DE2514536A1

DE2514536A1 - Verfahren zur reaktivierung von interferon

Info

Publication number: DE2514536A1
Application number: DE19752514536
Authority: DE
Inventors: Pierre Marie Hendrik Fra Somer; William Edgar Stewart
Original assignee: Stichting Rega VZW
Current assignee: Stichting Rega VZW
Priority date: 1974-04-03
Filing date: 1975-04-03
Publication date: 1975-10-09
Also published as: NO751117L; AU7951075A; BE826890A; IT1045540B; DK139875A; US4017600A; FR2266741B3; FI750952A; NL7404590A; SE7503770L; JPS5191319A; FR2266741A1

Description

Verfahren zur Reaktivierung von Interferon

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reaktivlrung von Interferon.

Interferon ist der Name, der einem zellulären Antivirus-Material gegeben wurde, das aus lebenden Zellen und von extrazellulären Flüssigkeiten gewonnen werden kann. Die Bildung von Interferon in den Zellen kann durch verschiedene Mittel hervorgerufen werden, an erster Stelle durch Viren und weiterhin eine Vielzahl von anderen Stimulantlen einschließlich von Bakterien bis zu hochmolekularen Polymeren. Das Interferon kann von den Zellen oder extrazellulären Flüssigkeiten in verschiedenen Reinheitsgraden gewonnen werden und scheint in der Lage zu sein, menschliche Gewebe und Zellen gegen Angriffe von Viren zu schützen. Im allgemeinen ist die Antivirus-Aktivität von Interferon unspesifisch seiner Wirksamkeit für einen Schutz auch gegen andere Viren zus-ätzlieh zu denen, die zur Anregung der Zellen verwendet wurden, obwohl Unterschiede in der Empfindlichkeit gegen Interferon bei unterschiedlichen Viren beobachtet wurden. In den meisten Fällen wurde festgestellt, daß Interferon einen besseren Schutz für Gewebe und Zellen der Art ergibt, aus denen es erzeugt wurde, als für andere Gewebe und Zellen.

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Allgemeine Übersicht über die derzeitigen Kenntnisse Über Inter feron finden sich in den Büchern j "Interferon¹¹ von J. Vilcek, Springer-Verlag, Wien-New-York, 1969, und "Selective Inhibitors of Viral Puntions¹¹ von W.A. Carter (ed), CRC-Presse, Cleveland, 1-973* auf die hiermit Bezug genommen wird.

Obwohl viel Arbeit auf die physikalische und chemische Charakterisierung von Interferon verwendet wurde, war es bisher nicht möglich, mit StherheIt die chemische Struktur von Interferon zu bestimmen♦ Es scheint ersichtlich zu sein, daß Interferon

proteinartig ist, doch sind die meisten Einzelheiten hiervon ungewiß. Die Bestimmung dieser chemischen Struktur wurd in großem Ausmaß durch die Tatsache behindert, daß es anscheine verschiedene molekulare Spezies von Interferon gibt, die unterschiedliche Molekulargewichte und unterschiedliche Eigenschafte aufweisen und deren Bildung von verschiedenen Paktoren wie z.B. der Art der für die Herstellung von Interferon verwendeten Zellen (beispielsweise Zellen von unterschiedlichen Tierarten wie z.B. Mäusen, Kaninchen, Küken oder von Menschen oder Zellen, die von unterschiedlichen Geweben einer einzigen Tierart gewonnen wurden) der Art des für die Anregung der Bildung von Interferon verwendeten Mittel (beispielsweise unterschiedliche Viren) dem verwendeten Herstellungsverfahren und dem verwende ten Verfahren zur Gewinnung von Interferon aus Zellen oder Flüssigkeiten abhängt.

Weiterhin wurde die Erzeugung, Reinigung und klinische Auswertung von Interferon bisher durch verschiedene Paktoren behinder von denen der wichtigste die bekannte Instabilität von interfer 1st. Obwohl berichtet wurde, daß manche Arten von Interferon, wie z.B. aus menschlichen Leukozyten gewonnenes Interferon sowie Kaninchen-Interferon mehr oder weniger gegen eine Inaktivierung stabil sind, werden andere Arten von Interferon sehr sohnell durch verschiedenenUmstände inaktiviert, wie z.B. durch längere Aufbewahrung, unerwünschte pH-Werte, erhöhte Temperatur

