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DE2558088C2 - Verfahren zur Herstellung von 4-Androsten-3,17-dion-Derivaten - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 4-Androsten-3,17-dion-Derivaten

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Publication number
DE2558088C2
DE2558088C2 DE2558088A DE2558088A DE2558088C2 DE 2558088 C2 DE2558088 C2 DE 2558088C2 DE 2558088 A DE2558088 A DE 2558088A DE 2558088 A DE2558088 A DE 2558088A DE 2558088 C2 DE2558088 C2 DE 2558088C2
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DE
Germany
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androstene
methyl
dione
cholesten
culture
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DE2558088A
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English (en)
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DE2558088A1 (de
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Ulrich Dr. Eder
Mario Dr. Kennecke
Rudolf Dr. Müller
Alfred Dr. Weber
Rudolf Prof. 1000 Berlin Wiechert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Schering AG
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Publication date
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Description

worin X die obengenannte Bedeutung besitzt
und R| ein WasserstolTatom, eine Methylgruppe oder eine Äthylgruppe bedeutet, mit einer Kultur der Species Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 fermentiert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man der Fermentationskultur das Sterin-Derivat in emulgierter und mikronisierter Form zusetzt.
Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen gekennzeichnete Verfahren.
Geeignete Ausgangsverbindungen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise solche Sterine der allgemeinen Formel II, in denen der Substituent X ein ocr-Fluoratom, eine oa-Methylgruppc, eine 6aja- oder h/fJjtf-Methylengruppe. eine 7i/-Methylgruppe oder eine 7/?-Methylgruppe bedeutet. Als geeignete Ausgangsverbindungen seien beispielsweise genannt: Das 6a-Fluor-4-cholesten-3-on, das 6ff-Methyl-4-cholesten-3-on, das 7ü-Methyl-4-cholesten-3-on, das 7>Methyl-4-cholesten-3-on, das oo-FluoM-stigmastenO-on, das 6a-Mcthyl-4-stigmasten-3-on, das 7a-Methyl-4-stigmasten-3-on, das 7/?-Methyl-4-stigmasten-3-on, das 6cr-Fluor-4-campesten-3-on, das öa-MethyM-campestenO-on, das 7a-Methyl-4-campesten-3-on, das 7/?-Methyl-4-campe- «ten-3-on oder die entsprechenden Sitosterinderivate.
Zahlreiche Zoo- und Phytosterine (wie zum Beispiel das Cholesterin, das Stigmasterin, das Campesterin, das Brassicasterin oder die Sitosterine) sind in der Natur weit verbreitet und somit leicht zugängliche Rohstoffe für die Synthese pharmakologisch wirksamer Steroide. Es wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, den Abbau der Sterine so zu lenken, daß bei der Fermentation ein weiterer Abbau des gebildeten 4-Androsten-3,17-dions und des l,4-Androstadien-3,17-dions verhindert wird.
So gelang es beispielsweise Marsheck et. al. (Appl. Microbiol. 1972,72 ff) den weiteren Abbau von 1,4-Androstadien-3,17-dion und von 4-Androsten-3,17-dion dadurch zu verhindern, indem sie zur fermentativen Llmwandlung der Sterine mutierte Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium verwendeten. Die gezüchteten Mutanten haben aber den Nachteil, daß sie nur eine begrenzte Fähigkeit besitzen, aus Sterinen 1,4-Androstadicn-3.17-dion oder 4-Androsten-3,17-dion zu bilden.
Hiiki ct. al. (Atta Microbiol. Acad. Sei. llung., 22, 1975,447) gelang es 3-Methoxy-cholesterin /u 3-Methoxy-5-androstcn-17-on ab/ubaucn. Die dabei erzielten Ausbeuten an Verfahrensprodukt war aber ebenfalls unbefriedigend.
Bu Verwendung der Ausgangsverbindungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die Seitenkette von in 3-Position substituierten Sterin-Derivaten unter Erzielen wesentlich höherer Ausbeuten abzubauen, wie aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich ist.
Fundstelle Substiat Substr. Ferm. Produkt Ausbeute
Konz. Zeit % d. Th.
