DE2511698C2

DE2511698C2 - Verfahren zur Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin (HCG), luteinisierendem Hormon (LH) oder dem menschlichen Choriongonadotropin ähnlichem Material, Reagenz zur Durchführung des Verfahrens und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE2511698C2
Application number: DE2511698A
Authority: DE
Inventors: Brij B. Englewood N.J. Saxena
Original assignee: Carter Wallace Inc
Current assignee: Meda Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1974-03-22
Filing date: 1975-03-18
Publication date: 1984-07-12
Also published as: FR2265099B1; AU7917575A; DE2511698A1; FR2265099A1; JPS514895A; GB1508221A; AU502577B2; JPS6119268B2; US4016250A; CA1067002A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin (HCG), luteinislerendem Hormon (LH) oder dem menschlichen Choriongonadotropin ähnlichem Material in einer wäßrigen Probe durch Inberührungbringen der Probe mit einem Mittel, das In der Lage 1st, das Hormon spezifisch zu binden und einem Mittel zum Anzeigen, ob eine Bindung stattgefunden hat. Das Verfahren dient zur Bestimmung der Schwangerschaft bei der Frau.

Tests für die Bestimmung der Schwangerschaft basieren im allgemeinen auf der Bestimmung von Hormonen, weiche durch die sich entwickelnde Plazenta erzeugt werden, wie beispielsweise gonadotrope Hormone, die ähnlieh jenen sind, die durch die vordere Hypophyse erzeugt werden, und Steroidhormone ähnlich jenen des Ovarlums und der Nebenniere. Heute verwendete Schwangerschaftstests beruhen beinahe ausschließlich auf der Untersuchung des Plazentahormons, des menschlichen Choriongonadotropin (HCG). Dieses Hormon wird nur während der Schwangerschaft in Körperflüssigkeiten, wie Blutserum und Urin, festgestellt, mit der Ausnahme von anderen sehr seltenen hormonerzeugenden Zuständen des Körpers. Die Internationale Einheit von menschlichem Choriongonadotropin wurde 1938 angenommen und 1st definiert als die spezifische gonadotrope Aktivität von 0,1 mg eines getrockneten Standards, der In National Institutes of Health, London, aufbewahrt wird.

Die frühesten Tests auf Schwangerschaft basierten auf biologischen in vivo-Verfahren zur Bestimmung von HCG. Zum Beispiel beruhte der früheste Test, der Aschhelm-Zondek-Test, auf der Eignung von subcutan in Mäuse injiziertem HCG, um corpora lutea zu erzeugen. Der Friedman-Test 1st ein anderer biologischer Test, in welchem eine Urinprobe der vermuteten Schwangerschaft in die Ohrvene eines erwachsenen weiblichen Kaninchens injiziert wird, welches drei bis vier Wochen isoliert gewesen ist, und 48 Stunden nach der Injektion werden die Ovarlen auf unterbrochene hämorrhagische Follikel geprüft, welche eine positive Reaktion anzeigen. Ein von Kuppermann 1943 entwickelter weniger bekannter Test umfaßt die Injektion des Urins eines Patienten in eine weibliche Ratte mit anschließender Inspektion des Ovariums auf Zeichen von Hyperämie. Obwohl die zwei Stunden, die zum Ausführen dieses Tests notwendig sind, beträchtlich kürzer sind als die 48 Stunden, die für den Friedman-Test erforderlich sind und die nahezu fünf Tage, die für den Aschhelm-Zondek-Test benötigt werden, Ist dieser Test nicht sehr zuverlässig, da er einen geübten Fachmann erfordert, um ein rosa negatives Ovarlum von einem geröteten positiven Ovarlum zu unterscheiden, um einen hohen Grad an Genauigkeit zu erreichen. Ein durch GeIIi und Meinini in den späten 1940er Jahren entwickelter Test erfordert nur etwa zwei Stunden, um den Test auszuführen, jedoch umfaßt dieser Test die Injektion von Urin des Patienten In Frösche mit der anschließenden Beobachtung des Ausstoßes von Spermen, jedoch sind diese Tiere verhältnismäßig unempfindlich verglichen mit Kaninchen, Mäusen und Ratten.

All die obigen biologischen Tests leiden an schwerwiegenden Nachteilen, einschließlich der Verfügbarkelt der Tiere, der Notwendigkeit, eine große Kolonie von Tieren zu halten und die verhältnismäßig langen Zelträume des Untersuchens, der häufigen falschen positiven und negativen Ergebnisse und Insbesondere der Tatsache, daß ein positiver Test mit nur 95* Zuverlässigkeitsgrad erst nach dem Zeltraum von 25 bis 30 Tagen erreicht werden kann, der auf die Ovulatlon folgt.

Eine zweite Art von Schwangerschaftstests, die während der frühen 1960er Jahie entwickelt wurden, werden als immunologische oder Immunochemlsche Verfahren bezeichnet. Da menschliches Choriongonadotropin ein Proteinhormon Ist, wirkt es bei einer heterologen Art antigen. Wenn demgemäß HCG durch geeignete Verfahren In ein geeignetes Testtier Injiziert wird, am typischsten In Kaninchen, wird In dem Tier ein Antikörper zu HCG erzeugt. Bei ersten Tests, die dieses Prinzip verwendeten, ist versucht worden, die Antlgen-Antikörper-Dlrekt-PräzlDltatlonsreaktlon zu verwenden, nach welcher sich ein sichtbarer Niederschlag aufgrund der Kombi-

nation von menschlichen Choriongonadotropin und seinem Antikörper bildet, um das Vorhandensein dieses Hormons nachzuweisen. Üblichere Verfahren umfaßten sogenannte indirekte Bestimmungsverfohren, wie beispielsweise der Latextellchenobjektträger-Test von Brody und Carlstrom und den Hämagglutinations- und Inhibitionstest von Wide und Gemzel. Beim ersteren Verfahren wird ein Antiserum dem Urin eines Patienten zugesetzt, worauf ein Latexträger, welcher mit HCG beschichtet worden ist, zugesetzt wird. Wenn die Urinprobe von einer schwangeren Frau ist und HCG enthält, werden die Antikörper in dem Antiserum neutralisiert und werden deshalb nicht mit dem auf dem Träger geschichteten menschlichen Choriongonadotropin reagieren, um Agglutination herzustellen. In dem letzteren Testverfahren wird ein ähnliches Prinzip verwendet, wobei jedoch der Indikator aus mit roten Blutzellen oder mit formalinisierten roten Blutzellen verbundenem HCG besteht. Der erste Test wird in einem Zeitraum von nur etwa 2 Minuten ausgeführt, wohingegen der zweite etwa 2 Stunden benötigt. Sowohl der Urin als auch das Blut des Patienten können für diese Testverfahren verwendet werden.

