DE2246969C2 - Urokinase-Heparinat und dieses enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Urokinase-Heparinat und ein dieses enthaltende Arzneimittel.
Es ist bekannt, daß die Urokinase ein im Urin vorhandenes Enzym ist, daß die Umwandlung des Plasminogen in Plasmin katalysiert, wobei es sich bei letzterem um eine Peptidase handelt, deren physiologische Aufgabe darin besteht, die fibrinösen intravasculären Ausbildungen aufzulösen. Ein Defekt in den Aktivierungsmechanismen des Plasminogens führt im Falle der beschleunigten Kinetik des Systems der Koagulation oder der Veränderung der vaskulären Wände dazu, daß intravaskuläres Fibrin aufrechterhalten wird, das schließlich die verschiedenen thrombo-embolischen Syndrome verursacht (Thrombosen, Embolien, weitläufige bzw. verstreute intravaskuläre Koagulation). Die Anwendung der Urokinase in diesem pathologischen Fall ruft eine Beschleunigung der Piasminbildung hervor, insbesondere auf dem Niveau von fibrinösen Ausbildungen, wie im Schrifttum dargelegt worden ist.

Die Urokinase bildet infolgedessen ein wahlweises Behandlungsmittel für thrombo-embolische Syndrome, und ihr menschlicher Ursprung beseitigt die Gefahr von anaphylaktischen Schocks.

Es sind bereits eine gewisse Anzahl von Verfahren zur Herstellung von Präparaten gereinigter Urokinase vorgeschlagen worden, diese Verfahren haben jedoch durchweg erhöhte Ausbeuteverluste an Urokinase zur Folge. Diese Ausbeuteverluste sind deswegen um so schwerwiegender bzw. bedauerlicher, als die Kosten der Herstellung gereinigter Urokinase beträchtlich sind, und, im Falle der aus dem menschlichen Urin extrahierten Urokinase, die Ansammlung derselben in großen Mengen mühsam bzw. schwierig wird.

Andererseits ermöglichen es die bekannten Reinigungsverfahren durchweg nicht, Urokinasepräparate herzustellen, deren Gehalt an pyrogenen Substanzen genügend reduziert ist, wodurch ihre therapeutische Anwendung erleichtert würde. Tatsächlich ist dieser Gehalt an pyrogenen Substanzen derart, daß er einen Nachteil darstellt, der noch größer werden kann, wenn man die außerordentliche Empfindlichkeit in Betracht zieht, die man oft bei den Kranken beobachten kann, die einer Behandlung auf der Basis von Urokinase unterworfen sind, einer Behandlung, die zu einer Verabreichung von Urokinasedosen auf intravenösem Wege führen, welche erhöht sein können, beispielsweise 150 0OG CTA-Einheiten oder mehr bei einer einzigen Injektion erreichen können. Unter CTA-Einheiten sind normalisierte Aktivitätseinheiten an Urokinase zu verstehen, wie sie durch das »Committee on Thrombolytic Agents, National Heart Institute« (USA) angenommen bzw. eingeführt worden sind.

Eine weitere Schwierigkeit besteht schließlich darin, daß es schwierig ist, Urokinasepräparate großer Stabilitat herzustellen, wodurch die Fragen der Lagerung wie die Probleme, welche die Verabreichung dieser Präparate an Patienten betreffen kompliziert bzw. erschwert werden.

Es sei darauf hingewiesen, daß diese Verabreichung, die durchweg mittels fortgesetzter venöser Perfusion von Urokinasepräparaten erfolgt, welche insbesondere durch ein Glukoseserum verdünnt sind, wegen der Tatsache der Instabilität des Enzyms in verdünnter Lösung schwierig gemacht wird, da es dieser Umstand erfordert, die Lösung sehr oft zu erneuern oder mit unterbrochenen Injektionen einer konzentrierten Urokinaselösung in das Röhrensystem einer Perfusion des Glukoseserums zu arbeiten, wenn diese Perfusion an Ort und Stelle ausgeführt wird.

Aufgabe der Erfindung ist es, alle diese Nachteile zu überwinden und ein stabilisiertes Präparat mit Urokinaseaktivität zu schaffen, welches leicht gelagert werden kann und dessen Verabreichung an Patienten durch einfache Perfusion einer Lösung dieses Präparats sowie während mehrerer Stunden erfolgen kann.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Urokinase-Heparinat gemäß Anspruch 1. Eine besonders zweckmäßige Ausführungsform ist dem Anspruch 2 oder 3 zu entnehmen.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Arzneimittel, das das erfindungsgemäße Urokinase-Heparinat neben üblichen pharmazeutischen Trägern und Verdünnungsmittel, insbesondere einer isotonischen Perfusionslösung, enthält.

Das Produkt, das durch die Reaktion der Urokinaselösung mit einer Kcparinlösung erhalten wird, besteht aus einem Komplex von Urokinase und Heparin, der zweckmäßigerweise als » Urokinase-Heparinat« bezeichnet wird, wobei zu berücksichtigen ist, daß der Ausdruck Urokinase ebensogut die reine Urokinase wie auch die als gereinigt bezeichneten Urokinasen, welche bisher in der Theraphie benutzt werden, umfassen soll.
Man erhält das Urokinaseheparinat im trockenen Zustand, insbesondere durch Lyophilisierung seiner Lösungen. Es ist stabil und kann ohne Schwierigkeiten aufbewahrt werden.

Im Überschuß behält das Urokinaseheparinat integrierend alle Eigenschaften der Urokinase, insbesondere deren pharmakologische und therapeutische Eigenschaften, und gibt stabilisierte Lösungen in gebräuchlichen

Perfusionsmedien, wie beispielsweise Lösungen des Glukoseserums von 5%.

Nachstehend wird anhand der Beispiele A bis F die Herstellung einer gereinigten bzw. apyrogenen, als Ausgangsmaterial für die weitere Umsetzung zum Heparinat geeigneten Urokinase beschrieben.

Es sei darauf hingewiesen, daß bei dem Folgenden alle Prozesse bei einer Temperatur von 4° C ausgeführt worden sind, sofern nicht in dem einen oder anderen Falle ausdrücklich ein unterschiedlicher Temperaturwert angegeben ist

Beispiel A
Herstellung einer gereinigten Urokinase

Behandlung des menschlichen Urins, der mit Essigsäure auf pH 5,6 eingestellt worden ist, mit einem Filtrierhilfsmittel, wie es im Handel unter der Bezeichnung »Hyflosupercel®« erhältlich ist

Extraktion der auf dem Hyflosupercel·⁹ adsorbierten Urokinase bei 4°C, indem man das Filtrierhilfsmittel mit einer auf pH 7,2 gepufferten Lösung von 032 M Dinatriumphosphat und 2,2 M Natriumchlorid behandelt, und Trennung durch Filtration des Hyflosupercel¹⁸; dieses wird mit einem gleichen Volumen der Pufferlösung gewaschen.

Die Lösungen (Filtrat und Waschwasser) werden vereinigt, mit 0,5 η Phosphorsäure auf pH 6,25 eingestellt; nötigeafalls werden eventuelle virusale Verunreinigungen entfernt, insbesondere durch Erwärmung auf 6O⁰C während 10 Stunden; man kühlt plötzlich auf 4° C ab und läßt 16 Stunden stehen; man scheidet den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren aus. M

Zum Rückstand, der zuvor mit 5 η Salzsäure auf pH 4,2 eingestellt worden ist fügt man Ammoniumsulfat hinzu, um die ²13 Sättigung an diesem Salz zu erreichen, wobei man die Temperatur zwischen 5° und 8° C aufrecht erhält

Man nimmt den gebildeten Niederschlag auf, der die Urokinase enthält, und löst ihn in zwei Teilen von im Verhältnis von 18 g Glucose pro Liter mit Glucose versetztem Wasser auf, und man unterwirft die Lösung einer Dialyse bis man eine Leitfähigkeit von 40 000 Mikrosiemens erhält; man trennt das Unlösliche durch Zentrifugieren, und man dialysiert den Rückstand, bis man ein Dialysat mit einem Widerstand von 22 000 Mikrosiemens erhält

Behandlung des Dialysats mit der DEAE-Cellulose (Diäthylaminoäthylcellulose) mit pH 4,5 im Verhältnis von 25 g für 14 Millionen CTA-Einheiten an Urokinase; man bewegt bzw. rührt 30 Minuten, filtert und wäscht das Harz mit einer Ammoniumsulfatlösung eines Widerstandes von 15 000 Mikrosiemens und eines pH von 4,5.

Zufügung von DEAE-Cellulose mit pH 7 zum Eluat und zur Waschlösung im Verhältnis von 65 g zu 14 Millionen CTA-Einheiten Urokinase bei 2 bis 4°C; man stellt auf pH 6,6 bis 6,8 ein; man bewegt bzw. rührt 30 Minuten; man fügt Wasser hinzu, um den Widerstand auf 9000 Mikrosiemens einzustellen, stellt den pH auf 7 ein und filtriert; man wäscht anschließend das Harz mit einer Ammoniumsulfatlösung eines Widerstandes von 9000 Mikrosiemens bei pH 7.

Nachdem die Lösung wieder auf pH 6,2 eingestellt worden ist, wird sie während einer Stunde bei 4°C im Kontakt mit Kaolin bewegt bzw. gerührt (das Kaolin ist in der Weise hergestellt worden, daß gewaschenes Kaolin in der, bezogen auf sein Volumen, dreifachen Menge an destilliertem Wasser suspendiert worden ist, diese Suspension wurde in einem Autoklaven während 90 Minuten auf 120⁰C gehalten, danach dekantiert, und das Kaolin abgetrennt sowie in einem Ofen bei 200⁰C getrocknet).

Nach dem Kaltzentrifugieren trennt man das Kaolin und suspendiert es in einer 0,05 M Pufferlösung von Phosphat und pH 6,2; man bewegt bzw. rührt während 30 Minuten und trennt das Kaolin durch Zentrifugieren; dieser letztere Vorgang des Waschens kann mehrere Male wiederholt werden.

