DE2133181B2

DE2133181B2 - Tuberactinomycffi-N, Verfahren zu dessen Herstellung und dieses enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2133181B2
Application number: DE2133181A
Authority: DE
Inventors: J Abe; T Ando; R Izumi; K Matsuura; A Nagata; T Noda; T Take; T Watanabe
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1970-06-30
Filing date: 1971-06-30
Publication date: 1979-07-12
Also published as: CA981198A; DK129138C; BE769237A; CH558832A; ES392755A1; DE2133181C3; PL81845B1; DK129138B; SU384233A3; NL155049B; HU164533B; CS188875B2; DE2133181A1; FR2100846A1; SE375324B; FR2100846B1; JPS4838877B1; AT310944B; NL7109029A; US3892732A

Description

C—NH-CH-C—NH-CH

Il I Il I

CH₂-CH₂-CH-CH-CH₂-C-NH-Ch O C=O

NH,

OH NH₂

NH

NH-C-CH-NH-C-C = C

Il

NH- C—NH₂

Il ο Il o

2. Verfahren zur Herstellung von Tuberactinomycin-N, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces griseoverticillatus van tuberacticus FERM P-619 unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium bei !8 bis 37°C züchtet und Tuberactinomycin-N in üblicher Weise aus dem Kulturmedi um isoliert

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Züchten in einem Zeitraum von etwa 2 bis 10 Tagen durchführt

4. Arzneimittel, enthaltend Tuberactinomycin-N im Gemisch mit üblichen Zusatzstoffen.

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, d:is Tuberactinomycin-N genannt wird, ein Verfahren zu dessen Herstellung durch Fermentation und Gewinnung aus der Fermentationsbrühe sowie Arzneimittel, diie Tuberactinomycin-N im Gemisch mit üblichen Zusatzstoffen enthalten.

Es ist bekannt, daß es eine Vielzahl von Antibiotika gibt, die durch Boden-Organismen, speziell der Gattung Streptomyces produziert werden. Einige dieser Antibiotika sind klinisch als Antituberkulosemittel angewendet worden, wie beispielsweise Streptomycin, Kanamycin, Cycloserin, Viomycin. Es sind jedoch früher häufig Stämme von Tuberkulose-Bazillen aufgetreten, die gegen diese Antituberkulose-Antibiotika resistent sind, und dies hat in der Tuberkulose-Therapie ernste Schwierigkeiten verursacht

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Antituberkulose-Antibiotikum zu schaffen. Diese Aulgabe wird gelöst mittels eines neuen basischen Peptids Tuberactinomycin-N. Es wurde gefunden, daß ein zur Gruppe des Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus gehörender Stamm ein Antituberkulose-Antibiotikum zu produzieren vermag. Dieses wird bezeichnet als Tuberactin oder Tuberactinomycin (entsprechend J. Antibiotics. 21, 681 [1968J GB-PS 12 Ol 727). Es wurde weiterhin ein Mutant des besagten Streptomyces erforscht und untersucht, und dabei wurde gefunden, daß dieser ein neues antibiotisches Tuberactinomycin-N zu produzieren vermag, welches, verglichen mit Tuberactinomycin, eine stärkere Antituberkulose- Aktivität gegenüber Tuberkelbazillen hat die gegen Streptomycin, p-Aminosalizylsäure oder Kanamycin resistent sind. Außerdem hat dieses neue Antibiotikum eine niedrige Toxizität

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Antibiotikums besteht darin, daß ein neues, klinisch brauchbares Mittel zur Verfügung steht, demgegenüber die Tuberkelbazillen nicht resistent sind

Ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antibiotikums Tuberactinomycin-N ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einem wäßrigen Nährmedium bei 18 bis 37" C Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus FERM P-619 aerob züchtet, bis es antibiotische Aktivität aufweist und Tuberactinomycin-N in üblicher Weise aus dem Kulturmedium isoliert Das Antibiotikum wird als im wesentlichen kristallines Pulver gewonnen, welches eine Antituberkulose-Aktivität besitzt

Der Erfindungsgegenstand sowie dessen Vorteile werden in der nachstehenden Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen noch näher veranschaulicht Es zeigt F i g. 1 ein Schaubild des Ultraviolett-Absorptions spektrums vonTuberactinomycin-N-Hydrochlorid,

F i g. 2 ein Schaubild des Infrarot-Absorptionsspektrums von Tuberactinomycin-N,

F i g. 3 eine graphische Darstellung, die das kernmagnetische Resonanzspektrum von Tuberactinomycin-N- hydrochlorid zeigt, und

Fig.4 ein Schaubild, in welchem die analytische Aminosäure-Struktur von Tuberactinomycin-N-hydrochlorid dargestellt ist Der Tuberactinomycin-N produzierende Stamm ist ein Mutanten-Stamm von Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus NRRL 3482, der durch Nitrosoguanidinbehandiung erhalten wurde.