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und chemische und mechanische Handhabungen, wie z.B. Schütteln, wiederholte Gefrier- und Tauzyklen, Schaumbildung beim Filtern usw. Weitere Arten von Interferon, wie z.EL aus menschlichem Fibroblast gewonnenes Interferon weist eine derartige Instabilität auf, daß Aktivitätspegel dieses Interferons nicht zuverlässig sind. Weiterhin scheinen selbst die relativ stabilsten Arten von Interferon labil zu werden, sobald ein hoher Reinheitsgrad erreicht wurde. Zur Beseitigung dieser Nachtelle wurde vorgeschlagen, fremde Proteine hinzuzufügen, um das Interferon während der Reinigung zu schützen, doch weist diese HInzufügung von Protein viele Nachteile auf, weil die meisten Arten von Interferon einem Schutz entgegenwirken, wodurch den Zweck der Reinigung entgegengewirkt wird.

Es wäre daher vorteilhaft, ein Verfahren zur Reaktivierung von Interferon zur Verfügung zu haben, das einen Teil oder sein6 gesamte Aktivität als Ergebnis seiner Art unter -dem Einfluß der oben erwähnten Umstände verloren hat. Insbesondere wäre ein Verfahren wünschenswert, das eine vollständige Reaktivierung von derartigem teilweise oder vollständig inaktiviertem Interferon ermöglicht, damit dieses auf seine anfängliche Aktivität zurückgeführt wird.

In der deutschen Patentschrift (deutsche Patentanmeldung

unser Aktenzeichen 15 152 mit dem gleichen Anmeldetag) wurde bereits beschrieben, daß eine wässrige Interferon-Lösung, in der das Interferon im wesentlichen nichts von seiner Aktivität eingebüßt hat, durch die Behandlung mit einer Kombination von drei Reagenzien stabilisiert werden kann, nämlich (a) einem Agens zur Unterbrechung nicht-kovalenter Bindungen, wie z.B. Harnstoff oder Guanidin-HCl, (b) einem Agens zur Reduzierung von Disulfid-Brücken, wie z.B. Mercaptoäthanol, und (c) einem anionischen oder kationischen oberflächenaktiven Agens, wie z.B. Natriumlaurylsulfat oder Laurylamin. Wenn das Interferon mit

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diesen drei Agenzien behandelt wird, behält es Im wesentlichen seine anfängliche Aktivität und ist gegen eine Inaktivierung unter dem Einfluß der oben erwähnten Umstände und Manipulationen stabil.

Unerwarteterweise wurde nunmehr festgestellt, daß ein Interfe dessen Aktivität bereits verringert wurde, oder des sogar vol ständig Inaktiviert wurde, teilweise oder vollständig durch eine Behandlung mit einer Kombination der gleichen drei Reage reaktiviert werden kann. Eine vollständige Reaktivierung ist Sicherheit möglich, wenn das Interferon nach der Hinzufügung drei Reagenien bei 90 bis 1O5°C für einige Minuten erwärmt wi und das resultierende Produkt hat in diesem Fall im wesentlic die gleiche oder sogar höhere Aktivität als das ursprüngliche noch nicht inaktivierte Interferon. Weiterhin bleibt die resu tierende Aktivität konstant, wodurch sich ein Produkt ergibt, das gegen inaktivierende Umstände und Manipulationen stabil 1

EIn erflndungsgemäß ausgebildetes Verfahren zur Reaktivierung von Interferon umfaßt die Behandlung einer wässrigen Interferoi Lösung, In der das Interferon zumindest einen Teil seiner anfänglichen Aktivität verloren hat, mit einer Kombination von

(a) einem Agens zur Unterbrechung nicht-kovalenter Bindungen,

(b) einem Agens zur Reduzierung von Disulfid-Brücken und (c) einem anionischen kationischen oberflächenaktiven Agens. Gemäü einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, die Interferon-Lösung nach der Hinzufügung dieser drei Agenzien einer Wärmebehandlung auszusetzen, beispielsweise einer Erwärmung auf 90 bis 105°C Über 0,5 bis 10 Minuten, um eine vollständig Reaktivierung zu erreichen.

Auf Grund dieses Verfahrens wird es möglich, eine höhere Ausbeute bei der Herstellung und Reinigung von Interferon zu erzi und weiterhin ist es möglich, ein stabiles Interferon-Produkt zu bereiten, das für eine klinische Auswertung geeignet ist.