In einem unlängst entwickelten Schwangerschaftstestverfahren als einer Modifikation des grundlegenden immunologischen Mechanismus werden radiologische Anordnungen verwendet, um das Vorhandensein von menschlichem Choriongonadotropin in dem Blut oder Urin des Patienten nachzuweisen und/oder zu messen, wozu auf z.B. Goldstein et al in Fort. Steril., BiUid 23, Seite 817 (1972) verwiesen wird. In diesen Radioimmunountersuchungstests wird der Antikörper in Berührung mit einem Gemisch der zu uniersuchenden Körperflüssigkeit und einer bekannten Menge von HCG, das mit einem radioaktiven Isotop markiert ist, gebracht, und das HCG der Testprobe und das markierte HCG wirken kompetitiv auf den HCG-Antikörper. Der Antikörper wird dann von der Flüssigkeit getrennt und jede Fraktion wird radiologisch analysiert, um die jeweiligen Proportionen des markierten und unmarkierten HCG zu bestimmen, welche an die Antikörper gebunden wurden, und die Konzentration des menschlichen Choriongonadotropins in der Probe wird aus dieser Information berechnet, da das Verhältnis von markiertem und unmarkiertem HCG in beiden Fraktionen gleich ist. Die Radiolmmununtersuchungstechniken haben eine erhebliche Begrenzung des immunochemlschen Schwangerschaftstests überwunden, nämlich die der Empfindlichkeit. Radiotmmununtersuchungstechniken sind mehrtausendmal empfindlicher als die oben beschriebenen indirekten Tests und erlauben demgemäß eine Bestimmung der Schwangerschaft weit früher als den 25 bis 30 Tagen, die der Ovulation folgen, wie es mit dem Latexpartikelobjektträgertest und dem Hämagglutlnattonstest erforderlich war. Jedoch selbst hier wird die Schwangerschaft nach dem zehnten oder zwölften der Ovulation folgenden Tag mit einem Grad der Wahrscheinlichkeit von 95% durch das Radioimmununtersuchungsverfahren bestimmt und diese Tests haben den Nachteil, daß sie mehr Zeit erfordern, um den Test auszuführen, typischerweise etwa 24 bis 48 Stunden.

Jedoch der schwerwiegendste Nachteil bei allen bisher bekannten Schwangerschafts-Untersuchungstechniken umfaßt die häufige Anzeige von falschen positiven und negativen Ergebnissen. In dem Fall des immunochemlschen Schwangerschaftstests ist diese Schwierigkeit dem nicht-spezifischen Immunansprechen zuzuschreiben, ähnlich den nicht-spezifischen Antikörper-Antlgenreaktlonen. Zum Beispiel haben das Vorliegen eines gemeinsamen Hormons, der nicht-spezifischen Alpha-Untereinheit, bei dem follikelstlmulierenden Hormon (FSH), Lutelnlslerungshormon (LH), menschliches Choriongonadotropin (HCG) und Thyroidstimulierungshormon sowie eine homologe Aminosäurefolge der hormonspezlfischen Beta-Untereinheiten weitere Schwierigkeiten beim Herstellen spezifischer Antiseren zur Anwendung in den lmmunochemischen Techniken verursacht. Diese Schwierigkelten treten bei Radlolmmununtersuchungsverfahren Infolge des hohen Empfindlichkeltsgrades dieser Techniken verstärkt auf. Dieser zuletzt erwähnte Nachteil ist teilweise durch Antiseren, die für die Beta-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin spezifisch sind, umgangen worden. Diese Arbeitsweise erfordert jedoch die Verwendung von wertvollem Material, Immunisierung, Auswahl und Reinigung, um spezifische Antikörper zu erhalten, und sind deshalb zeltraubend, teuer und umständlich. Trotz dieser Maßnahme 1st das Ziel von annährend 10096 Zuverlässigkeit bei der Feststellung von Schwangerschaft durch ⁴$ Radioimmununtersuchung nicht erreicht worden.

Ferner besteht ein starker Bedarf nach Methoden zum Feststellen von Extrauterlnschwangerschaften zum frühestmöglichen Augenblick. Solche Schwangerschaften bringen negative HämagglutlnaUon- oder Latexobjektträgertests bei 40 bis 60% aller Patienten, selbst nach den der Ovulation folgenden 25 bis 30 Tagen, wie er erforderlich 1st, um diese Tests auszuführen. Es wird dabei angenommen, daß die immunochemlschen Schwanger- so Schaftsuntersuchungstechniken nur dann die Feststellung einer Schwangerschaft erlauben, nachdem die Implantation des befruchteten Eies stattgefunden hat. Alle bisher bekannten Schwangerschaftsuntersuchungsverfahren leiden an diesem Nachteil, daß sie nicht vor der Nldatlon effektiv werden. Ein Test, welcher aus Vorhandensein einer Schwangerschaft während des Zeitraums zwischen der Befruchtung des Eies und der Implantation des befruchteten Eies bestimmen könnte, würde unschätzbar sein bei der Behandlung von z. B. drohender Fehlgeburt, bei einer künstlichen Insemination und Im Zusammenhang mit neuen empfängnisverhütenden Verfahren, welche eine Schwangerschaft vor der Implantation effektiv verhindern.