Nachfolgend wird eine allgemeine Beschreibung der taxonomischen Eigenschaften dieses Mutant-Organis mus gegeben, die auf beobachteten diagnostischen Eigenschaften basiert

(1) Das kulturelle Verhalten ist in Tabelle I niedergelegt

TabeUe I

Medium

Untersuchte Eigenschaften

Medium

Untersuchte Eigenschaften Czapek-Dox.- G: gut Agar AM: weiß bis perirosa (3 ca)

SM: hellweizenfarben (2 ea) oder bambusfarben (2 ge)

SP: keine

Asparagin- G: mäßig Glukose-Agar AM: mäßig, weiß bis mattrosa

(5 ba) oder frischrosa (5 ca) SM: manchmal in das Medium eindringend, perirosa (3 ca), bisquit (3 ec) SP: keine

Bennett's Agar G: sehr gut

AM: gut, weiß bis frischrosa (4 ca) bis hellrosabeige (4 ec), Tröpfchen

SM: bambiusfarben (2 gc) bis graduell dunkel- bis hellbraun (4 ng)

SP: keine

Bouillon-Agar G: schlecht AM: keine SM: nahezu farblos bis kalkig

(ll/2ec) SP: keine

Calcium-malat G: mäßig Agar AM: weiß bis bisquit (3 ec),

kurzes Mycelium SM: schlechtes Wachstum, perliormig bis schalenförmig gefärbt (3 ba) SP: keine

Gelatin-Medium G: sehr schlecht

inkubiert bei AM:: keine

24"C SM: hellbraun (4 ng) oder kakao

braun (5 Ig), Gelatine-Verflüssigung SP: keine

Löffler's Serum G: mäßig AM: keine SM: hellweizenfarben (2 ea) oder

bambusfarben (2 gc), keine

Haemolyse SP: keine

Stärke-Agar G: mäßig

AM: gut, weiß bis frischrosa (A ca) bis hellrosabeige (4 ec)

SM: manchmal in das Medium eindringend, frischrosa (4 ca) bis hellrosabeige (4 ec)

Eier-Medium G: gut AM: weiß bis perifarben (2 ba)

SM: -

SP: keine

Milch-Medium G: mäßig

AM: mäßig, weiß bis hellweizenfarben (2 ea) oder bisquit-

farben (3 ec)

SM: an der Oberfläche Ring bildend, schwache Koagulation SP: keine Cellulose G: keine

Tyrosin-Agar G: mäßig AM: sehr schlecht SM: hellweizenfarben (2 ea) bis

zimtfarben (3 Ie) SP: keine

Harnstoff- G: sehr gut Glycerin-Agar AM: weiß bis hellbeige (4 ec),

mit vielen Tropfen bedeckt SM: hellweizenfarben (2 ea) bis

hellwürzbraun (4 Ig) SP: meist nicht vorhanden oder hell kalkig (\^xk ec) oder ecrufarben (2 ec)

G: gut

AM: weiß bis hellrosabeige (4 ec),

Wassertröpfchen SM: perirosa (3 ca oder 4 ca) SP: keine

G: Gut

AM: hellrosabeige (4 ec),

Wassertröpfchen SM: hellamberfarben (3 ic) bis

zimtfarben (3 Ie) SP: keine

Glucose- G: gut Bouillon AM: keine

SM: nahezu farblose Mycelium-Klumpen am Boden

SP: keine

Pepton- G: gut Glucose-Agar AM: hellrosabeige (4 ec) bis

rosabeige (4 gc) SM: Butterscotch (3 ne) bis

goldbraun (3 pg) SP: keine

Glycerin- G: mäßig Czapek AM: frischrosa oder perirosa(4 ca) SM: keine Färbung

SP: keine

Hafermehl-Agar

Kartoffel-Glucose-Agar

	SP:	keine
Kartoffel	G:	mäßig
pfropfen	AM:	seitlich mit weißem Mycelium
		bedeckt
	SM:	gekrümmtes Wachstum, hell
		weizenfarben (2 ea)
	SP:	keine
Möhren-	G:	keines
nfmnfen

