DE2359921B2 - Verfahren und vorrichtung zum erkennen von leukozyten mit einer besonderen optischen absorptionseigenschaft in einem fluessigen blutprobenvolumen - Google Patents

Description

Teilchen feststellen kann, wenn sie beleuchtet werden. Nach dieser Patentschrift ist es zur Bestimmung der Populationszählwerte von in Suspension befindlichen gefärbten und ungefärbten Zcüen. bekannt, zwei verschiedene elektrooptische Reaktionssignalimpulse von jeder der gefärbten und ungefärbten Zellen, die nacheinander den Lichtstrahl durchqueren, gleichzeitig /u erzeugen. Dabei handelt es sich bei der einen dieser optischen Reaktionen um eine bei einer Absorptionswellenlänge gemessene weitwinklige optische Streuung. die von der Absorptionsfähigkeit der Zellen und damit von der Farbe ahhär.gt. Die andere Reaktion ist ebenfalls eine Lichtstreuungsmessung bei der Absorplionswellenlänge. jedoch handelt es sich in diesem Fall um eine schmalwinklige Streuung, die von der Farbe der Zellen kaum oder weniger stark beeinflußt ist als die zuerst erwähnte weitwinklige optische Strenung. Diese Eigenschaft der beiden gleichzeitig gewonnenen Si reulichtsignal wird zur Zelldifferenzierung und Zellzählung herangezogen. Zu diesem Stand der Technik wird ergänzend auch noch auf die US-PS 37 05 771 verwiesen.

An dieser Stelle sei bemerkt, dali vor der optischen Analyse die optischen Eigenschaften der interessierenden Zellklasse unter Anwendung von herkömmiichen Farbverfahren geändert werden, wobei die übrigen Zellen ungefärbt bleiben. Ein derartiges selektives Farbverfahren für die verschiedenartigen l.eukozv'cn ,st aus der DT-OS 21 53 405 bekannt.

Bei den herkömmlichen automatisch arbeitenden Anordnungen zur elektrooptischen Bestimmung der differentiellen Leuko/.ytenzählwerte von menschlichen Blutproben hat sich die Schwierigkeit ergebe;-,, daß leichtgefärbte Zellen von ungefärbten Zellen nicht immer unterschieden werden, so daß die entsprechenden Zählvverte mit Fehlern behaftet sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, mit denen die gefärbten Leukozyten von den ungefärbten Leukozyten besser unterschieden werden können.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist das eingangs beschriebene Verfahren nach der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß das von jedem Teilchen bei Absorptionsweilenlängen gestreute Licht und bei Nichtabsorptionswellcnlängen gestreute Licht festgestellt und zur Unterscheidung der Leukozyten mit der besonderen optischen Absorptionseigenschafi von den Leukozyten ohne die besondere optische Absorptionseigenschaft das bei Absorptionswellenlängen gestreute Licht und das bei Nichtabsorptionswellenlangei· gestreute Licht miteinander verglichen werden.

Die eingangs beschriebene Vorrichtung zeichnet sich nach der Erfindung dadurch aus, daß die Fotodetektoren auf das bei der Bestrahlung jedes Leukozyts gestreute Licht ansprechen, daß der eine Fotodetektor auf Licht mit Absorptionswellenlängen und der andere Fotodetektor auf Licht mit Nichtabsorptionswcllenlängen anspricht und daß die Vergleichscinrichtung die ihr von den Fotodetektoren zugeführten elektrischen Signale zu einem die Leukozyten mit den besonderen optischen Absorptionseigenschaften von den Leukozyten ohne die besonderen optischen Absorptionseigenschaften unterscheidenden Ausgangssignal verarbeite!.

Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens und der Vorrichtung sind in den Patentansprüchen 2 und I b/v\. 5 und 6 beschrieben.

