DE2247608B2 - Mittel und verfahren zur enzymatischen bestimmung von glucose - Google Patents

Description

nis der Enzymeinheiten von Glucosedehydro- io mit aromatischen Aminen wie z. B. o-Toluidin zu genäse zu Mutarotase 10: 0,25—10:1 beträgt so- Farbstoffen. Obwohl die Methode als Routinebestimmung weit verbreitet ist, läßt ihre Spezifität zu wünschen übrig, da neben Glucose alle anderen Aldosen

ebenfalls reagieren. Eine empfindliche Störung dieses

wie gegebenenfalls Inhibitoren für Oxidasen von reduzierten Pyridin-Coenzymen und/oder Alkalichlorid

2. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von 15 Tests tritt bei der Glucosebestimmung im Serum bei Glucose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich- Patienten auf, welche Infusionen von Plasma-Expannet, daß die Glucosedehydrogenase eine Aktivität dem auf Dextran-Basis erhielten, da hierbei im Testvon mindestens 2 U/ml Testlösung hat. gemisch Trübungen entstehen. Außerdem macht das

3. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von zur Kondensation erforderliche Kochen mit Säure Glucose nach einem der Ansprüche 1 und 2, da- ao die Bestimmung lästig und zeitraubend.

durch gekennzeichnet, daß die Pyiidin-Coenzyme Neben dieser sogenannten o-Toiuidin-Methode

Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) oder Ni- sind vor allem zwei enzymatische Verfahren zur Be

cotinamid-adenin-dinucleotid phosphat (NADP) Stimmung von Glucose gebräuchlich: Die Glucose-

sind.

oxidase-Methode und die Hexokinase-Methode.

4. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von 25 Bei der Glucoseoxidase-Methode wird die Glucose Glucose nach einem der Ansprüche 1 bis 3, da- unter Glucoseoxidase-Katalyse durch Sauerstoff zu

Gluconsäure oxidiert, wobei Wasserstoffperoxid entsteht, das seinerseits in einer katalysierten Folgereaktion ein farbloses Chromogen zu einem Farbstoff

durch gekennzeichnet, daß die Puffersubstanzen einen pH-Wert von 6,5—8,5 aufrechterhalten.

5. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von

Glucose nach einem der Ansprüche 1 bis 4, da- 30 oxidiert. Als Katalysator der Folgereaktion kann z. B. durch gekennzeichnet, daß die gegebenenfalls ent- Peroxidase dienen; ein häufig verwendetes Chromohaltenen Inhibitoren für Oxidasen von reduzier- gen ist o-Dianisidin. Die Glucoseoxidase ist weitten Pyridin-Coenzymen Pyridin-, Purin- und/oder gehend spezifisch für Glucose, jedoch wird die Folge-Hydroxybenzoesäurederivate sind. reaktion durch Stoffe gestört, die Wasserstoffperoxid

6. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von 35 verbrauchen. In Körperflüssigkeiten stören insbeson-Glucose nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da- dere Harnsäure, Ascorbinsäure und Katalase. Weitere Nachteile sind die lange Analysendauer und die Tatsache, daß das Chromogen o-Dianisidin medizinisch nicht unbedenklich ist.

Als die Glucosebestimmung mit der höchsten Spezifität wird die enzymatische Bestimmung mit Hexokinase/Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase angese-

durch gekennzeichnet, daß die gegebenenfalls enthaltenen Inhibitoren für Oxidasen von reduzierten Pyridin-Coenzymen 3-Acetylchinolin und/ oder Sulfosalicylsäure sind.

7. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das gegebenenfalls enthaltene Alkalichlorid Natriumchlorid ist.

hen. Hierbei wird die Glucose mit Adenosintriphosphat/Hexokinase phosphoryliert und das gebildete

8. Verfahren zur enzymatischen Bestimmung 45 Glucose-6-phosphat mit Glucose-6-phosphat-Dehyvon Glucose, dadurch gekennzeichnet, daß man drogenase zu Gluconat-6-phosphat dehydiert, wobei ein Mittel nach einem der Ansp -üche 1 bis 7 auf der Wasserstoff auf Nicotinamid-adenin-dinucleotiddie 2:u untersuchende glucosehiiltige Probe ein- phosphat (NADP) übertragen wird; das reduzierte wirken läßt und den Gehalt an gebildetem redu- Coenzym wird photometrisch bestimmt. Wegen dei ziertem Pyridin-Coenzym spektrophotometrisch 50 zentralen Stellung von Glucose-6-phosphat im Koh-

oder fluorometrisch mißt.

lenhydratstoffwechsel ist der Test anfällig gegen Störungen durch Fremdenzyme wie Phosphoglucose-Isomerase, Phosphoglucomutase und Gluconat-6-phosphat-Dehydrogenase. Es wird daher empfohlen, die Störreaktionen durch Extrapolation zu eliminieren (H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischem Analyse, 2. Auflage, S. 1166, 1970, Verlag Chemb, Weinheim). Dadurch wird jedoch die Bestimmungsmethode unsicher, umständlich und zeitraubend (ca,

Die wichtigste Routineanalyse im klinischen Laboratorium ist die Blutzuckerbestimmung. Sie dient zur

Erkennung und zur Therapiekontrolle des Diabetes 60 20 bis 30 Minuten für eine Einzelbestimmung), mellitus und zur Diagnose einiger anderer Stoff- Es wurde nun gefunden, daß die Nachteile dei

bisher in der Praxis angewandten Methoden zur Glucosebestimmung vermieden werden können, wenn

wechselkrankheiten.