Diese Eigenschaften wurden, ausgenommen der Versuch mit Gelatin-Medium, bei 30⁰C und zehntägiger Züchtung beobachtet

Die Angabe der Färbungen wurde gemäß dem »Color Harmony Manual« (Container Corp. of America, 1958) gemacht und bei nördlichem Tagesiicht beobachtet.

Ir Tabelle I bedeuten

G = Wachstum,

AM = Luft-Mycelium, SM = Substrat-Mycelium und SP = löslicher Farbstoff.

(2) Struktur von Hyphae-tragenden Sporen

Ein Luft-Mycelium wird in vielen Medien gut ausgebildet, und es wurden viele primäre und sekundäre Windungen mit einer starren oder flexiblen Form beobachtet

(3) Sporen-Struktur

Bei einer elektronenmikroskopischen Betrachtung zeigten die Sporen glatte Oberfläche, lange elliptische oder zylindrische Form, 0,7 bis 1,5 μ χ 0,5 bis 0,6 μ.

(4) Färbung des Myceliums

Die Färbung des Luft-Myceliums ist in zahlreichen Medien zu Beginn weiß, verändert sich allmählich in rosa oder beige. Manchmal ist es mit Wassertröpfchen bedeckt Die Färbung des Substrat-Myceliums ist im allgemeinen gelblichbraun oder fahlbraun.

(5) Lösliches Pigment

Es wurde in dem untersuchten Medium keine Bildung von löslichem Pigment beobachtet, ausgenommen eine hellkalkige oder ecrufarbene Färbung in dem Harnstoff-Glycerin-Medium.

(6) Physiologische Charakteristiken

(a) Gelatine-Verflüssigung: sehr schlechtes Wachstum, positive Verflüssigung

(b) Stärke-Hydrolyse: positive Hydrolyse

(c) Nitrat-Reduktion: keine

(d) Peptonisation von Milch: kaum beobachtet

(e) Cellulose-Zersetzung: keine

(f) Produktion von H₂S: keine

(g) Haemolyse: negativ

(h) Melanin-Pigment-Bildung: keine

(7) Verwendung von Kohlenstoffquellen

Glukose, Maltose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Mamose und Inosit: läßt sich verwenden (+).

Xylose, Fruktose, Thamnose, Raffinose, Salicin und Arabinose: läßt sich nicht verwenden (—).

Laktose, Saccharose und Mannitol: nicht eindeutig

(8) Kolonie

Großkolonie zeigt eine chrysanthemenartige Form und ist mit baumwollartigem Mycelium bedeckt

In Tabelle II sind die Verschiedenheiten veranschaulicht, die sich beim Vergleich der taxonomischen Eigenschaften zwischen dem hier beschriebenen Streptomyces und dem Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus NRRL 3482 ergeben. Es ist aus diesem Grund der hier beschriebene Streptomyces als Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus Nr. N 6-130 bezeichnet

Tabelle Π	-	Hier beschriebe
Medium	Streptomyces	ner Streptomyces
	griseoverticillatus	NRRL 3986
	var. tuberacticus
	NRRL 3482	sehr gutes
Harnstoff-	gutes Wachstum	Wachstum
Glycerin-Agar		kein
Möhrenpfropfen	mäßig	Wachstum
		schwache
Milch	keine	Koagulation
	Koagulation

Der hier beschriebene Streptomyces wurde hinterlegt beim Institute for Microbiological Industry and Technology, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade & Industry, Japan und der dort befindlichen permanenten Kulturen-Kollektion unter der Hinterlegungsnummer FERM P-619 beigegeben. Ferner wurde dieser Stamm bei dem United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and

ίο Development Division hinterlegt und dort unter der Hinterlegungsnummer NRRL 3986 registriert

Erfindungsgemäß wird Tuberactinomycin-N durch Beimpfen eines geeigneten Nährmediums mit Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus No. N 6-130, Züchten unter für die Antibiotika-Produktion üblichen Bedingungen und Isolieren des Antibiotikums aus dem Kulturmedium gewonnen. Der Mikroorganismus läßt sich in flüssigen Kulturen oder auf festen Nährböden züchten. Der für die industrielle Herstellung von Tuberactinomycin-N vorteilhafte Weg ist das aerobe Kulturverfahren.