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Der durch das erfindungsgemäße Verfahren erzielte Mechanismus der Reaktivierung ist noch nicht vollständig klar. Es wird jedoch vermutet, daß das Interferon-Molekül eine Polypeptidkette mit kovalenten und nicht-kovalenten Bindungen umfaßt und weiterhin eine oder mehrere Disulfid-Brücken aufweist und daß der Unterschied zwischen biologisch aktivem Interferon und einem Interferon, das durch die oben erwähnten'umstände inaktiviert wurde, nur als ein Unterschied in der räumlichen Struktur oder Gestaltung des Moleküls beschrieben werden kann. Somit existiert eine aktive Gestaltung und eine inaktive Gestaltung (selbstverständlich sind Umstände denkbar, bei denen das Interferon-Molekül bis zu einem gewissen Ausmaß zerstört 1st, doch werden derartige Umstände hier nicht betrachtet). Wenn das inaktivierte Interferon nunmehr mit den drei Reagenzien nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wird, so wird das Molekül offensichtlich durch Unterbrechung der nicht-kovalenten Bindungen und Reduktion der Disulfid-Brücken in einer anderen Gestaltung umgewandelt, die ein "linear zufälliges Knäuel" aufweist und freie Sulfidrylgruppen aufweist, worauf das anionische oder kationische oberflächenaktive'Agens die geladenen Gruppen an der PoIypeptidkette bindet und die freigegebenen Sulfidrylgruppen gegen eine erneute Oxydation schützt, die zu . Intramolekularen oder intermolekukartnNeugestaltung der Disulfidbrücken führen würde. Diese Reaktionen erfolgen bereits zum größten Teil bei Umgebungstemperaturen, sie können Jedoch mit Hilfe einer Wärmebehandlung beschleunigt oder vervollständigt werden, wie z.B. durch eine Erwärmung auf 90 bis 105°C für eine gewisse Zeit. Das resultierende Produkt kann von dem Überschuß an oberflächenaktivem Agens und von den unterbrechenden und reduzierenden Agenzien mit Hilfe einer Dialyse befreit werden, wenn dies erwünscht ist. Wenn das Produkt später mit einem Protein enthaltenden Medium inkubiert wird, wie z.B.einem Medium, das lebende Zellen enthalt, so entwickelt das Produkt spontan eine aktive Gestaltung, die im wesentlichen die anfängliche Aktivität des entsprechenden Interferon aufweist oder die in manchen Fällen eine, noch höhere Aktivität aufweist. Der gesamte Vorgang kann als eine Reaktivierung des

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inaktivierten Interferons bezeichnet werden.

Es ist Jedoch verständlich, daß die Erfindung nicht durch diese theoretische Erläuterung beschränkt ist. Unterdessen umfaßt die Erfindung alle Merkmale und Materialien, die in den Rahmen der beigefügten Ansprüche fallen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Ausgangsmaterial irgendeiner Art von Interferon sein, das zumindest einen Teil seiner anfänglichen Aktivität verloren hat. Ein brauchbares Ausgangsmaterial kann Interferon sein, das eineiji Teil oder seine gesamte Aktivität unter dem Einfluß von inaktivierenden Umständen oder Manipulationen verloren hat und es kann weiterhin Interferon sein,das in labilem oder inaktivem Zustand während seiner Produktion oder Reinigung gewonnen wurde\ Aus den folgenden Beispielen ist erkennbar, daß von Mäusen gewonnenes Interferon (von unterschiedlinen Arten) sowie menschliches Pibroblast-Interferon in einem mehr oder weniger inaktivierten Zustand als Ausgangsmaterial verwendet werden und daß andere Arten von Interferon (mit der Ausnahme der Arten, die an sich stabil sind) außerdem geeignet sind. In den meisten Fällen steht dieses Interferon in der Form einer wässrigen Lösung zur Verfügung, die eine Menge von Interferon enthält, die einer anfänglichen Aktivität zwischen 10·^ und 10 Interferon-Einheiten pro Milligramm Protein (oder zwischen ungefähr 10 und 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter der Lösung) entspricht und diese Lösung kann als solche für das erflndungsgemäße Verfahren verwendet werden.

Erfindungsgemäß wird dieses vollständig oder teilweise inaktivierte Interferon nunmehr mit einer Kombination der drei Reagenzien behandelt, nämlich einem Agens zur Unterbrechung nichtkovalenter Bindungen« einem Agens zur Reduzierung von Disulfid-BrÜcken und einem anionischen oder kationischen oberflächenaktiven Agens.

