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DE2517028A1 - Verfahren zur isolierung von gamma- l-glutamyltaurin - Google Patents

Verfahren zur isolierung von gamma- l-glutamyltaurin

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Publication number
DE2517028A1
DE2517028A1 DE19752517028 DE2517028A DE2517028A1 DE 2517028 A1 DE2517028 A1 DE 2517028A1 DE 19752517028 DE19752517028 DE 19752517028 DE 2517028 A DE2517028 A DE 2517028A DE 2517028 A1 DE2517028 A1 DE 2517028A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
chromatography
active ingredient
effect
water
glutamyltaurine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19752517028
Other languages
English (en)
Inventor
Geb Dobay Erzsebet Bendefy
Laszlo Feuer
Arpad Furka
Geb Szepespataky Jolan Hercsel
Ferenc Sebestyen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chinoin Private Co Ltd
Original Assignee
Chinoin Gyogyszer es Vegyeszeti Termekek Gyara Zrt
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from HUCI1146A external-priority patent/HU169462B/hu
Priority claimed from HU74FE00000928A external-priority patent/HU171576B/hu
Application filed by Chinoin Gyogyszer es Vegyeszeti Termekek Gyara Zrt filed Critical Chinoin Gyogyszer es Vegyeszeti Termekek Gyara Zrt
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Description

16. April 1975
Chinoin GySgyszer es Vegyeszeti Termekek Gyara EiD Budapest IV, Τδ utca 1 - 5, Ungarn
VJBRVAHRBN ZUR ISOLIERUHG YON /-L-GLUTAMYLTAURIN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von ^-L-GIutamyItaurin aus Extrakten der Nebenschilddrüae.
In der Stammanme.ldung des amtlichen Aktenzeichens
^£ ^f?^*:!ist die Herstellung eines bis dahin unbekannten» aus der Nebenschilddrüse isolierbaren Konzentrates oder Gemisches niedergelegt. Das über sehr wertvolle biologische Eigenschaften verfügende Konzentrat oder Gemisch wurde als Litoralon bezeichnet (s· DE-OS Nr. 2 234 832)i
S09847/1189
I nachqereichtI Or
Bei weiteren Forschungen wurde gefunden, daß der Wirkstoff des als Litoralon bezeichneten Konzentrates ein bisher unbekanntes MikrÖpeptid Λ, daa ^-L-Glutamyltaurin, ist* '.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist - als Weiterentwicklung des in der Baaiaanmeldung obigen Aktenzeichens geschützten Verfahrens - ein Verfahren zur Isolierung dieses neuen Wirkstoffes in reiner Form aus dem Extrakt der Nebenschilddrüse.
Gemäß dem in der obigen Stammanmeldung beschriebenen Verfahren wird die Nebenachilddrüae von Säugetieren beziehungsweise deren Gewebe- oder Zellkultur,vorzugsweise in Form eines Pulvers, mit Wasser oder einer anorganische Ionen enthaltenden wäßrigen Lösung extrahiert, der Extrakt filtriert und dann mit einem Eiweißfällungsmittel behandelt» Der Niederschlag wird einer Gelfiltration unterzogen. Das auf diese Weise erhaltene Konzentrat wird verwendet, .
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird aus diesem Konzentrat durch spektroskopische Bestimmung die das zweite Maximum zeigende Fraktion (Fraktion B) ausgewählt, abgetrennt und mittels Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Das erhaltene Konzentrat wird danach einer Elektrophorese unterworfen, die zweckmäßig bei einem pH-Wert von etwa 1,8 und mit verhältnismäßig hohen Spannungen durchgeführt wird; Schließlich wird daa reine Produkt mittels Chromatographie isoliert;
Für die Ionenaustauachchromatographie wird zweck-
mäßig daa Kunstharz Dowex 50 (Dow Ghent* ι USA) oder ein. anderes Kunstharz gleichen iCyps verwendet. ··'■■■■.
Wie die Erfahrung zeigt, wandert das -^ -L-Glutamyl-509847/1189
taurin während der erfindungsgemäß angewandten Elektrophorese in Richtung der Anode.