Das Kaolin wird in einer Lösung suspendiert, die 75 g Ammoniumchlorid pro Liter einer 4°/oigen Ammoniaklösung enthält, und während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt. Das Kaolin, das vom Rückstand durch Zentrifugation abgetrennt worden ist, wird zwei weitere Male bei gleichem Prozeß der Auswaschung unterworfen.

Die Rückstände werden vereinigt und es wird 0,1 η H2SO4 hinzugefügt, um einen pH von 3,5 zu erhalten, sowie eine Lösung mit 350 Gramm Ammoniumsulfat pro Liter.

Der Niederschlag wird durch Kaltzentrifugieren aufgenommen und suspendiert sowie gegen eine 0,05 M Phosphatpufferlösung mit pH 6,2 während 18 Stunden bei +4°C dialysiert.

Diese dialysierte Lösung wird auf einer Harzkolonne filtriert, die im Handel unter der Bezeichnung Amberlite® IRC 50 bekannt ist und die einen Durchmesser von 5 cm sowie eine Höhe von 60 cm besitzt sowie mit dem 0,05 M Phosphatpuffer mit pH 6,2 neutralisiert worden ist; diese Kolonne wird mit dem gleichen Puffer gewaschen, bis es keinen Niederschlag mehr mit 5% Trichloressigsäure gibt.

Die Amberlite® IRC 50 Kolonne wird mit einer 0,2 M Pufferphosphatlösung von bei pH 8,2 eluiert, in welcher 75 g Ammoniumchlorid pro Liter gelöst sind; das Eluat wird in einem Fraktionssammelbehälter aufgefangen, der sich in einem umschlossenen Raum auf +4O⁰C befindet.

Die Fraktionen, welche die Aktivität enthalten, werden durch das Ammoniumsulfat (350 g/Liter) bei pH 3,5 zum Niederschlag gebracht. Der durch Zentrifugieren aufgenommene Niederschlag wird wieder in Lösung bei pH 7 gebracht und genügend verdünnt, so daß man einen Widerstand in der Größenordnung von 20 000 Mikrosiemens erhält.

Die auf diese Weise erhaltene Urokinaselösung kann noch mehr durch eine Dialyse unter üblichen Bedingungen gereinigt werden, damit man schließlich eine gereinigte Urokinase erhält, die lyophilisiert werden kann.

, Beispiel B

*£ Herstellung einer gereinigten Urokinase

~ Tausend Liter Urokinase werden auf Phenol aufgenommen. Die Menge des zu diesem Zwecke verwendeten

5 Phenols ist derart, daß am Ende des Sammelns die Phenolkonzentration wenigstens 0,5% beträgt Durch Zufügung von Essigsäure wird c'?r pH des auf diese Weise gesammelten Urins auf 5,8 eingestellt

(1) Adsorption der im Urin enthaltenen Urokinase auf dem Hyflosupercel®

ίο M?jx fügt zu der Mischung 5 kg Hyflosupercel® hinzu und unterwirft sie in einem doppelwandigen, auf 4°C ' gekühlten Grignardbehälter einer Bewegung bzw. einem Rühren während 3 Stunden. Das Hyflosupercelpuiver

wird durch Filtration auf einen Druckfilter aufgenommen, und man erhält 17 kg einer Masse bzw. Paste, die 12 kg Wasser enthält

"j 15 (2) Extraktion der auf dem Hyflosupercel® adsorbierten Urokinase

[., . Der erhaltenen Masse bzw. Paste werden 960 g kristallisiertes Natriumchlorid und 17 Liter einer auf pH 7,2

f gepufferten Lösung hinzugefügt, wobei letztere dadurch erhalten worden ist, daß man in 1000 ml entminerali-

Γ siertes Wasser 10,8 g Dinatriumphoäphat und 80 g NaCl gegeben hat Der Widerstand der Pufferlösung ist

_t" 20 84 000 Mikrosiemens bei I5°C

^Ϋ Nach 30 Minuten Bewegen bzw. Rühren wird das Hyflosupercelpuiver von der Mischung durch Filtrieren

' getrennt, und zwar auf einem Buchnertrichter von 200 mm Durchmesser, der mit einem Stoff versehen ist,

beispielsweise aus synthetischen Fasern, wie sie etwa unter der Bezeichnung Tergal® im Handel sind. Man läßt das Pulver sich absetzen und beendet die Filtrierung, indem man unter einem Unterdruck von 500 mm Hg

25 (665 mbar) arbeitet Bevor das Pulver vollständig trocken ist, wäscht man es mit 10 Litern Waschlösung, man

' erhält ein Volumen von 30 Litern. Die Urokinaseaktivität der auf diese Weise erhaltenen Lösung beträgt 4

>j Millionen CTA-Einheiten.

ι (3) Ausfällung der in der Pufferlösung enthaltenen Urokinase

Der pH der Lösung wird durch 5 η Salzsäure auf 4,2 eingestellt Man fügt 13,5 kg Ammoniumsulfat (450 g pro * Liter Lösung) hinzu und bewegt bzw. rührt, bis das Salz vollständig gelöst ist

Die Mischung wird in Ruhe während 12 Stunden stehen gelassen. Der Niederschlag, der sich ausgebildet hat, ι wird duch Zentrifugieren aufgenommen. Man verwendet hierzu eine Zentrifuge, die im Handel unter der

35 Bezeichnung Alfa Laval vom Typ B 1424 F erhältlich ist Man erhält 60 g feuchten Niederschlag und fügt zu dem j' Niederschlag 60 ml einer wäßrigen Lösung hinzu, die 18 g Glukose pro Liter Wasser enthält.

Die Mischung wird dann dialysiert, bis die Endleitfähigkeit der die Urokinase enthaltenden Lösung 22 000 τ Mikrosiemens beträgt.

! ι Man aktiviert die Dialyse durch Bewegen bzw. Rühren. Die dialysierte Lösung wird durch Zentrifugieren

40 geklärt Die Aktivität der erhaltenen Lösung beträgt 4 Millionen CTA-Einheiten an Urokinase.

(4) Ausschlußchromatographie an DEAE-Cellulose

(a) Man fügt 7,1 g DEAE-Cellulose zu der vorher geklärten Lösung hinzu und stellt auf pH 4,5 ein. Nach 30 45 Minuten Bewegen bzw. Rühren trennt man die DEAE-Cellulose durch Filtrieren auf einem Buchnertrichter von 150 mm Durchmesser, wobei man unter gemäßigtem Vakuum arbeitet, um die Bildung von Schaum zu verhindern.

Die DEAE-Cellulose wird bei zwei Wiederholungen mit einer Ammoniumsulfatlösung mit der Leitfähigkeit ; von 15 000 Mikrosiemens und dem pH 4,5 gewaschen. Das bei jeder Waschung verwendete Volumen ist gleich

■ 50 dem der DEAE-Cellulose und beträgt etwa 250 ml.

Während des Filtrierens der Waschlösung hält man die Phiole luftleer in einem Eisbad. ! Die Aktivität des Filtrats beträgt 4 Millionen CTA-Einheiten.

^;; (b) Dem erhaltenen Filtrat von pH 4,5 werden 17,2 g DEAE-Cellulose zugefügt und es wird auf pH 6,7

eingestellt

55 Die Leitfähigkeit wird durch Verdünnung mit Wasser auf 9000 Mikrosiemenss erniedrigt. Nach 30 Minuten Bewegen bzw. Rühren trennt man die DEAE-Cellulose durch Filtrieren mittels eines Buchnertrichters von 150 mm Durchmesser aus Porzellan. Entsprechend der Filtrierung stellt man den pH des Filtrats oder des aufgefangenen abströmenden Mediums durch Hinzufügung von 5 η Schwefelsäure auf 5 ein.

Man wäscht die DEAE-Cellulose mit einer Ammoniumsulfatlösung der Leitfähigkeit von 9000 Mikrosiemens 60 und bei pH 7 bis man ein farbloses Filtrat erhält.

T Die Filtrate und Waschlösungen werden vereinigt und auf pH 5 eingestellt. Die Urokinaseaktivität der

erhaltenen Lösung beträgt 4 400 000 CTA-Einheiten.

(5) Adsorption der Urokinase auf Kaolin und Trennung durch Eluieren

Man bereitet das Kaolin wie folgt:

1 kg Kaolin wird gewaschen und in 3 Litern destilliertem Wasser suspendiert. Man läßt die Mischung während 90 Minuten bei 120⁰C im Autoklaven.

Nachdem man die in Suspension befindlichen Stoffe sich hat absetzen lassen, trennt man das Kaolin, danach _Vl

bringt man es zum Trocknen in einen Ofen bei 200° C. fs

Die im Verlauf des letzten Verfahrensschrittes erhaltene Lösung von 4 400 000 CTA-Einheiten wird auf einen t;'

pH von 6,8 eingestellt, danach, nachdem 65 g des in der vorstehend erwähnten Weise bereiteten Kaolins ;>;:.

zugefügt worden sind, auf einen pH von 6,2. Die Mischung wird während einer Stunde bewegt bzw. gerührt. Das 5 fi

Kaolin wird daraufhin durch Kaltzentrifugieren abgetrennt und in einem Liter einer 0,05 M Phosphatlösung, if

gepuffert auf pH 6,2, suspendiert. |j

Nach 30 Minuten Bewegen bzw. Rühren trennt man das Kaolin durch Zentrifugieren. Ii

Die 65 g Kaolin werden in 500 ml einer Lösung suspendiert, die 75 g Ammoniumchlorid pro Liter einer §j

4%igen Ammoniaklösung enthält, und während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt. Das vom Rückstand durch 10 §■

Zentrifugieren getrennte Kaolin wird zwei weitere Male dem gleichen Eluierungsvorgang unterworfen. ^:,

Die bei dem Zentrifugieren erhaltenen Rückstände werden vereinigt, und zu ihnen wird 0,1 η Schwefelsäure |'

hinzugefügt, um einen pH von 3,5 zu erhalten. i^:

Indem man die während der Zentrifugiervorgänge erhaltenen Rückstände vereinigt, erhält man 1400 ml Eluat. %,

Der pH des Eluats wird durch Hinzufügen von 0,1 η Schwefelsäure auf 3,5 eingestellt. Man fügt dann 490 g 15 I₁