Nährmedien, die für die Produktion von Tuberactinomycin-N verwendbar sind, sollen eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, wie beispielsweise Glukose, Saccharose, Laktose, Maltose, Stärke, Dextrin, Melasse, Glycerin, eine Quelle für assimilierbaren organischen und anorganischen Stickstoff, wie beispielsweise Kornweichflüssigkeit, Sojabohnenpulver, Baumwollsaatöi, Gluten, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt Hefe, Kaseinhydrolysat oder beispielsweise Ammoniumsalze, anorganische Nitrate enthalten. Die Medien weisen weiterhin Salze, beispielsweise Phosphate, Magnesium-, Kalzium-, Kalium-, Natrium-, Zink-, Mangan-Salze, auf.

Für die Produktion von Tuberactinomycin-N züchtet man den Mikroorganismus vorzugsweise bei 25—30° C.

Aus der Kulturbrühe wird das Tuberactinomycin-N,

wie nachstehend im einzelnen beschrieben, entfernt Im allgemeinen ist es nicht möglich, das Produkt mit mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln zu extrahieren, weil es von Natur aus leicht löslich in Wasser ist Daher wird bei industrieller Herstellung auf solche Arbeitsmaßnahmen für die Isolierung und Reinigung des Tuberactinomycins-N zurückgegriffen, die durch dessen basische Natur sich anbieten.

Bei einer bevorzugten Arbeitsweise wird die gesamte Nährmedium-Masse filtriert, das Tuberactinomycin-N wird durch Zugabe von Sulfonsäure-Farbstoff, wie beispielsweise Methylorange, Eriochrom-Violett, AlizarinrotS als Farbstoff-Salz aus dem Filtrat ausgefällt Das so gebildete Tuberactinomycin-N-Farbstoffsalz wird in einem organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Aceton, suspendiert, dann wird ein anorganisches Salz von Triäthylamin, wie beispielsweise Triäthylamin-Hydrochlorid oder -sulfat, dazugegeben, und es fällt das entsprechende anorganische Salz von Tuberactinomycin-N, beispielsweise Tuberactinomydn-N-hydrochlorid oder -sulfat, aus. Man kann auch so arbeiten, daß man das Farbstoffsalz von Tuberactmo- mycin-N in wäßriger Salzsäure oder Schwefelsäure löst und, nachdem man den Farbstoff durch Extraktion mit mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln daraus entfernt hat, die wäßrige Schicht konzen triert, ein organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Aceton, dazugibt und in dieser Weise das anorganische Salz von Tuberactinomycin-N ausfällt

Eine weitere Arbeitsweise, die das für industrielle Zwecke besonders vorteilhafte Verfahren darstellt.

besteht darin, daß man zum Isolieren des Tuberactinomycin-N aus der Kulturbrühe Kationenaustauscherharz einsetzt Bei diesem Verfahren wird das Tuberactinomycin-N im Kationenaustauscherharz festgehalten, mit verdünnter Lösung von Schwefelsäure oder Salzsäure oder auch mit verdünnter alkalischer Lösung eluiert, und die Tuberactinomycin-N-aktiven Fraktionen werden gesammelt, neutralisiert und konzentriert, es wird ein Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Aceton, dazugegeben, und dann wird das Salz von Tuberactinomycin-N als Ausfällung gewonnen. Man kann auch so vorgehen, daß man das Filtrat des Kulturmediums dialysiert oder einer Gel-Filtration unterzieht, um die Substanzen mit hohen Molekulargewichten, wie beispielsweise proteinartige Substanzen, wie Polysaccharide, die in der Brühe vorhanden sind, zu entfernen, danach durch Zugabe einer Säure konzentriert und anschließend mittels organischem Lösungsmittel das Säuresalz von Tuberactinomycin-N ausfällt

Das so gewonnene rohe Tuberactinomycin-N-Salz wird vorzugsweise durch Umkristallisation gereinigt, und dazu löst man in Wasser, mischt dann ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, zu. Man kann die Reinigung auch durch Aufgeben auf eine Chromatographie-Säule, beispielsweise aus Kationenaustauscherharz, Silicagel, Cellulosepulver, die als Trägerstoffe bei der Reinigung von Tuberactinomycin-N geeignet sind, eiuieren und die aktiven Fraktionen sammeln, daran anschließend konzentrieren und ein Lösungsmittel zugeben und auf diese Weise das Material in Form eines Salzes eiuieren.