Die den letzten Schritt deB erfindungsgemäßen Isolierungsverfahrens darstellende chromatographische Trennung wird zweckmäßig als Papierchromatographie oder Säulenchromatographie an Cellulose ausgeführt. In dieser Phase dea Veriahrens geschieht die Bestimmung des abzutrennenden Aminosäure-Derivates zweckmäßig mit Ninhydrin, Der reine Wirkstoff kann auf die beschriebene Weise in einer Konzentration erhalten werden, die zehn- bis hunderttausendmal so groß ist wie seine Konzentration in der getrockneten Nebenschilddrüse, Eine beliebige Fraktion der Reinigungsreihe kann prinzipiell auch für therapeutische Zwecke verwendet werden.
Die Ergebnisse der Elementaranalyse und der Molekulargewi chtsbestimmung stehen in guter Übereinstimmung mit der Bruttoformel Cr7H^N2O6S und der sich daraus ergebenden Zusammensetzung*
C = 33,07 % H » 5t55 % N = 11,02 % 0 = 37,75 % 0=0.2,61 II s 254,27·
Die Assignation der Absorptionsbanden im (in KBr aufgenommenen) Infrarot-Spektrum erlauben bezüglich der Struktur folgende Schlüssel
SO;," und NH,+ Zwitterionenstrukturj die freie Carboxylgruppe ist undissoziiert,
Charakteristische Absorptionsbandeni •J(OH), (NH,) bei 3600-240Ό cm"1
bei 3315 cm""1
Valenaschwingung der
Carboxylgruppe bei 175C o™
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-T(CO) Amidoarbonyl (l) bei 1662 cdT1
) bei 1576 cm""1
3") bei 1296-1031 crn""1
Die Nfffi-Werte des /~L~Glutarny Itaurins: Chemische Verschiebungen (^)t 4.15 (t, 1, 2CH)| 3.65 (m, 2, 2CH)5 3.12 (m, 2, lCH)| 2.7-2.1 (m, 4» 5CH2 4CIJ2). Protonen Chemische Verschiebung relative Intensität CH - NH2 4.15 (t) 1
%>- SO^H 3.65 (m) 2
CH - NH 3.12 (m) 2
O^C-CI^-CHg-OH 2.7-2.1 (ta) 4
Die aus einem 80 Volumenprozent Äthanol enthalten-
dem Athanol-Wasser-Gemisch umkristallisierte Verbindung zeigt folgende kristallographische Daten:
Maße der iilementarzelle (bestimmt nach der photo graphischen Methode von Weissenberg).: a a 6,63 Ä, b =7,87 Ä, c a 11,38 £, ß S3 101°. Die Kristalle gehören zum monoklinen Kristallsystem und in die Klasse P2^. Dichte gemessen» 1,55 g/cnr $ Dichte berechnet: 1,552 g/cnr.
fjaue-Aufnähme (Kristallfläche des Index OkO): systematische Auslöschungen bei k » 2n+l.
Die Säureamidbindung wird durch Carboxypeptidase nicht hydrolysiertι auch dies beweist'das Vorhandensein der ^-Peptidbindung.
Die elektrophoretisch^ Wanderungsgeschwindigkeit stimmt mit dem berechneten Wert gut überein. Sie beträgt bei Verwendung von Cysteinsäure als Standardsubstanz bezogen auf diese 0,74 (pH a 6,5, Spannung a 1500V, Zeit = 90 Minuten, Belastung a 0,Ö3,uM/cni , Papier: Whatman 3 Mal). Optisches Drehvermögen*!«] | = + 14° (Wasser, c -. isC.:l ;.;/t Zersetzungspunkt: 223-226 0C (korrigiert)
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Wach Hydrolyse kann im Hydrolysat mit einem Aminosäureanalysator Glutaminsäure und durch dünnschichtchromatographische Bestimmung Taurin nachgewiesen werden.
Gehaltsbestimraungen können bei Mengen in Milligrammgrößenordnung alkalometrisch durch Bestimmung der Sulfogruppe, durch die van Slyke Methode oder mit Ninhydrin photometrisch durchgeführt werden. Zur Bestimmung geringerer Mengen sind die chroraatographische Methode mit densitometrischer Mengenbeatimmung und der Nachweis durch die elektrophoretisch^ Wanderungsgeschwindigkeit geeignet.
Auf die biologischen Bestimmungsmethoden wird später eingegangen.
Die Stabilität des aus der Nebenschilddrüse isolier« ten reinen Produktes ist für pharmazeutische Zwecke befriedigend. An einer für 8 Tage bei 70 0C in einem Thermostaten belassenen Probe konnte nach Untersuchung des Schmelzpunktes, des optischen Drehvermögens sowie der dünnschichtchromatographischen und papierelektrophoretischen Vierte keine Zersetzung nachgewiesen werden.