Der Erfindungsgegenstand beruht auf der Erkenntnis, daß bei Teilchen, wie Leukozyten, die einen optischen

Exi'nktiunsquerschniit haben, den man durch Einfärben vergrößern kann, und die eine optische Bahndifferenz haben, die geringer als das Fünffache der Lichtwellenlängc Iv₁, eine durch eine stärkere Farbreaktion innerhalb der Zelle hervorgerufene vermehrte Farbausfüllung mit einer Zunahme der Lichtstreuung bei einer Niehtabsorptionswellenlänge verbunden ist. Diese Tatsache war überraschend und unvorhersehnbar. da man. wie es für Absorpnonswellenlüngen allgemein bekannt ist, auch für Nichtabsorptionswellenlängen mit einer Abnahme der Lichtstreuung bei zunehmender Farbe rechnen mußte. Nach der Erfindung wird nun /ur L.eukozytendift'eren/ierung die gleichzeitige Lichtstreuung durch die gefärbten und nichtgefärbten Zellen bei Absorptions- und Nichtabsorptionswellenlängen ausgenützt. Damit ist ein beachtlicher technischer Fortschritt verbunden, der darauf beruht, daß im Vergleich zu einer ungefärbten Zelle beim Auftreten einer gefärbten Zelle das bei Nichtabsorptionswellenlängen gestreute Lieh; zunimmt und demgegenüber das bei Absorptionswellenlängen gestreute Licht abnimmt. Durch die damit verbundene Zunahme des einen Meßsignals und die gleichzeitig auftretende Abnahme des anderen Meßsignals ist es möglich, die Unterscheidung zwischen gefärbten und ungefärbten Zellen mit einer höheren Genauigkeit und größeren Empfindlichkeit vorzunehmen, als es bisher üblich war. Insbesondere können auch geringfügig gefärbte Zellen von nichtgefärbten Zellen unterschieden werden. Ferner erhält man einen größeren Rauschabstand.

Mit dem Erfindungsgegenstand kann man eine sehr große Anzahl von suspendierten und mit hoher Geschwindigkeit durch den Lichtstrahl der Analysiereinrichtung aufeinanderfolgend geleiteten Leukozyten einzeln optisch erfassen und die gewonnenen, von zwei unabhängigen Fotodetektoren stammenden elektrischen Signale zur gegenseitigen differentiellen Einwirkung in Beziehung zueinander setzen, um insbesondere eine Unterklasse der gefärbten in Suspension befindlichen Leukozyten zu erkennen und durch Sichtbarmachung und bzw. oder Zählung anzuzeigen.

Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiei der Erfindung wird an Hand von Zeichnungen beschrieben. Es zeigt

F i g. 1 eine schematische Ansicht einer Leukozytenanalysiervorrichtung,

F i g. 2 eine schematische Ansicht von einer typischen sichtbaren Darstellung der mit der Vorrichtung gewonnenen Ergebnisse und

Fig. 3 eine .schematische Ansicht, die zur Erläuterung der Einstellmöglichkeiten eines die Analyse beeinflussenden winkelförmigen Schwellwerts dient.

Die Fig. 1 zeigt beispielshalber eine Anordnung zur elektrooptischen Analyse von Leukozyten. Die Anordnung enthält eine als Durchflußzell? 10 ausgebildete optische Kammer, durch die die von einem Mantelstrom umgebenen Leukozyten nacheinander strömen. Die Flüssigkeit für den Mantelstrom wird über eine Leitung 12 zugeführt. Der Auslaß 14 eier Durchflußzelle führt zu,η Abfluß. Bei dem Mantelstrom kann es sich um Wasser handeln.

Die Leukozyten werden in Suspension zugeführt, beispielsweise wie bei einer Probe aus menschlichem Gesamtblut. Die l.o-.ikozyten uer interessierenden Klasse werden vor der Analyse derart selektiv eingefärbt, daß die übrigen in der Probe vorhandenen Leukozyten ungefärbt bleiben. Ein dafür geeignetes Farbverfahren ist aus der DT-OS 21 53 405 bekannt. Bei den interessierenden Leukozyten kann es sich beispiels-

weise um die Klasse der Busophilcn handeln. Tür diese Leukozytenklasse kann man Toluidinblau verwenden, bei dem es sich um ein herkömmliches Farbmittel handelt. Abweichend davon kann man die selektive Färbung der Monozyten zur Detektion dieser l.eukozytenklasse beispielsweise in einer solchen Weise vornehmen, wie es aus der DT-OS 21 53 479 bekannt ist. Die Suspension strömt von einer nicht dargestellten Quelle durch eine Leitung 16. Der von irgendeiner geeigneten Quelle stammende Mantelstrom dient dazu. die Zellpartikeln mitzunehmen. Der zusammengeführte Strom wird über den unterhalb der Durchflußzelle 10 befindlichen Auslaß 14 abgeführt.