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Es kam irgendein geeignetes Agens zur Unterbrechung der nichtkovalenten Bindungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Typische Beispiele sind Harnstoff und Guanidin-Hydrochlorid, wobei Harnstoff bevorzugt wird,

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Menge eines derartigen Agens sollte ausreichend sein, um eine Umfaltung der Polypeptidkette des Interferon-Moleküls zu erreichen, damit sich ein "linear zufälliges Knäuel" (linear random coil) ergibt. Allgemein ist die verwendete Menge von Harnstoff derart, daß die resultierende Lösung von 0,1 bis 10 M harnstoff enthält und vorzugsweise wird eine Konzentration von 5 M Harnstoff gewählt. Niederigere Konzentrationen als 0,1 M haben keine Wirkung und höhere Konzentrationen als 10 M sind nutzlos, weil der Sättigungspunkt dann erreicht wurde.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann irgendein geeignetes Agens zur Reduzierung von Disulfid-Brücken verwendet werden. Ein typisches Beispiel ist Äthanthiol oder Mercaptoäthanol. Die hiervon verwendete Menge sollte ausreichend sein, um alle Disulfid-Brücken in dem Interferon-Molekül zu reduzieren, soweit sie vorhanden sind. In den meisten Fällen ist die Menge von Mercaptoäthanol derart, daß die resultierende Lösung zu-

—p
mindest 10 M von Mercaptoäthanol enthält. Niedrigere Mengen

—2
als 10 M haben wenig oder keine Auswirkung. Eine obere Grenze kann kaum angegeben werden, weil höhere Mengen nicht gefährlich sind. Es wird bevorzugt, Konzentrationen von l,k χ 10" M bis 1,4 χ 10 M von Mercaptoäthanol in der Lösung zu verwenden. ·

Irgendein geeignetes anionisches oder kationisches oberflächenaktives Agens kann beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Das anionische Agens ist meistens ein Alkylsulfat mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen in seiner Alkylgruppe, wie z.B. Natriumlaurylsulfat oder Natriumdecylsulfat, oder ein entsprechendes Alkylsulfonat wie z.B. Natriumlaurylsulfonat. Das kationi-

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sehe Agens 1st im allgemeinen ein Alkylamin mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen in seiner Alkylgruppe, wie z.B. Laurylamin oder Decylamin. Die verwendete Menge dieses Agens sollte ausreichend sein, um das Protein zu binden und um die SuIfidrylgruppen des Interferon-Moleküls, die durch das oben erwähnte Reduktionsagens freigemacht wurden, zu schützen. Um die gewünschte Wirkujng

sicherzustellen, wird in den meisten Fällen ein einfacher bis fünffacher Überschuß des oberflächenaktiven Agens berechnet

' auf der Gesamtmenge des Proteins in der Lösung, verwendet. Wenr das Ausgangsmaterial eine Interferon-Lösung mit ungefähr 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter ist, so bedeutet dies, dad die Lösung zumindest 1 χ 10"* M und höchsten 1 χ 10** M des oberflächenaktiven Agens umfassen sollte« Eine Menge von 3,5 χ 10~2 M bis 3,5 χ ΙΟ"². M Natriumlaurylsulfat wird in diesem Fall bevorzugt.

Die Folge der Hinzufügung dieser drei Reagenzien ist nicht kritisch, obwohl es bevorzugt wird, das oberflächenaktive Agei gleichzeitig mit oder vor den anderen beiden Agenzien zuzufügen, um sicherzustellen, daß dieses oberflächenaktive Agens in der Lage 1st, mit den Polypeptiden zu reagieren, um die SuIfhydry Gruppen zu schützen, sobald sie durch das Reduktionsagens fre gesetzt wurden. Es wird bevorzugt, alle drei Agenzien im wese tlichen zur gleichen Zeit oder eines kurz nach dem anderen hlnz zufügen.

Obwohl im allgemeinen diese drei Reagenzien bereits bei Umgebungstemperaturen mit dem inaktivierten Interferon reagieren, erreicht die Reaktion nicht mehr einen vollständigen Abschluß unter diesen Bedingungen. Wenn daher das Ausgangsmaterial eine wässrige Interferonlösung ist, die vollständig durch Kochen inaktiviert wurde, ergibt eine Behandlung mit den drei Reagenzien bei Umgebungstemperatur lediglich eine Reaktivierung, die einen Wert von ungefähr 50 % der anfänglichen Interferon-Aktivität erreicht. In derartigen Fällen wird es bevorzugt, die Interferon-Lösuni einer Wärmebehandlung nach der HinzufUgung der drei Reagenzien

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zu unterwerfen. Diese VJärmebehandlung kann beispielsweise eine Erwärmung auf eine Temperatur von 90 bis 105°C Über einen Zeitraum von 0,5 bis 10 Minuten umfassen und vorzugsweise wird die Lösung Über eine Minute auf 100⁰C erhitzt. Eine derartige Wärmebehandlung kann in jedem Fall eine vollständige Reaktivierung des Interferons ergeben.