Es ist deshalb die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin, Lutelnisierungshormon und dem menschlichen Choriongonadotropin ähnlichen Materlallen in einer wäßrigen Probe vorzusehen, das annähernd 10096 Zuverlässigkeit beim Bestimmen der Schwangerschaft erreicht.

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren zur Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin (HCG), lutelnlslerendem Hormon (LH) oder dem menschlichen Choriongonadotropin ähnlichem Material in einer wäßrigen Probe durch Inberührungbrlngen der Probe mil einem MIttel, das In der Lage Ist, das Hormon spezifisch zu binden und einem Mittel zum Anzeigen, ob eine Bindung stattgefunden hat, dadurch löst, daß das Mittel, das in der Lage 1st, das Hormon spezifisch zu binden, ein Plasmamembranenextrakt von dem corpus luteuin einer Tierspezies ist, die einen Rezeptor für menschliches Choriongonadotropin besitzt.

Das in diesem Verfahren verwendete Anzeigesystem Ist eines von jenen, die herkömmlich In ähnlichen

immunochemischen Verfahren zum Bestimmen von Proteinen und/oder Polypeptiden verwendet werden. Zum Beispiel ist der Indikator ein Material, welches mit dem Hormon behandelt worden ist, so daß in Gegenwart des

■ Rezeptors der Indikator verfärbt, gefärbt, agglutiniert, ausgefällt wird oder eine andere sichtbare Anzeige der Anwesenheit oder Abwesenheit des Mormons in der behandelten Flüssigkeit gibt. Vorzugsweise werden dlt genaueren radiologischen Meßtechniken verwendet. Beim Anwenden dieses Verfahrens für die Bestimmung der Schwangerschaft bei Frauen wird eine Blut- oder Urinprcbe mit dem oben angegebenen spezifischen Rezeptor Jn Berührung gebracht und die Anwesenheit oder Abwesenheit von HCG wird in der Probe bestimmt, bezogen auf den durch das Anzeigesystem angezeigten gebundenen Anteil.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren für die Bestimmung ': ίο von HCG an einer wäßrigen Probe, vorzugsweise dem Blutserum oder dem Urin einer Patientin mit vermuteter •t Schwangerschaft vorgenommen, wöbe! das Mittel zum Anzeigen, ob eine Bindung stattgefunden hat, mit einem

Radioisotop markiertes menschliches Choriongonadotropin enthält.

Bei diesem Verfahren wird das in der Probe möglicherweise vorhandene HCG und ein Teil des radioaktiv

; markierten HCG an den Rezeptor gebunden. Der Rezeptor mit dem gebundenen HCG wird dann von der

:Vj 15 wäßrigen Probe getrennt, und die Radioaktivität einer oder beider der abgetrennten Fraktionen wird gemessen,

Sf- um die Konzentration von HCG in der wäßrigen Probe zu bestimmen, wobei diese Konzentration eine Funktion

\", der gemessenen Radioaktivität ist.

μ Das markierende Isotop ist vorzugsweise das Isotop J'²⁵.

H Bevorzugt wird der Rezeptor von dei.i corpus luteum eines Säugetiers erhalten.

Es wird bevorzugt, den Rezeptor von dem corpus luteum einer Kuh, eines Schafes, eines Pferdes oder ■i Schweines zu erhalten, insbesondere von einem Tier, welches schwanger 1st und am bevorzugtesten von einem

Tier während des ersten Vierteljahres der Schwangerschaft.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung Ist ein Reagenz zur Durchführung des vorstehenden Verfahrens, das ; dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Fraktion des Plasmamembranenextraktes von dem corpus luteum einer

: 25 Tierspezies, die den Rezeptor für das Hormon menschliches Choriongonadotropin besitzt, enthält, wobei die

Fraktion in der Lage ist, biologisch aktives menschliches Choriongonadotropin spezifisch zu binden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des vorstehenden Reagenz, gekenn-

k zeichnet durch die Arbeltsgänge des Herstellens eines fein verteilten Homogenats aus geeignetem corpus

■)■ luteum-Gewebe, des Abscheidens der Plasmamembranen von dem Homogenat und des Isolierens der Plasma-

: 30 membranenfraktion, die In der Lage 1st, das biologisch aktive menschliche Choriongonadotropin spezifisch zu

binden.

Das vorliegende Testverfahen Ist auch geeignet zum Feststellen der Schwangerschaft bei Tieren. Demgemäß kann es verwendet werden, um die Schwangerschaft bei einer der Tierarten festzustellen, worin der spezifische Rezeptor der Erfindung festgestellt ist, d. h. Säugetiere und möglicherweise ausgewählte Nicht-Säugetiere.

■ ³⁵ Zur Durchführung einer erfindungsgemäßen Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin, Luteini-

sierungshormon oder menschlichem Choriongonadotropin ähnlichem Material In einer wäßrigen Probe werden normalerweise ein erstes Reagenz und ein zweites Reagenz benötigt; das erste Reagenz enthält in im wesentlichen reiner Form die spezifische Fraktion des Plasmamembranenextraktes von dem corpus luteum einer Art, die den Rezeptor für menschliches Choriongonadotropin aufweist, das In der Lage ist, biologisch aktives HCG -40 selektiv zu binden; das zweite Reagenz enthält markiertes HCG, das in der Lage Ist, Strahlung zu emittieren. Das erste Reagenz ist dazu bestimmt, mit der Probe In Berührung gebracht zu werden, die das zu messende Hormon enthält und das zweite Reagenz dazu, einen Teil des markierten und nicht markierten Hormons an den Rezeptor zu binden, wobei der Anteil des markierten Hormons, der an den Rezeptor gebunden ist, gemessen wird und die davon emittierte Strahlung eine Funktion der Konzentration des Hormons In der wäßrigen Probe 1st.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein sehr spezifisches Verfahren zur Bestimmung von HCG angegeben. Im Gegensatz zu früheren biologischen Tests, welche sich als sehr unpraktisch erwiesen haben, und zu den jüngst entwickelten Immunochemischen Tests, welche auf dem Prinzip der Antlgen-Antlkörperbindung basleren, beruht das vorliegende Verfahren auf der Verwendung eines höchst selektiven Rezeptors für HCG. Der Rezeptor wird von einem Netzgewebe eines geeigneten Tieres gewonnen, wohingegen in dem Fall lmmunochemischer Verfahren ein Antiserum von dem Blut eines geeigneten Tieres erzeugt wird, dem das Hormon injiziert worden ist, um Antigen-Antlkörperreaktion zu erzeugen.