Ammoniumsulfat hinzu (350 g pro Liter Eluat). Der gebildete Niederschlag wird durch Kaltzentrifugieren |';

aufgenommen und in Wasser suspendiert Man führt dann während 18 Stunden eine Dialyse gegen eine 0,05 M S

Phosphatlösung, die auf pH 6,2 gepuffert ist, aus. |

Die Urokinaseaktivität der erhaltenen Lösung beträgt 2 800 000 CTA-Einheiten. |

(6) Filtrierung des Dialysats auf einer Harzkolonne |

Die dialysierte Lösung wird filtriert und auf einer Harzkolonne des Typs Amberlite® IRC 50 von 4 cm ·

Durchmesser und 60 cm Höhe filtriert, welche zuvor mit einer 0,05 M Phosphatlösung, die auf pH 6,2 gepuffert ί

worden ist, neutralisiert hat 25 ^!;

Wenn das Eluat aus der Kolonne ausgetreten ist dann wäscht man das Harz mit der Pufferlösungs bis die

Hinzufügung von 5°/oiger Trichloressigsäurelösung keine Bildung eines Niederschlags in den aufgenommenen ¥

Fraktionen hervorruft ;*;

Um die Urokinase herauszulösen, verwendet man eine 0,2 M Phosphatpufferlösung mit pH 8,2, die 75 g |

Ammoniumchlorid pro Liter Lösung enthält Das Eluat wird in einem Fraktionssammler aufgenommen. Die 30 |

Röhren, welche die Aktivität enthalten, werden durch Ammoniumsulfat bei pH 3,5 einer Ausfällung unterworfen, ff

um die vorhandene Urokinase auszufällen und zwar mit einem Verhältnis von 350 g Ammonisumsulfat pro Liter |"'

Eluat oder 158 g für die 450 ml des erhaltenen Eluats. f

Beispiel C 35 :

Herstellung einer gereinigten Urokinase

In der nachstehenden Weise behandelt man ein Präzipitat mit Ammoniumsulfat das Rohurokinase enthält und :

unter den Bedingungen des Abschnittes (3) des Beispiels B erhalten worden ist und zwar von einer Lösung, die _; ■

ihrerseits von menschlichem Urin erhalten worden ist auf die man zuvor das Konzentrationsverfahren nach den 40 ;

Abschnitten (1) bis (2) des gleichen Beispiels B 2 angewandt hat F

(1) Bedingungen der ersten Ausschlußchromatographie an DEAE-Cellulose :

Das Präzipitat mit Ammoniumsulfat wird in ein bis zwei Teilen Glucosewasser gelöst, und zwar im Verhältnis 45 \? von 18 Gramm Glucose pro Liter, und der pH wird auf einen Wert zwischen 4 und 6, vorzugsweise auf einen >

Wert von 43 eingestellt ' :

Die erhaltene Lösung wird gegen destilliertes Wasser dialysiert, bis man eine Leitfähigkeit zwischen 30 000 t

und 50 000 Mikrosiemens, vorzugsweise eine solche von 40 000 Mikrosiemens, erhält

Man zentrifugiert die erhaltene Lösung mit 3000 g, um die gebildeten unlöslichen Stoffe auszuscheiden, die 50 ! aus den nichtproteinischen Verunreinigungen bestehen. 3

Man nimmt eine neue Dialyse des Rückstandes vor, bis man ein Dialysat erhält dessen Leitfähigkeit zwischen 15 000 und 25 000 Mikrosiemens, vorzugsweise bei 22 000 Mikrosiemens, liegt

Man fügt DEAE-Cellulose zur erhaltenen Lösung in einem Verhältnis von 25 g trockenen Harzes oder 100 g zentrifugierten Harzes, das vorher mit einer 0,11 M Ammoniumsulfatlösung mit pH 4,5 (Leitfähigkeit von 15 000 55 Mikrosiemens bei 4°C) neutralisiert worden ist auf 14 Millionen CTA-Einheiten Urokinase.

Man bewegt bzw. rührt das Medium während einer Dauer von 20 bis 40 Minuten, vorzugsweise während 30 Minuten.

Man saugt das Harz ab, vorzugsweise nach Buchner unter leichtem Unterdruck, und man wäscht es mit einer Lösung von 0,1 M Ammoniumsulfat mit pH 4,5 bis man ein farbloses abströmendes Filtrat erhält 60 ;

Man vereinigt das Filtrat mit den Waschlösungen. Die Gesamtaktivität der erhaltenen Lösung an Urokinase ist genau gleich der Aktivität die am Eingang angegeben worden ist

(2) Bedingungen der zweiten Ausschlußchromatographie an DEAE-Cellulose

Die obige Lösung wird auf einen pH zwischen 6 und 7, vorzugsweise in der Größenordnung von 6,6 eingestellt Man fügt zu dieser Lösung 60 g DEAE-Cellulosepulver oder 250 g abgesaugte bzw. zentrifugierte DEAE-Cellulose, die zuvor mit einer 0,068 M Ammoniumsulfatlösung mit pH 7 (Leitfähigkeit 9000 Mikrosiemens bei 4° C)

neutralisiert worden ist, auf 14 Millionen CTA-Einheiten Urokinase hinzu. Die Leitfähigkeit des Mediums liegt dann zwischen 15 000 und 18 000 Mikrosiemens.

Die Leitfähigkeit des Mediums wird danach durch aufeinanderfolgende Zugaben von apyrogenem destilliertem Wasser auf 9000 Mikrosiemens eingestellt, und zwar in der Weise, daß bei jeder Zufügung eine Erniedrigung der Leitfähigkeit des Mediums um 1000 Mikrosiemens stattfindet, wobei jede Zufügung durch ein Bewegen bzw. Rühren während einer Dauer von 5 bis 15 Minuten, vorzugsweise von 10 Minuten, unterbrochen wird.

Der pH des Mediums wird dann durch 2 M Soda auf 7 eingestellt. Nach Bewegen bzw. Rühren während einer

Dauer von 30 Minuten filtriert man, vorzugsweise nach Buchner, nichtoxydierend, unter leichtem Unterdruck, wobei der aufnehmende Rezipient in einem Bad mit Eisstücken gehalten wird, man wäscht das Harz mit einer 0,068 M Ammoniumsulfatlösung mit 9000 Mikrosiemens Leitfähigkeit, und pH 7, bis sich ein farbloses Filtrat ergibt.

Die durch Vereinigung des Filtrats und der Waschlösung erhaltene Lösung kann anschließend zusätzlichen Reinigungsbehandlungen unterworfen werden, insbesondere Behandlungen, bei denen eine Adsorption auf Kaolin und eine Chromatographie mit Adsorption auf Harz vom Typ Amberlite ® unter den im vorhergehenden Beispiel· beschriebenen Bedingungen erfolgt, oder noch durch Adsorptionschromatographie auf Carboxymethylcellulose unter den folgenden Bedingungen:

(3) Adsorptionschromatographie an Carboxymethylcellulose

Der vorerwähnten Lösung, die auf pH 5 eingestellt worden ist, wird Carboxymethylcellulose im Verhältnis von 80 g trockenen Harzes auf 14 Millionen CTA-Einheiten zugefügt, wobei die Carboxymethylcellulose zuvor mit einer 0,068 M Ammoniumsulfatlösung von 9000 Mikrosiemens und pH 5 bei 4° C neutralisiert worden ist. Die Suspension wird während einer Dauer von 12 bis 14 Stunden bei einer Temperatur zwischen 2 und 4°C in gemäßigter Bewegung gehalten, wobei ihr pH mit 5 ± 0,1 aufrechterhalten wird.

Die Suspension wird anschließend auf Kreppapier mit einem Büchnerfilter aus Porzellan unter leichtem Unterdruck filtriert. Die abströmenden Medien behalten die anfängliche Färbung.

Die Carboxymethylcellulose wird dann mit einer Ammoniumsulfatlösung von 9000 Mikrosiemens bei pH 5 gewaschen, bis man eine farblose Lösung erhält.
Die Carboxymethylcellulose wird danach abgesaugt bzw. zentrifugiert. Man fügt dann ein gleiches Volumen einer Ammoniumsulfatlösung von 22 000 Mikrosiemens, pH 5 bei 4° C zu.

Die Temperatur wird auf 4° C gehalten, die Suspension wird während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt, die Carboxymethylcellulose wird anschließend auf Kreppapier abgesaugt (nach Büchner) und mit einer Ammoniumsulfatlösung von 22 000 Mikrosiemens gewaschen, bis man eine klare Lösung erhält, die mit Tannin keinen Niederschlag bildet

Das Eluat und die Waschlösungen werden vereinigt, um eine gereinigte Urokinaselösung zu ergeben, die 80 bis 90% der Aktivität der Urokinase der Lösung enthält, die sich aus der Vereinigung des abströmenden Mittels und der Waschlösungen ergibt, welche am Schluß der zweiten vorerwähnten Ausschlußchromatographie erhalten worden sind.
Die in dieser Lösung enthaltene Urokinase wird durch Natriumchlorid ausgefällt Diese letztere Ausfällung wird erreicht mit Hilfe von kristallisiertem, streng reinem Natriumchlorid im Verhältnis von 330 g pro Liter auf eine Lösung, deren pH vorher auf einen Wert zwischen 4 und 5,5 eingestellt worden ist Nachdem man das Medium während einer Stunde mit einer Temperatur von 4 bis 6°C ruhig stehen gelassen hat zentrifugiert man mit 9000 g. Der Rückstand wird entfernt und das Präzipitat in einer Lösung aufgelöst, die wenigstens 30 g pro Liter an Natriumchlorid enthält, eine Leitfähigkeit von 28 000 Mikrosiemens und einen pH von 6,8 besitzt, die Natriumchloridkonzentration dieser Lösung soll derart sein, daß die schließlich erhaltene Lösung eine Urokinaseaktivität von 200 000 CTA-Einheiten/ml hat Man filtriert die erhaltene Lösung und läßt sie nach Dosierung in Plasmafläschchen von 250 ml einfrieren.