Eine weitere Methode für die Reinigung von Tuberactinomycin-N-Salz besteht darin, daß die konzentrierte wäßrige Lösung von Tuberactinomycin-N-Salz mit einem Überschuß von wäßrigem Triäthylaminsulfat versetzt wird. Es bildet sich dann Tuberactinomycin-N-Sulfat, und anschließend wird eine große Menge von mit Wasser mischbarem organischem Lösungsmitte!, wie beispielsweise Methanol, Aceton, zugegeben, wodurch das Tuberactinomycin-N als Sulfat abgetrennt wird. Dieses läßt sich durch Wiederholung dieser Arbeitsvorgänge reinigen.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Tuberactinomycin-N, wie es nach den oben beschriebenen Verfahren gewonnen wurde, sind folgende:

(1) Elementaranalyse

Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid:

Gefunden:

C 37,70%, H 6,12%, N 22,50%. Cl 13,32%; berechnet WrC₂₅H₄₃Ni₃Oi₀-S HCl:

C 37,76%, H 5,83%, N 22,90%, Cl 13,38%.

(2) Molekulargewicht:

778,4 (durch Titrationsmethode ermittelt).

(3) Molekularformel, durch Berechnung ermittelt aus den bei der Elementaranalyse gefundenen Werten und dem festgestellten Molekulargewicht: C₂5H«Ni30io-3 HCl als Hydrochlorid.

(4) Schmelzpunkt:

245° C (unter Zersetzung).

(5) Optische Drehung desTuberactinomycin-N-Hydrochlorids: [«] y 19,l(c= 1,H₂O).

(6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Hydrochloride:

veranschaulicht in F i g. 1 (Konzentration 20 y/ml)

(j?)m«.-268 mu, (»?)m«:269mn, (j})_m„;288mn,

= 342,5 (in Wasser) = 320,0 (in 0,1 n-HCl) = 215,O(inO,l n-NaOH)

(7) Infrarotspektrum (als KBr-Preßling): in F i g. 2 veranschaulicht

Charakteristische Maxima:

3300,1660,1500,1225 und 1050 cm-¹.

(8) Löslichkeit:

Anorganische Salze von Tuberactinomycin-N, wie

beispielsweise Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid und -sulfat sind leicht löslich in Wasser und schwer löslich in den üblichen organischen Lösungsmitteln.

(9) Färbungsreaktion: Positiv: Ninhydrin, Biuret;

Negativ: Sakaguchi, Isatin, Pauli, Molisch.

(10) Basizität:

pkai = 7,25, pka₂ = 10,05, pka₃ > 11.

(11) Aussehen:

Als Hydrochlorid oder Sulfat weißes kristallines Pulver.

(12) Aminosäure-Bestandteile:

In Fig.4 veranschaulicht; Säurehydrolyse von Tuberactinomycin-N gibt Serin, DAPA (a^J-Diaminopropionsäure), v-Oxy-ß-lysin und Capreomycindin.

(13) Kernmagnetisches Resonanzspektrum: In F i g. 3 veranschaulicht

Das zuvor beschriebene Tuberactinomycin-N hat die so Formel:

OH OH

I I

O CH₂ CH₂

Il I I

C—NH—CH—C—NH-CH

CH₂-CH₂-CH-CH-CH₂-C-NH-Ch

NH₂

OH NH₂

CH₂

Γνη

C=O NH

NH-C-CH-NH-C-C = C

Il

NH-C-NH₂

Tuberactinomycin-N stellt, wie hier beschrieben, ein
Peptid-Antibiotikum mit Antituberkulose-Aktivität dar,
welches aus 2 Mol Serin, 1 Mol L-oJJ-Diaminopropionsäure, 1 Mol 3-Ureidodehydroalanin, t Mol L-Capreomycidin und 1 Mol Erythro-y-hydroxy-L-0-lysin zusammengesetzt ist.

