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DE2426584A1 - Substanz zur heilung von leberschaeden und verfahren zu deren herstellung aus protein-bruehen - Google Patents

Substanz zur heilung von leberschaeden und verfahren zu deren herstellung aus protein-bruehen

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Publication number
DE2426584A1
DE2426584A1 DE19742426584 DE2426584A DE2426584A1 DE 2426584 A1 DE2426584 A1 DE 2426584A1 DE 19742426584 DE19742426584 DE 19742426584 DE 2426584 A DE2426584 A DE 2426584A DE 2426584 A1 DE2426584 A1 DE 2426584A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
broth
brought
substance
added
gesthuysen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE19742426584
Other languages
English (en)
Inventor
Pietro Bianchini
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Opocrin SpA
Original Assignee
Opocrin SpA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from IT2867173A external-priority patent/IT1045649B/it
Application filed by Opocrin SpA filed Critical Opocrin SpA
Publication of DE2426584A1 publication Critical patent/DE2426584A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description

Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch Patentanwälte Diplom-Physiker Dr. Walter Andrejewski Diplom-Ingenieur Dr.-lng. Manfred Honke Diplom-Ingenieur Hans Dieter Gesthuysen Diplom-Physiker Dr. Karl Gerhard Masch Anwaltsakt·: 43 917/Sch-ma
43 Essen 1 ,Thaatarplatz 3, Postf: 789
30. Mai 1974
Patentanmeldung OPOCRIN s.r.l. Via Pacinotti FORMIGINEy Frazione CorIo (Modena - Italien)
Substanz zur Heilung von Leberschäden und Verfahren zu deren Herstellung aus Protein-Brühen.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine vergiftungshemmende und entzündungshemmende Substanz für Leberschäden sowie ein Verfahren zu deren Herstellung aus Protein-Brühen.
Es wurden bereits vielfach Versuche zum Zwecke der Isolierung einer lebervergiftungshemmenden (anti-petatotoxisch wirkenden) Fraktion aus Leberextrakten durchgeführt. Man war allgemein
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Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte in Essen
der Annahme, daß von Fall zu Fall diese Wirksamkeit der Leberextrakte den phosphopolidischen, nucleosidischen, poly-peptischen Fraktionen zuzuschreiben sei. Anläßlich der seitens der Anmelderin durchgeführten Forschungen zwecks Isolierung des angenommenerweise anti-hepatotoxischen Faktors der Leber, wurde eine Fraktion gewonnen, welche an der Ratte und bei Säugetieren, die durch mancherlei lebervergiftende Wirkstoffe hervorgerufenen Leberschäden zu hemmen imstande war.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine zur Heilung von Leberschäden geeignete Substanz zu schaffen, die nicht nur aus Leberbrühen gewonnen werden kann, sondern auch aus anderen Protein-Brühen, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung anzugeben. Zur Lösung dieser Aufgabe lehrt die Erfindung, daß die Substanz gleichzeitig eine lebervergiftungs- und entzündungshemmende sowie antilipämische Wirkung besitzt, und mittels Elektrophorese in alkalischem Puffer zum negativen Pol wandert, auf einem Ionenaustauscher eluiert, der aus gekreuzten Dextranen gebildet ist, die Diäthylaminoessigfunktionale Gruppen in den Fraktionen zwischen den Molaritäten 0,35 und 0,60 und zwischen 275 und 350 ml Eluiermittel aufweisen. Die biologischen Wirkungen der erfindungsgemäßen Substanz bestehen hauptsächlich in einer erhöhten Fähigkeit die Nekrose (Absterben) des Leber- \ gewebes zu verhindern und dasselbe gegen verschiedene verletzend ! wirkende Stoffarten zu schützen und gleichzeitig eine antilipämische und entzündungshemmende Wirkung herbeizuführen. , Diese vorgenannten biologischen Wirkungen werden mittels folgender Tests näher erläutert:
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Andrefewski, Honk·, Gesthuysen & Match, Patentanwälte in Essen
1) Verfahren zur Vergiftung (Intoxitation) mittels CCl j. Die Verabreichnung von CCl, löst an der Ratte nekrotische gegenlobulftre Verletzungen aus, welche durch das Auftreten im Kreislauf von Transäminasen, wie GOT, GPT, GLDH und eine veränderte Leberfunktion begleitet sind, welche durch Auswertung der Clerance-Fähigkeit des Bromosulfonphtaleins (BAF) durch Einspritzung auf intravenösem Weg beobachtet wird. Die Verabreichung der Substanz gemäß der in der Tabelle I erwähnten Art und Zeiten, bewirkt eine Inhibition des durch CCl^ ausgelösten Leberschadens hinsichtlich aller untersuchten Parameter. Diese Hemmung entwickelt sich gemäß einer Reihe von Wirkungen, die vollständig verschieden von denjenigen sind, welche durch andere Substanzen erzeugt werden und die sich denjenigen der pharmakometabilischen Induktion nähern.
TABELLE I Behandelte Tiere: weibliche Ratten WISTAR mit 190 + 10 Gramm
Gruppe 1. Behandlung 2. Behandlung Stunden 3. Behandlung
nach 18 nach 24 Stunden
und nüchtern ab
- i.p. der 2. Behandlung
C s.f. - s.c. s.f. - i.p. BSF - i.v.
I o * ΐ · ^ S · C · cci4 - i.p. BSF - i.v.
F + I F - s.c. CCl BSF - i.v.
Die Ratten werden 30 Minuten nach der 3. Behandlung geopfert.
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Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte in Essen
C = Kontroll-Ratten
I = mit CCl4 vergiftete Ratten
F + I = mit CCl. vergiftete Ratten und mit der in Untersuchung befindlichen Substanz behandelt
s.f, s.c,
i.p,
i.V.
physiologische Lösung
subkutanische Einspritzung
= Intraperitoneo
= intravenöse Einspritzung
CCl4 Lösung in CCl4 - Öl (handelsüblich), Konzentration zu 15 % : verabreichte Dosis 8 ml/kg = 1200 mg/kg i.p.
BSF = Bromosulfonphtalein (handelsüblich), Phiolen ä 0,5 g in 10 ml verdünnt mit s.f. a 10 mg/ml; Dosis verabreicht: 5 ml/kg
F.
in Untersuchung befindliche Substanz.
Unter Zugrundelegung dieses Tests ist die Masseneinheit willkürlich, welche als UAET (anti-hapatotoxische Einheit) hier bezeichnet wird. 1 UART ist die Bezeichnung der Menge der Substanz, welche nach Einspritzung unter die Haut gemäß den obigen Testverfahrensschritten in der Lage ist, die hämatische Konzentration des Bromosulfonphtaleins um 50 % herabzusetzen. Der akute Vergiftungs-(Intoxitations)-Test durch CCl4 wird grundsätzlich zur Dosierung der erfindungsgemäßen Substanz angewandt, sowohl für die rohen Präparationen als auch für die gereinigten Produkte, da in allen Fällen eine Kurve für die Dosis und als Antwort erhalten wird, wenn die Substanz sowohl subkutan als auch auf andere Weise verabreicht wird.
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Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte in Essen
2) Hyperlipämie-Test aus Triton
Dieser Test stützt sich auf die Zunahme der Triglyderide, Cholesterins und Beta-Lioproteins im Blut der endovenös behandelten Ratten mittels eines nicht ionischen Tensioaktiv-Stoffes, z. B. Octiphenol-polyaethilenglikolaether. Die Hyperlipämie wurde nach 8 Stunden offensichtlich. Die gemäßdem Verfahren und den Zeiten gemäß Tabelle II verabreichte Substanz verhinderte diese Art Hyperlipämie mit dem gleichen weiter oben genannten Wirkungsverlauf, welcher an den Mechanismus pharmako-methabolischer Induktion erinnern.
T A B E L L E II Behandelte Tiere : männliche Ratten WISTAR mit 320 +10 Gramm
Gruppe 1. Behandlung - i.p. 2. Behandlung nach 18 Std
C s.f. - i.p. s.f. - i.v.
I s.f. - i.p. T - i.v.
F + I F T - i.v.
Die Ratten wurden 8 Stunden nüchtern nach der 2. Behandlung geopfert.
C = Kontroll-Ratten i.p. = intraperitonäum
F = mit Oetylphenolpolyäthylen-
glykoläther i.v. = intravenös
F + I = mit Octylphenolpolyäthylenglykoläther vergiftete und
mit dem in Untersuchung befindlichen Substanz behandelte Ratten s.f. = physiologi-·
sehe Lösung