Wenn die Teilchen oder Zellen durch die optische Meßkammer der Durchfluß/eile strömen, durchqueren sie nacheinander einen von einer Lichtquelle !8 stammenden engen Lichtstrahl. Dieser Strahl wird in herkömmlicher Weise gebildet. Zu diesem Zweck v. ird das aus der Lichtquelle austretende Licht von einer Kondensorlinse 20 gesammelt und über eine Lochblen de 22 auf eine Belcuchtungsobjektivlinsc 24 geworfen. Der von dieser Anordnung gebildete Lichtstrahl Irin durch die optische Kammer und triff! auf eine Empfangsobjektivlinse 26. Von der Objektivlinse 26 gelangt der Lichtstrahl zu einem Strahlenteiler oder dichroitischen Spiegel 28. Das durch den dichroitischen Spiegel 28 tretende Licht trifft auf einem Dunkelfeldnetz 30 auf. Das vom dichroitischen Spiegel 28 reflektierte Licht wird auf einen dichroitischen Spiegel 32 gelenkt. Das vom dichroitischen Spiegel 32 reflektierte Licht trifft auf ein Dunkelfeldnetz 34.

Gestreutes Licht von einer optischen Reaktion in der Sichtkammer passiert das Dunkelfeldnetz 34 in einem ersten optischen Meßkanal CHI und füllt auf eine Diodendetektorlinse 36. Von dort gelangt das Licht über ein wellenlängenselektives !-ilter 38 zu einer Fotodiode 40. in ähnlicher Weise passiert in einem zweiten optischen Meßkanal CWII gestreutes I icht von einer optischen Reaktion in der Sichtkammer das Dunkelfeldnetz 30 und fällt auf eine Diodendetektorlinse 42. Von dort gelangt das Licht über ein wellenlängenselektives Filter 44 zu einer Fotodiode 46. Obwohl die beiden Fotodioden 40 und 46 auf Licht ansprechen, das durch eine Zelle in der Sichtkammer gestreut wird, und obwohl die Fotodioden das Streulicht gleichzeitig registrieren, ist die mit einem Filter versehene Fotodiode 40 gegenüber Licht mit absorbierenden Wellenlängen empfindlicher und die mit einem Filter versehene Fotodiode 46 gegenüber Licht mit mehl absorbierenden Wellenlängen oder längeren Wellenlängen empfindlicher. Die Impulshöhen der von den Fotodioden erzeugten Signale geben diese unterschiedliche Empfindlichkeit wieder.

Die von den als Meßwandiern dienenden Fotodioden 40 und 46 erzeugten Signale werden in Verstärkern 48 bzw. 50 verstärkt. Die Ausgänge der Verstärker 48 und 50 sind an die Eingänge von Vergleichern 52 bzw. 54 angeschlossen, die als Schwellwerteinrichtungen arbeiten, um zufällig auftretende Rauschsignale wirksam zu beseitigen. Die Vergleicher 52 und 54 sind in Logikkanälen L\ bzw. /.1I angeordnet, die den optischen Kanälen CH] bzw. CH]] zugeordnet sind und die die Eingangssignale tür Abtast- und Halteeinrichtungen oder Spii/endetcktorcn 56 bzw. 58 bereitstellen. Die <\mp!ii',hUT. -.1er •Xü-L'angsimpuKe der Spn/endetekioren >6 :;"-u ^8 entsprechen der Spitzenamplitude der Sign.i'e ,!'e .<ti ilen Fotodioden 40 bzv. 4h M. ι in men und die ben;' I ^irchiMns: '.on L'ef.nb'en ι in·!