Nach der Reaktion mit diesen drei Reagenzien kann das Überschüssige oberflächenaktive Agens und die Gesamtmenge der anderen beiden Reagenzien durch Dialyse beseitigt werden, wenn dies erwünscht ist. Diese Beseitigung ist jedoch für eine weitere Benutzung des Produktes nicht absolut erforderlich.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann eine erhebliche bis ν ollständige Reaktivierung des inaktivierten Interferons erreicht werden und weiterhin ergibt sich eine Stabilisierung des Produktes gegenüber nachfolgenden Inaktivierung hervorrufenden Umstände und Manipulationen. Es wurde festgestellt« daß inak-

en
tiviertes menschliches Pibroblastainterferon sowie inaktiviertes \on Mäusen gewonnenes Interferon die anfängliche Aktivität durch die Behandlung mit Harnstoff, Mercaptoäthanol und Natriumlaurylsulfat und einer nachfolgenden Wärmebehandlung wiedergewinnen. Weiterhin scheint das resultierende Produkt gegen eine darauffolgende Erhitzung auf 56⁰C und 100⁰C stabil zu sein.

Es sei bemerkt, daß die gleiche Wirkung nicht mit nur einer oder zwei der oben erwähnten drei Reagenzien erzielt werden kann. So haben Harnstoff und Mercaptoäthanol, wenn sie allein oder zusammen verwendet werden, keine Reaktivlerungswirkung sondern vielmehr eine die Instabilität fördernde Wirkung auf Interferon

obwohl ausgeflockte Teile des Interferons hierdurch wieder gelöst werden. Natriumlaurylsulfat oder eine Kombination von Natriumlaurylsulfat und Harnstoff können zu einer teilweisen Reaktivierung führen, doch bleibt diese Reaktivierüng sehr gering. Wenn von einem vollständig inaktivierten menschlichen Fibroblasfftnterferon oder von Mäusen gewonnenem Interferon

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ausgegangen wird und diese beiden Reagenzien verwendet werden« kann nicht mehr als 5 # der anfänglichen Aktivität bei Raumtemperatur und nicht mehr als 10 % der anfänglichen Aktivität durch Kochen über eine Minute bei 100°C wiedergev/onnen werden. Dies bedeutet, daß eine Kombination der drei Reagenzien zusammen mit einer oder ohne eine Wärmebehandlung Immer erforderlich ist« um eine vollständige Reaktivierung zu erreichen.

Das hier beschriebene Verfahren der Reaktivierung von Interferon ergibt eine Möglichkeit zur Reaktivierung aller Arten von Interferon, die einen Teil ihrer Aktivität während ihrer Reinigung verloren haben und weiterhin können alle Interferon-Verbindungejn reaktiviert werden, deren Aktivität während einer längeren Aufbewahrung verringert wurde.' Damit kann eine bessere Ausnutzung von Interferon erreicht werden, das bereits in einer früheren Stufe erzeugt wurde. Die Tatsache, daß dieses reaktivierte Interferon gegen eine weitere Inaktivierung stabil ist, ermöglicht es, dieses Interferon in vielfältiger Weise zu verwenden und ej klinisch anzuwenden. Ein relativ reines raktiviertes Interferor mit einer Aktivität von ungefähr 10-⁵ bislO⁸ Interferon-Einheiten pro Milligramm Protein kann somit klinisch in reaktivierte: Form verabreicht werden. Im allgemeinen binden Proteine nur 1,44 Gramm Natriumlaurylsulfat pro Gramm Protein und dies bedeutet, daß eine Dosierung, die Millionen von Interferon-Einheiten enthält, nur einige wenige Microgramm von Natriumlauryl sulfat enthält. Daher besteht keine Gefahr von Komplikationen bei der klinischen Verabreichung. Die folgenden Beispiele dlenjsn nur zur Erläuterung und sollen den Rahmender Erfindung In kein Weise beschränken.