Der isolierte Wirkstoff verfügt über ein breites Wirkungsspektrum therapeutischer und präventiver Wirkungen auf direkt oder indirekt mit Schädigungen des "AGAS" (Aerobiosphärisch-genetisches Adaptionssystem) zusammenhängende krankhafte Veränderungen.(Die Entwicklung der Nebenschilddrüse und die Ausbildung des Lebens auf dem Festland fallen entwicklungsgeschichtlich eng zusammen.)
Zur Erklärung des Begriffes 11AGAS" sollen hier die wichtigsten Gewebe und Organe aufgezählt werden, die dieses System bilden!
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a) Alle biologischen Grenzflächen, die mit der Außenluft als Biosphäre in Berührung stehen (Haut und Hautgebilde 9 Cornea und Conjunktiva, Mund- und Rachenhöhle, Atemwege und Lunge);
b) Skelett und Gliedmaßen (Röhrenknochen und Schwammknochen, Kugelgelenke, synoviale Membran, Skelettmuskulatur)5
c) die bei Festlandlebewesen an der Regulierung des Ionenhaushaltes teilnehmenden Organe (transepitheles Transportsystem, wie Darmzotten und Nierenkanäle);
d) das zum Zerkleinern fester Nahrungsmittel nötige theko«. donte (durch Zahnalveole und Wurzel befestigte) Gebißj
e) Hör-, Riech- und Stimmorgane der Festlandlebewesen,
Die erfindungsgemäße Verbindung übt auf die Organe und Gewebe des genannten Systems eine günstige biologische beziehungsweise therapeutische Wirkung aus.
Die erfindungsgemäße Verbindung wirkt ferner auf die folgenden, mit dem AGAS-Systera in Zusammenhang stehenden Funktionen: Strahlenschutzwirkung, die Wundheilung begünstigende, das Mesenchym allgemein aktivierende Wirkung, Schute gegen die ständig steigende Infektions- und Verschmutzungsgefahr von Haut und Schleimhäuten (Lysozymerzeugung der feuch« ten Schleimhäute, Aktivierung der Flimmerepithelien in den Atemwegen usw.), gesteigerter Schutz gegen die von Viren unä Pilzen verursachten Infektionen;
Gegen die smch ständig und in hohem Maße steigernde Stresswirkungen (z.B, meteorologische Einflüsse, starke Unterschiede zwischen Tag- und Hachttemperatur, erhöhte Verletzungsgefahr) des Lebens auf dem Festland ist die erfindungsgemäße Verbindung wirksam, indem sie das Adaptionssyndrom stabilisiert und gleichzeitig die peripheren Gewebeschäden der Gluco-
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chorticoide abwehrt (30 zum Beispiel Schäden dee Bindegewebes, Verletzungen des Xnochenmatrixbestandes usw.), Entwicklung der Immun-HomoeostaGe Gsoübeigertes Erkenntnisvermögen des Körpers, welche Zellen körpereigen sind und welche nicht).