Beispiel D
so Herstellung einer gereinigten Urokinase

Nachstehend wird ein Beispiel der Extraktion von Urokinase in größerem Maßstab beschrieben, wobei man von 8700 Litern menschlichem männlichem Urin ausgeht-

Man führt eine Behandlung dieses menschlichen Urins mit einem Filtrierhilfsmittel des Beispiels (A) durch, man reextrahiert die auf dem Filtrierhilfsmittel adsorbierte Urokinase, und man behandelt das erhaltene Eluat und die Waschlösungen des Filtrierhilfsmittels nach den in Beispiel A angegebenen Bedingungen, um 500 g eines Ammoniumsulfatniederschlags zu erhalten, der fast die Gesamtaktivität der in der behandelten Unnmasse enthaltenen Urokinaseaktivität aufweist, das sind insgesamt 35 Millionen CTA-Einheiten.

Diese 500 g Präzipitat werden in einer Lösung von 18 g Glucose, welche eine Codexreinheit besitzt in 500 ml apyrogenem destilliertem Wasser gelöst Man bewegt bzw. rührt während 15 Minuten bei einer Temperatur von 4°C Man stellt anschließend den pH mit 2 η Schwefelsäure auf einen Wert von 4,5 ein. Die Leitfähigkeit der erhaltenen Lösung beträgt 90 000 Mikrosiemens. Die Lösung wird in Dialysedärme bzw. (lange) -schläuche im Verhältnis von 150 ml pro Darm bzw. Schlauch verteilt Die Dialyse wird in einer kalten Kammer unter leichtem bzw. vorsichtigem Rühren gegen apyrogenes destilliertes Wasser bei 4°C vorgenommen, bis man eine Leitfähigkeit von 40 000 Mikrosiemens im Dialysat erhält Dieses wird dann in einer abgekühlten Zentrifuge mit 3000 g zentrifugiert. Die 35 g des erhaltenen unlöslichen Produktes werden beseitigt

Der Rückstand wird dann von neuem aufeinanderfolgenden Dialysen gegen apyrogenes destilliertes Wasser unterworfen, wobei die Temperatur auf 4°C gehalten wird, und zwar bis man eine Leitfähigkeit von 22 000 Mikrosiemens im Dialysat erhält, und zwar vorzugsweise wie folgt:

(a) eine erste Dialyse gegen 5 Liter destilliertes Wasser während 3 Stunden,

(b) eine zweite Dialyse gegen 5 Liter destilliertes Wasser während 3 Stunden, und

(c) eine dritte Dialyse gegen 3 Liter destilliertes Wasser während 2 Stunden.

Das Volumen des erhaltenen Dialysats ist 1700 ml. Seine Leitfähigkeit beträgt 22 000 Mikrosiemens bei 4° C.

Sein Gesamtgehalt an Proteinen ist 27 200 mg, das sind 16 mg Proteine pro ml Dialysat.

Seine Urokinaseaktivität ist 30 600 000 CTA-Einheiten, das heißt 18 000 CTA-Einheiten pro ml.

Die spezifische Aktivität an Urokinase auf ein Milligramm Proteine ist 1125 CTA-Einheiten.

Dieses Dialysat wird der vorstehend ersten Ausschlußchromatographie in Kontakt mit 218 g abgesaugter bzw. zentrifugierter DEAE-Cellulose, die 54,5 g DEAE-Cellulosepulver der Qualität 0,9 meq/g äquivalent ist, unterworfen. Die Zufügung der DEAE-Cellulose erfolgt unter Bewegen bzw. Rühren, und zwar während einer Dauer von 30 Minuten, wobei die Temperatur auf 4° C gehalten wird. Anschließend wird die Trennung des Filirats nach Büchner unter Einwirkung eines zur Vermeidung von Schaumbildung ausreichenden leichten Unterdrucks durchgeführt. Das Harz wird zweimal nach Büchner gewaschen, und zwar jedesmal mit 250 ml einer Ammoniumsulfatlösung von 15 000 Mikrosiemens mit pH 4,5.

Die Lösung, die man durch Vereinigung des Filtrats und der Waschlösung erhält, ist insgesamt 2280 ml und weist eine Leitfähigkeit von 18 000 Mikrosiemens auf; diese Lösung wird einer zweiten Ausschlußchromatographie auf DEAE-Cellulose mit pH 7 unter den folgenden Bedingungen unterworfen:

Man stellt den pH der vorstehenden, auf 4°C gehaltenen Lösung mit 2 η Soda auf einen Wert von 6,6 ein. Zu dieser Lösung fügt man 528 g abgesaugte bzw. zentrifugierte DEAE-Cellulose hinzu, was einem Äquivalent von 132 g DEAE-Cellulosepulver der Qualität 0,9 meq/g entspricht. Das auf 4°C gehaltene Medium wird während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt.

Die erhaltene Mischung mit pH 6,6 weist eine Leitfähigkeit von 16 000 Mikrosiemens auf.

Man nimiTit bei 4°C eine erste Zufügung von 400 ml apyrogenem destilliertem Wasser vor und bewegt bzw. rührt die Mischung während 10 Minuten. Die Leitfähigkeit der Mischung am Ende dieser Bewegungs- bzw. Rührbehandlung beträgt 15 000 Mikrosiemens.

Dann erfolgt eine zweite Zufügung von 400 ml apyrogenen destillierten Wassers, und man bewegt bzw. rührt das Medium von neuem während 10 Minuten. Am Ende dieser Bewegungs- bzw. Rührbehandlung ist die Leitfähigkeit der Mischung 14 000 Mikrosiemens.

Schließlich erfolgt unter den gleichen Bedingungen eine dritte, danach eine vierte, danach eine fünfte und schließlich eine sechste Verdünnung, wobei die Leitfähigkeit der Mischung am Ende der sechsten Verdünnung 9000 Mikrosiemens beträgt.

Der pH des Mediums wird dann mit 2 η Soda auf 7 eingestellt, und die Bewegungs- bzw. Rührbehandlung wird während 30 Minuten durchgeführt

Anschließend erfolgt eine Trennung des Harzes durch Filtration nach Büchner unter leichtem Unterdruck. Das Harz wird mit einer Ammoniumsulfatlösung von 9000 Mikrosiemens bei pH 7 gewaschen, bis man ein farbloses Filtrat erhält Nach der Vereinigung des Filtrats und der Waschlösungen (1500 ml) erhält man ein Lösungsvolumen von 6000 ml.

Die an dieser Lösung ausgeführten Gewichtsbestimmungen führten zu folgenden Ergebnissen:

Gesamtgehalt an Proteinen: 14 400 mg, das heißt 2,4 mg pro ml;

Gesamtaktivität an Urokinase: 34 800 000 CTA-Einheiten, das heißt 5800 CTA-Einheiten pro ml; Spezifische Urokinaseaktivität pro mg Proteine: 2400 CTA-Einheiten.

Die erhaltene Lösung kann danach ergänzenden Reinigungen gemäß irgendeiner der hierfür bekannten Techniken unterworfen werden, insbesondere aber solchen Techniken, die im Beispiel A oder in den vorstehenden Beispielen an entsprechender Stelle beschrieben sind.

In dem vorhergehenden Beispiel sind besonders vorteilhafte Ergebnisse erhalten worden. Der Wert des Verhältnisses der Menge des in der zweiten Ausschlußchromatographie verwendeten Harzes zur Urokinaseaktivilät der zu behandelnden Lösung beträgt 433 g Harz pro 10 Millionen Einheiten Urokinaseaktivität CTA. Dieser Wert liegt in einem sehr vorteilhaften Bereich, was die Ergebnisse einer Versuchsreihe zeigen, die an der gleichen Lösung auf dem Niveau der zweiten Ausschlußchromatographie mit veränderlichen Mengen von Harz ausgeführt worden ist, wobei alle anderen Parameter im übrigen identisch waren. Die Ergebnisse, die es gestattet haben, den günstigsten Bereich der Verhältnisse unter den Erfahrungsbedingungen zu bestimmen, sind nachstehend durch die Menge des Harzes (bezeichnet durch die Abkürzung DEAE) in Gramm und bezogen auf 10 Millionen CTA-Einheiten Urokinaseaktivität ausgedrückt:

25 g DEAE: alle Proteine gehen mit der Urokinase in das abströmende Medium.

30 g DEA E: alle Proteine gehen mit der Urokinase in das abströmende Medium.

40 g DEAE: untere Grenze, bei der zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden, die spezifische Aktivität (Urokinaseaktivität relativ zum Gewicht der Proteine) nimmt zu, und die Urokinase geht in ihrer Gesamtheit in das abströmende Mittel.

433 g DEAE: untere Grenze, bei der zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden, die spezifische Aktivität (Urokinaseaktivität relativ zum Gewicht der Proteine) nimmt zu, und die Urokinase geht in ihrer Gesamtheit in das abströmende Mittel.

48 ε DEAE: D° obere Grenze.

53 g DEAE: die spezifische Aktivität nimmt nicht mehr zu, und man beginnt eine bestimmte Menge Urokinaseakti vität zu verlieren, die auf dem Harz adsorbiert ist.

60 g DEAE: die vorgenannten Erscheinungen werden stärker.

Man stellt fest, daß analoge Ergebnisse erhalten werden, wenn man Leitfähigkeitswerte der der zweiten Ausschlußchromatographie unterworfenen Lösung zugrunde legt, die von 22 000 Mikrosiemens abweichen, jedoch selbstverständlich in dem oben angegebenen Bereich liegen.

Dementsprechend erhält man ein besonders wirkungsvolles Verfahren zur Herstellung gereinigter Urokinasen mit Ausbeuten, die bisher noch niemals erreicht worden sind und gleichzeitig eine außerordentlich beträchtliche Erhöhung ihrer spezifischen Aktivitäten relativ zum Gewicht der die Urokinasen in den Mutter- bzw. to Ausgangsurinen begleitenden Proteine.

Beispiel E
Herstellung einer apyrogenen Urokinase

is Das Endpräzipitat des Beispiels B wird durch Zentrifugieren aufgenommen, nachher in apyrogenem und sterilem destilliertem Wasser gelöst, derart, daß man eine Leitfähigkeit zwischen 15 000 und 25 000 Mikrosiemens erhält. Die Konzentration dieser Lösung an Proteinen ist in der Größenordnung von 2 mg/ml.