Beispiel 1:

Das Ausgangsmaterial war eine Lösung von Maus Interferon, das von Zellen des Log«-Typs gewonnen wurde, die durch den Newcastle-Disease-Virus (NDV) stimuliert wurden. Die

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Lösung wurde auf einem pH-Wert von 2 angesäuert, worauf fremde Proteine durch die Hinzufügung von Ammoniumsulfat ausgefällt wurden, bis ein Sättigungsgrad von 20 % bei 20°C errreicht wurde. Die geklärte Lösung wurdeauf einen pH-Wert von 7,2 durch

Dialyse gegen einen 0,01 M TRIS-HCl-Puffer eingestellt. Die resultierende gereinigt Lösung hatte eine Aktivität von 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter (die durch eine biologische Test bestimmt wurde).

Ein Teil von 1 Milliliter dieser gereinigten Interferon-Lösung wurd in ein Testrohr gebracht, das- in einen mit kochendem Wasser gefüllten Becher eingetaucht wurde. Nach einem Erhitzen auf 100⁰C über 2 l/2 Minuten war das Interferon im wesentlichen vollständig inaktiviert weil seine Aktivität auf weniger als 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter reduziert war.

EineAnzahl von weiteren Teilen von 1 Milliliter der gereinigten Interferon-Lösung wurde zuerst auf 100⁰C in der oben erwähnten Weise über 2 1/2 Minuten erhitzt. Nach der Abkühlung der inaktivierten Lösungen wurden eine oder mehrere Reagenzien, die aus der Gruppe von festem harnstoff, flüssigem Mercaptoäthanol und einer wässrigen Lösung von Nafcriumlaurylsulfat ausgewählt wurden, der Interferon-Lösung in derartigen Mengen zugegeben, daß die Endkonzentration dieser Reagenzien 5 M Harstoff, 1,4 χ

-2 —"5

10 M Mercaptoäthanol und 3,5 x 10 M Natriumlaurylsulfat betrug. In einigen Fällen wurde zusätzlich Wasser hinzugefügt, um den Verdünnungsfaktor für alle Untersuchungen auszugleichen. Für irgendein Reagenz oder eine Kombination von Reagenzien wurde die Reaktion einmal bei Raumtemperatur und einmal bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde die Lösung für eine Minute bei 100⁰C nach der HinzufUgung der Reagenzien erhitzt. Darauf wurden die Aktivitäten der resultierenden Mischungen mit Hilfe eines biologischen Testes ausgewertet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 niedergelegt.

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Der Ausdruck"Titer"in dieser Tabelle ist eine Angabe des Dezi mallogarithmus der Aktivität (in Interferon-Einheiten pro Milliliter). Alle Titer-Werte sind ein Mittelwert von drei getrennten Experimente.

Tabelle 1 Inaktivierung

Reagenzien fUr die Reaktivierung

Titer

keine 100°C/2i/2 Min

M Il It

n η R M

Μ It It

keine 4,0

keine <l,0

Harnstoff <l,0 Harnstoff + 100°C/l Min. <l,0 Mercaptoäthanol <l,0 Mereaptoäthanol + 100°C/l Min. <l,0 Harnstoff + Mercaptoäthanol <l,0

Harnstoff + Mercaptoäthanol <l,0 + 100°C/1 Min.

Natriumlaurylsulfat (SDS) 2,7

SDS + 100°C/l Min. 3,0

SDS + Harnstoff . 2,0 SDS + Harnstoff + 100°C/ 1 Min. 2,5

SDS + Mercaptoäthanol , 3,7 SDS + Mercaptoäthanol + 100⁰C/ lMin. 3,9

SDS + Harnstoff + Mercaptoäthanol 3,7 SDS 4- Harnstoff + Mercaptoäthanol

+ 100°C/l Min. 4,0

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Aus der Tabelle 1 ergibt sich, daß eine erhebliche bis vollständige Reaktivierung des inaktivierten Interferons durch Behandlung mit einer Kombination dieser drei Reagenzien in der erfindungsgemäßen Weise erreicht werden kann. Die Behandlung des inaktivie rten Interferons mit Natriumlaurylsulfat allein oder mit einer Kombination von Natriumlaurylsulfat mit einem der anderen Reagenzien ergibt eine gewisse Wiederherstellung der Aktivität doch ist selbst nach einem Kochen bei 100⁰C über 1 Minute diese Reaktivierung nicht vollständig. Eine Behandlung mit Harnstoff und Mercaptoäthanol entweder allein oder in Kombination ergibt keine Reaktivierung.