Die erfindungögetaäße Verbindung übt ihre Wirkung zum Teil unmittelbar, zum Teil über die Lenkung des Vitamin A Metabolismus, durch die Erzeugung von Vitamin A Metaboliten stärker polaren Charakters aus. Diese Wirkung ist der des Parathormons auf das 25-Hydroxy~cholecalciferol-l-cl~hydroxylase~Enzyra der Nierenkanäle vergleichbar. Durch diese Erläuterung wird die breite pharmakologische, biochemische und therapeutische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung verständlich. Die if/irkungsrichtungen sind folgendet A) Wirkungen mit Vitamin A Gharaktert
a) Pharmakologische und biochemische Wirkungen« Markierte Sulfate werden in erhöhtem Maße in den Knorpel der Ratte beziehungsweise die Augenlinse, das Leber- und Lügengewebe des Hühnerembryos eingebautj radioaktiv markier* ter Phosphor wird in gesteigertem Maße in den Knorpel der Ratte eingebaut § die Chondroitinsulfatsynthese steigernde Wirkung* günstige Wirkung auf die Wundheilung beziehungsweise auf die durch Verabreichung von Cortison experimentell verschlechterte Wundheilung bei Hunden und Ratten; die Wirkung des Vitamins A potenzierende Wirkung an bei Ratten und Hunden experimentell hervor-» gerufenen Hypo- beziehungsweise Hypervitaminosenj die uleus-bedingte Stresswirkung vermindernde Wirkung bei Ratten; die Degranulation von Mastocyten begünstigende Wirkung; steigernde Wirkung auf die Produktion von
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NACHQERgIOHT I - 8 -
Lyaozyin; Wirkung auf den haushalt der Spurenelemente (Silicium, Zink, Kupfer, Mangan, Fluor); fördernde Wirkung auf die Epithelbildung; steigernde Wirkung auf die alkalische Phoophatase-Aktivit&t; die auf die durch lokale Einwirkung von Vitamin A hervorgerufene Granulomsackbildung ausgeübte Wirkung; der sehr flache Verlauf der Dosis-Wirkungs-Kurve beziehungsweise Il
die Änderung des Vorzeichens bei großen Dosen. b) klinisch-therapeutische Wirkungent keratooonjunctivis sicca; SJögren-Syndrom; rhino-laryngo-pharyngitis sioca; ozaena; chronische Bronchitis, Sinobronchitis; Mucoviscidose; konstitutionelle Lungenerkrankungen bei Kleinkindern; Parodontose; Ansteckungsneigung der Haut und der Schleimhäute für Viren und Pilze; cliortisonantagonistische Wirkung, günstige Wirkung aUf den Heilvorgang bei Operationswunden und Schleimhautwunden; erosio colli; pruritus-artige; Herabsetzung des Geruchsund Geschmackssinnes» aktivierende Wirkung auf den Golgi-
Apparat. B) Wirkungen ohne Vitamin A Charakter
a) Pharmakologische und biochemische Wirkungen: Wirkung auf den Blutzuckerspiegel im Sinne einer vorübergehenden Senkung; steigernde Wirkung auf die Phosphaturie* senken-■ de Wirkung auf den Phosphorspiegel im Blutserum; radioprotektive Wirkung; bei Labyrinthversuchen mit inaktiven Tieren die zur Erreichung des Ziels nötige Zeit verkürzende Wirkung; vermindernde Wirkung auf experimentell hervorgerufene Fluor- und Cadmiumtoxikose; die cyclische Adenosinmonophosphat-Bntleepung der Niere steigernde Wirkungi
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— O, M
. steigernde Wirkü~ng~at die Aktivität des Leberenzyms Tyrosinaminotransferasej
b) Therapeutische Wirkungen* schwache Strahlenschädenj Vitiligoj Muskelhypotonie j p3ychoener.getisierende Wirkung; günstige Wirkung auf involutioneile und gerontologische Zustände sowie auf die mystischen Funktionen; cheloide Neigungen; Spondylosis ankylopoetica; auf Abnutzung beruhende Erkrankungen der Bewegungsorgane§ sclerotischer Fundus; Amyloidosej Morphea, fibrooycti« sehe Mastopathie.
Bei der Verabreichung der erfindungsgemäßen.Verbindung ist die Zeitdauer der Behandlung außerordentlich unterschiedlich. Manche Krankheiten (zum Beispiel Rhino-laryngo-pharyn- : gitis aicca) werden bei oraler Verabreichung von täglich 3x5 Mikrogramm bereits nach zwei Wochen symptomfrei, zur symptomatischen Besserung anderer Krankheiten (zum Beispiel Paradentose, SJögren-Syndrom) sind ein bis zwei Monate erforderlich, bei wieder anderen Krankheiten (zum Beispiel Spondylosis Ankylo*· poetica) muß ein viertel bis ein halbes Jahr behandelt werden»
Aus der erfindungsgemäßen Verbindung können in einfacher Weise beliebige pharmazeutische, präventive, kosmetische beziehungsweise veterinärmedizinische Präparate hergestellt werden.Die Präparate können einen einzigen Wirkstoff oder aber eine Wirkstoff kombination enthalten. Die Dosis an'reinem Wirk« stoff beträgt jpO-500 Nanogramm pro Tag und Kilo Körpergewicht und wird verteilt auf drei Einzeldosen appliziert.