Zur quantitativen Bestimmung des Blutzuckers benötigt man spezifische Methoden. Die ältesten Bestimmungsarten basieren auf dem Reduktionsvermö- 65 Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist dem gen der Glucose, wobei Stoffe wie Kaüumhexacyano- nach ein neues Mittel zur enzymatischen Bestimmung

man ein neues enzymatisches Mittel anwendet.

ferrat(III), Pikrinsäure oder Kupfer(H)-ionen in alkalischer Lösung als Oxidationsmittel verwendet wer-

von Glucose mittels Glvicosedehydrogenasc, einem Pyridin-Coenzym und Puffersubstanzen unter Bildung

von Gluconsäure und reduziertem Pyridin-Coenzym, schlägigen Literatur gegen die Verwendung von GIu-

das gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an Muta- cosedehydrogenase für die enzymatische Glucose-

rotase, wobei das Verhältnis der Enzymeinheiten von bestimmung.

Glucosedehydrogenase zu Mutarotase 10:0,25— Mit der vorliegenden Erfindung ist es gelungen,

10 :1 beträgt sowie gegebenenfalls Inhibitoren für 5 erstmals ein Mittel und Verfahren zur enzymatischen

Oxidasen von reduzierten Pyridin-Coenzymen und/ Glucosebestimmung mit Hilfe von Glucosedehydro-

oder Alkalichlorid. genäse zur Verfügung zu stellen, das bei einfacher

Ferner umfaßt der Gegenstand der Erfindung ein Handhabung rasche und zuverlässige Ergebnisse

Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von GIu- liefert

cose, das darin besteht, daß man das vorstehend ge- ίο Im folgenden wird die Erfindung näher beschrieben:

nannte und im folgenden näher beschriebene Mittel Die im Mittel nach der Erfindung enthaltene GIu-

auf die zu untersuchende glucosehaltige Probe ein- cosehydrogenase muß möglichst rein sein. Die im

wirken läßt und den Gehalt an gebildetem reduzier- Test verwendeten Aktivitäten der Glucosedehydro-

tem Pyridiii-CGenzym in an sich bekannter Weise genäse richten sich vor allem nach der Zeit, innerhalb

spektrophotometrisch oder fluorimetrisch mißt. 15 der der Endpunkt der Reaktion erreicht sein soll. Die

Das neue Mittel nach der Erfindung zeichnet sich Enzymaktivität kann dabei zweckmäßigerweise in

gegenüber der vorbekannten Glucoseoxidase-Me- einem Bereich von etwa 2—200 U/ml Testlösung

thode dadurch aus, daß es spezifisch den Glucose- variiert werden. Vorzugsweise verwendet man

gehalt mißt und nicht durch andere Oxidations- oder 4—20 U/ml Testlösung zusammen mit dem Enzym

Reduktionsmittel gestört wird. Gegenüber der vor- ao Mutarotase.

bekannten Hexokinase-Methode hat das neue Mittel Die Herstellung der verwendeten Glucosedehydro-

den Vorteil, daß bei seiner Anwendung nur eine ein- genäse erfolgt aus Mikroorganismen, vorzugsweise

stufige Reaktion verwendet wird, wobei anstelle von aus Mikroorganismen der Gattung Bazillus, wobei

zwei Enzymen bei der Hexokinase-Methode hier nur das mikrobielle Ausgangsprodukt eine Glucosedehy-

ein Enzym erforderlich ist. Da keine Indikatorreak- as drcgenase-Aktivität von mindestens 5 U/ml Roh-

tion nötig ist, ist auch eine dadurch bedingte mög- extrakt enthält. Die weitere Aufreinigung erfolgt z. B.

liehe Störung ausgeschaltet, was einen wesentlichen analog der in The Spores III, 97 (1965) beschrie-