Beispiel 2

Eine Anzahl von Interferon-Lösungen von verschiedenen Quellen und mit unterschiedlichen Aktivitäten wurde zuerst inaktiviert und dann einer erfindungsgemäßen ReaktiVierungsbehandlung unter worfen. Die für dieses Beispiel verwendeten Lösungen waren:

1. Eine Lösung von Maus-Interferon, das in L-ZeIlen erzeugt wurde, die mit ultraviolettbestrahlten Newcastle-Disease-Viren (NDV-UV)-be impft wurden. Dieses Interferon enthielt 0,5 % Serum Albumin und hatte zu Anfang eine Aktivität von 10 Interferon-Einheiten pro Milligramm Protein oder 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter,

2. Eine Lösung von Maus-Interferon, das in g erzeugt wurde, die mit dem Newcastle-Dlsease-Virus (NDV)beimpft wurden. Es wurden drei Typen verwendet, die Jeweils Aktivitäten von 10 , 10⁶ bzw. mehr als 10' Interferon-Einheiten pro Milligramm Protein aufwiesen. Dieses entspricht in Jedem Pall IO Interferon-Einheiten pro Milliliter.

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3« Eine Lösung von Maus-Interferon, das in interferonstlmulierten Lpa-Zellen erzeugt wurde» die mit dem MM-Stamm des Encephalomyocarditis-Virus beimpft wurden Es wurden zwei Typen verwendet, die Aktivitäten von 10 bzw. 5 χ 10 Interferon-Einheiten pro Milligramm Protein aufwiesen. Dies entspricht in beiden Fällen 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter.

. en

4. Eine Lösung von menschlichem diploidem Fibroblastf-Inter

en feron, das in menschlichen diploiden Fibroblast^Zellen erzeugt wurde, die durch Polyribolnosinsäure und PoIycytidynsäure (Poly I, Poly C) stimuliert und darauffolgend entsprechend dem Verfahren von Havell und Vilcek (Antimicrobial Agents Chemother., 2, 476-484 (1972)) über stimuliert wurden. Es wurden drei Typen vet«

4 "5

wendet, die jeweils Aktivitäten von 10 , ungefähr KK

bzw. ungefähr 10* aufwiesen.

Interferon-Einheiten pro Milliliter

Die biologischen Teste zur Auswertung der Interferon-Aktivität wurden durch eine Bestimmung des Endpunktes durchgeführt, bei dem eine 50 #ige Verringerung des Virus-Titers erfolgte. Dies wurde mit einem Vesiculären Stomatitis-Virus in Lq₂q~ Zellen für Maus-Interferon und mit dem gleichen Virus, in L₁ .,g-Fibroblast-Zellen für menschliches Interferon durchgeführt.

Die Inaktivierung wurde auf verschiedene Weise durchgeführt, beispielsweise durch Kochen bei 100⁰C für 2 1/2 Minuten, durch Erwärmen auf 56⁰C über 30 Minuten, durch 100 maliges Frieren und Tauen oder durch Hinzufügen von Harnstoff und Mercaptoäthahol in derartigen Mengen, daß ihre Endkonzentrationen 5 M tiarnstof bzw. 1,4 χ 10 M Mercaptoäthanol betrugen. Diese Inaktivierungverfahren sind in der Tabelle 2 niedergelegt. Eine Eyhitzung bei 100⁰C erschien als die wirkungsvolle Welse für eine Inakti Vierung. Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Inaktivierung

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waren von der Gesamtmenge von Eremdproteinen unabhängig.

Nach der Inaktivierung wurden die Interferon-Lösungen einer Reaktivierungsbehandlung entsprechend dem erfindvingsgemäßen Verfahren unterworfen. Diese Behandlung umfaßte die Hinzufügung von festem Harnstoff, flüssigem Mercaptoäthanol und einer wässrigen Lösung von Natriumlaurylsulfat in derartigen Mengen, daß die Endkonzentrationen 5 M Harnstoff, 1,4 X 10 M Mercaptoäthanol und 3,5 x 10"^ M Natriumlaurlysulfat betrugen, worauf eine Erwärmung
erfolgte.

Erwärmung der gesamten Mischung auf 100⁰C Über eine Minute

Weiter Einzelheiten bezüglich des Ausgangsmaterials, des anfänglichen Titers, der Art der inaktivierung, des Titers nach der

in Inaktivierung und des Titers nach der Reaktivierung sind der folgenden Tabelle 2 angegeben. Der Ausdruck ^wTiter^w bezeichnet den dezimalen Logarithmus der Aktivität in Werten der Interferon-Einheiten pro Milliliter.

Der Ausdruck "spezifische Aktivität? bedeutet die Aktivität pro Milligramm Protein.