Eine Tablette enthält 2-20 Mikrogramm, vorzugsweise 10 Mikr'ogramm Wirkstoff und außerdem biologisch inerte Trägeratoffe (zum Beispiel Milchzuoker, Stärke) sowie die üblichen Tabiettierungshilfen (Granulier- und Gleitmittel»
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wie zum Beispiel Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Talkum, Magnesiutnstearat, Aeroeil usw.) Bei der außerordentlich geringen Dosis ist es zweckmäßig, den Wirkstoff noch vor dem Granulieren in Form einer Lösung der Tablettenrnasse zuzusetzen und mit einem Kneter zu homogenisieren. Auf diese Weise wird der Wirkstoff gleichmäßig verteilt, Der geringe Wirkstoffgehalt ermöglicht die Herstellung im Maßstab eines großen Laboratoriums. Der Wirkstoff ist stabil, die Tabletten können daher ohne Angabe einer Frist für den Verbrauch in den Handel gebracht werden. Der Wirkstoffgehalt von verzögert wirkenden Tabletten beziehungsweise spansularen Kapseln kann bei 10-20 Mikrogramm liegen, Bei Injektionspräparaten beträgt die zweckmäßige Dosis pro Ampulle 5-10 Mikrograinm, Die parenterale Anwendung kann intramuskulär, subcutan oder intravenös vorgenommen werden. In der angegebenen Konzentration schädigt der Wirkstoff weder Gewebe noch Gefäßwände. Dar Wirkstoff kann daher auch als Infusion appliziert werden.
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Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert, ohne daß sie indessen auf die Beispiele beschränkt bliebe,
Beispiel 1
Gewinnung von A-k-Glutamyltaurin aus Naturstoffen IO s lyophilisiertes und gemahlenes Nebenachilddrüsenpulver werden nach der bekannten Methode von Auerbach auf folgende Weise entfettet: Das Drüsenpulver wird bei Zimmertemperatur mit 25 ml Aceton gründlich vermischt und dann die Suspension durch ein Glasfilter (G4 Schott) filtriert. Da3 gut abgesaugte Drüsenpulver wird, ebenfalls bei Zimmertemperatur, mit Chloroform gründlich verrieben und die Suspension erneut durch ein Glasfilter filtriert. Dieser Arbeitsgang wird noch einmal wiederholt. Anschließend wird die abgelaugte Substanz noch einmal in 25 ml Aceton.suspendiert und durch ein Glasfilter gründlich abgesaugt. Das auf diese V/eise gereinigte Drüsenpulver wird bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 7-9 g trockenes, fettfreies Drüsenpulver j dieses Gewicht hängt vom Fettgehalt des Ausgangsmaterials ab.
10 g des entfetteten, trockenen Drüsenpulvers werden bei 50 0C dreimal mit je 100 ml destilliertem Wasser· extrahiert. Jede Extraktion dauert eine Stunde* Nach jeder Extraktion wird die wäßrige Lösung mittels einer !laborzentrifuge hoher Drehzahl vom Drtisenpulver abgetrennt. Bis zur weiteren Verwendung werden die wäßrigen Extrakte unter Stickstoff bf>i Temperaturen von 3-5 0G im Kühlschrank aufbewahrt. Der wäßrige Extrakt zeigt gegen Hinhydrin, Biuret und Trichloreasigaäure positive Reaktion,
Vor der nächsten Operation werden die wäßrigen Extrakte vereinigt. Dem vereSnig^en^xtratb wird unter G
ORIGINAL INSPECTED
Schütteln tropfenweise so viel 50 Vol.-^-ige wäßrige Trichloreasigsäurelöaung zugesetzt, daß die JSndkonzentr« tion an Trichloressigsäure 15 % beträgt.
Die den Niederschlag enthaltende wäßrige Lösung wird bei 3-5 0C im Kühlschrank 2 Stunden lang stehen gelassen und dann der durch Einwirkung der Trichloressigsäure entstandene Niederschlag abzentrifugiert. Die klare Lösung gibt auf Zugabe von !Erichloressigsäure keinen weiteren Niederschlag.
Der Überschuß an l'richloressigsäure wird durch eine serienmäßige Extraktion bei Zimmertemperatur entfernt, Zur Extraktion wird Äther verwendet. Um den gesamten Trichlores sigsäureüb er schuß zu entfernen, ist eine 17 bis 18 malige Extraktion erforderlich, in manchen Fällen sogaj? 20 bis 25 malige Extraktion. Nach der letzten Extraktion soll die wäßrige Phase einen pH-Wert zwischen 4|5 und 5 aufweisen.