Vorteil gegenüber der GOD- und Hexokinase-Me- benen Methode. Auf diese Weise sind lyophilisierte

thode bedeutet. Glucosedehydrogenase-Präparate erhältlich, die mehr

Die Bestimmung benötigt in einer bevorzugten Aus- 30 als 2 U/mg Trockensubstanz enthalten und deren

führungsform etwa 5 Minuten, womit sie bereits dop- gute Löslichkeit die Herstellung von Lösungen mit

pelt so schnell wie die zur Zeit schnellste enzyma- mehr als 200 U/ml erlaubt; die störende NADH₂-

tische Glucosebestimmung (Hexokinase-Methode Oxydase-Aktivität beträgt weniger als 1 Vw der GIu-

ohne Extrapolation der Större.-.ktion) ist. Die Umsatz- cosedehydrogenase-Aktivität. Die im Vergleich mit

zeit läßt sich durch Erhöhung der Enzymaktivitäten 35 früher beschriebenen Präparaten um Größenordnun-

im Test noch wesentlich herabsetzen, so daß neben gen bessere Qualität des Enzyms ermöglichte erst

der Spezifität auch die Einfachheit und Schnelligkeit seinen Einsatz in der enzymatischen Glucose-

des erfindungsgemäßen Tests von keiner anderen bestimmung.

Glucose-Bestimmung erreicht wird. Die im eiiindungsgemäßen Mittel enthaltener

Vor längerer Zeit wurde vorgeschlagen, Glucose 40 Pyridin-Coenzyme sind vorzugsweise Nicotinamid-

durch eine Indikatorfarbreaktion mit Hilfe von GIu- adenin-dinucleotid (NAD) oder Nicotinamid-adenin-

cosedehydrogenase (GDH) und Nicotinamid-adenin- dinucleotid-phosphat (NADP), insbesondere NAD

dinuoleotid (NAD), insbesondere in Gegenwart von Die Coenzymkonjentration kann in den Grenzer

Diaphorase oder Xanthinoxidase, zu bestimmen (ka- von 2,0 mM bis 5,0 mM variiert werden, ohne daC

nadische Patentschrit 7 45 087), jedoch ohne Muta- 45 die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflußt wird. Ir

rotationsbeschleuniger. In der Praxis ist Glucose- einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die End

dehydrogenase noch nie für diesen Zweck verwen- konzentration im Test etwa 2,8 NAD. Anstelle vor

det worden. NAD und NADP können auch andere NAD-aktive

Aus der einschlägigen Literatur (Methods in Enzy- Substanzen wie z. B. Thio-NAD oder Thio-NADP

mology, Vol. IX, 92—111, Acad. Press New York, 50 verwendet werden.

London, 1966; R.P.Metzger u.a., J. Biol. Chem. Da die Glucosedehydrogenase spezifisch für/S-GIu

239, 1769—1772 [1964] und 240, 2767—2771 cose ist, muß die im Gleichgewicht stets vorliegend«

[1965] und N. G. Brink, Acta chem. Scand. 7, α-Glucose zunächst mutarotieren, bevor sie von de

1081—1088 [1953]) war bekannt, daß die Glucose- Glucosedehydrognase umgesetzt wird, d. h., bei hohe

dehydrogenase eine Reihe von ungünstigen Eigen- 55 Glucosedehydrogenase-Aktivität reagiert die im Re

schäften besitzt, die einer analytischen Verwendung aktionsgemisch vorhandene ^-Glucose schnell ab

entgegenstehen. So sind z. B. häufig die Glucose- was sich im steilen Extinklionsanstieg zu Beginn de

dehydrogenasen an Partikeln gebunden und/oder er- Reaktion zeigt. Die langsamze Mutarotation de

weisen sich als nicht NAD- bzw. NADP-abhängig. α-Glucose manifestiert sich in der verzögerte!

Ferner ist bekannt, daß Glucosedehydrogenase eine 60 NADH₂-Bildung, die erst nach mehr als 30 Minutei

geringe Aktivität und/oder eine zu geringe Stabilität abgeschlossen ist. Das erfindungsgemäße Mittel ent

aufweist. Die Michaelis-Konstanten der Glucose- hält deshalb Mutarotase. Die Beschleunigung der Mu

dehydrogenase zur Glucose betragen lediglich tarotation durch das Enzym Mutarotase ist zwar fü

0,007—2, d. h., erst in einer 0,007molaren Lösung die Glucosebestimmung mit Glucoseoxidase bekann

ist das Enzym zur Hälfte mit Substrat gesättigt. Bei 65 (J. Okuda, I. Miwa, Anal. Biochem. 43, 31:

der üblichen Blutzuckeranalyse stehen jedoch nur [1971]); es war jedoch nicht naheliegend, daß be

etwa 0,0000001 Mol Glucose zur Verfügung. Es be- Zusatz von Mutarotase zum Glucosedehydrogenase

stand demnach ein erhebliches Vorurteil in der ein- NAD-System ebenfalls eine sehr effektive Beschleuni