Der pH wird auf einen Wert von 3,8 eingestellt und die Temperatur zwischen 0 und 4° C, man fügt zu diesem Medium eine gesättigte Lösung von Ammoniumsulfat hinzu, bis eine Konzentration, die ³/|₀ der Sättigungskonzentration beträgt, erreicht ist (das entspricht einer 1,22 M Ammoniumsulfatlösung). Das Medium wird während 15 Minuten bewegt bzw. gerührt, danach läßt man es ebenfalls während 15 Minuten ruhig stehen.
Man nimmt den Niederschlag durch Zentrifugieren mit 10 000 g auf (Fraktion A).

Dem Rückstand wird reines Ammoniumsulfat zugefügt, und zwar in einem Verhältnis von 250 g/l auf pH 3 bis 3,5, danach wird während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt. Das die Urokinase enthaltende Präzipitat wird durch Zentrifugieren mit 10 000 g aufgenommen (Fraktion B).

Ergebnisse

Jeder dieser Niederschläge (Fraktionen A und B) wird wieder in apyrogenem und sterilem destilliertem Wasser suspendiert, der pH der Suspension wird auf 7 eingestellt, die Suspension wird abschließend auf einer Membran mit 0,22 μ in sterilem Medium filtriert

Das Filtrat, das von der Fraktion A stammt, enthält ungefähr 5% der Urokinaseaktivität Das von der Fraktion B stammende Filtrat enthält etwa 95% der Urokinaseaktivität der Ausgangslösung.

Es erweist sich, daß die Fraktion A praktisch alle pyrogenen Substanzen enthält, die anfänglich in der Ausgangslösung enthalten waren, welche durch Lösung des Präzipitats mit Ammoniumsulfat vor der Fraktionierung erhalten worden ist. Die Fraktion B dagegen ist von pyrogenen Substanzen befreit, und zwar gemäß den Normen der Pharmacopee Francaise, die oben zitiert worden sind. Diese Ergebnisse lassen sich der nachstehenden Tabelle I entnehmen, in der die Temperaturerhöhungen wiedergegeben sind, die jeweils in getrennten Serien mit drei Kaninchen für jede der getesteten Fraktionen beobachtet wurden, sowie in einer ergänzenden Serie mit acht Kaninchen für die Fraktion B; alle diese Kaninchen hatten die Dosen erhalten, die in der linken Seite der Tabelle angegeben worden sind, und zwar unter den von der Pharmacop6e Francais vorgesehenen Bedingungen.

Tabelle I

Getestete Temperaturerhöhung in ° C

Lösungen Reihe mit Reihe mit Mittel- Mitteloder Fraktionen 3 Kaninchen 8 Kaninchen wert wert

(3 Kanin- (8 Kaninchen) chen)

Ausgangslösung:

3000 CTA- 0,5 0,8 0,9 0,7

f Einheiten/kg

⁵⁵ Fraktion A

ι Λ 3000 CTA- 0,9 0,9 1 0,9

ή¹ Einheiten/kg

¹ « Fraktion B

^ 60 15 000 CTA- 0,1 0,2 0 0, 0, 0, 0, 0,1 03 0,4 0,1 0,1 0,1

i' Einheiten/kg

v, B e i s ρ i e I F

"> Herstellung einer apyrogenen Urokinase

i, (1) Herstellung einer gereinigten und konzentrierten Urokinaselösung

>p Man geht von 22 000 Litern menschlichem Urin aus und führt eine Extraktion der Rohurokinase unter

¹F; Bedingungen durch, die identisch mit denen des Beispiels (C) sind, mit Ausnahme der Bedingungen, welche den

8

Verfahrensschritt der Adsorptionschromatographie auf Carboxymethylcellulose an der Lösung betreffen, die am Ende der zweiten Ausschließung bei Berührung mit dem DEAE-Celluloseharz erhalten wurde, diese Adsorptionschromatographie wird wie folgt durchgeführt:

Der vorerwähnten, auf pH 5 eingestellten Lösung wird Carboxymethylcellulose im Verhältnis von 80 g trockenen Harzes auf 14 Millionen CTA-Einheiten Urokinase hinzugefügt, wobei die Carboxymethylcellulose zuvor mit einer 0,068 M Ammoniumsulfatlösung (9000 Mikrosiemens, pH 5) neutralisiert worden ist Die Suspension wird unter gemäßigter Bewegung bzw. mäßigem Rühren während einer Dauer von 12 bis 14 Stunden auf einer Temperatur zwischen 2 und 4° C gehalten, ihr pH wird auf 5 ± 0,1 gehalten.

Die Suspension wird dann auf Kreppapier filtriert, und zwar mittels eines Buchnerfilters aus Porzellan unter leichtem Unterdruck. Die abströmenden Medien bewahren die anfängliche Färbung.

Die Carboxymethylcellulose wird dann mit einer Ammoniumsulfatlösung von 9000 Mikrosiemens mit pH 5 gewaschen, danach mit einem 0,05 M Phosphatpuffer mit pH 6,5, um die Sulfate zu verdrängen, und zwar so lange, bis man eine farblose Lösung erhält

Die Carboxymethylcellulose wird dann abgesaugt bzw. zentrifugiert Zu dieser wird anschließend ein Volumen von 0,5 M Phosphatpuffer hinzugefügt, das gleich dem Gewicht des 0,05 M Puffers ist, der in der abgesaug- ten bzw. zentrifugierten Carboxymethylcellulose zurückgehalten worden ist, diese Hinzufügung erfolgt bei einer Temperatur von 15 bis 20⁰C unter Bewegen bzw. Rühren. Man fügt weiter ein gleiches Volumen eines 03 M Natriumphosphatpuffers zu, danach einen 0,5 M Phosphatpuffer um eine Endmolarität von 0,29 M und einen pH in der Größenordnung von 6,8 bis 63 zu erreichen.

Die Temperatur wird dann wieder auf 6° C eingestellt die Suspension wird während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt, die Carboxymethylcellulose wird sodann auf Kreppapier abgesaugt (nach Büchner) und mit einem 0,29 M Phosphatpuffer gewaschen, bis man eine klare Lösung erhält, die mit Tannin keinen Niederschlag ergibt

Das Eluat und die Waschlösungen werden vereinigt, so daß sich eins gereinigte Urokinaselösung ergibt die 80 bis 90% der Urokinaseaktivität der Lösung enthält die sich aus der Vereinigung des abströmenden Mediums und der Waschlösungen ergibt, welche man am Ende der oben erwähnten zweiten Ausschlußchromatographie erhalten hat

(2) Depyrogenisation

Die erhaltene gereinigte Lösung, die 65 Millionen CTA-Einheiten Urokinase enthält, wird auf pH 3,5 eingestellt und die Urokinase wird mit Ammoniumsulfat mit einem Verhältnis von 350 g Ammoniumsulfat pro Liter Eluat ausgeschieden. Man erhält 35 g eines Niederschlags, der insgesamt 65 Millionen CTA-Einheiten an Urokinase hat

Dieser Niederschlag wird in 600 ml destilliertem sterilisiertem apyrogenem Wasser gelöst die erhaltene Lösung weist bei pH 3,8 eine Leitfähigkeit von 15 000 Mikrosiemens auf und besitzt einen Proteingehalt von 2 mg/ml.

Diese Lösung ruft bei dem am Kaninchen ausgeführten Pyrogentest eine Hyperthermie von 0,9° C bei einer Dosis von 3000 CTA-Einheiten/kg hervor.

Man fügt unter Bewegung bzw. Rühren langsam 258 ml der gesättigten Ammoniumsulfatlösung hinzu, die zuvor auf pH 4 und 4°C gebracht worden ist Der pH des Mediums wird auf 3,8 eingestellt es wird während 15 Minuten bewegt bzw. gerührt danach wird die Lösung während 15 Minuten ruhig stehen gelassen. Der gebildete leichte Niederschlag wird durch Zentrifugieren mit 10 000 g aufgenommen: man isoliert 5 g Präzipitat Fraktion Q-

Dem Rückstand wird reines kristallisiertes Ammoniumsulfat im Verhältnis von 250 g/Liter zugefügt und es wird während 30 Minuten bewegt bzw. gerührt Der pH des Mediums wird dann durch Hinzufügen einiger Tropfen von 2 η Schwefelsäure auf 3 eingestellt Der entstandene Niederschlag wird durch Zentrifugieren mit 10 000 g aufgenommen, und der Rückstand wird beseitigt: man erhält 25 g Präzipitat (Fraktion D).

(3) Ergeönisse

Das Präzipitat der Fraktion C wird in 25 ml destilliertem sterilem apyrogenem Wasser gelöst, und der pH wird mit 0,1 η Soda auf 7 eingestellt Die erhaltene Lösung wird steril filtriert: Die Urokinasekonzentration ist 100 000 CTA-Einheiten/ml.

Das Präzipitat der Fraktion D wird in 150 ml destilliertem sterilem apyrogenem Wasser gelöst. Der pH wird mit 0,1 η Soda auf 7 eingestellt und die erhaltene Lösung wird steril filtriert: Ihre Urokinasekonzentration ist 300 000 CTA-Einheiten/ml. Ihre spezifische Aktivität bezogen auf Protein beträgt 43 000 CTA-Einheiten pro mg Proteine.

Auch hier kann man die gleichen Beobachtungen wie im vorhergehenden Falle machen. Man stellt fest, daß der Hauptteil der pyrogenen Substanzen in der Fraktion C zurückgehalten worden ist, während die Fraktion D fiw vs\n nurnopnAn QuHctan7An opmäR rtpn Nnrmpn Hpr Pharmflmnip Pranf»nie<» iet· rlipcp V^rhältniccA laccpn cn

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sich auch der Tabelle Ii entnehmen, die unter Bedingungen erstellt wurde, welche mit denen vergleichbar sind, die der Erstellung der Tabelle I zugrunde lagen.