4°

45 nicht gefärbten Zellen durch die Durchflußzelle 10 erzeugt werden.

Das Ausgangssignal des Spitzendeicktors 58 wird über eine Leitung 60 der 1 lorizontal- oder X-Achse des Schirms eines Sichtgeräts 62 und einer Verbindungslcitung 64 zugeführt. Die Leitung 64 verbindet den einen Eingang eines UND-Glieds 66 mit einem Potentiometer 68. dessen Abgriff an den einen Hingang A 1 einer Scgmenüerschaluing 72 angeschlossen ist. Der Ausgang des Spiizendetektors 56 ist über eine Leitung 74 mit der Vertikal- oder V-Achse des Schirms des Sichtgeräts 62 verbunden. Darüber hinaus ist die Leitung 74 an eine Verbindungsleitung 76 angeschlossen, die den anderer· Eingang des I IN D-Glieds 66 über einen Widersland mit dem verbleibenden Eingang A 2 tier Segmentierschal lung 72 verbindet.

Der Eingang A 1 der Segmentierschaliung 72 isi darüber hinaus über eine Leitung 80 und einen Widerstand an eine Spannungsquelle 82 veränderbare. Spannung angeschlossen. Die Scgmenuerschaliung 72 enthält einen Vergleicher mit üblichen Schaltungsmaß nahmen und ist derart ausgelegt, daß sie die Eingange A 1 und A 2 miteinander vergleicht. Wenn

An+MA 1 -4 2>0,
tritt ein Ausgangssignal auf. Wenn

Au+MA 1 - 4 2<0,

ist kein Ausgangssignal vorhanden. Dabei ist -Au die von der Spannungsquelle 82 gelieferte Vorspannung, und A,' ist das durch das Potentiometer 68 bestimmte Verhältnis.

Das Ausgangssigna! der Scgmcntierschaltung 72 u irti über eine Leitung 84 dem verbleibenden Eingang de UND-Glieds 66 zugeführt. Der Ausgang des UND Glied¹- 66 ist über eine Leitung 86 mit dem Eingang eine Zählschaltung 87 verbunden, die einen herkömmlichen Zähler enthält, um denjenigen Anteil oder diejenige Klasse von Zellen der Zellpopulation zu zählen, die gefärbt sind. Weiterhin führt die Leitung 86 zu einet Leitung 88. die an den Z-Anschluß des Sichtgeräts 62 angeschlossen ist. Das Ausgangssignal des UND-Glied·- 66 gibt das Sichtgerät 62 über die Leitung 88 frei.

Wie es aus der Darstellung nach der Eil¹.! hervorgeht, kann man die Gesamtpopulation an gefärbten und nichtgefärbten Zellen als eine Funktion des zweiten Logikkanals zähler. Zu diesem Zweck is; der Ausgang des Vergleichers 54 über eine Leitung 90 an den Eingang einer herkömmlichen Zählschaltung 92 mit einem Zähler angeschlossen.

In der Fig 2 ist die Funktion der Segmentierscha! tung 72 schema:isch dargestellt, die in Wirklichkeit einen winkelförmigen .Schwellwert oder eine winklige Maske erzeug!. Bei einer typischen Einstellung dePotentiometers 68 und dei Vorspannung der einstellbaren Spannungsquelle 82 erstreckt sich der Schwellwen 94 auf dem Sichtgerät 62 nach rechts oben. Obwohl der Schwellwen auf dem Schirm nicht sichtbar ist. werder alle Zelldarsielhngen rechts \.,_m .Schwellwert maskier' während alle Zellen. beispieK^ eise die gefärbten Zellen die links vom Sdiwellwen auftreten, als Lichtpunkte auftreten, beispielsweise in tier-· von einer Linie 9f umgebenen Bereich. Die Linie % selbst ist nichi sichtbar. Die Anzeige k.-.m man auf einem Fiiir aufzeichnen Darübei hinaus L<rir m.m die Zahlschaltungen 87 und 92 nut viner Ausgabeeinrichtung lerhinder.. bcispic!^ eise eii.e'ii Di ucker.