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gung eintritt. Aus H. U. Bergmeyer, Methoden Für Messungen mit hohen Genauigkeitsanfcrdeder enzymatischen Analyse, 2. Auflage, S. 1172, rangen, wie sie die Bestimmung der Glucose in Kör-1970, Verlag Chemie, Weinheim, ist bekannt, daß perflüssigkeiten stellt, macht sich auch der Einfluß hochgereinigte Glucoseoxidasepräparate meist noch eines geringen Anteils an Oxidasen von reduzierten Mutarotase enthalten. Es wird deshalb dort vor- S Pyridin-Coenzymen bemerkbar. Sie bewirken, daß geschlagen, die Reaktionszeit so groß zu wählen, das gebildete reduzierte Pyridin-Coenzym wieder daß mit Sicherheit auch sämtliche α-Glucose um- oxidiert wird. Die als Meßgröße dienende Extinktion gesetzt wird. Bei der erfindungsgemäßen Glucose- bleibt daher nicht konstant, sondern fällt nach Erbestimmung mit Glucosedehydrogenase soll jedoch reichen eines Maximalwertes wieder ab. Hinzu die Reaktionszeit bis auf wenige Sekunden im Ex- io kommt, daß die gemessene maximale Extinktion getremfall verkürzt werden. Daraus ergibt sich eine ringer ist als der unter Zugrundelegung des Extinkenorme Zeitersparnis, wenn man bedenkt, daß in tlonskoeffizienten von z. B. NADH₂ errechnete Wert großea klinischen Laboratorien täglich tausende von (ca. 3—5Vo zu niedrig bei l°/oo NADH.,-Oxidase). Glucosebestimmungen durchgeführt werden. Es ist Aus diesem Grunde ist es vorteilhaft, wenn das Mitdeshalb erforderlich, dem Mittel nach der Erfindung 15 tel nach der Erfindung gegebenenfalls Inhibitoren für relativ große Mengen an Mutarotase zuzusetzen. Da Oxidasen von reduzierten Pyridin-Coenzymen entjedoch selbst hochgereinigte Mutarotase stets ungün- hält.

stige Nebenaktivitäten besitzt, war es überraschend, Da sich die präparative Abreicherung der in der

daß der erfindungsgemäße Mutarotaseumsatz keinen Glucosedehydrogenase noch vorhandenen Reste von

störenden Einfluß auf die Gesamtreaktion hat. Eine ao NADH,-Oxidase als zu aufwendig erwies, ist es

Mutarotase-Menge von zahlenmäßig 8°/o der GIu- zweckmäßig, den Störeffekt durch Einsatz von spezi-

cosedehydrogenase-Aktivität ist bereits ausreichend fischen Inhibitoren zu unterdrücken. Es wurde nun

für die optimale Reaktionsbeschleunigung; der Mu- überraschenderweise eine Reihe von Inhibitoren ge-

tarotase-Anteil kann jedoch beliebig erhöht werden, funden, die in bereits relativ geringen Konzentra-

ohne daß sich ein negativer Einfluß auf das Test- 25 tionen das Störenzym wirksam hemmen, ohne die

system bemerkbar macht. Aktivitäten von Glucosedehydrogenase oder Mutaro-

Im erfindungsgemäßen Mittel zur Glueosebestim- tase wesentlich zu beeinflussen. Es handelt sich dabei

mung beträgt das Verhältnis der Glucosedehydro- vor allem um Pyridin-, Purin- und Hydroxybenzoe-

genase-Aktivität zur Mutarotase-Aktivität etwa säurederivate.

10:0,25—10:1. Einen qualitativen Reaktionsablauf 30 Geeignet sind Pyridinderivate, die in 2- und/oder

innerhalb von 5 Minuten (was einer mehr als sechs- 3- und/oder 4-Stellung durch niederes Alkyl, Phenyl,

fachen Beschleunigung gegenüber dem analogen niederes Hydroxyalkyl, niederes Halogenalkyl, Car-

Testsystem ohne Mutarotase entspricht) erreicht man oxy, niederes Acyl, Benzoyl, Carbonamid und Amino

ζ. B. mit Aktivitäten von 4 U Glucosedehydrognase substituiert sind, wobei in 5,6-Stellung ein Benzol-

und 0,4 Einheiten Mutarotase pro ml Meßansatz. Bei 35 kern ankondensiert sein kann, wie z. B. Nicotinsäure,

2OU Glucosedehydrogenase und 2 Einheiten Muta- Nicotinsäureamid, 2-Amino-4-methyl-pyridin, 2-Me-

rotase pro ml Testlösung beträgt die Umsatzzeit z. B. thyl-3-(/J-hydroxyäthyl)-pyridin, 3-Hydroxymethyl-

weniger als eine Minute. Bei Einsatz von mehr als pyridin, 2-Hydroxymethyl-pyridin, 2-Benzol-pyridin,

100 U Glucosedehydrogenase und 10 Einheiten Mu- Chinolinsäure-a-methylester, 3-Acetylchinolin, Chi-

tarotase pro ml Testlösung können Umsatzzeiten in 40 naldinsäure, Chinolyl-2-chlormethan, Chinaldin,

der Größenordnung von 10 Sekunden erreicht wer- 2-Phenyl-chinolinsäureamid und/oder Atophan. Vor-

den. Allerdings müssen in diesem Fall die Enzyme zugsweise verwendet man 3-Acetylchinolin, Nicotin-

höher aufgereinigt werden oder die störenden Neben- säure, Chinolyl-2-chlormethan, Chinaldinsäure und/

akitivitäten müssen unterdrückt werden. oder Nicotinsäureamid, insbesondere 3-Acetylchino-

Zur Erzielung eines schnellen und qualitativen 45 Hn.