Das Tuberactinomycin-N hat die nachfolgenden
biologischen Eigenschaften:

(1) Akute Toxizität von Tuberactinomycin-N-sulfat:
LD₅O = 385 mg/kg (ddy Stamm Mäuse, i.v.)
LD₅O = 1240 mg/kg (ddy Stamm Mäuse, im).

(2) Antimikrobielles Spektrum, ermittelt durch die
Verdünnungsmethode auf Agar-Streifen

Minimum-Konzentration für die Inhibierung (mcg/ml)

Vergleichs- Tuberactisubstanz nomycin-N

Organismus	Minimale Hemmkonzen tration	100
	(mcg/ml)	50
Pseudomonas aeruginosa	>	100
Escherichia coli NIHJ		100
Escherichia coli B		25
Proteus vulgaris OX 19	>	100
Salmonella paratyphi A		25
Salmonella paratyphi B		100
Shigella dysenteriae E-I		100
Shigella flexineri		12,5
Shigeiia sonnei E-33	>	100
Bacillus subtilis PCI 219		100
Staphylococcus aureus FDA 209 P	>	25
Staphylococcus albus	>	100
Staphylococcus citreus	>	100
Micrococcus flavus	>	100
Sarcina lutea		12,5
Sarcina lutea ATCC 1001		100
Mycobacterium ATCC 607		100
Vibrio comma (A)	>	100
Vibrio comma (B)	>	25
Staphylococcus aureus Yoshioka	>
Staphylococcus aureus Yonemoto

(3) Antituberkulose-Aktivität:
i) Verwendeter Stamm:

Mycobacterium tuberculosis H37RV,
ii) Medium:

Kirchners halbflüssiges Medium, pH 6$, iii) Beimpfungsmenge:10-³mg, iv) Beobachtung: nach dreiwöchiger Incubation

a) Konzentrationsminimum für die Inhibierung an sensitiven Stämmen: mcg/ml;

b) Konzentrationsminimum für die Inhibierung an resistenten Stimmen: In der nachfolgenden Tabelle veranschaulicht

Streptomycin-resisten- 64 2

ter Stamm

p-Aminosalicylsäure- 256 4

resistenter Stamm

Isonicotinsäurehydra- 256 4

zid-resistenter Stamm

Viomyoän-resister.ter 64 32

Stamm

Kanamyoin-resistenter 8 4

Stamm

Cyoloserin-resistenter 256 2

Stamm

(4) Experimentell ermittelter chemotherapeutischer Effekt bei Mäusen:

Es wurden drei Gruppen von je lOddY Stamm Mäusen, männlich, mit einem Gewicht von 20 g, die mit patho|enen Tuberculose-Bazillen, Mycobacterium tuberculosis H37RV, intravenös infiziert worden waren, mit Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid behandelt, und dabei wurden je Maus und Tag für die eine Gruppe 0,5 mg, für die andere Gruppe 1 mg/Maus und Tag und für die dritte Gruppe 2 mg nach dreitägiger Infektion subkutan verabreicht
Die Behandlung wurde drei Wochen lang kontinuierlich wiederholt Einer aus zehn Mäusen bestehenden weiteren Gruppe, die als Kontrollgruppe diente, wurde physiologische Salzlösung verabreicht Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle veranschaulicht:

Einige Tage nach Infektion mit dem Stamm H₃₇Rv:

Maus	Kontrolle	Gruppe	'20	Behandelte Mäuse	1,0	2,0
Nr.	Gruppe	U	21	(Dosierung: mg/Maus/	24	>42
	I		21	Tag)	25	>42
		22	0,5	>42	>42
1	20	23	21	>42	>42
2	21	28	22	>42	>42
3	21	29	25	>42	>42
4	21	30	29	>42	>42
5	22	>42	35	>42	>42
6	22	>42	>42	>42	>42
7	23	>42	>42	>42
8	25	>42
9	26	>42
10	29	>42

In den nachfolgenden Beispielen sind alle Prozentangaben Gewichtsprozente und alle Verhältniswerfe für Lösungsmittel-Gemische Volumen-Verhältnisse, sofern nichts anderes gesagt ist