Die Verwendung eines spezifischen Rezeptors, der von dem corpus luteum eines Tieres stammt, welches diesen spezifischen Rezeptor besitzt, überwindet offensichtlich vollständig den Nachteil nichtspezifischer Reaktionen, welche häufig im Zusammenhang mit Immunochemischen Verfahren eintreten. In den meisten Fällen erfordert die spezifische Rezeptorblndung das natürliche Strukturschema eines Hormons In seiner biologisch aktiven Form. Wenn demgemäß das Rezeptor-chemische Testverfahren mit den Anzeigetechniken der Strahlenuntersuchung kombiniert werden, ergibt sich ein Radlorezeptoruntersuchungsverfahren, welches den Grad der Ansprechempflndilchkelt der Radioimmununtersuchungstechniken besitzt und gleichzeitig den Grad der Spezlfität des Tierexperimentes, und deshalb zeigt dieses Verfahren eine weit größere Genauigkeit gegenüber allen bestehenden Immunologischen und biologischen Hormontests, Insbesondere Tests auf Schwangerschaft.

Well ferner die Rezeptor die biologisch aktive Form des Hormons für die Bindung erfordert, würde die endogene Synthese eines durch den Stoffwechsel geschädigten HCG, welches normalerweise gemäß den Immunochemischen Testverfahren eine positive Reaktion geben würde, das jedoch nicht In der Lage Ist, die Schwangerschaft durchzuhalten, keinen Anlaß zu einem falschen positiven Test gemäß dem Testverfahren der vorliegenden Erfindung geben.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Radiorezeptor-Untersuchungstechnik die Feststellung der Schwangerschaft so zeltig wie am vierten der Ovulatlon folgenden Tag. Dies stellt In der Tat einen wichtigen

Vorteil auf dem Gebiet der Schwangerschaflsbestlmmungstests dar, da bisher der Schwangerschaftszustand nicht früher als etwa am zehnten oder zwölften der Ovulation folgenden Tag entdeckt werden konnte. Dieses Ergebnis wird noch wichtiger, wenn man weiß, daß die große Vielzahl von Schwangerschaftstests heute nicht mittels des Radiolmmununtersuchungsverfahrens ausgeführt wird, welches die Bestimmung so zeitig wie zehn oder zwölf der Ovulation folgenden Tage erlaubt, sondern vielmehr mittels des Hämagglutlnations- oder Latexobjektträgertests, welcher eine Bestimmung der Schwangerschaft nur nach etwa 25 oder 30 der Ovulation folgenden Tagen erlaubt. Radloimmununtersuchungstests erfordern wenigstens 24 Stunden Arbeltszeit und typischerweise etwa 48 Stunden Prüfzelt, verbunden mit beschwerlichen und teuren Verfahren zum Herstellen ausreichend spezifischer Antikörper oder Antisera. Andererseits beläuft sich die zum Ausführen des Prüfverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung benötigte Zelt auf nicht mehr als eine Stunde und typischerweise nur etwa eine ici halbe Stunde. Die praktischen Vorteile, die sich aus einem solchen Schwangerschaftstest verfahren ergeben, welches zudem die Bestimmung des Schwangerschaftszustandes vor der Implantation des befruchteten Eies in dem endometrialen Gewebe erlaubt, sind oben kurz besprochen worden.

Aufgrund der Ähnlichkeiten des Bindemechanismus des vorliegenden Rezeptor-chemischen Testmechanismus und des bekannten immunochemischen Testmechanismus ist es möglich, die bisher entwickelten Anzeige- η mechanismen In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Demgemäß kann das Anzeigesystem aus einem Indikationsmaterial bestehen, welches mit HCG behandelt worden ist, so daß bei Anwesenheit des Rezeptors das Indikatormaterial sich verfärbt, gefärbt, agllutlnlert, niedergeschlagen wird oder ein anderes sichtbares oder chemisches Zeichen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von HCG in der wäßrigen Probe oder der zu untersuchenden Körperflüssigkeit gibt. Aus dem Obigen geht jedoch hervor, daß die wirksamsten Ergebnisse erreicht werden, wenn eine radiologische Untersuchungstechnik als das Indikatorsystem verwendet wird. Demgemäß stellt die Radiorezeptoruntersucnungs-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung klar die bevorzugteste Ausführungsform dar.

Hinsichtlich des extremen Grades der Spezlfltät und Empfindlichkeit des Radlorezeptoruntersuchungsverfahrens der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine zufrledendstellende Bestimmung von HCG mit einer äußerst kleinen Probe auszuführen. Bei der Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung als Test auf Schwangerschaft 1st es möglich, den Test unter Verwendung von nur etwa 0,1 ml des von dem Patienten genommenen Blutes auszuführen. Diese Entnahme von dem Patienten kann mittels eines einfachen Nadelstiches In das Ende eines Fingers ausgeführt werden. Ferner 1st das Verfahren der Erfindung wirksam, um das Vorhandensein von HCG in einer wäßrigen Probe zu bestimmen und demgemäß kann entweder Blutserum oder eine Urinprobe von einem Patienten zweckmäßig verwendet werden.