Bei Kenntnis der Erfindung ist ohne weiteres ersichtlich, daß man an Stelle von Ammoniumsulfat jedes andere Salz verwenden kann, das wegen seiner Fähigkeit, Proteine auszuscheiden, bekannt ist. beispielsweise Magnesiumsulfat, Natriumchlorid; wobei man zu beachten hat, daß es in jedem Fall erforderlich ist, vorher den Sättigungsgrad der Ausgangslösung an dem in Betracht gezogenen Salz zu bestimmen, der zu einer Ausfällung der Proteine unter den obigen Bedingungen führt

Dementsprechend erhält man ein Verfahren zur Depyrogenisierung und gleichzeitig zum relativen Konzen-

trieren der Urokinase gegenüber ihrem Proteingehalt, welches einfach und besonders wirkungsvoll ist, wobei die apyrogene mit erhöhten Dosen erhaltene Urokinase dann Patienten verabreicht werden kann, ohne daß irgendeine Sekundärwirkung bis zu Dosen von 150 000 CTA-Enheiten odsr mehr auftritt, und zwar durch eine einzige intravenöse Injektion, zur Behandlung der hier erwähnten Beschwerden, sei es nun in der vorliegenden Form 5 oder sei es in anderer Form, beispielsweise nach Überführung in Urokinaseheparinat, wie zum Beispiel unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen:

Tabelle II

Getestete Temperaturerhöhungen in jedem der getesteten Kaninchen in "C

Lösungen Reihe von Reihe von Mittel- Mitteloder Fraktionen 3 Kaninchen 8 Kaninchen wert wert

(3 Kanin- (8 Kaninchen) chen)

Ausgangslösung:

3000 CTA- 1,1 0,9 0,8 0,9

Einheiten/kg .

Fraktion C

3000 CTA- 0,9 0,8 0,8 0,8

Einheiten/kg

Fraktion D

15 000 CTA- 0,1 0, 0,1 0, 0, 0, 03 0,1 0,1 03 0 0,07 0,1

Einheiten/kg

Fraktion D

20 000 CTA- 0, 0, 0, 0, 0,1 0,1 03 0,3 0,1

Einheiten/kg

Beispiel 1

Herstellung von Urokinaseheparinat

Man kann Urokinaseheparinat von einer gereinigten und konzentrierten Urokinaselösung herstellen, indem man auf die folgende Verfahrensweise zurückgreift:

Man fügt zu dieser Lösung Heparin hinzu, beispielsweise in einem Verhältnis von 50 000 Heparineinheiten auf 14 Millionen CTA-Einheiten Urokinase; man stellt den pH mit 0,5 η Phosphorsäure auf 4,2 ein; man läßt das Ganze während einer Stunde bei einer Temperatur von 4° C in Ruhe stehen; man zentrifugiert, nimmt den Bodensatz der Zentrifugierung mit einer Lösung von 10 g/Liter Natriumchlorid im Verhältnis von 100 ml Lösung auf 14 Millionen CTA-Einheiten Urokinase auf, und man lyophilisiert, um wasserfreies Urokinasehepari-

nat zu erhalten.

Beispiel 2
Herstellung von Urokinaseheparinat

Die Ausgangslösung gereinigter Urokinase ist durch Anwendung des in Beispiel B beschriebenen Arbeitsverfahrens erhalten worden. Ihre Gesamtaktivität an Urokinase ist 4 950 000 CTA-Einheiten.

Zu dieser Lösung fügt man 50 000 Einheiten apyrogenes Heparin, und man stellt den pH durch Hinzufügung von 0,5 η Phosphorsäure auf 4,2 ein. Man läßt den sich bildenden Niederschlag während 30 Minuten ausflocken, dann nimmt man ihn durch Zentrifugieren auf. Der Rückstand besitzt eine Aktivität unterhalb von 25 CTA-Einheiten/ml.

Der Niederschlag wird in 20 ml einer Lösung von 30 g Natriumchlorid pro Liter aufgelöst, deren pH auf 7,3 eingestellt worden ist.

Die Urokinaseaktivität der Lösung ist 200 000 CTA-Einheiten/ml, was einer Gesamtaktivität von 4 Millionen CTA-Einheiten entspricht

Man erhält Urokinaseheparinat in trockenem Zustand, wenn man die erhaltene Lösung einer Lyophilisation unterwirft.

Indem in gleicher bzw. ähnlicher Weise verfahren wurde, konnte Urokinaseheparinat ferner ausgehend von gereinigter und im vorliegenden Falle weiterhin depyrogenisierter, Urokinase hergestellt werden, insbesondere von gereinigten Fraktionen der anderen obigen Beispiele.

In den vorherigen Beispielen erfolgte die Reaktion zur Bildung des Urokinaseheparinats bei pH 4,2. Dieser Wert des pH ist nicht kritisch. Jedoch löst sich das gebildete Urokinaseheparinat bei einem zu schwach saurem pH im Reaktionsmedium, was seine Trennung sehr schwierig macht. Bei einem zu saurem pH besteht die Gefahr, daß die Urokinase Zersetzungen ausgesetzt ist. Gute Ergebnisse erhält man in einem Bereich des pH von 1 bis 5. Man stellt fest, daß die Proteine, welche die Urokinase in den gereinigten Urokinasepräparaten noch begleiten, ebenfalls vom Heparin gebunden werden. Die spezifischen relativen Aktivitäten an Urokinase und an Heparin stellen daher ein gewisses Maß dar, das eine Funktion des Reinheitsgrades des Ausgangsurokinasepräparats ist.

Tabelle	III	Aktivität	Aktivität
	an Urokinase	an Heparin
	(UCTA/mg)	(Ul/mg)
	54 800	60,7
A	32 000	27,1
B	50500	52
C	62 000	72
D	51500	57
E

So kann man Urokinaseheparinate herstellen, deren relative Aktivitäten in der Größenordnung von 30 000 bis 100 000 UCTA auf 100 UI Heparin Hegen können.

Wenn man hochgereinigte Ausgangsprodukte nimmt, wie beispielsweise eine Urokinase von 100 000 UCTA/ mg, ein Heparin von 160 Ul/mg, dann stellt man fest, daß sich 1 mg Urokinase mit ungefähr 0,6 mg Heparin zu einem Komplex verbindet s

Die spezifische Aktivität eines solchen Heparin-Urokhresekomplexes ist folgende:

Ausgedrückt in Urokinase: 62 600 UCTA/mg
Ausgedrückt in Heparin: 100 Ul/mg.

Nachstehend werden in den Beispielen (sowie auch im Rahmen der übrigen Ausführungen) die Urokinaseaktivitäten in UCTA/mg (CTA-Einheiten/mg), und die Heparinaktivitäten in internationalen Heparineinheiten/mg (Ul/mg) angegeben, insbesondere bei den mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Mengen an Urokinasepheparinat

20 25

Nachstehend werden bestimmte Eigenschaften des Urokinaseheparinats beschrieben, sowie an Beispielen gewisse charakteristische klinische Anwendungen desselben.

30

(A) Stabilität des Urokinaseheparinats

Das Urokinaseheparinat ist bemerkenswert stabil und kann während länger dauernden Zeiträumen aufbewahrt werden. In der nachstehenden Tabelle IV sind die Ergebnisse der Kontrollen wiedergegeben, die an einer Menge ausgeführt worden sind, welche ursprünglich 48 750 UCTA/mg besaß, und zwar wurden die Kontrollen in aufeinanderfolgenden Zeitintervallen durchgeführt (es sei darauf hingewiesen, daß die Präzision der Kontrolle bzw. Messungen plus oder minus 10% beträgt):

45

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Urokinaseheparinat vollkommen stabil ist; das ist bei der nicht im Komplex vorhandenen Urokinase nicht der Fall, die in lyophilisierter oder gefrorener Form 20 bis 30% ihrer Aktivität in 24 bis 48 Stunden verliert.

Das Urokinaseheparinat führt zu stabilisierten Lösungen in üblichen Perfusionsmedien, wie in den Lösungen des Glucoseserums von 5%, wie sich aus Vergleichsversuchen ergibt, die unten aufgeführt sind.

Man vergleicht die Änderungen der Aktivität in Abhängigkeit von der Zeit bei einer Temperatur von 22° C, und zwar einerseits von Urokinaseheparinatlösungen und andererseits von Urokinase im Glucoseserum von 5%.

Tabelle IV	Aktivität
Zeitpunkt der Messung	an Urokinase
	in UCTA/mg
	48 750
Am Anfang	46 875
3 Wochen danach	50 000
1 Monat danach	50 000
10 Wochen danach	50 000
4 Monate danach	50 000
5 Monate danach

65

Urokinase im	Verlust	Urokinaseheparinat	Verlust
Clucoseserum	%	im Glucoseserum	%
von 5%: Gehalte		von 5%: Gehalte
in CTA-Einheiten		in CTA-Einheiten

250	—	300	—
175	30	250	16,6
180	30	250	16,6
175	30	250	16,6
150	40	250	16,6
120	52	250	16,6

Zu Beginn Nach 2 h Nach 4 h 30 min _I0 Nach 5 h 30 min Nach 24 h Nach 48 h

Die Betrachtung der in der vorstehenden Tabelle zusammengefaßten Ergebnisse zeigt deutlich, daß sich die Aktivität des Urokinaseheparinats in einer Lösung, wie sie für intravenöse Perfusionen benutzt wird, sehr schnell stabilisiert, während sich die vergleichbaren Lösungen von Urokinase allein fortlaufend zersetzen.

(B) Pharmakologische Eigenschaften des Urokinaseheparinats
(1) Einwirkung auf Fibrinklümpchen

20

Gemäß der Technik von E VAIREL und R. COURBIER in »Die Bedeutung der Arterienwand in der Physiologie der Fibrinolyse« (»Röle de la paroi artorielle dans la Physiologie de la fibrinolyse«) in »Die Bedeutung der Arterienwand in der Atherogenese« (»Röle de Ia paroi arterielle dans l'atherogenese«), Edition CNRS, Paris 1967, Teil II, Seiten 561 bis 569, wurde eine Obstruktion mit intraarteriellen Klümpchen bei zwanzig Hunden hervorgerufen.