Beispiel 1

Zwei Liter eines wäßrigen Mediums,- welches 3% Glukose, 2% Stärke, 3% Sojabohnenmehl und 1,5%

Natriumchlorid enthielt, wurden in gleichmäßige Teilmengen aufgeteilt und in zwanzig 500-MiIliliter-Erlenmeyer-Kolben gefüllt. Der pH-Wert wurde auf 6 eingestellt, es wurde 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert, danach mit Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus N 6-130 beimpft und danach in einer Drehschüttel-Einrichtung (Radius 2,5 cm, 330 UpM) bei 30⁰C 7 Tage lang bebrütet Es wurden 1,5 1 einer Kulturbrühe erhalten, die 2360 mcg/ml an Tuberactinomycin-N enthielt.

Die abfiltrierte Brühe wurde mit 2,5 ml/Min, durch eine Harzsäule (2,5 cm Durchmesser, 28 cm Länge), die aus 150 ml eines schwach sauren Ionenaustauscherharzes in der Natrium-Form bestand, hindurchgeleitet Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, mit 0,5 n-HCL bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,3 ml/Min, eluiert Die Eluate wurden in Portionen von 10 ml aufgefangen; Tuberactinomycin-N-Aktivität wurde bei den Fraktionen Nos. 45—63 durch Ultraviolett-Absorption und Bioversuch ermittelt.

Die so gewonnene aktive Fraktion, etwa 200 ml, wurde mit Natriumhydroxyd neutralisiert, im Vakuum zu etwa 15 ml konzentriert, und durch Ausfällung wurden anorganische Salze daraus abgetrennt Nach Entfärbung mit Aktivkohle wurden 150 ml Methanol zugegeben, man ließ das Gemisch bei 5° C über Nacht stehen und sammelte die Ausfällung durch Abfiltrieren. Die Ausfällung wurde mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, und es wurde rohes Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid gewonnen (Menge: 3,07 g. Reinheit 713%. Ausbeute: 62%).

Beispiel 2

Es wurde wie im Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde ein Medium verwendet, welches 3% Glukose, 2% Stärke, 13% Melasse, 1,5% Sojabohnenmehl und 13% Natriumchlorid enthielt und auf pH 6,0 eingestellt war. Es wurden 1,51 an Kulturbrühe erhalten, die 2150 mcg/ml an Tuberactinomycin-N enthielten. Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid fiel als Rohprodukt an (erhaltene Menge: 2^8 g. Reinheit: 703%, Ausbeute: 65%).

Beispiel 3

Es wurde wie im Beispie! 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle des dort angegebenen ein Medium eingesetzt, welches 2% Glukose, 3% Stärke, 1,4% Trockenhefe und 03% Natriumchlorid enthielt, und es wurde 11 an Kulturbrühe mit 1665 mcg/ml an Tuberactinomycin-N erhalten. Die Menge betrug 135 g an rohem Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid (Reinheit 72%, Ausbeute 67%).

Beispiel 4

In einen 500-mI-Sakaguchi-Kolben wurden 100 ml eines wäßrigen Mediums eingefüllt, welches 1% Stärke, 1% Melasse, 1% Pepton, 1% Fleischextrakt und 03% Natriumchlorid enthielt Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt, es wurde 30 Minuten lang bei 120° C sterilisiert, dann wurde mit Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus No. N 6-130 beimpft und anschließend unter Hin- und Herschütteln, 7 cm Weglänge, 130UpM bei 30°C während zwei Tagen bebrütet Die Fermentationsbrühe wurde in 201 sterilisiertem (bei 120⁰C, 30 Minuten lang) wäßrigem Medium, welches 1% Stärke, 1% Melasse, 1% Pepton, 1% Fleischextrakt, 03% Natriumchlorid und 5 ml eines handelsüblichen Antischaummittels enthielt und sich in einem 30-1-Fermentationsbehälter befand, als Beimpfungsmittel zugegeben. Es wurde 24 Stunden lang unter Belüftung mit 20 l/Min, und Rühren mit 200 UpM gezüchtet Nach 24stündiger Fermentation wurde die Brühe als Beimpfungsmittel zu 2001 eines sterilisierten wäßrigen Mediums mit 3% Stärke, 2% Glukose, 4,0% entfettetem Sojabohnenmehl, 13% Natriumchlorid und 100 ml Antischaummittel (pH 6,0 vor der Sterilisation), die sich in einem 250-1-Fermentationstank aus Edelstahl

ίο befanden, hinzugegeben. Es wurde 90 Stunden lang unter Belüftung mit 100 l/Min, und Rühren mit 300 UpM bei 30⁰C gezüchtet Dabei wurden 1901 an Kulturbrühe gewonnen, die 2400 mcg/ml an Tuberactinomycin-N enthielten.