Der In dem Testverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete spezifische Rezeptor wird von einem ovariellen Gewebe erhalten. Wie oben dargelegt, Ist der Rezeptor wesentlich selektiver für HCG und dem Choriongonadotropin ähnlicher Materialien, als es ein Chorlongonadotropln-Antikörper ist, da der Rezeptor die natürliche Gestaltung des Hormons in seiner biologisch aktiven Form für die Bindung benötigt. Folglich gibt es keine Möglichkeit einer nichtspezifischen Immunreaktion. In allen Tieren, welche diesen spezifischen Rezeptor besitzen, ist er leicht in dem ovariellen Gewebe feststellbar, welches das Zielgewebe des Hormons darstellt. Obwohl der Rezeptor von einem Säugetier isoliert werden kann und möglicherweise von bestimmten Nicht-Säugetieren, wird bevorzugt, den Rezeptor von den Ovarien verhältnismäßig großer Tiere zu erhalten, wie beispielsweise Kühe, Schafe, Schweine, Pferde und dergleichen, hinsichtlich der Tatsache, daß diese Tiere proportional eine größere Menge von ovarleilen Gewebe haben und ferner eine leichte Versorgung von solchem Gewebe aufgrund der Tatsache besteht, daß diese Tiere kommerziell wegen Ihres Fleisches geschlachtet werden.

Vorzugsweise 1st das Tier, von welchem der Rezeptor erhalten wird, zum Zeitpunkt des Schlachtens in einem schwangeren Zustand, da zu dieser Zelt die Menge von ovarlellem Gewebe und die Anzahl von Rezeptorstellen maximal 1st. Das erste Quartal der Schwangerschaft hat sich als die vorteilhafteste Zeit zum Erhalten des Gewebes erwiesen.

Der spezifische Rezeptor der Erfindung wird erhalten durch Abtrennen von reinen Plasmamembranen von dem overiellen Gewebe, worauf die Bewertung der verschiedenen Plasmamembranenfraktionen durch Testen gegen mit Isotopen markiertes menschliches Choriongonadotropin und Auswahl der Fraktion, welche die größte Bindung für das Hormon zeigt, erfolgt. Der Rezeptor 1st äußerst stabil und kann für lange Zeiträume gelagert oder sogar in einem zweiten oder anschließenden Tesiverfahren wieder verwendet werden. Das genaue Verfahren zum Erhalten des Rezeptors 1st im folgenden ausführlicher beschrieben.

Da das Testverfahren der Erfindung nicht artspezifisch ist, kann es auch verwendet werden, um Schwangerschaft bei Tieren zu ermitteln, von welchen festgestellt ist, daß sie den spezifischen Rezeptor der Erfindung besitzen. Selbst wenn somit der Rezeptor, der spezifisch für HCG in Menschen und lutelnlsierendem Hormon In Menschen und Tieren ist, ist er auch in der Lage, dem menschlichen Choriongonadotropin ähnliche Proteine selektiv zu binden, welche in Tieren eine Rolle entsprechend dem menschlichen Choriongonadotropin in Menschen spielen, d. h. sie entsprechen dem Choriongonadotropin des Menschen. Der Vorteil davon besteht darin, daß Standardlaboratoriumstesttiere, wie beispielsweise Affen, Hunde, Kaninchen, Mäuse etc., durch dieses Verfahren getestet werden können, wohingegen getrennte Antikörper für jedes Tier gemäß dem immunchemischen Testverfahren benötigt würden.

Die Markierung des menschlichen Choriongonadotroplns mit einem radioaktiven Isotop kann auf die herkömmliche Welse mit einem geeigneten, für diesen Zweck ausgewählten Isotop, z. B. von J^IJ1, C¹⁴, H³ und dergleichen, ausgeführt werden. Ein besonders geeignetes Isotop 1st ein radioaktives Isotop von Jod, insbesondere J^u\ aufgrund der Tatsache, daß die Markierung mit diesem Isotop verhältnismäßig einfach 1st und viele Laboratorien die notwendige Einrichtung besitzen, um dieses Isotop zu messen.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Beschreibung beispielsweiser Verfahren zum Herstellen der Testreagenzien und zur Anwendung der Radiorezeptoruntersuchung näher erläutert.

I. Radioisotopische Markierung des Hormons

Hochgereinigtes menschliches Choriongonadotropin (enthaltend 12 000 I. E./mg) wurde für den Test verwendet. Das menschliche Choriongonadotropin wurde mit J^l!! durch Verwendung von Lactoperoxldase, hergestellt aus Milch (RZ = 0,78) markiert. Zwei mCI von J¹" in 20 μΐ von 0,1 m-Natrlumacetatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 wurden In einem Reagenzglas mit 25 μg menschlichem Choriongonadotropin gemischt. Eine Teilmenge von 50 ng Lactoperoxidase in 20 μΐ und 200 mg von H₂O₂ 10 μΐ Wasser wurden dann dem Reagenzglas zugesetzt. Drei Teilmengen von 100 ng H₂O₂ wurden dann In Abständen von 5 Minuten zugesetzt. Nach 20 Minuten wurde die Reaktion durch den Zusatz von 0,5 ml 0,15 m-NaCl, enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA), mit einem pH-Wert von 7,0 beendet. Das markierte Hormon wurde dann durch Gelfiltrlerung auf einer 1 χ 30-cm-Säule von dem Jod abgeschieden, eingestellt mit 0,15 n-NaCl, enthaltend 1% von BSA mit einem pH-Wert von 7,0. Die spezifische Aktivität des markierten menschlichen Choriongonadotroplns wurde durch Ausfällung mit Trlchloresslgsäure bestimmt. 5 μΐ des rohen Reaktionsgemisches wurde mit 0,05 m-Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,5, enthaltend 0,1% BSA, auf 5 ml verdünnt. Einer 200 μΙ-Teilmenge dieser Lösung wurden 400 μΐ Trichloresslgsäure zugesetzt, so daß eine Konzentration von 10% Trlchioressigsäure erhallen wurde. Die ausgefällten Proteine wurden durch Zentrifugleren wiedergewonnen. Die mit dem Niederschlag verbundene Radioaktivität wurde als proteingebunden betrachtet und wurde zur Berechnung der spezifischen Aktivität des markierten Hormons verwendet. Das rohe Reaktionsgemisch wurde durch Gelfiltrierung durch eine 1 x30-cm-Säule gereinigt, eingestellt mit \% BSA In 0,996 NaCl. Die spezifische Aktivität des bei der Radiorezeptoruntersuchung verwendeten Choriongonadotroplns betrug 20 bis 30 \iCWng. Die biologische Aktivität des In dem Test verwendeten markierten menschlichen Choriongonadotroplns, bestimmt durch ovarielle Ascorblnsäureverarmungsuntersuchung, betrug 8,923 I. E./mg mit 95% Zuverlässigkeitsgrenzen von 5,826 bis 12 250 I. E./mg.