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Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte in Essen
fr
T = Octylphenolpolyäthylenglykoläther F = in Untersuchung befindliche Substanz.
3) Pfotenödem aus Carragenin an der Ratte.
Bei diesem Versuch löst die Einspritzung unter die Sehnenhaut (aponeurosische) einer Lambdacarragenin-Schwemme ein ödem beträchtlicher Intensität aus. Die Substanz bewirkt gemäß den in der Tabelle III angegebenen Verfahren und Zeiten die Verhinderung des gleichen, durch nicht kortisonische Steriode ausgelösten Ödems.
TABELLE III
Behandelte Tiere : männliche WISTAR-Ratten Gewicht 180 + 10 Gramm 12 Stunden lang ungefüttert.
1. Behandlung
30 ml/kg H3O
orale Verabreichung
2. Behandlung
s.f. - i.p. Dose a 5 ml/kg
3. Behandlung nach 60 Std.
Cr. - s.p. und Messen
3 Stunden nach der 3. Verabreichung wird die Volumenzunähme der Pfote gemessen.
Cr = Carragenin (Lambda Carragenan) Schwemme zu 1 %
in steriler physiologischer Lösung Gerät = Plethismometer (handelsüblich) i.p. = intraperitonäum s.p. = unter-aponeutrosische (unter Sehnen) s.f. = physiologische Lösung
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Die erfindungsgemäße Substanz ist außer ihrer biologischen Wirkung auch durch die chemisch-physikalischen Merkmale gekennzeichnet .
Die Elektrophorese auf Whatmann-3 MM-Papier im alkalinischen Puffer bei einem pH-Wert von 8,6 zeigt, daß das aktive Prinzip vom Negativ-Pol wandert und sich von einer proteischen Fraktion trennt, welche zu Anfang schon still liegen bleibt. Die Feststellung der Aktivfraktion wird an den Eulierungen Zentimeter um Zentimeter des elektrophoretischen Streifens bestimmt, auf welchen die Substanz mittels des Vergiftungstests aus CCl4 aufgebracht wurde. Ein Beispiel dieser Elektrophorese, die in einem Borat-Puffer mit einem pH-Wert von 8,6 durchgeführt wurde und zwar mit einem Potentialunterschied von 150 Volt und über eine Zeitdauer von 3 Stunden und unter Niederschlag am positiven Pol bei der numerierten Fraktion wie 3, ist in der anliegenden Figur dargestellt. Die Figur zeigt auf der Abzisse die Längen-Zentimeter des Streifens und auf der Ordinate den prozentuellen Schutz für den Vergiftungsversuch durch CCl4. Gewöhnlich wird die Substanz auch mittels Chromatographie an der Säule bestimmt.
Ein Beispiel des chromatographischen Verhaltens der Substanz an einem Ionen-Austauscher bestehend aus Dextranen, die mit Funktionalgruppen aus Diäthylaminoäthyl als Träger gekreuzt sind, ist in der Fig. 2 dargestellt.
Die Elution wurde mittels Lösungen mit ansteigender Molarität von NaCl durchgeführt; die biologisch aktive Substanz wird im Eluat mittels Dosierung des Vergiftungstestes aus CCl4 bestimmt. Die aktiven Fraktionen liegen zwischen dem Molarbe-
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reich 0/35 und 0,60 und in den Fraktionen zwischen 275 und 350 ml Eluiermittel. Die graphische Darstellung der Fig. 2 zeigt ein Beispiel dieser mit einem Phosphat-Puffer von 100 ml Substanz durchgeführten Chromatographie. Die jeweils in der oberen Skala angegebenen Abzisse geben die Zahlen der einzelnen Volumen, jedes aus 5 ml ab, welche erhalten wurden und in der unteren Skala die ml an gesammeltem Eluiermittel; die Ordinaten geben jeweils in der innersten Skala den prozentualen Schutz beim Vergiftungstext mit CCl. an und die äußerste die Molarität in NaCl, welche in der graphischen Darstellung durch die kleinen Dreiecke bezeichnet ist. Es ist möglich, die Überlagerung der antihäpatotoxischen und entzündungshemmenden Wirkung zu kontrollieren, indem unter Vergleich die verschiedenen Fraktionen der elektrophoretischen Streifen gemäß den Vergiftungsversuchen mit CCl4 dosiert werden, sowie des durch Carragenin verursachten Ödems, ein Beispiel dieses Verhaltens ist in der Fig. 3 gezeigt. Die Fig. 3 zeigt die Dosierungen einer Elektrophorese, die kontinuierliche auf Whatman 3 MM-Papier unter Ablagerung am positiven Pol durchgeführt wurde.
