cellulose wurde vorher mit 0,01 molarem Phosphatpuffer (pH 7,0)eingeschlämmt. Das Enzym wird an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Sodann wird die Säule mit 0,01 mojlarem Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen. Hierauf wird mit 0,1 molarem Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert, der 0,1 molar an Natriumchlorid ist.
Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und bei einer Temperatur unterhalb 40°C unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml
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eingedampft. Das Konzentrat wird durch Dialyse gegen 0,01 molaren Phosphatpuffer (pH 7,0) entsalzt und. gefriergetrocknet. Ausbeute 1,2 g Cholesterinesterase. Das Produkt zeigt eine spezifische Aktivität von 0,105 Einheiten/mg Protein.
Auf jeder Reinigungsstufe wird die Proteinmengo, die Gesamtaktivität, die spezifische Aktivität und die Ausbeute an Cholesterinesterase bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
Tabelle III
Protein- Gesamt- Spezifische Ausbeumenge, aktivität, Aktivität, te, % mg Einheiten Einheiten/
mg Protein
filtrierte
Kulturbrühe 		32 200 225 0,007 100
Konzentrat des
Filtrats 		30 .600 214 0,007 95
Ammoniumsulfat-
Fällung 		15 000 180 0,012 80
aktive Fraktionen
aus der Sephadex
G-25-Säule 		10 000 170 0,017 75
aktive Fraktionen aus
der DEAE-Cellulose-
Säule 		1 120 118 0,105 52
gefriergetrocknetes
Präparat 		1 050 110 0,105 49
Beispiel 4
225 g von gemäß Beispiel 2 erhaltenen feuchten Zellen werden in einer Kugelmühle zerstört. Die zerstörten Zellen werden in 1 Li ter eines 0,01 molaren Phosphatpuffers (pH 7,0) suspendiert.
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Die Suspension wird zentrifugiert und der Überstand gemäß Beispiel 3 aufgearbeitet. Es werden 98 mg gereinigte Cholesterinesterase mit einer spezifischen Aktivität von 0,101 Einheiten/mg Protein erhalten. Auf jeder Reinigungsstufe wird die Proteinmenge, die Gesamtaktivität, die spezifische Aktivität und die Ausbeute an Cholesterinesterase bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.
Tabelle IV
Protein- Gesamt- Spezifische Ausbeumenge, aktivität, Aktivität, te, % mg Einheiten, Einheiten/
mg Protein
Zellextrat 5 000 18,0 0,003 100
Ammoniumsulfa t-
Fällung		 1 250 15,5 0,003 86
aktive Fraktionen aus
der Sephadex G-25-
Säule		 400 14,0 0,O10 78
aktive Fraktionen aus
der DEAE-Cellulose-
Säule		 106 10,8 0,102 60
gefriergetrocknetes
Präparat		 98 9,9 0,101
Beispiel 5
Beispiel 2 wird wiederholt, jedoch werden der Kulturflüssigkeit die in Tabelle V aufgeführten Verbindungen in einer Konzentration von 5 g/Liter zugesetzt. Die Cholesterinesteraseaktivität der erhaltenen Kulturfiltrate ist ebenfalls in Tabelle V angegeben.
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Zusatz
Linolsäure
Ölsäure
Stearinsäure
Sojabohnenöl
Reiskleienöl
Rapsöl
Olivenöl
Triolein
Trilinolein
Kein Zusatz
- 17 -
Tabelle V
Aktivität, Einheiten/Liter
310 170 230 290 300 130 180 200 250 20
Beispiel 6
Beispiel 2 wird wiederholt, jedoch werden die in Tabelle VI aufgeführten Stämme der Gattung Pseudomonas anstelle von Pseudomonas fluorescens ATCC 31156 verwendet. Die Cholesterinesteraseaktivität der erhaltenen Kulturfiltrate ist ebenfalls in Tabelle VI angegeben.
Tabelle VI
Mikroorganismus
Pseudoraonas fluorescens KY 3956 CEAI'I 1051)
Pseudomonas fluorescens KY 3975(IFO 3903;ATCC 948)
Pseudomonas fluorescens KY 4032
Pseudomonas fluorescens KY 4033(IFO 3081)
Aktivität, Einheiten/Liter
3,4
1,7
1,7
1,7
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Claims (8)

  1. Patentansprüche
    (f) Verfahren zur Herstellung von Cholesterinesterase,
    dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas oder eine davon nach üblichen Methoden hergestellte Mutante oder Variante unter üblichen Bedingungen in einem Nährmedium züchtet und die
    Esterase aus den Zellen und der Kulturflüssigkeit isoliert.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Pseudomonas fluorescens oder eine davon nach üblichen Methoden hergestellte Mutante oder
    Variante verwendet.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Pseudomonas fluorescens KY 3955 (FERM-P Nr. 2611; ATCC 31156), Pseudomonas fluorescens
    KY 3956 (IAM 1051), Pseudomonas fluorescens KY 3975 (IFO 3903; ATCC 948), Pseudomonas fluorescens KY 4032 oder Pseudomonas fluorescens KY 4033 (IFO 3081) oder eine davon nach üblichen Methoden hergestellte Mutante oder Variante verwendet.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß t
    man die Züchtung in Gegenwart von Sojabohnenmehl durchführt.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ■man die Züchtung in Gegenwart mindestens einer Fettsäure oder eines Fettsäureesters durchführt.
    509881 / 1022
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart von Linolsäure, Ölsäure, Stearinsäure, Sojabohnenöl, Reiskleienöl, Rapsöl, Olivenöl, Triolein oder Trilinolein durchführt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart mindestens eines Cholesterinesters durchführt.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cholesterinester Cholesterinstearat, Cholesterinpalmitat, Cholesterinlaurat, Cholesterinoleat oder Cholesterinlinoleat verwendet.
    9« Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung 1 bis 5 Tage bei Temperaturen von 20 bis 400C und einem pH-Wert von 3 bis 9 durchführt.
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