Glucoseumsatzes, zur Beseitigung bzw. Unterdrük- Geeignete Purinderivate sind z. B. Harnsäure, Cof-

kung störender Nebenaktivitäten und zur Stabilisie- fein, Theophyllin oder Purine, die in 2- und/oder

rung der Glucosedehydrogenase enthält das Mittel 6-Stellung Hydroxy- und/oder Aminogruppen und

nach der Erfindung gegebenenfalls noch weitere Be- in 7-Stellung einen Ribose- oder Desoxyriboserest

standteile, wie Inhibitoren für Oxidasen von redu- 50 tragen, wie z. B. Xanthosin, 2-Desoxyguanosin, Ino-

zierten Pyridin-Coenzymen und/oder Alkalichlorid. sin usw. Besonders geeignet aus dieser Gruppe sind

Um den pH-Wert des Bestimmungsansatzes in Xanthosin und/oder Harnsäure,
einem Bereich zwischen etwa 6,5 und 8,5, Vorzugs- Geeignete Hydroxybenzoesäurederivate sind solweise 7 bis 8, zu halten, enthält das Mittel einen Puf- ehe, die in 2- oder 3-Stellung eine freie oder aeylievte fer. Der Puffer wird vorzugsweise in einer Konzentra- 55 Hydroxygruppe tragen und die zusätzlich durch eine tion von etwa 50 bis 200 mM verwendet. Niedrigere Sulfonsäuregruppe substituiert sein können, wobei oder höhere Konzentrationen stören grundsätzlich die Carboxylgruppe auch als Amid vorliegen kann, nicht, sofern die Löslichkeit der verschiedenen Be- wie z. B. m-Hydroxybenzoesäure, Salicylsäure, Acestandteile nicht herabgesetzt wird und die Puffer- tylsäure, Salicylamid und/oder Sulfosalicylsäure, vorkapazität ausreicht, um den angegebenen pH-Be- 60 zugsweise 3-Acetylchinolin und Sulfosalicylsäure. Als reich, d. h. den optimalen Bereich der Enzymaktivität gut geeignet erwies sich auch l-(p-Chlorphenylsulim Meßansatz, aufrechtzuerhalten. Als Puffer korn- fonyl)-3-propylharnstoff. Insbesondere ist die Anmen die üblicherweise eingesetzten Verbindungen in wendung von Sulfosalicylsäure wegen der starken Frage, die das Gemisch auf dem genannten pH von NADH₂-Oxidase-Hemmung, der guten Löslichkeit, etwa 6,5—8,5 halten, wie z. B. Phosphat, Trishydroxy- 65 der relativ geringen Beeinflussung von Glucosedehymethylaminomethan, Diäthanolamin, Triäthanolamin, drogenase und Mutarotase, der leichten Zugänglich-Collidin, Borat usw., vorzugsweise Phosphat- und keit und der unproblematischen Handhabung bevor-TrisDuffer. zugt.

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Der Gehalt an NADH₂-Oxidase-Hemmer im Test- durchgeführt, indem man dais vorstehend beschrie-

system ist variabel, er richtet sich von Fall zu Fall bene Mittel auf die zu untersuchende glucosehaltige

nach der vorliegenden Aktivität des Störenzyms in Probe einwirken läßt und den Gehalt an gebildetem

der GDH-Präparation. Die Inhibitoren werden vor- reduziertem Pyridin-Coenzym spektrophotometrisch

teilhaft in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 5 oder fluorimetrisch mißt. Dazu wird die Pufferlösung,

100 mM (Endkonzentration im Meßansatz), insbe- das Enzymgemisch aus Glucosedehydrogenase und

sondere von etwa 10—50 mM zugesetzt. Mutarotase sowie die Probe in einer Küvette ge-