Die Dosierung gemäß dem CCl.-Test ist in der graphischen Darstellung mittels durchgehender Linien gezeigt, während der Test mit Carragenin gestrichelt angedeutet ist. In der Figur geben die Abzissen die Zentimeter des elektrophoretischen Streifens an, aus welchem die Substanz eluiert wird, welche zur Dosierung dient; die Ordinaten zeigen die Schutzwer«te prozentual aus den beiden Tests an.
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Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung der Substanz, welches darin besteht, daß Tierfleisch in Wasser zermahlen und homogenisiert und danach zwischen 30 und 240 Minuten gekocht sowie anschließend filtriert wird und danach die festen Bestandteile ausgeschieden werden, daß anschließend das Filtrat auf einen pH-Wert zwischen 6 und 8 gebracht, alsdann sterilisiert und auf 20 bis 37° C abgekühlt wird und so eine sterile, zur Fermentierung fertige Brühe erhalten wird, daß ferner gesondert eine Einokulierung von Kulturen von Mikroorganismen des Stammes "Pseudomonas" vorbereitet und zwischen 2 und Tagen bei 20 - 37° C unter Umrühren in ärobier der Reife überlassen wird, daß das so zubereitete Inokulum im Verhältnis von 1 : 50 bis 1 : 100 in die zuvor zubereitete sterile Brühe eingegeben und- diese Brühe bei 20-37 C zwischen 2 und 6 Tagen in lirobier unter Umrühren zur Fermentierung belassen wird, daß nach Abschluß der Fermentation ein verflüchtigendes Alkali bis zu einem pH-Wert von 9-12 eingerührt sowie danach umgerührt und filtriert wird, die sterile alkalische Brühe im Verhältnis 4 : 1 bis 12:1 konzentriert wird und mittels eines organischen polaren Lösungsmütels ausgefällt wird und der Rückstand dann wieder in dem gleichen Volumen H2O wie das konzentrierte Produkt gelöst und auf einen pH-Wert von 4-5 gebracht mittels Essigsäure und mit Alkohol mit einer unter 4 liegenden Atomzahl C ausgefällt wird, daß der Rückstand danach mehrfach mit Methanol und Äther zum Rohrprodukt (Wirkung 0,5 UAET/mg) gewaschen wird.
Zwecks Erhalt der gereinigten Substanz mit Gehalt 4-8 UAET/mg wird das Rohrprodukt in alkalischem Wasser mit einem
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Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte in Essen
pH-Wert von 9 - 11,5 mittels verflüchtigendem Alkohol aufgelöst und bis zum Erhalt einer klaren Flüssigkeit filtriert und danach die Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 6-8 mittels Essigsäure gebracht, sowie anschließend mit einer Lösung aus Trichloressigsäure zur Ausziehung der Proteine behandelt und filtriert, danach wird es mit einem organischen, polaren Lösungsmittel ausgefällt und anschließend zentrifugiert, wobei ein weißer Niederschlag erhalten wird, dieser Niederschlag wird in Wasser gelöst und auf einen pH-Wert von 6,5-8 eingestellt und nach Zusatz von Zinkazetat zentrifugiert, der Niederschlag mit Äthanol und Äther bis zur Trocknung gewaschen wird. Damit wird eine gereinigte Substanz mit einem Gehalt von 4-8 UAET/mg erhalten.
Zwecks besserer Erläuterung der Durchführung des Verfahrens werden im folgenden zwei Beispiel lediglich beispielsweise und nicht einschränkenderweise angegeben.
Beispiel 1
25 kg frische oder tiefgekühlte Rinderleber werden in 150 1 H3O gemahlen und homogenisiert. Die Brühe wird zum Kochen gebracht und 60 Minuten lang gekocht, es wird mit 3000 U.p.M. zentrifugiert und filtriert, wobei ein Teil eines Ausschuß-Kuchens und andererseits ein klares, gelbliches Filtrat erhalten wird, das auf einen pH-Wert von 7 gebracht wird. Alsdann wird bei 1 at 30 Minuten lang sterilisiert und auf 25° C abgekühlt, wobei eine sterile, fermentationsfertige