Nach arteriographischer Kontrolle wurde die Hälfte dieser Tiere mit einer Urokinaseheparinatlösung mit einem Gehalt von 50 000 CTA-Einheiten mitteis intravenöser P^rfusion während 90 Minuten behandelt; die nichtbehandelten Tiere dienten zur Kontrolle.

Am Ende der Perfusion wurde eine Kontrollarteriographie durchgeführt, wonach eine Arteriotomie des Abschnitts der verschlossenen Arterie durchgeführt wurde.

Bei den behandelten Tieren stellte man eine vollständige Lyse des Klümpchens fest, welches die Arterie verschlossen hatte. Dagegen zeigte bei den Kontrolltieren die Kontrollarteriographie, danach die Arteriotomie, die Fortdauer des Arterienverschlusses.

(2) Pyrogene Substanzen

Das Urokinaseheparinat, das ausgehend von der gereinigten und depyrogenisierten Urokinase erhalten worden war, ist seinerseits innerhalb der Normen, die in den Beispielen E und F angewendet worden sind, frei von pyrogenen Substanzen.

(3) Vasopressive Substanzen

Das Urokinaseheparinat, insbesondere dasjenige, welches aus den vorerwähnten depyrogenisierten Urokinasen erhalten worden war, ist frei von vasopressiven Substanzen.

Die Untersuchung wurde in der Weise durchgeführt, daß man eine Injektion von Urokinaseheparinat bei sechs männlichen Hunden der Rasse Beagle, die ungefähr 8 Monate alt waren und 9 bis 15 kg Gewicht besaßen, durchführte, und zwar im Verhältnis von 20 000 UCTA/kg; diese Hunde waren einer Anästhesie durch eine Injektion von Pentothai® 1V4 Stunde vor der Verabreichung des Urokinaseheparinats unterworfen worden. Die Messungen des arteriellen Drucks wurden fortlaufend während einer Dauer von 300 Minuten nach der Injektion durchgeführt Man fand keine Veränderungen des arteriellen Druckes als diejenigen, die man ebenfalls bei 4 Hunden beobachtete, sofern man diesen selben Hunden die gleiche Dosis Pentothal® injizierte, ohne daß später eine Injektion von Urokinaseheparinat stattfand. Der Komplex gemäß der Erfindung wurde daher ausgezeichnet und vollkommen vertragen.
Eine Untersuchung, die am Kaninchen durchgeführt wurde, und sich auf 4 Tiere erstreckte, die 100000 UCTA/kg in fünf Injektionen mit 50 000 Einheiten alle 15 Minuten erhielten, zeigte die gleiche Verträglichkeit des Produkts.

(4) Thromboplastine

Mit Hilfe eines Thrombelastogrammes wurde bei mehreren Tieren nachgeprüft, daß die intravenöse Injektion von beträchtlichen Dosen von Hcparin-Urokinasc beim Kaninchen (lOGGGO UCTA/kg/Stunde) iedigiich eine

Hypogerinnbarkeit bzw. Hypocoagulabilität aufgrund des Heparins zur Folge hatte, ohne daß sich ein Rückfall nach der Neutralisierung des Antikoagulierungs- bzw. -gerinnungsmittels durch Protaminsulfat oder nach seiner spontanen Entfernung manifestierte.

(C) Klinische Untersuchungen

(1) Die Verabreichung der Urokinase im Zustand des Komplexes mit Heparin wird wegen ihrer viel gröJeren Stabilität gegenüber der nicht im Komplex befindlichen Urokinase besonders im Perfusionsmedium erleichtert,

wie die nachstehenden klinischen Untersuchungen mit Urokinaseheparinatpräparaten in Lösung in einem Glucoseserum zeigen, die an Kranken ausgeführt worden sind, welche unterschiedliche Kreislaufschwierigkeiten hatten, die zur Bildung von obliteranten Klümpchen führen. Das Urokinaseheparinat wurde durch intravenöse Perfusion während 24 Stunden mit einer Dosis von 50 000 bis 100 000 CTA-Einheiten/h verabreicht.
Die Beobachtungen und Ergebnisse, die erhalten wurden, sind nachstehend aufgeführt:

(a) Bei einem Kranken, der seit langer Zeit von einer Arterienentzündung befallen war und dessen Aortagabel von einer Dacronprothese gebildet wurde, führte diese Behandlung dazu, daß es möglich war, bei zwei Wiederholungen, in 8 bis 12 Stunden, die Lyse der Klümpchen zu erreichen, welche die Prothese zusetzen bzw. abstruieren.

(b) Bei einem Kranken, der mit einer, ihn ans Bett fesselnden Thrombose befallen war, und der durch Perfusion während einer Stunde behandelt wurde, und zwar mit einer Lösung von Urokinaseheparinat mit einem Gehalt von 100 000 CTA-Einheiten, und danach während der folgenden Stunden mit einer Lösung mit einem Gehalt von 50 000 CTA-Einheiten, konnte durch ophtalmoskopische Kontrolle die Lyse der Thrombose 8 Stunden nach Beginn der Behandlung festgestellt werden. 1S

(c) Bei einem Kranken, der sich in einem allgemein mißlichen Zustand befand, dessen phlebographische Untersuchung ein schweres Phlegma alba dolens des unteren Gliedes erkennen ließ, konnte man feststellen, daß durch Verabreichung von 50 000 CTA-Einheiten/h von Urokinaseheparinat eine vollständige Regression bzw. ein vollständiger Rückgang des Phlegma alba dolens in 18 Stunden stattfand.

Eine phlebographische Untersuchung, die nach 48 Stunden durchgeführt wurde, konnte zu der Feststellung führen, daß der Thrombus, welcher die tiefliegende Schenkelvene von ihrem kniekehlenbezüglichen Ursprung bis zu ihrem zum Darmbein gehörigen Ende verstopfte, lysiert worden war.

Bei der Untersuchung dieser Ergebnisse zeigt sich, daß das Urokinaseheparinat ein bemerkenswertes Thrombosemittel ist das innerhalb relativ kurzer Fristen zur Befreiung eines arteriellen oder venösen Abschnitts führt, der durch Klümpchen versperrt ist

In allen hier beschriebenen Versuchen war die Stabilität des in Lösung gebrachten Urokinaseheparinats derart daß es in keinem Falle erforderlich war, das Urokinaseperfusionsmedium zu regenerieren, und zwar während der gesamten Dauer der Perfusionsvorgänge.

Der Nutzen des erfindungsgemäßen Urokinaseheparinats wird noch erhöht durch die Tatsache, daß er vom Organismus gut toleriert wird, daß seine Anwendung keine Nachwirkungen auf die Gerinnungsfaktoren des umlaufenden Blutes hat und daß er keinen hämorrhagischen Unfall oder Zwischenfall hervorruft.

(2) Die vorhergehenden Ergebnisse sind mit hochgereinigten Urokinasepräparaten erhalten worden, die jedoch keiner Depyrogenisierungsbehandlung unterworfen worden waren.

Die nachfolgende Darstellung betrifft klinische Beobachtungen, die mit Urokinasepräparaten im Zustand 35 [ gereinigten und gleichzeitig depyrogenisierten Urokinaseheparinats realisiert wurden. Die Verwendung dieser Präparate hat zu den unten aufgeführten beachtlichen Ergebnissen geführt, und zwar unter Abwesenheit jeder unerwünschten Sekundärwirkung.

(a) Die Verabreichung von Urokinaseheparinat das frei von pyrogenen Substanzen war, an 10 Kranke, die mehr oder weniger fortgeschrittene Syndrome des Herzmuskelinfarkts aufwiesen, mit wiederholten Dosen von 75 000 bis 150 000 CTA-Einheiten hat in allen Fällen zu einer schnellen und günstigen Entwicklung der beobachteten Syndrome seit den ersten Tagen der Behandlung geführt

Nachstehend werden die Grundlinien einer dieser 10 klinischen Beobachtungen wiedergegeben, die besonders typisch bezüglich der Wirkung von urokinaseheparinat sind, das frei von pyrogenen Substanzen ist

B... Jean Louis, 44 Jahre, Erzieher nicht angepaßter Kinder, ist wegen eines prämonitorischen Syndroms eines Herzmuskelinfarkts in die Klinik eingewiesen worden. Er leidet seit einer Woche an einer anginösen Krankheit begleitet von einer Hyperthermie. Das Elektrokardiogramm enthüllt eine umfassende subepikardische Ischämie.

Er erhält durch Perfusion eine Behandlung auf der Grundlage von Urokinaseheparinat im Verhältnis von 75 000 CTA-Einheiten pro Stunde während 24 Stunden, das heißt insgesamt 1 850 000 CTA-Einheiten, Heparin (30 mg alle zwei Stunden) und Corticosteroide, die im Handel unter der Bezeichnung SOLUDECADRON erhältlich sind.

Man beobachtet auf klinischer Ebene eine Regression der Hyperthermie und ein Verschwinden des anginösen Syndroms seit der vierten Stunde der Behandlung. Die Elektrokardiographie läßt eine schnelle günstige Entwicklung im Verlauf von 24 Stunden der Behandlung erkennen. Am Ende von 8 Tagen ist das Elektrokardiogramm zum ersten Mal praktisch normal.

Auf biologischer Ebene beobachtet man parallel eine schnelle Verminderung des Plasminogenspiegels, was eine rasche Umwandlung der Plasminogene in Piasmine bedeutet; außerdem ist eine schnelle Vermehrung der Zersetzungsprodukte des Fibrins zu beobachten, was sachlich die Lysis des Fibrins der pathologischen Klümpchen bedeutet eo

Die Nachwirkungen, die beim Patienten nach seiner Konvaleszenz übrigbleiben, sind so gering, daß er seine Arbeit wieder aufnehmen kann.

Es werden nachstehend noch die Ergebnisse wiedergegeben, welche bei einer Behandlung von 15 an einem Herzmuskelinfarkt leidenden Patienten erhalten worden sind.

Generalien und Verfahren

Die Untersuchung der therapeutischen Wirkung des Urokinaseheparinats bei einer Gruppe von 15 Kranken wurde in der folgenden Weise durchgeführt:
5

(a) Wahl der Kranken: Der Infarkt datiert wenigstens seit 48 Stunden.