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την *· anfänglicher Inaktivierungs- Titer nach

xnterieron Titer verfahren Inaktivier

Titer nach

g verfahren Inaktivierung Reaktivierung

Maus-L-NDV-UV mit 0,5 % Serum Albumin

Maus-L-_g29 NDV

Spez.Akt. 10 Interferon-Stimul.

Maus« Lpa-MMh 3pez.Akt» 10 Interferon-Stimul.

Maus-Lpa-MM g

Spez. Akt. 5 χ 10 Maus-L_Q2Q-NDV Spez.AKt?>10'

MaUs-L₉₂₉-NDV Spez.Akt. 10⁶

η η

4,0

4,7

4,3 3,7

4,0

4,0 4,0

4,0

mensch!.diploides

Poly I. 4,0

Poly C Uberstimuliert

" 2,3

3,3 100°C/2'l/2 MIn. <l,0

100°C/2 1/2 Min. < 1,0

100°C/ 2 1/2 Min. <l,0

100°C/2 1/2 Min. < 1,0 100°C/2 1/2 Min. <l,0

lOO°C/2 1/2 Min.

56°C/3O Min.

Gefrier-Tau-Zyklen (100 χ)

3,2

5 M Harnstoff +1,4

χ 10"²M 3,0

Mercaptoäthanol

100°C/2 1/2 Min. <l,0

^r2 1/2 Min.

100°C/2 1/2 Min.

Aus Tabelle 2 ergibt sich, daß eine vollständige Reaktivierung mi s ohiedlichen Ausgangsmaterialien erzielt werden kann.

t unter-

PatentansprUch ϊ

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Claims

25H536 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reaktivierung von Interferon, gekennzeich net durch die Behandlung einer wässrigen Interferon-Lösung, in der das Interferon zumindest einen Teil der anfänglichen Aktivität verloren hat, mit einer Kombination von (a) einem Agens zum Aufbrechen nicht-kovalenter Bindungen, (b) einem Agens zur Reduzierung von Disulfid-Brüoken und (c) einem anionischen oder kationischen oberflächenaktiven Agens.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Interferon-Lösung ungefähr ICK bis ungefähr Interferon-Einheiten pro Milligramm Protein oder ungefähr oder ungefähr 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter enthält.-

3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Agens zum Aufbrechen nicht-kovalenter Bindungen Harnstoff ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Harnstoff in einer derartigen Menge verwendet wird, daß die resultierende Lösung von 0,1 bis 10 M Harnstoff und vorzugsweise 5 M Harnstoff enthält.

5. Verfahren nach einem der /nsprüche 1 bis 4, dadurch g e k e η η zeichnet, daß das Agens zum Reduzieren Von Disulfidbrüoken Merkaptoäthanol ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß das Mercaptoäthanol in einer derartigen Menge verwendet wird, daß die resultierende Lösung zumindest 10 " M und vorzugsweise 1,4 χ 10"² M bis 1,4 χ ΙΟ"¹ Μ Mercaptoäthanol enthält.

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7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch g e ke η η · zeichnet, daß das anionische oder kationische oberflächen·

Agens Natriumlaury!sulfat bzw.

Laurylamin 1st.

ekennzeich

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch g| net, daß das oberflächenaktive Agens in einem einfachen bis fünffachen Überschuß verwende tjwird, der auf der Gesamtmenge von Proteinen in der Lösung berechnet ist.

9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß wenn der Interferon-Gehalt infer Lösung ungefähr 10 Interferon-Einheiten pro Milliliter beträgt, die hinzugefügte Menge des oberflächenaktiven Agens derart ist, daß die Lösu

enthält.

die Lösung von 1 χ 10*^ bis 1 χ 10 M oberflächenaktives Agehs

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß nach Hinzufügung der drei Agenzien die resultierende Interferon-Lösung einer Wärmebehandlung unterworfen wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Wärmebehandlung die Erwärmung der Lösung auf 90 bis 105⁰C während 0,5 bis 10 Minuten umfaßt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Behandlung mit den oben erwähnten drei Reagenzien das überschüssige oberflächenaktive Agens und die gesamten Proportionen der beiden anderen Agenzien durch Dialyse beseitigt werden.

Reaktiviertes Interferon-Produkt mit einer wässrigen Interferon-Lusung, deren Aktivität durch eine Behandlung mit einer Kombination \on (a) einem Agens zum Aufbrechen nicht-kovalenter Bindungen, (b) einen Agens zur Reduzierung von Dlsulfid-Brücken und (c) einejn anionischen oder kationischen oberflächenaktiven Agens wieder hergestellt wurde· ι

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