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Brühe erzeugt wird. Eine Portion des ErhaltungsStammes von Pseudomonas syringae, das auf festem Terrain konserviert wurde, wird steril in eine kleine Menge Brühe gegeben und 5 Tage lang bei 25° C unter Umrühren in Ärobier belassen. Das so zubereitete Inokulum wird im Verhältnis von 1 : 60 in den die sterile Brühe enthaltenden Fermentator eingebracht, die wie vorstehend beschrieben zubereitet worden war.
Es folgt über 5 Tage lang eine Fermentierung in Ärobier und unter Umrühren sowie unter Zusatz eines Schaumverhütungsmittels auf Silikonbasis. Nach Abschluß der Fermentierung wird mit Ammoniak ein pH-Wert von 10 eingestellt, gerührt und steril filtriert. Das Filtrat wird im Verhältnis 10 : 1 konzentriert und mit 10 Volumen Azeton ausgefällt. Der Niederschlag wird erneut in Wasser gelöst, bis ein der konzentrierten Brühe gleiches Volumen erhalten wird und dann mit 3 Volumen Methanol ausgefällt. Der Niederschlag wird mehrmals mit Methanol und Äthyläther gewaschen und es werden so 50 bis 150 g eines Erzeugnisses mit einer Wirkung von 0,5 UAET/mg erhalten. Das Produkt wird in Wasser aufgelöst und auf einen pH-Wert von 11 mittels Ammoniak gebracht, es wird bis eine klare Flüssigkeit abfiltriert und mittels Essigsäure auf einen pH-Wert von 7 gebracht. Die Lösung wird mit 1 Volumen 20 %-iger Flüssigkeit aus Trichloroessigsäure behandelt und der Niederschlag entfernt, während die Flüssigkeit mit 3 Volumen Methanol behandelt wird, woraus sich ein Niederschlag ergibt, der frei von Trichloroessigsäure ist. Es wird zentrifugiert und ein weißer Niederschlag (ca. 50 % des Ausgangsmaterials mit Wirksamkeit 2 UAET/mg erhalten. Der Niederschlag wird in 50 Volumen Wasser auf einen pH-Wert von 5,7 gebracht und es wird Zinkazetat bis zu einer Konzentration von 3 % zugesetzt
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und zentrifugiert. Der so erhaltene Niederschlag wird gewaschen und mit Methanol-Lösungsmittel bis zur Trocknung ausgefällt und so ein Produkt mit einer Wirksamkeit von ca. 5 üAET/mg erhalten.
Beispiel 2
25 kg Fleisch werden zermahlen, in 150 1 Wasser homogenisiert, zum Sieden gebracht und 3 Stunden lang gekocht und auf 5° C abgekühlt. Durch Abziehen wird der fette Teil entfernt und die entfettete Brühe wird zentrifugiert, auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht und in einem Autoklaven 30 Stunden lang bei 1 at sterilisiert; es wird dann die Brühe auf 30° C abgekühlt. Ferner wird ein Inokulum aus Pseudomonas fragi gesondert zubereitet unter Entnahme vom Erhaltungsstamm des Mikroorganismus und in eine kleine Menge Brühe eingegeben, die aus der sterilen Brühe entnommen wurde. Es wird dieses Inokulum 3 Tage lang einer Reifung unterzogen und zwar bei 28 C in Ärobier und unter Umrühren. Es wird diese Brühe auf einen pH-Wert von 11 mittels Ammoniak gebracht und umgerührt sowie danach filtriert. Das Filtrat wird auf 5 : 1 konzentriert und mittels 7 Volumen Methanol ausgefällt und zentrifugiert. Es wird erneut aufgelöst in Wasser bis das gleiche Volumen der konzentrierten Brühe erreicht ist. Es wird auf einen pH-Wert von 4,8 mit Essigsäure gebracht und mit Äthanol ausgefällt. Der Niederschlag wird mit Äthanol und Äther gewaschen und mit alkalinischem Wasser mit Ammoniak auf einen pH-Wert von 9,5 gebracht. Es wird anschließend filtriert und
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auf einen. pH-Wert von 7,5 mittels Essigsäure eingestellt. Die Lösung wird mit Richloressigsäure behandelt und filtriert. Das Filtrat wird mit 3 Volumen Äthanol ausgefällt und zentrifugiert. Der Niederschlag wird erneut in Wasser auf einen pH-Wert von 7 gebracht, mit Zinkazetat behandelt, bis zu einer Konzentration von 3 % behandelt und zentrifugiert. Der so erhaltene Niederschlag wird mit Methanol und Äthyläther bis zur Trocknung gewaschen.
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Claims (1)