In der f ι g 3 ist en uTik.. :.'.rm.gcT Sehu ellv\ ei : ^i dargestellt, der dem Schw e'i^ lt: 44 ähnlich ist. jediiv.! gegenub·.·: !cm in J₁.; i ι _L- J ;!.;; j.. -' _t ϋκ'Π Sein·. elh>. e:'

parallel verschoben ist. Diese Verschiebung isi eine Funktion der Hinstellung der Vorspannung der einstellbaren Spannungsquclle 82. Damit erreicht man eine andere Maskierung als mit dem Schwellwe^rt 94 und damit auch eine andere nicht gezeigte Darstellung. Der Schwellwert 98 ist typisch für eine ausgewählte Versetzung. Andererseits kann man den Winkel oder

die Neigung des Schwellwerk /um lirzielen einei ausgewählten Maskierung verandern, wie es durch tier Schwellwert 102 in der K i g. i angedeutet ist. Diesi Veränderung wird durch das Potentiometer 68 einge stellt. [;s sei erwähnt, daß die Schwellwerk 98 und 10; nicht gleichzeitig auftreten.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

Palentansprüche:

1. Verfahren zum Erkennen von Leukozyten mit einer besonderen optischen Absorptionseigenschaft in einem Volumen einer flüssigen Blutprobe, bei dem die Leukozyten in einem aus der Probe gebildeten Strom nacheinander durch eine optische Kammer geleitet, die optische Kammer mit einem quergerichteten Lichtstrahl bestrahlt und verschiedene Eigenschäften des von den die optische Kammer durchströmenden Leukozyten beeinflußten Lichts festgestellt und miteinander verglichen werden, dadurch gekennzeichnet, daß cias von jedem Teilchen bei Absorptionswellenlängen gestreute Licht und bei Nichtabsorptionswellenlängen gestreute Licht festgestellt und zur (/n'erscheidung der Leukozyten mit der besonderen optischen Absorptionseigenschaft von den Leukozyten ohne die besondere optische Absorptionseigenschaft das bei Absorptionswellenlängen gestreute Licht und das bei Ni^htabsorptionswellenlangen gestreute Licht miteinander verglichen werden.

2. Verfahren nach Anspruch !. dadurch gekennzeichnet, daß die Leukozyten mit der besonderen optischen Absorptionseigenschaft gezählt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß alle Leukozyten gezahlt werden und die Anzahl der Leukozyten mit der besonderen optischen Absorptionseigenschaft mit der Gesamtanzahl der Leukozyten verglichen wird.

4. Vorrichtung zum Erkennen von Leukozyten mit einer besonderen optischen Absorptionseigenschaft, enthaltend eine als optische Kammer mit einer querlaufenden Lichtdurchtrittsbahn ausgebildete Durchflußzelle, eine Lichtquelle, derer: Lichtstrahl entlang der Lichtdurchtrittsbahn gerichtet werden kann, eine Einrichtung, mit der die Leukozyten durch die Durchflußzelle geleitet und nacheinander dem Lichtstrahl ausgesetzt werden können, zwei Fotodetektoren zum Erfassen verschiedener Eigenschaften des von den die Durchflußzelle durchströmenden Leukozyten beeinflußten Lichts, eine Einrichtung zum Vergleichen der Ausgangssignale der beiden Fotodetektoren und gegebenenfalls eine Schwellwertschaltung, dadurch gekennzeichnet, daß die Fotodetektoren (40, 46) auf das bei der Bestrahlung jedes Leukozyts gestreute Licht ansprechen, daß der eine Fotodetektor (40) auf Licht mit Absorptionswellenlängen und der andere Fotodetektor (46) auf Licht mit Nichtabsorptionswellenlängen anspricht und daß die Vergleichseinrichtung (72) die ihr von den Fotodetektoren zugeführten elektrischen Signale zu einem die Leukozyten mit den besonderen optischen Absorptionseigenschaften von den Leukozyten ohne die besonderen optischen Absorptionseigenschaften unterscheidenden Ausgangssignal verarbeitet.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch eine Einrichtung (87) zum Zählen der Leukozyten mit der besonderen Absorptionseigenschaft.