It
Zur Entfernung des Äthers wird bei einer Temperatur von unter 30 0C mittels einer Wasserstrahlpumpe ein Stickstoff strom durch die wäßrige Phase geleitet, Nach etwa 6
Stunden ist der gesamte Athör entfernt, Die Operation ist mit einem Volumenverlust verbunden, da bei dem verminderten Druck außer dem Äther auch ein Teil des Wassers verdampft;
It
Man prüft durch Riechent ob aller Äther entfernt ist.
Die wäßrige Lösung wird anschließend lyophilisiert, und die Substanz, da sie hygroskopisch ist, in einem gut verschließbaren Gefäß aufbewahrt, Die Ausbeute an Substanz beträgt bezogen auf das noch nicht entfettete Drüsenpulver 10-15 %, was naturgemäß vom Fettgehalt des Ausbau;;ydrüGenpulvers abhängt.
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Die erhaltene lyophilisierte Substanz wird über Sephadex G-15 (Pharmacia, Schweden, üpsala| Teilchengröße 90-120 Mikron) nach absteigender Methode gelgefiltert.
Das Elutionsdiagramm wird durch Messen der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Dabei werden insgesamt 7 Maxima (peaks) erhalten (A-G),
Charakteristische Parameter der Gelfiltration»
Ansatz
Durchmesser der Säule Höhe der Säule Durchflußgeschwindigkeit Zeitdauer Fraktionsgröße Maxima (peak)
5,1 g lyophilisierte Substanz in 10 ml destilliertem Wasser gelöst 4,85 cm 149 cm 0,78 ml/min 10 min 7,8 ml/Röhrchen Röhrehenzahl
77-103 104-128 129-134 135-162 163-189 I9O-217 218-227.
Die aktive Substanz befindet sich in der mit B bezeichneten Fraktion, Bis zum Röhrchen Nr. 104 beträgt das Volumen des Eluates 814 ml« Das Gesamtvolumen der Fraktion B beträgt 188 ml·
Die Fraktion B wird anschließend lyophilisiert. Bei 5 g Ausgangsstoff erhält man 0,43-0*53 g Lyophilir.at.
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Identifizierung während der <ielfi'i.tr<itioDS
NACHGEREICHT
Wird die Gelfiltration unter den oben angegebenen Bedingungen durchgeführt, so erscheint der Wirkstoff bei dem Volumen (0,67 ± 0,02) χ V0, wobei V0 dasjenige Eluatvoluraen ist, bei dem die anorganischen Ionen im Eluat erscheinen (positive Chloridreaktion, mit Silbernitrat geprüft).
Die lyophilisierte Fraktion B wird einer Ionenaustauachchroraatographie unterworfen.
301 g der lyophilisierten Fraktion B werden in einem Ameisensäure-Essigsäure-Gemisch vom pH-Wert 1,8 zu einer 30 #-igen Lösung gelöst. Die Lösung wird auf einer mit einem Ameisensäure-Essigsäure-Gemisch auf pH l,8Veingestellten, mit Dowex 50x2 (Dow Chemical, USA) gefüllten Säule der Größe 132 χ 1 cm bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 13 ml pro Stunde chromatographiert, wobei Fraktionen von je 4 ml aufgefangen werden» Diese Einzelfraktionen werden auf Grund ihrer bei 280 nm gemessenen Extinktionsmaxima zu den Fraktionen A-I vereinigt!
Bezeichnung der
Fraktion		 Röhrohenzahl Gewicht (mg)
(lyophilisiert)
A 9-12 . 8,4
B 13-17 18,4
C 18-23 64,4
D 24-29 5,2
E * 30-36 2,2
3? 37-42 ■ 0,5
G 43-50 3,1 ·
H 51-57 7,3
I 58-80 6,8
116,3 (38,6 %) (
*) (86 ml Eisessig und 25 ml Ameisensäure /88 Vol.96/ mit dest. Wasser auf 1000 ml verdünnt.)
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BAD ORIGINAL
Die aktive Substanz befindet sich In den Fraktionen D, B Und F. Durch Lyophilisieren der vereinigten Eluate dieser drei Fraktionen erhält man 7,9 mg Substanz, waa 2,62 % der gelgefilterten Ausgangsfraktion B entspricht.