  1. Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte in Essen
    Patentansprüche :
    1. Substanz zur Behandlung von Leberschäden, dadurch gekennzeichnet, daß sie gleichzeitig eine lebervergiftungs- und entzündungshemmende sowie antilipämische Wirkung besitzt, und mittels Elektrophorese in alkalischem Puffer zum negativen Pol wandert, auf einem Ionenaustauscher eluiert, der aus gekreuzten Dextranen gebildet ist, die Diäthylaminoessigfunktionale Gruppen in den Fraktionen zwischen den Molaritäten 0,35 und 0,60 und zwischen 275 und 350 ml Eluiermittel aufweisen.
    2. Verfahren zur Herstellung der Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Tierfleisch in Wasser zermahlen und homogenisiert und danach die Mischung zwischen 30 und 240 Minuten gekocht sowie anschließend filtriert wird und danach die festen Bestandteile ausgeschieden werden, daß anschließend das Filtrat auf einen pH-Wert zwischen 6 und 8 gebracht,sterilisiert und auf 20 bis 37° C abgekühlt wird, daß ferner gesondert ein Inokulum von Mikroorganismenkulturen des Stammes pseudomonas aufbereitet und 2 bis 6 Tage auf 20 bis 37 C unter Umrühren und in Ärobier erwärmt wird, daß dieses Inokulum im Verhältnis 1 : 50 bis 1 : 100 in die zuvor zubereitete sterile Brühe eingegeben und diese Brühe bei 20 bis 37° C 2 bis 6 Tage lang in Ärobier unter Umrühren belassen wird sowie nach Abschluß der Fermentierung ein verflüchtigendes Alkali beigegeben und der pH-Wert auf 9 bis 12 eingestellt wird, daß danach die Brühe umgerührt und filtriert sowie der feste Teil abgesondert und
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    te
    die Brühe im Verhältnis 4 : 1 bis 12 : 1 konzentriert und filtriert wird sowie der Rückstand wiederum in Wasser gelöst wird und zwar bis das gleiche Volumen der konzentrierten Brühe erreicht ist, daß anschließend diese Brühe mittels Essigsäure auf einen pH-Wert zwischen 4 und 5 eingestellt und mittels eines Alkohols, der weniger als 4 Kohlenstoffatome enthält, ausgefällt sowie der Rückstand mehrmals mit Methanol und Äther zum Rohprodukt gewaschen wird.
    3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Rohprodukt erneut in Wasser gelöst und auf einen pH-Wert von 9 bis 11,5 mittels einer flüchtigen Alkalis gebracht, anschließend zu einer klaren Flüssigkeit filtriert und diese auf einen pH-Wert zwischen 6 und 8 mittels Essigsäure gebracht wird, danach mittels einer Trichloressigsäure eine Koagulation der Proteinfraktion herbeigeführt und diese durch Filtrierung abgeschieden wird, daß der Rückstand mittels eines polaren organischen Lösungsmittels ausgefällt und das Fällungsprodukt in Wasser bis auf einen pH-Wert von 6,5 bis 8 gebracht, Zinkazetat zugesetzt und zentrifugiert sowie danach der Rückstand mittels Äthanol und Äthyläther bis zur Trocknung gewaschen wird.
    4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Zinkazetat in einer Konzentration von etwa 3 % zugesetzt wird.
    5V Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als verflüchtigendes Alkali Ammoniak zugesetzt wird.
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    Andrejewski, Honke, Gesthuysen & Masch, Patentanwälte in Essen
    6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Fleisch Säugetierleber eingesetzt wird.
    7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus der Stämme der Pseudomonas eingesetzt und aus den Sorten syringae und fluoreszenz fragi ausgewählt wird.
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DE19742426584 1973-06-26 1974-05-31 Substanz zur heilung von leberschaeden und verfahren zu deren herstellung aus protein-bruehen Pending DE2426584A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT2582473 1973-06-26
IT2867173A IT1045649B (it) 1973-09-07 1973-09-07 Sostanza attiva verso le reazioni infiammatorie ottenuta con un metodo di isolamento da brodi proteto

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE2426584A1 true DE2426584A1 (de) 1975-01-09

Family

ID=26328620

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19742426584 Pending DE2426584A1 (de) 1973-06-26 1974-05-31 Substanz zur heilung von leberschaeden und verfahren zu deren herstellung aus protein-bruehen

Country Status (4)

Country Link
JP (1) JPS5069297A (de)
AU (1) AU7044974A (de)
DE (1) DE2426584A1 (de)
FR (1) FR2234900A1 (de)

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