Marsheck1) Cholesterin lg/1 ca. 170 Π 4-Androsten-3,l 7-dion 31%
Sitosterin lg/1 ca. 170 h 4-Androsten-3,17-dion 39%
Bükr) 3-Methoxycholesterin 0,2 g/l 72 h S-Methoxy-S-androsten- 20%
17-on
Erfindung
Beispiel 1 6a-Fluor4-cholesten- 0,5 g/l 56 h 6a-Fluor-4-androsten- 56%
3-on 3,17-dion
Beispiel 3 Ta-M ethyl-4-cholesten- lg/1 96 h 7a-Methyl-4-androsten- 52%
3-on 3,17-dion
Beispiel 4 off-MethyW-cholesten- lg/1 96 h 6a-Methyl-4-androsten- 52%
3-on 3,17-dion
1I Appi. Microbiol. 1972, 72 (T 3I Acta Microbiol. Acad. Sic. Hung. 22, 1975, 447
20
Das erfindungsgemäße Verfahren kann unter den gleichen Fermentationsbedingungen durchgeführt werden, die man auch bei den bekannten mikrobiologischen Seitenkettenabbau-Reaktionen von Sterinen anwendet.
Unter den üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften, Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man den Kulturen das Substrat (in einem geeigneten Lösungsmittel oder vorzugsweise in emulgierter Form) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist.
Geeignete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Ethanol, Glykolmonomethylether. Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid. Die Emulgierung des Substrats kann beispielsweise bewirkt werden, indem man dieses in mikronisierter Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie Methanol, Ethanol, Aceton, Glykolmonomethylether, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid) gelöst unter starker Turbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält, eindüst. Geeignete Emulgationshilfen sind nichtionogene Emulgatoren, wie zum Beispiel Ethylenoxyaddukte odei Fettsäureester von Polyglykolen. Als geeignete Emulgatoren seien die handelsüblichen Netzmittel Tegin®, Tagat*, Tween® und Span * siehe hierzu Römpps Chemie-Lexikon, Franckh'sche Verlagshandlung, Stuttgart, 7. Auflage, 1977, Seite 3479, 3456, 3711 und 3268 beispielsmäßig genannt.
Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer ist von der Struktur des verwendeten Substrates abhängig. Diese GröCsn müssen, wie dies bei mikrobiologischen Steroidumwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren 4-Androsten-3,17-dion-Derivate der allgemeinen Formel 1 sind wertvolle Zwischenprodukte zur Synthese pharmakologisch wirksamer Steroide.
So kann man beispielsweise die 17-Ketogruppe der 4-Androsten-3,17-dion-Derivate, gegebenenfalls nach Ketalisierung der 3-Oxo-gruppe reduzieren oder mit einer metallorganischen Verbindung der allgemeinen Formel III
MeR2
(III)
worin R2 einen niederen gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest darstellt und Me ein Alkali metallatom oder ein Magnesiumhalogenidrest bedeutet, umsetzen und erhält nach Abspaltung der gegebenenfalls vorhandenen Ketalgruppe, die lT/f-Hydroxy^-androsten-S-on-Derivate der allgemeinen Formel IV
OH
(IV)
worin X die obengenannte Bedeutung besitzt und R3 das gleiche wie R2 bedeutet oder ein Wasserstoffatom darstellt.
Unter einem niederen gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest R2 soll vorzugsweise ein Methylrest, ein Äthylrest, ein Vinylrest oder ein Äthinylrest verstanden werden.
Die Reduktion der 17-Ketogruppe der 4-Androsten-3,17-dion-Derivate der allgemeinen Formel I erfolgt mittels der dem Fachmann wohlbekannten Arbeitsmethode (siehe zum Beispiel John Fried: Organic Reactions in
4(1
M)
Z? Steroid Chemistry-van Nostrand Reinhold Comp. New York etc. 1972, Volume l,Seite61 ff). So kann man diese
^ Verbindungen beispielsweise nach Ketalisierung mit Natnumborhydnd oder Lithiumaluminiumhydnd umset-
!* zen und erhält nach Spaltung der Ketale die entsprechenden 17j8-Hydroxy-4-androsten-3-on-Derivate der allge-
I- meinen Formel III, welche bekanntlich eine anabole und/oder androgene Wirksamkeit besitzen.