Die durch Ionenaustauschchromatographie erhaltenen und anschließend lyophilisierten Fraktionen D, B und F wer-' den böi einem pH-Wert von 1,8 auf einem 22 cm breiten Papier (Whatman 3 MM) bei einer Spannung von 1500 V 90 Minuten lang einer Elektrophorese unterzogen.
Die aktive Substanz zeigt positive Ninhydrinreaktion und wandert von der Startlinie einheitlich in Richtung des positiven Pols, und zwar bei 1500 V Spannung..
Nach der Elektrophorese muß der gegen Ninhydrin positive Streifen, der die eine entsprechende Wanderungsgeschwindigkeit besitzende Substanz enthält, ausgeschnitten und in der Weise auf einen neuen papierchromatographischen Bogen aufgenäht werden, daß die Entwicklungsrichtung der elektrophoretischen Wanderungsrichtung entgegengesetzt ist« Die weitere Reinigung geschieht durch absteigende Papierchromatographie. Als Fließmittel wird ein Butanol-Pyridin-Eisessig- -Wasser-Gemisch im Verhältnis 15*10*3*12 verwendet. Die bei Zimmertemperatur auf Whatman 3 MM Papier durchgeführte Papierchromatographie dauert 60 Stunden.
In dem angegebenen Fließmittel hat die reine Verbindung einen Rf-Wert von 0,19. Die bei pH 6,5 papier elektrophoretisch festgestellte relative (auf Cysteinaäure bezogene) Beweglichkeit beträgt 0,74. Nach salzsaurer Hydrolyse dee Produktes sind ia Hydrolysat Glutaminsäure und
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Taurin nachweisbar. Die isolierte Substanz wird von Carboxypeptidase nicht hydrolysiert. Formolt C7H14N2O6S, M = 254,27.
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Claims (1)

  1. Puαent anaprü cho
    l.yv/eiterontvjicklung des in der Stammannieldung i-lr.
    yf geschützten Verfahrens zu einem Verfahren zur Isolierung von ^-L-Glutamyltaurin aus dem Extrakt der Neben~ schilddru.se, dadurch gekennzeichnet, daß man - nachdem die Nebenschilddrüse beziehungsweise deren Gewebe- oder Zellkultur, vorzugsweise in pulverisierter Form, mit Wasser oder einer anorganische Ionen enthaltenden wäßrigen Lösung extrahiert, der filtrierte Extrakt vom iüiweiß befreit und lyophilisiert würde - die Substanz in Wasser löst und die Lösung einer Gelfiltration unterzieht, die den Wirkstoff enthaltende Fraktion, vorzugsweise durch spektrographische Bestimmung, auswählt und lyophilisiert, das Lyophilisat in V/asser löst und die wäßrige Lösung mittels Ionenaustauachchromatographie reinigt, das erhaltene Wirkstoffkonzentrat einer Elektrophorese unterwirft und schließlich das ^-L-Glutamyltaurin chromatographisch isoliert,
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet« daß zur reinigenden lonenaustauschchromatographie diejenige Fraktion der Gelfiltration ausgewählt wird, die im Laufe der Blution bei einem Volumen von V (0,67+0,02) erscheint, wobei
    ο —
    V das Volumen bedeutet, bei dem anorganische Ionen*im FiI- •ferat erscheinen.
    3, Verfaliren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur weiteren Reinigung als Ausgangsstoff dasjenige Bluat der Gelfiltration ausgewählt wird, dessen bei 280 nm gemessene Extinktion das zweite Maximum aufweist.
    4.Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrophorese bei pH«*l,8 und unter Anwendung holier
    Spannung durchgeführt wird.
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    λ*
    5· Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographieehe Reinigung als Papierchroraatographie oder Cellulose-Säulenchromatographie ausgeführt wird.
    6, Ärzneimittelpräparat, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff aus der Nebenschilddrüse isoliertes -L-GlutamyItaurin enthält.
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DE19752517028 1971-08-04 1975-04-17 Verfahren zur isolierung von gamma- l-glutamyltaurin Withdrawn DE2517028A1 (de)

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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2234832A1 (de) * 1971-08-04 1973-04-05 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Verfahren zur herstellung von litoralon

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DE2234832A1 (de) * 1971-08-04 1973-04-05 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Verfahren zur herstellung von litoralon

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BE828545R (fr) 1975-08-18
NL181080C (nl) 1987-06-16
NL181080B (nl) 1987-01-16
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