(b) Kriterien der Bewertung der therapeutischen Aktivität:

— Klinische Entwicklung: Verschwinden des Schmerzes;
Wiederbeginn bzw. -aufnahme der physischen Aktivität;

Ableben in mittlerer Frist (30Tage).

— Elektrokardiographische Entwicklung

— Entwicklung der Tri-Scintigraphie

— Berechnung bzw. Schätzung der biologischen Aktivität der Urokinase, gehandhabt nach dem festgehaltenen Schema:

Berechnung bzw. Schätzung des Plasminogenspiegels;

Berechnung bzw. Schätzung des Fibrinogenspiegels;
Berechnung bzw. Schätzung der Produkte der Lyse;
Berechnung bzw. Schätzung der Toleranz:

— Blutdruck
— Temperatur

— klinische und biologische Zeichen, die der Urokinase zugeschrieben werden können, mit Ausnahme derjenigen, die mit ihrer spezifischen Aktivität verknüpft sind.

(c) Therapeutisches Schema

— Urokinaseheparinat: 75 000 UCTA/Stunde während 24 Stunden, verabreicht durch Perfusion. Das Urokinaseheparinat wird in gelöster isotonischer Glucose verdünnt

— Heparin: Verabreicht auf subkutanem Wege mit einer Behandlungsweise bzw. -Vorschrift, die in Abhängigkeit vom Zustand des Kranken passend gewählt war, um eine wirksame und stabile Hypogerinnbarkeit bzw. -koagulabilität zu erreichen (Howellzeit des Kranken doppelt derjenigen der Kontrollperson).

Ergebnisse:

(a) 15 behandelte Kranke: 14 Männer, 1 Frau. Alter zwischen 41 und 74 Jahre.
(b) Globale klinische Entwicklung:

— Verschwinden des Schmerzes zwischen 1 h und 4 h nach Anfang der Behandlung, mit Ausnahme von einem Fall.

— Zeit des Krankenhausaufenthalts: Zwischen 23 und 36 Tagen.

— Wiederbeginn der Passivaktivität im Bett: Zwischen 3 und 14 Tagen.
— Mobilisierung und Aufstehen bzw. Erheben: Zwischen 9 und 23 Tagen.

Diese Gruppe der Kranken ist repräsentativ. Die Zeiten des Verschwindens des Schmerzes, der Mobilisierung und des Erhebens bzw. Aufstehens sind kürzer als diejenigen, die klassischerweise bei einer Gruppe von Herzmuskelinfarktkranken beobachtet wurden, welche nicht mit Urokinase behandelt worden sind.

« In dieser Gruppe wurde kein Sterbefall beobachtet: In einer Gruppe von vergleichbaren Kranken — nicht mit Urokinase behandelt — beträgt die Sterblichkeit 26%; sie ist 18%, wenn man ein anderes thrombolytisches Medikament verabreicht (Streptokinase).

Es wurde kein hämorrhagischer Zwischen- bzw. Unfall beobachtet, die Verträglichkeit der Urokinase ist vollkommen; es wurde keine Veränderung der Temperatur, keine Veränderung des Blutdrucks, keinerlei klinisehe oder biologische Veränderung, die diesem Medikament zuzuschreiben ist, beobachtet, abgesehen von denjenigen, die unmittelbar seiner spezifischen Aktivität zuzuschreiben sind.

Globale elektrokardiographische Entwicklung:

9 Fälle von Ischämie oder Ischämie-Läsion:
Normale oder praktisch normale elektrokardiographische Aufzeichnung in 6 Fällen. Mittlere Zeit: 22 Tage.

Nachwirkungszustand der Ischämie-Läsion in 3 Fällen (aber in 2 Fällen liegt eine kammerbezügliche bzw. ventrikuläre Hohlorganerweiterung bzw. Ektasie vor, die bereits vor der Behandlung vorhanden war).

6 Fälle von Nekrose und Ischämie-Syndrom:

Normale oder praktisch normale elektrokardiographische Aufzeichnung mit vollständiger Regression der Nekrose in 3 Fällen. Mittlere Zeit: 26 Tage.

Beachtliche Regression der Nekrose in 3 Fällen (in einem Fall war die kammerbezügliche Hohlgefäßerweiterung bzw. ventrikuläre Ektasie vorher bereits vorhanden).

Diese elektrokardiographische Entwicklung verläuft schneller als diejenige, die man üblicherweise in einer gleichartigen Gruppe von nicht mit Urokinase behandelten Herzmuskelinfarktkranken beobachtet

Scintigraphische Entwicklung

jedesmal wenn die Herzcintigraphie (Scintigraphic des Herzmuskels, Hohlraumscintigraphie und Coronarscintigraphie), das heißt also eine dreifache oder TRl-Scintigraphie ausgeführt worden ist — vor und nach der Behandlung — beispielsweise 21 Tage nach der ersten Untersuchung, war sie genau parallel zum Elektrokardiogramm (insbesondere wurden die vor der Behandlung vorliegenden ventrikulären Ektasien objektiviert, desgleichen die Regression oder das Verschwinden der Nekrose, wie auch die Regression oder das Verschwinden des Ischämie-Syndroms).

Biologische Berechnung bzw. Schätzung

Plasminogen

— Anfänglicher Spiegel bzw. Gehalt zwischen 90 und 120%.

— Maximaler beobachteter Sturz bzw. Abfall: Zwischen 43 und 11 %.

Der Sturz bzw. Abfall ist bedeutsam bzw. prägnant.

Fibrinogen

— Anfänglicher Spiegel bzw. Gehalt zwischen 10,80 g/l und 1,96 g/l.

— Minimaler Gehalt, der unter der Behandlung beobachtet worden ist: Zwischen 6,36 g/I und 1,85 g/l. Die beobachteten Veränderungen sind nicht bedeutend bzw. kennzeichnend.

Zersetzungsprodukte des Fibrins

— Anfänglicher Spiegel bzw. Gehalt zwischen 0,4 μ und 12,80 u,

— Gehalt, der unter der Behandlung beobachtet worden ist: zwischen 320 μ und 2660 μ. Die beobachteten Veränderungen sind bedeutend bzw. kennzeichnend.

Folgerung

In dieser Gruppe der 15 Herzmuskelinfarktkranken, die mit Urokinaseheparinat mit einer Dosis von 75 000 UCTA/Stunde während 24 Stunden behandelt worden sind, kann man unter Vergleich mit einer Gruppe von vergleichbaren, nicht behandelten Kranken feststellen, daß folgendes erreicht worden ist:

— In 14 unter 15 Fällen eine schnelle Regression des Schmerzes ohne Wiederbeginn des anginösen Syndroms;

— eine frühzeitigere Wiederkehr sowohl der passiven als auch der aktiven physischen Aktivität;

— keinen Todesfall, keinen hämorrhagischen Zwischen- bzw. Unfall, die Verträglichkeit war vollkommen;

— die elektrokardiographische Entwicklung, bestätigt durch die scintigraphische Entwicklung, ist viel kürzer

als diejenige die in der Vergleichsgruppe beobachtet worden ist

Wie sich aus den vorstehenden klinischen Beobachtungen ergibt ist das Urokinaseheparinat also ein fibrinolytisches und thrombolytisches Medikament von großem Wert und zwar für den Menschen wie auch für die Tiere.

Wenn auch in den vorstehenden Beispielen das Urokinaseheparinat durch endovenöse Perfusion verabreicht worden ist kann man auch auf andere Perfusionsarten zurückgreifen, wie beispielsweise auf Perfusionen in situ, insbesondere solche intrapleuraler Art.

Die Behandlungs-bzw. Verabreichungsvorschriften sollen dem Fall jedes Patienten angepaßt sein. Sie sehen im allgemeinen Dosen vor, die in einem Bereich von 50 000 bis 150 000, vorzugsweise 50 000 bis 100 000 UCTA/ Stunde, während 24 Stunden liegen.

Das Urokinaseheparinat kann in Lösung in jedem für den Organismus annehmbaren Perfusionsmedium verabreicht werden, das mit der Urokinase verträglich ist mit dem Heparin keinen Niederschlag bildet und Ttrei von mineralischen Salzen ist Ein bevorzugtes Perfusionsmedium ist das isotonische Glucoseserum.

Das Urokinaseheparinat ist in diesem Medium in allen Verdünnungen stabil. An den Beendigungen der Behandlung wird man solche Verdünnungen wählen, welche die Verabreichung der genannten Dosen erlauben, ohne daß die Perfusionsvolumina die vom Organismus vertragenen Werte überschreiten, jedoch sollen diese Volumina ausi eichend sein, daß man eine fortlaufende Perfusion »Tropfen auf Tropfen« verwirklichen kann. Wenn das Perfusionsmedium von einem isotonischen Glucoseserum gebildet wird, dann wählt man vorteilhafterweise eine Verdünnung, welche die Verabreichung der gewählten Urokinaseheparinatdosen in einem Verhältnis von etwa 250 ml Lösung/6 Stunden gestattet beispielsweise Verdünnungen von etwa 300 000 bis 900 000, vorzugsweise 300 000 bis 600 000 UCTA an Urokinase/250 mL

Die in Mikrosiemens im Rahmen der Beschreibung und der Ansprüche angegebenen Werte beziehen sich auf den Zentimeter, sind also als Mikrosiemens/cm zu lesen.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Urokinase-Heparinat, erhältlich durch Zusammengeben von Heparin und hochgereinigter, therapeutisch verwendbarer Urokinase in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 1 bis 5 und Isolierung des gebildeten Niederschlags.

2. Urokinase-Heparinat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Aktivitätsverhältnis von 300 bis 1000 CTA-Einheiten Urokinase je 1 UI Heparin aufweist

3. Urokinase-Heparinat nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch ein Aktivitätsverhältnis von 625 CTA-Einheiten Urokinase je 1 UI Heparin und ein Gewichtsverhältnis von Urokinase zu Heparin in der

ίο Größenordnung von 10:6.

4. Arzneimittel enthaltend Urokinase-Heparinat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 neben üblichen pharmazeutischen Trägern und Verdünnungsmitteln, insbesondere einer isotonischen Perfusionslösung.