II. Herstellung des Rezeptors

Alle Vorgänge bei der Herstellung von Plasmamembranen wurden in einem Eisbad oder bei 4° C ausgeführt. Frische Rinderovarien von zeltiger Schwangerschaft (erstes Quartal: Fötuslänge von Kopf bis Steiß bis zu 22 cm) wurden von einem Schlachthaus erhalten und in flüssigem Stickstoff bis zur Verarbeitung gelagert. In einem typischen Experiment wurden 100 g Gewebe von etwa 25 großen corpore lutea mit einer scharfen Stahlklinge In kleine Stücke geschnitten und in 500 ml 10 mM-Trls-HCl-Puffer eines pH-Wertes von 7,8 gemahlen, enthaltend 1 mM MtCl₂, 1 mM Dlthiothreit, 10 000 I. E. Trasylol pro Liter und 0,25 m-Saccharose. Das Homogenat wurde durch zwei Schichten Seihtuch gefiltert und die größeren Partikel wurden in 500 ml des Puffers wieder verarbeitet. Das Gewebe wurde welter homogenisiert durch 10 bis 15 Hübe in einem Teflon-Glashomogenlslerapparat, Typ C mit einer Spielraumgröße von 0,12 bis 0,17 mm bei 4° C. Das Homogenisat wurde bei 650 g 20 Minuten lang in einer gekühlten Servallzentrifuge zentrifugiert, um intakte Zellen, Zellbruch und Kerne zu entfernen. Die bei 650 g oben stehende Flüssigkeit wurde wieder bei 13 000 g 20 Minuten lang in derselben Zentrifuge zentrifugiert. Die oben stehende Flüssigkeit wurde diesmal weggeschüttet und der Niederschlag wurde in 50 bis 70 ml des Trls-HCl-Puffers mit Hilfe des Teflon-Glashomogenlsierungsgerätes wieder suspendiert. Diese Suspension wurde in den Kern eines Zonenrotors eingespritzt, der bei 3000 U/mln lief und 500 ml Saccharose mit einem linearen Gradienten von 30% (w/v) bis 50% (w/v) Sacharose und ein 120 ml-Polster von 50% (w/v) Saccharose (Pumpgeschwindigkeit 20 ml/mln) enthielt. Eine Abdeckung von 20 ml wurde nach der Probe eingespritzt. Zwei Stunden nach der Zentrlfugierung bei 45 000 U/min wurde die Zentrifuge abgebremst und der Rotorinhalt mit 55% Saccharose mit 20 mi/min ersetzt. Die Plasmamembranen wurden von dem Rotor in der Reihenfolge der zunehmenden Partikelgröße abgenommen und Fraktionen von 12 ml wurden gesammelt und unverzüglich gefroren, bis sie aufbindende und enzymatlsche Aktivität untersucht wurden. Membranen wurden bis zu drei Monaten gefroren gehalten ohne sichtbaren Verlust der Bindungsfähigkeit. Teilproben der Fraktionen wurden vor dem Gefrieren zur elektronischen Mikroskopie entnommen. Die in der Suspension enthaltene Saccharose störte nicht die Bindung des markierten menschlichen Choriongonadotroplns.

Teilmengen von ovariellem Homogenisat und geeignete Teilmengen der von dem kontinuierlichen Saccharosedichtegradlenten erhaltenen verschiedenen Fraktionen wurden in 1 m-NaOH gelöst, das 0,1% Natriumdodecylsulfat enthielt, um den Proteingehait durch das Verfahren von Luwry (3. Βίοι. Chern., Band 193, Seite 265, 1951) unter Verwendung des Rinderserumalbumins als Norm zu bestimmen. Teilmengen der verschiedenen Fraktionen wurden auch mit menschlichem Choriongonadotropin kombiniert, das mit J¹²⁵ markiert war, und dann wurde der Grad der Bindung in jedem Fall gemessen. Auf der Basis der Proteinkonzentration zeigten die Plasmamembranen, die einen spezifischen Rezeptor für das markierte menschliche Choriongonadotropin enthielten, eine lOfach größere Bindung als das rohe overielle Homogenisat.

Jede Fraktion wurde auch auf Verunreinigung durch Ermitteln ihrer enzymatischen Aktivität analysiert. Jede Fraktion wurde auf 5'-Nucleodiase-Aktivltät, durch das Verfahren von Song et al (3. Blol. Chem., Band 262, Seite 694, 1967) und das freigesetzte anorganische Phosphat durch das Verfahren von Fiske et al (J. Blol.

Chem., Band 66, Seite 375, 1925) untersucht. Cytochrom C-Reductase wurde nach dem Verfahren von Cooperstein et al untersucht (J. Bioi. Chem., Band 189, Seite 665,1951).

Als weitere Probe bezüglich der Reinheit der Plasmamembranen wurden die einzelnen Fraktionen der Elektronenmikroskopie unterzogen. Eine Teilmenge von jeder Proteinfraktion wurde 24 Stunden lang in 6,25% Glutaraldehyd in 0,067-m-Cacodylat-Puffer eines pH-Wertes von 7,3 gemischt. Die Proben wurden 5 Minuten lang in gekühltem 0,25-m-Cacodylat- oder Phosphatpuffer gewaschen, der 1% OsO₄ eines pH-Wertes von 7,3 für 2 Stunden enthielt. Anschließend wurden alle Proben durch Fließenlassen durch eine gestufte Reihe von Alkohol entwässert und entweder in Epon oder Araldite eingebettet. Abschnitte von 0,06 bis 0,09 mm wurden geschnitten und in einer 4% wäßrigen Uranylacetat-Lösung gefärbt und durch ein Elektronenmikroskop

photographlert.