6. Vorrichtung n3ch Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine Einrichtung (92) zum Zählen sowohl der Leukozyten mit der besonderen Absorptionscigenschaft als auch der Leukozyten ohne die besondere Absorptionseigenschaf'.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zurr Erkennen von Leukozyten mit einer besonderer

opiiscnen /\dmji μί,^:^<_Β^'·^··" ~........

einer flüssigen Blutprobe, bei dem die LeuKozyten ir einem aus der Probe gebildeten Strom nacheinander durch eine optische Kammer geleitet, die optischi Kammer mit einem quergerichteten Lichtstrahl bestrahlt und verschiedene Eigenschaften des von den dii optische Kammer durchströmenden Leukozyten beeinflußten Lichts festgestellt und miteinander verglicher werden.

Ferner bezieht sich die Erfindung auf eine Vorrichtung zum Erkennen von Leukozyten mit einet besonderen optischen Absorptionseigenschaft, enthaltend eine als optische Kammer mit einer querlaufender Lichtdurchtrittsbahn ausgebildete Durchflußzelle, eint Lichtquelle, deren Lichtstrahl entlang der Lichldurchtrittsbahn gerichtet werden kann, eine Einrichtung, mit der die Leukozyten durch die Durchfluß/eile geleitet und nacheinander dem Lichtstrahl ausgesetzt werden können, zwei Fotodetektoren zum Erfassen verschiedener Eigenschanen des von den die Durchfluß/eilt durchströmenden Leukozyten beeinflußten Lichts, cmc Einrichtung zum Vergleichen der Ausgangssignule der beiden Fotodetektoren und gegebenenfalls cmc Schwellwertschaltung.

Die Erfindung betrifft somit beispielsweise die Feststellung der Population einer Unterklasse vor gefärbten Leukozyten in piner Suspension aus gefärbte!: und ungefärbten Leukozyten, beispielsweise in einer menschlichen Blutprobe.

Bekanntlich ist die Kenntnis der Populationen vor besonderen Leukozyten in einer menschlichen Blutprobe und die Kenntnis der Beziehung zwischen dieser Populationen untereinander bei der Krankheitsdiagnose und auf dem Gebiet der medizinischen Forschung von großer Bedeutung. Verfahren und Vorrichtungen die zur Feststellung der Populationen von kleiner Teilchen dienen, sind bereits aus zahlreichen Literaturstellen bekannt. Dazu wird beispielsweise verwiesen aul »Measurement of Small Particles Using Light Scattering: A Survey of the Current State of the Art«, von A. E Martens, Ann., N. Y. Ada. Sei.. 58,690 bis 702; »Rapic Multiple Mass Constituent Analysis of Biological Cells« von LA. K a m e η t s k y et al., Ann. N. Y. Acad. Sei. 157, 310 bis 323; und »Absorption Cytophotomctry Comparative Methodology for Heterogeneous Objects and the Two-Wavelength Method« von M. L Mendelsohn in »Introduction to Quantitative Cytochemistry«, herausgegeben von George L. Wied Academic Press. 1966, S. 201 bis 214.

Das eingangs beschriebene Verfahren und die Vorrichtung zum Erkennen von Leukozyten mit einer besonderen optischen Absorptionseigenschaft geher von einem Stand der Technik aus, wie er in der US-PS 36 62 176 beschrieben ist. Aus dieser Druckschrift isl eine elektrooptische Anordnung zur Partikelanalysc bekannt, deren Anwendungsbereich auf dem Gebiet der medizinischen Forschung und Diagnose liegt. Bei dieser bekannten Anordnung werden kleine Teilchen nachein ander als Strom an einer optischen Detektoreinrichtuni; vorbeigeführl. Es sind mindestens zwei Fotodetektorer vorgesehen, die die optische Reaktion jedes Teilchen¹ auf die Bestrahlung mit einem Lichtstrahl feststellen Die unterschiedlichen optischen Reaktionen, die vor den verschiedenen Detektoren nachgewiesen werden dienen zur Frzeugung von elektrischen Signalen, mn denen man Unterschiede in den verschiedenartigen