Gegebenenfalls kann das Mittel nach der Erfin- mischt und die Extinktion E₁ bzw. E_1(blind) abgedung noch Alkalichlorid wie Lihtium-, Natrium- gelesen, sobald keine Extinktionsänderung mehr auf- und/oder Kaliumchlorid enthalten, insbesondere Na- io tritt. Die Blindprobe enthält anstelle der Probelösung tiiumchlorid. Es ist bekannt, daß die Hitzestabilität destilliertes Wasser. Anschließend wird die Reaktion von gelöster Glucosedehydrogenase durch Natrium- durch Zugabe der Coenzymiösung gestartet. Wenn chlorid-Zusatz erhöht werden kann. Glucoscdehydro- die Extinktion konstant geworden ist, wird E₂ bzw. genase-Lösungen mit einem Natriumchloridgehalt E_{2 (bUnä)} abgelesen und aus den erhaltenen Meßwervon 3 M sind bei Kühlschranklagerung monatelang 15 ten der Glucosegehalt der Probe nach Bücher haltbar. Da das Enzym bei pH 8,2, dem pH-Wert (Hoppe-Seyler/Thierfelder, Handbuch der des Testansatzes zur Aktivitätsbestimmung, bei Na- physiologisch- und pathologisch-chemischen Analyse, triumchlorid-Konzentrationen > 0,8 M durch das 10. Auflage, Springer-Verlag Berlin/Göttingen/Hei-SaIz gehemmt wird, müssen gelagerte Lösungen, die delberg/New York, S. 292 ff.) berechnet.
3 M Natriumchlorid enthalten, in der Aktivitätsbe- 20 Die Meßtemperatur ist nicht kritisch. Es empfiehlt Stimmung verdünnt werden. Hierbei zeigte sich der sich, die Bestimmung bei etwa 20—40° C durchzuüberraschende Effekt, daß Präparationen, deren Ak- führen, vorzugsweise bei Raumtemperatur. Die tivität bereits stark abgesunken war, durch das Salz Extinktionsmessungen erfolgen im UV-Bereich zwiwieder reaktiviert wurden. Im Extremfall konnte ein sehen 300 und 400 nm, vorzugsweise bei 366 nm. Aktivitätsverlust von 86,4 °/o wieder rückgängig ge- as Anstelle der Extinktionsmessung im UV-Bereich macht werden. Für die Reaktivierung des Enzyms kann die NADH₂-Konzentration auch fluorimetrisch ist es erforderlich, die Natriumchlorid-Konzentration bestimmt werden. Hierzu wird bei 366 nm oder bei in der Enzymlösung mindestens eine Stunde lang auf 313 und 366 nm angeregt und die Fluoreszenz-Emis-3 Mol/l zu halten und anschließend zu verdünnen. sion oberhalb 420 nm gemessen; die Eichung erfolgt Um die maximale Reaktivierung der Glucosedehy- 30 mit Glucoselösungen bekanntem Gehalts,
drogenase zu erreichen, stellt man die Konzentration Bei der Bestimmung von Glucose in Körperflüssigzweckmäßigerweise zwischen 0,05 und 0,1 M Na- keiten, wie z. B. Blut, Serum oder Plasma oder in antriumchlorid ein. Vorzugsweise verwendet man ein deren eiweißhaltigen Proben empfiehlt sich eine vor-Glucosedehydrogenase-Konzentrat, das 2- bis 5-, ausgehende Enteiweißung mit den üblichen Entinsbesondere 3molar an Natriumchlorid ist. Für die 35 eiweißungsmitteln wie z. B. Trichloressigsäure, Per-Glucosebestimmung verdünnt man das Konzentrat chlorsäure oder Uranylacetat/Nitriumchlorid. Eine so, daß die Konzentration an Natriumchlorid im Meß- Enteiweißung von Serum oder Plasma ist jedoch nicht ansatz 0,05- bis 0,1 molar ist. Auf diese Weise wird unbedingt erforderlich.

sowohl die optimale Stabilität des Enzyms bei der Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung

Lagerung als auch die optimale Aktivität im Test- 40 läßt sich auch an Analysenautomaten durchführen,

ansatz erreicht. Dazu werden die zu bestimmenden Proben über einen

Das Mittel nach der Erfindung kann zusätzlich Probesammler einem Analysensystem zugeführt, in

weitere Bestandteile enthalten, die üblicherweise für welchem den einzelnen Proben die Bestandteile des

ein diagnostisches Reagenz verwendet werden. Zur Mittels nach der Erfindung zugegeben werden. Nach

Verhinderung der Bildung von störenden Luftbläs- 45 Mischung und Reaktionsablauf wird die Reaktions-

chen in der Meßküvette oder zur schnelleren Lösung lösung einem Spektrophotometer zugeführt und ge-

der Festsubstanzen empfiehlt sich z. B. die Zugabe messen.

eines Detergens in einer Konzentration zwischen 0,01 Neben der Bestimmung von Glucose in biologischen

und 0,1 Gew.-o/o. Als Detergenzien kommen z. B. Flüssigkeiten, wie Blut, Serum, Plasma, Harn usw.,

äthoxyliertes Glycerin-Monooleat oder langksttige 50 ist das erfindungsgemäße Mittel und Verfahren auch