s Ebenso bekannt sind die Methoden, die 17-Ketogruppe zu alkylieren (siehe zum Beispie! John Fried: Organic Reactions in Steroid Chemistry- van Nostrand Reinhold Comp., New York etc. 1972, Volume 2 Seite 53 (T). So kann man die 4-Androsten-3,17--dion-Derivate der allgemeinen Formel I gegebenenfalls nach Ketalisierung der 3-Oxo-gruppe beispielsweise mit Alkylmagnesiumhalogeniden, Vinyllithium oder Alkalimetallacetyliden umsetzen und erhält nach Spaltung der gegebenenfalls vorhandenen Ketalgruppen die 17eR-17jS-hydroxy-4-m andr>sten-3-on-Derivate der allgemeinen Formel III, welche bekanntlich pharmakologisch wirksame Substanzen sind oder Zwischenprodukte zur Herstellung von pharmakologisch wirksamen Steroiden.
Die als Ausgangsverbindungen verwendeten Sterin-Derivate der allgemeinen Formel II können aus den entsprechenden Sierinen mittels der Methoden hergestellt werden, welche man konventionellerweise zur Einführung der entsprechenden 6- und/oder 7-ständigen Substituenten in Steroide anwendet.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
v,
Beispiel 1
Ein 750 ml Erlenmeyerkolben wi:ii mit 200 ml einer sterilen Nährlösung, enthaltend 1% Hefeextrakt, 0,45% 2« Dinatriumhydrogenphosphat, 0,34% Kaliumdihydrogenphosphat und 0,2% Tween® 80 - eingestellt auf pH = 6,7 - beschickt, mit einer Abschwemmung einer Mycobacterium spec. NRRL-B-3805 Kultur beimpft und 3 Tage lang bei 3O0C mit 190 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
Ein 501 Fermenter mit 401 steriler Nährlösung, enthaltend 1,23% Hefeextrakt, 0,68% Kaliumdihydrogenphosphat und 0,2% Tween® 80 - eingestellt auf pH = 6,0 - wird mit 200 ml der Mycobacterium spec. Anzuchtskultur beimpft und 48 Stunden lang unter Belüften (2 m3 pro Stunde) bei 300C inkubiert.
Ein 501 Fermenter mit 401 Nährlösung, enthaltend 2,0% Corn steep liquor, 0,3% Diammoniumhydrogenphosphat und 0,25% Tween® 80 - eingestellt auf pH = 6,5 - wird zur Induktion mit 5 g 6a-Fluor-4-choIesten-3-on versetzt und 24 Stunden lang unter Belüften (2 m3 pro Stunde) und Rühren (200 Umdrehungen pro Minute) bei 300C inkubiert.
.-ο Dann setzt man der Kultur eine sterilfiltrierte Lösung von 20 g 6«-Fluor-4-cholesten-3-on in 150 ml Dimelhylformamid zu und fermentiert weitere 56 Stunden lang unter Rühren und Belüften bei 300C.
■ Nach erfolgter Fermentation wird die Kultur dreimal je 51 Äthylenchlorid extrahiert, die Extrakte im Vakuum
eingeengt, der Rückstand über eine Kieselgelsäule gereinigt und man erhält nach Umkristallisation aus Diisopropyläther 8,7 g 6a-Fluor-4-androsten-3,17-dion vom Schmelzpunkt 229-231°C.
Herstellung des Ausgangsmaterials
a) 60 g Sjg-Hydroxy-S-cholesten werden in 360 ml abs. Tetrahydrofuran und 120 ml Methylenchlorid bei Eiskühlung mit 60 g N-Bromsuccinimid versetzt und anschließend portionsweise 120 ml Pyridin: Fluorwasser-
4(J stofT-Reagenz (70%ig) zugegeben. Es wird 1 Stunde bei Kühlung nachgerührt und dann in Eiswasser/
Kaliumcarbonat eingerührt. Nach Ätherextraktion wird das erhaltene Rohprodukt an Silicagel chromatographiert aus Methanol umkristallisiert und man erhält 40,8 g S-Brom-ojß-fluor-Sir-cholestan-Sjß-ol vom Schmelzpunkt 114,5-1160C.
b) 30 g S-Brom-ojS-fluor-Sff-cholestanO/f-ol werden in 730 ml Aceton gelöst und bei 10°Cmit24,l ml Chrom-■»> schwefelsäure (hergestellt aus 267 g Chrom(VI)-oxid, 400 ml Wasser, 230 ml konz. Schwefelsäure a. d.