Die Fraktion, die die höchste Bindung mit dem markierten menschlichen Choriongonadotropin zeigt, eine niedrige Enzymaktivität und reine Plasmamembranen enthielt, wie durch Elektronenmikroskopie gezeigt, wurde bei einer Saccharosedichte von 1,16 (es. 35% w/v) definiert. Geeignete Teilmengen dieser Fraktion wurden In flüssigen Stickstoff gelagert und als Rezeptor verwendet.

III. Verfahren der Radiorezeptoruntersuchung

Die Radlorezeptoruntersachung wurde In 10 75 ml-Polystryrolrohren gemäß dem In Tabelle I angegebenen Ansatz ausgeführt.

Tabelle I

Verdünnungsmittel') Plasma- J'"-menschliches

Probe	Verdünnungsmittel')	:50)	Plasma-	J'"-menschliches
		membranen-	Choriongonadotropin ²)
		protein: 40 μg
Blindprobe	100 μΐ	100 μΐ	100 μΐ
HCG ³) (ng/ml)
3,0	100 μΐ	100 μΐ	100 μΐ
6,2	ΙΟΟμΙ	100 μΐ	100 μΐ
12,5	100 μΐ	100 μΐ	100 μ]
25,0	100 μΐ	100 μΐ	100 μΐ
50,0	100 μΐ	100 μΐ	100 μ!
100,0	100 μΐ	100 μΐ	100 μΐ
Plasma	100 μΐ	100 μΐ	100 μΐ
(verdünnt 1:2 bis 1

') 10 mM. Tris-HCl Puffer eines pH-Wertes von 7,2, enthaltend 0,1% BSA, 1 mM. CaCl₂ und 28 I.E. Tresylol
pro Rohr.

²) Annäherad (1,5 ng = 50 000 cpm)

³) 12 000 I.E. pro ng (7).

Die Inkubation wurde 30 Minuten lang bei 37° C In einer Dubenoff-Wasserbadeschüttelvorrlchtung ausgeführt. 1 ml gekühltes Verdünnungsmittel wurde dann jedem Rohr zugesetzt. Die Inhalte der Rohre wurden In einem Mischgerät-gemischt und 20 Minuten lang bei 3000 g in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert. Die oben stehende Flüssigkeit wurde abgesaugt und der Niederschlag wurde in einem Autogammazähler zu einem Wirkungsgrad von 51% für J¹²⁵ gezählt. Die Standardkurven und die hormoneile Konzentration in den Plasmaproben wurden durch einen zeltteilenden IBM-Computer unter Verwendung von Loglt-log-Transformationen berechnet.

Eine Loglt-log-Linerarislerung der kompetltlven Inhibitionsreaktion der Radiorezeptoruntersuchung von menschlichem Choriongonadotropin 1st In der Figur der beigefügten Zeichnung dargestellt. Die Empfindlichkeit der Untersuchung war geringer als 3,0 ng/ml mit einer Genauigkeit von ± 10%. Die Zwischenuntersuchungsvariationen, bestimmt durch das Untersuchen einer Plasmasammelstelle bei verschiedenen Verdünnungen in zwölf Untersuchungen waren ± 5% bzw. ± 15% durch den Bereich der Untersuchung, was somit den Beleg der hohen Reproduzierbarkeit ergibt. Die Plasmaprobe einer schwangeren Frau zeigte Dosenansprechbarkelt, iden tisch zum HCG-Standard, was die Zuverlässigkeiten der Untersuchung bestätigte. Es gab einen vollständigen Mangel an Querreuktion mit hochgereinigten Präparaten von FSH, PRL und HPL, als auch Plasma von hypothyrolden Objeken, Akromegalien und Frauen während postpertualer Lactation, was eine hohe Spezifltät der Radiorezeptoruntersuchung anzeigt. Die Radiorezeptoruntersuchung unterschied nicht zwischen menschlichen Choriongonadotropin und luteinisierendem Hormon, jedoch eine Radioimmununtersuchung unter Verwendung von J¹²⁵ markierten FSH, LH und HCG und Antikörper zu deren hdrmonspezlfischen Beta-Unterelnhe'.ten haben gezeigt, daß es während der frühen Schwangerschaft keinen Anstieg in den Plasmapegeln von LH und FSH gibt. Somit beeinträchtigt der Mangel an Unterscheidung zwischen HCG und LH nicht die Bestimmung der Schwangerschaft, wenn die Radiorezeptoruntersuchung verwendet wird.

IV. Klinische Tests

100 Frauen, die für die ersten erwarteten Menstruationen überfällig waren, waren potentielle Kandidaten für Miniarborte, und es wurden Blutproben für die Radiorezeptoruntersuchung genommen und 24 Stunden ihr Urin gesammelt für den Agglutinationstest (Pregnosticon-Drl-Dot-Test). Physikalische und Beckenuntersuchungen, Änderungen in der Uteringröße und -konsistenz und andere Symptome einer möglichen Schwangerschaft wurden bewertet. Wenn die Radiorezeptoruntersuchung positiv war, ungeachtet eines positiven oder negativen

Pregnosticontestes, wurde ein Miniarbort ausgeführt. Alle Proben wurden an das pathologische Laboratorium geschickt, um das Vorhandensein von Schwangerschaft zu bestätigen. Drei Patienten abortierten spontan und drei, die ektopische Schwangerschaft entwickelten, werden getrennt besprochen. Die Blutproben wurden bei 2500 U/mln bei 40° C 15 Minuten lang zentrifugiert, und das Plasma oder Serum wurde bis zur Verwendung bei -20° C gespeichert.