Polyglykolether in Frage. für die Industrie, insbesondere die Lebensmittelindu-

Die Stabilität der verwendeten Enzyme und Re- strie, von großer Bedeutung. Glucosebestimmungen agenzien erlaubt die Konfektionierung des Testsy- sind z. B. von Interesse bei der Analyse von Honig, stems, wobei das Nicotinamid-adenin-dinucleotid Früchten, Marmeladen, Süßwaren, Obstsäften, Restzweckmäßigerweise gefriergetrocknet wird und die 55 süße im Wein usw. sowie in der Zuckerfabrikation. Enzyme Glucosedehydrogenase und Mutarotase ent- Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beiweder gefriergetrocknet oder in Lösung vorliegen spiele näher erläutert:
können. Die Enzyme können vorgemischt oder ge- .
trennt sein, der Puffer kann als Lösung mit dem Beispiel 1
NADHj-Oxidase-Inhibitor und dem Detergens in 60 0,1 ml Serum werden mit 1 ml 3<>/oiger Trichlorder Testpackung enthalten sein. In dieser Form ist essigsäurelösung enteiweißt 0,2 ml des Überstandes das Testsystem bei Kühlschranklagerung mindestens werden zu 2 ml 0,1 M Trispnffer (pH 8,5), der ein Jahr haltbar. 0,5 mM 3-Acetylcholin enthält, in eine Küvette ge-

Zur Durchführung des Tests werden die in trok- geben. Anschließend werden 0,1 ml Enzymgemisch kener Form vorliegenden Bestandteile zweckmäßiger- 65 zupipettiert, das 120UGDWmI und 12 Einheiten weise erst kurz vor Gebrauch durch Zugabe der ent- Mutarotase/ml in 0,05 M Cit ratpuffer (pH 6,5)/3 M sprechenden Menge Lösungsmittel wieder in Lösung Natriumchlorid enthält Die Blindprobe enthält angebracht Das Verfahren nach der Erfindung wird stelle der Probeiösung 0,2 ml des Enteiweißungsmit-

tels. Analysenprobe und Bliridprobe werden durchgemischt und die Extinktionen bei 366 nm abgelesen, sobald keine Extinktionsänderungen mehr auftreten (ca. 1—2 Minuten).

Die Reaktion wird dann durch Zugabe von 0,02 ml der wäßrigen Coenzymlösung gestartet, die 0,58 M NAD enthält. Nach etwa 5 Minuten ist die Reaktion beendet, und die Extinktionen werden abgelesen. Aus der gemessenen Extinktionsdifferenz AE = 0,326 bei 366 nm errechnet sich ein Glucosegehalt von 227 mg/100 ml Serum.

Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn man eine 0,1-M-TrispuiIerlösung verwendet, die anstelle von 0,5 mM 3-Acetylcholin 45 rriM Nicotinsäure, 1,6 mM Nicotinsäureamid, 0,4 mM Chinaldinsäure oder 0,13 mM Chinolyl-2-chIormethan enthält.

Die im Test angegebenen Mutarotase-Eiinheiten wurden wie folgt festgelegt:

In eine Küvette werden 3 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 100 U Peroxidase/ml Puffer, 0,05 ml o-Dianisindinlösung (10 mg/ml Wasser), 0,1 ml Glucoseoxidaselösung (600 U/ml Wasser) und 0,05 ml Mutarotaselösung unbekannter Aktivität pipettiert. Durch Zugabe von 0,1 ml frisch bereiteter ft-Glucoselösung (0,3 mg/ml Wasser) wird die Reaktion gestartet. Bei 25° C und 436 nm wird die Extinktionszunahme pro Minute registriert. In gleicher Weise wird ein Blindwert bestimmt, wobei anstelle der Mutarolaselösung Wasser eingesetzt wird. Die für Blindwert und Meßwert erhaltenen Extinktionszunahmen pro Minute Δ E bzw. Δ E_blind werden in folgende Berechnungsformel eingesetzt:

Mutarotase-Ei nheiten/mlEnzymlösung = 0,05

Beispiel 2

0.02 ml Serum werden direkt in die Reaktion eingesetzt. Die Durchführung der Bestimmung erfolgt analog Beispiel 1, wobei folgende Bestandteile in der Reihenfolge ihrer Zugabe verwendet werden:

2 ml 0,2 M Trispuffer (pH 7,3), enthaltend

3 mM Coffein,

0,02 ml Serum bzw. Wasser bei der Blindprobe, 0,1 ml Enzymgemisch, hergestellt durch Lösen eines Lyophilisats in Citratpuffer (pH 6,5), so daß 120U GDH/ml und 12 Einheitein Mutarotase/ml vorliegen,

0,02 ml wäßrige Coenzymlösung, enthaltend 0,32MNAD.

0,05 M Citratpuffer (pH 6,5), der 3 M an Natriumchlorid ist,

0,02 ml wäßrige Coenzymlösung, enthaltend

0,23 M NAD.

Nach etwa zwei Minuten ist die Reaktion abgelaufen. Die errechnete Extinktionsdifferenz Δ E= 0,305 ergibt einen Glucosegehalt von 212 mg/100 ml Harn. Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn man eine Pufferlösung verwendet, die anstelle von 40 mM Sulfosalicylsäure 1 mM m-Hydroxybenzoesäure, 0,5 mM Salicylsäure, 0,7 mM Acetylsalicylsäure, 10 mM Salicylamid oder 50 mM l-(p-Chlorphenylsulfonyl)-3-propylharnstoff enthält.