1000 ml mit Wasser) versetzt. Es wird 15 Minuten bei 100C nachgerührt, in Eiswasser eingerührt, der Niederschlag abfiltriert und in Methylenchlorid aufgenommen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wird das erhaltene Rohprodukt in 290 ml Essigsäure gelöst, 3 Stunden bei 300C gerührt, dann 4,65 g Natriumacetat zugesetzt und weitere 15 Minuten bei -3O0C gerührt. Es wird dann in Eiswasser gefallt, der Niederschlag abfiltriert und in Methylenchlorid aufgenommen. Der nach dem Eindampfen erhaltene Rückstand wird an Silicagel chromatographiert, aus Methanol umkristallisiert und man erhält 14,5 g 6ar-Fluor-4-cholesten-3-on vom Schmelzpunkt 111 — 115°C.
In der gleichen Weise läßt sich das 5-Stigmasten-3^S-ol in das 6ir-Fluor-4-stigmasten-3-on überfuhren.
^ Beispiel 2
20 g 6a-FIuor-4-stigmasten-3-on (91,5%iges Rohprodukt) werden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen mit einer Mycobacterium spec. NRRL-3805 Kultur umgesetzt und man erhält 6,1 g 6a-Fluor-4-androsten-3,17-dion vom Schmelzpunkt 228-231°C.
Beispiel 3
Hin 2 I Hrlcnmeycrkolbcn mil 500 ml sterilem Nährmedium, enthaltend 1% Hefeextrakt,0,45% Dinalriumhydrogcnphosphat,0,34% Kaliumdihydrogenphosphat und 0,2% Tween® 80 - eingestellt auf pll = 6.7 - wird mit (o einer Suspension einer Mycobacterium spec. NRRL B-3805 Trockenkultur beimpft und drei Tage lang bei 300C mit 190 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
20 Erlenmeyerkolben mit jeweils 100 ml sterilen Nährmediums, enthaltend 2,0% Corn steep liquor, 0.3% Diammoniumhydrogenphosphat und 0,25% Tween® 80 - eingestellt auf pH =6,5 - werden mit jeweils 5 ml der
Mycobacterium spec. Anzuchtskultur beimpft und 24 Stunden lang bei 30°C mit 220 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
Dann setzt man jeder Kultur 100 mg 7a-Methyl-4-cholesten-3-on in 5 ml Dimethylformamid gelöst zu und fermentiert weitere 96 Stunden lang.
Die vereinigten Kulturen werden mit Äthylenchlorid extrahiert, der Extrakt im Vakuum eingeengt, der Rückstand durch Chromatographie über eine Kieselgelsäule gereinigt und man erhält nach Umkristallisation aus Diisopropyläther 0,8 g 7o-Methyl-4-androsten-3,17-dion vom Schmelzpunkt 193-194°C.
Herstellung des Ausgangsmaterials
30 g Cholesterin, 34,29 g Lithiumbromid und 34,3 g Lithiumcarbonat werden in 525 ml Dimethylformamid suspendiert, anschließend auf 75-800C (Innentemperatur) erhitzt und innerhalb von 45 Minuten mit 7,95 ml Brom in 170 ml Dioxan tropfenweise versetzt. Es wird 2 Stunden nachgerührt, anschließend in 3 1 Wasser eingerührt, 30 Minuten nachgerührt, bei Eiskühlung mit Eisessig bis pH = 4 angesäuert und mit Essigester extrahiert. Die Extrakte werden mit haibgesättigter Kochsalzlösung neutral gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert.
Man erhält 34,4 g Rohprodukt, das durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt wird. Die anschließende Kristallisation aus Methanol liefert 25,6 g 4,6-Cholastadien-3-on vom Schmelzpunkt 80-82,50C.