Die Radiorezeptoruntersuchung auf menschliches Choriongonadotropin Im Bl.it wurde 77mal für 72 Patienten ausgeführt, um das Vorhandensein von früher Schwangerschaft zu bestimmen. Die Genauigkeit des Testes wurde durch Vergleichen desselben mit dem Pregnostlcon-Drl-Dot-Test bestimmt, das Vorhandensein von Schwangerschaft wurde durch die histopathologische Untersuchung von endometrialen Proben bestätigt, erhalten bei selektivem oder spontanem Abort. Die gewöhnlichen klinischen Kriterien, z. B. die Vergrößerung des Uterus oder das Aussetzen der Menstruation, bestätigte die Genauigkeit der Radiorezeptoruntersuchung weiterhin.

•41 Patienten zeigten eine negative Radiorezeptoruntersuchung, und ein falsches positives Pregnostlconergebnis war mit dieser Gruppe verbunden. Alle 41 Frauen wurden durch weitere klinische Beobachtung als nicht schwanger bestätigt.

in 14 Fäiien von Abüii besiäügte die pathologische Diagnose des entnommenen Gewebes das F.rgebnls der Radiorezeptorunteruchung. 7 der 14 Miniaborte, die declduales oder plazentuales Gewebe demonstrierten, welche die Schwangerschaft bestätigte, hatten eine positive Radiorezeptoruntersuchung, aber negativen Pregnosticontest.

Der Pregnosticontest war auch nicht empfindlich genug, um die frühe Schwangerschaft festzustellen, wohingegen die Radiorezeptoruntersuchung in der Lage war, eine Schwangerschaft innerhalb von vier auf die Ovulation folgenden Tagen zu bestimmen und erwies sich von großem Wert in Fällen von drohendem Abort. Vier zeitige drohende Aborte innerhalb der ersten 7 Wochen einer Schwangerschaft zeigten positive Rezeptoruntersuchungen bei gleichzeitig negativen Pregnosticontests. Die Patienten abortierten in jedem Fall spontan und der Uteringehalt erholte sich, wie durch chorionisches Gewebe angezeigt. In den 4 Schwangerschaften, welche in spontantem Abort endeten, setzte s*ch die Verfärbung 10 bis 14 Tage fort und der Uterus war für die Dauer der Schwangerschaft nicht genügend vergrößert, was eine Abnormalltät in dem Wachstum und der Entwicklung des Embryos und der Plazenta nahelegte.

Von 20 Frauen, die die Fertilitätsklinik aufsuchten, wurden während des menstrualen Zyklus tägliche Blutproben entnommen, für die Bestimmung von FSH und LH durch Radioimmununtersuchung. Auf der Basis von BBT, Plasmapegeln von FSH und LH, urinärer Ausscheidung von Östrogen und Progesteron und charakteristischen Änderungen in dem cervlkalen Schleim als Beweis der Ovulation wurden diese Frauen als schwanger bezeichnet. Die Blutproben von 4 dieser Frauen, die schwanger waren, wurden analysiert, um die Pegel von menschlichem Choriongonadotropin durch die Radtorezeptoruntersuchung und die Pegel von FSH und LH durch Radioimmununtersuchung am Tag der Ovulation und während zeitiger Schwangerschaft festzustellen. Der Tag der Ovulation bei diesen 4 schwangeren Frauen wurde anschließend durch die Bestimmung von FSH und LH im Blut bestätigt. Eine Gesamtzahl von 15 normalen Schwangerschaften wurde während des die Ovulation und frühe Schwangerschaft umfassenden Zeitraumes getestet. Eine Zusammenfassung aller behandelten Frauen ist in Tabelle II dargelegt.

Tabelle II

Nr.	den ausbleibenden Menstruationen folgende Tage	Radio rezeptoruntersuchung Blut	Agglutinations- Test - Urin
Miniaborte
3	8 bis 11	+	+
8	6 bis 14	+	-
5*)	1 bis 11	-	-
normale Schwangerschaften
8	14 bis 33	+	+
7	0 bis 42	+	-
mögliche Ektopien
1 1	14	⁺	-
Spontaner Abort
3	5 bis 17	+
nicht schwanger
43 1	0 bis 40	-	+

*) Nicht-Schwangerschaften zweimal berichtet

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin (HCG), lutelnlsierendem Hormon (LH) oder aem menschlichen Choriongonadotropin ähnlichem Material In einer wäßrigen Probe durch Inberührungbringen der P.obe mit einem Mittel, das in der Lage ist, das Hormon spezifisch zu binden und einem Mittel zum Anzeigen, ob eine Bindung stattgefunden hat, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel, das in der Lage ist, das Hormon spezifisch zu binden, ein Plasmamembranenextrakt von dem corpus luteum einer Tierspezies ist, die einen Rezeptor für menschilches Choriongonadotropin besitzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Anzeigen, ob eine Bindung ίο stattgefunden hat, mit einem Radioisotop markiertes menschliches Choriongonadotropin enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Isotop J¹²⁵ ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor von dem corpus luteum eines Säugetiere erhalten wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor von dem corpus luteum eines Schafes, eines Schweines, eines Pferdes oder insbesondere einer Kuh erhalten wird.

6. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Fraktion des Plasmamembranenextraktes von dem corpus luteum einer Tierspezies, die den Rezeptor für das Hormon menschliches Choriongonadotropin besitzt, enthält, wobei die Fraktion in der Lage 1st, biologisch aktives menschliches Choriongonadotropin spezifisch zu binden.

7. Verfahren zur Herstellung des Reagenz gemäß Anspruch 6, gekennzeichnet durch die Arbeitsgänge des Herstellens eines fein verteilten Homogenats aus geeignetem corpus luteüm-Gewebe, des Abscheidens der Plasmamembranen von dem Homogenat und des Isolierens der Plasmamembranenfraktion, die in der Lage ist, das biologisch aktive menschliche Choriongonadotropin spezfisch zu binden.