Nach Ablauf der Reaktion (ca. 5 Minuten) errechnet sich aus der gemessenen Extinktionsdifferenz AE- 0,164 ein Glucosegehalt von 96 mg/100 ml Serum.

Die gleichen Ergebnisse wurden erhalten, wenn man eine Pufferlösung verwendet, die anstelle von 3 mM Coffein, 0,35 mM Harnsäure, 21 mM Theophyllin, 2,6 mM Desoxyguanosin, 30 mM Inosin oder 50 mM Xanthosin enthält.

Verwendet man anstelle deir obigen Enzyme ein hochgereinigtes Enzymgemisch mit 2500 U GDH/ml und 250 Einheiten Mutarotase/ml, so ist die Reaktion bereits nach 10 Sekunden beendet Das Ergebnis ist das gleiche wie oben.

Beispiel 3

Urin wird mit bidestilliertem H₂O im Verhältnis 1:11 verdünnt und 0,2 ml der erhaltenen Probelösung in die Reaktion eingesetzt Die Durchführung der Bestimmung erfolgt analog Beispiel 1, wobei folgende Bestandteile in der Reihenfolge ihrer Zugabe verwendet werden:

2 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5), enthaltend 40 mM Sulfosalicylsäure,

0,2 ml verdünnter Urin bzw. Wasser bei der Blindprobe,

0,1 ml Enzymgemisch, enthaltend 300U GDH/ ml, und 30 Einheiten Mutarotase/ml, gelöst in

55

Beispiel 4

Eine Probe von 54,0 mg Honig wird in bidestilliertem Wasser gelöst, auf 100ml aufgefüllt und 0,2ml hiervon zur Glucosebestimmung eingesetzt. Die Durchführung erfolgt analog Beispiel 1, wobei folgende Bestandteile in der Reihenfolge ihrer Zugabe verwendet werden:

2 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,3), enthaltend 40 mM Sulfosalicylsäure,

0,2 ml der zu untersuchenden Lösung bzw. Wasser bei der Blindprobe,

0,1 ml Enzymgemisch, enthaltend 300 U GDH/ ml, und 20 Einheiten Mutarotase/ml,
0,02 ml wäßrige Coenzymlösung, enthaltend 0,32 M NAD, oder die entsprechende Menge NADP.

Nach Ablauf der Reaktion (ca. 2 Minuten) ergibt sich eine Extinktionsdifferenz von ΔΕ = 0,338. Daraus errechnet sich ein Gehalt von 21,4 mg Glucose pro 100 ml Untersuchungslösung; der Honig enthält somit 39,6«/o Glucose.

Beispiel 5

Eine Testpackung zur enzymatiscben Bestimmung von Glucose, ausreichend füT etwa 90 Bestimmungen und 10 Blindwerte, enthalt die folgenden Bestandteile:

110 ml eines gebrauchsfertigen Enteiweißungsmittels, und zwar entweder eine 3%ige wäßrige Lösung von Trichloressigsäure oder eine 2%>ige wäßrige Lösung von Perchlorsäure.
220 ml eines gebrauchsfertigen Puffers vom pH 7,3, und zwar entweder 200 mM Phosphatpuffer oder 100 mM Trishydroxymethylaminomethan.

11 ml einer gebrauchsfertigen Lösung von GDH und Mutarotase in 50 mM Citratpuffer (ph 6,5)/ 3 M Natriumchlorid oder ein lyophilisiertes Enzymgemisch aus GDH und Mutarotase, das zum

Gebrauch in 11. ml 50 mM Citratpuffer gelöst wird, wobei in beiden Fällen 120 U GDH/ml und 12 Einheiten Mutarotase/ml vorhanden sind.

4. Lyophilisiertes NAD oder NADP, das zum Gebrauch in 2,2 ml bidestilliertem Wasser gelöst wird, wobei sich eine Molarität von 330 mM ergibt.

Die Glucosebestiramung mit dieser Testpackung wird wie in den obigen Beispielen beschrieben ausgeführt.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose mittels Glucosedehydrogenase, einem Pyridin-Coenzym und Pufiersubstanzen unter Bildung von Gluconsäure und reduziertem Pyridin-Coenzym, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Mutarotase, wobei das Verhält-

den. Da aber bei Einsatz von Körperflüssigkeiten alle anderen reduzierenden Stoffe wie Kreatin, Kreatinin, Harnsäure, Ascorbinsäure und Glutathion ebenfalls erfaßt werden, genügt die Spezifität nicht mehr den 5 heutigen Ansprüchen.

Eine andere Gruppe von Bestimmungsmethoden beruht auf der Bildung von Furanderivaten aus Glucose unter dem wasserabspaltenden Einfluß von konzentrierten Säuren; die Furane reagieren anschließend