Aus 7 g Magnesiumspänen, 275 ml Äther und 6,26 ml Methyljodid bereitet man sich in der üblichen Weise eine ätherische Methylmagnesiumjodid-Lösung.
Nach der Umsetzung werden unter gleichzeitigem Abdestillieren des Äthers 550 ml abs. Tetrahydrofuran zugetropft, bis die Innentemperatur 58-600C beträgt. Bei intensiver Eiskühlung werden 1,4 g Kupfer-I-chlorid zugefügt. Nach weiteren 15 Minuten tropft man innerhalb von 30 Minuten eine Lösung von 27,5 g 4,6-Cholestadien-3-on zu, rührt für 2 Stunden nach, versetzt vorsichtig mit 300 ml gesättigter Ammoniumchloridlösung, verdünnt mit 2 1 Äther und arbeitet wie üblich auf. Das Rohprodukt (28,7 g) wird in 250 ml Tetrahydrofuran gelöst und nach Zugabe von 10 ml 2 η Schwefelsäure 2 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt. Aus der üblichen Aufarbeitung resultieren 26,3 g Rohprodukt, das zur Reinigung an Kieselgel chromatographiert wird. Man erhält 16,6 g 7e-Methyl-4-cholesten-3-on vom Schmelzpunkt 72/73-750C (Pentan).
Beispiel 4 .to
In 20 Erlenmeyerkolben werden mittels den Bedingungendes Beispiels4jeweils 100 mgoa-MethyM-cholesten-3-on mit einer Mycobacterium spec. NRRL B-3805 Kultur fermentiert und aufbereitet.
Man erhält 0,8 g 6c-Methyl-4-androsten-3,17-dion vom Schmelzpunkt 171-174°C.
Herstellung des Ausgangsmaterials
Man löst 30 g Cholesterin in 600 ml Methylenchlorid und fügt bei Eiswasserkühlung 17,4 g m-Chlorperbenzoesäure anteilweise im Verlauf von 20 Minuten zu. 30 Minuten nach der letzten Zugabe wird mit 200 ml Methylenchlorid verdünnt, zweimd mit je 200 ml gesättigter Natriumsulfat-Lösung, zweimal mit je 200 ml verdünnter m> Natriumbicarbonat-Lösung und anschließend mit Wasser bis zur Neutralität ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Das Rohprodukt wird aus Methanol kristallisiert.
Man erhält 23,4 g 3jß-Hydroxy-5,6-epoxy-cholesterin vom Schmelzpunkt 133-136°C.
Aus 3,64 g Magnesiumspänen und 9,5 ml Methyljodid bereitet man sich in 100 ml Äther eine Methylmagnesiumjodid-Lösung. Dann tropft man 20 g 3j?-Hydroxy-5,6-epoxy-cholesterin in 400 ml absolutem Toluol zu und rührt bei 60-65° 45 Stunden lang. Bei Eiskühlung wird vorsichtig mit 100 ml gesättigter Ammoniumchloridlösung versetzt und wie üblich aufgearbeitet. Das Rohprodukt (21,3 g braunes, zähes Öl) wird in 400 ml Benzol gelöst und nach Zugabe von 100 ml Cyclohexanon 20 g Aluminium-i-propylat für 21 Stunden unter Rückfluß gekocht. Die abgekühlte Lösung wird mit Benzol verdünnt, mehrmals mit 1 η Schwefelsäure ausgeschüttelt und so mit Wasser neutral gewaschen.
Das Rohprodukt wird zur Reinigung an Kieselge! chromatographiert. Man erhält nach Kristallisation aus Methanol 12,75 g 6a-Methyl-4-cholesten-3-on vom Schmelzpunkt 151-154°C.

Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    L Verfahren zur Herstellung von 4-Androsten-3,17-dion-Derivaten der allgemeinen Formel !
    (D
    worin
    X eine 6,7-Methylengruppe oder einen in der 6- oder 7-Stellung befindlichen Fluor-, Chlor- oder Methylsubstituenten darstellt, dadurch gekennzeichnet,
    daß man ein Sterin-Derivat der allgemeinen Formel II
    H3C
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