Der pH-Wert der Kulturbrühe wurde mit Salzsäure auf 2,0 eingestellt Anschließend wurden 25 Volumprozent an Diatomeenerde beigegeben, und das Gemisch wurde bei vermindertem Druck filtriert Dabei fielen 1601 an filtrierter Brühe an. Nach dem Neutralisieren wurde das Filtrat durch eine Harzsäule aus 101 des wie im Beispiel 1 eingesetzten Ionenaustauscherharzes (Na-Form) mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 l/Stunde aufgegeben, und dabei wurde das Tuberactinomycin-N, das darin enthalten war, absorbiert Das Harz wurde mit Wasser gewaschen, dann mit 1 η-Salzsäure bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 l/Stunde eluiert Jeweils 131 wurden als Einzelfraktionen abgetrennt, und dabei wurde das Tuberactinomycin-N in den Fraktionen Nos. 10—17 gefunden. Die aktive Fraktion wurde nach Neutralisieren mit Natriumhydroxyd im Vakuum zu etwa 1300 ml konzentriert und es wurde das abgeschiedene Natriumchlorid entfernt Das so erhaltene Konzentrat wurde mit Aktivkohle entfärbt und es wurden unter Rühren 10,4 I Methanol hinzugegeben. Man ließ das Gemisch über Nacht bei 5° C stehen, wobei Tuberactinomycin-N ausfiel. Das Tuberactinomycin-N wurde mit Methanol gewaschen, über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet und es wurde rohes Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid gewonnen (Menge: 395 g, Reinheit 71,0%, Ausbeute: 72,8%).

Beispiel 5

Die Fermentation wurde wie im Beispie! 2 beschrieben durchgeführt, und es wurden 201 Kulturbrühe mit 2200 mcg/ml Tuberactinomycin-N darin erhalten.

Mit Schwefelsäure wurde der pH-Wert der Brühe auf 2,0 eingestellt dann wurde nach Zugabe einer geringen

so Menge an Filterhilfsmittel filtriert, und es fielen 1,76 an klarem Filtrat an. Dieses wurde auf pH 53 eingestellt es wurden 163 g Eriochromviolett hinzugegeben, dann wurde 13 Stunden lang dialysiert und anschließend die Ausfällung abfiltriert Das ausgefällte Farbstoffsalz von Tuberactinomycin-N wurde nach Waschen mit Wasser im Vakuum getrocknet Das so hergestellte Farbstoffsalz von Tuberactinomycin-N wurde in 350 ml eines Gemisches aus 80% Aceton und 20% Methanol suspendiert, dann wurde eine 50%ige Lösung von Triäthylaminsuifat in Methanol so lange hinzugegeben, bis sich keine Ausfällung von Tuberactinomycin-N-suI- fat mehr bildete. Nachdem das Gemisch 13 Stunden lang gerührt worden war, wurde die Ausfällung abfiltriert zur Entfernung des Farbstoffes mit Aceton und Methanol gewaschen, in einer kleinen Menge an Wasser gelöst, und das Tuberactinomycin-N-sulfat wurde durch Zugabe von Methanol ausgefällt (Menge: 3,09 g, Reinheit: 79%, Ausbeute: 63%).

Beispiel 6

an Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid, wis es gemäß Beispiel 1 erhalten worden war, wurden in 75 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule hindurchgeleitet, die aus 50 ml eines stark basischen Ionenaustauscherharzes bestand, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 ml/Std. Es wurden je 10 ml Einzelfraktionen ausgewaschen, und die Fraktionen No. 3—12 zeigten Tuberactinomydn-N-AktivitäL Diese Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, bis die Konzentration an Tuberactinomycin-N 200 mg/ml betrug. Diesem Konzentrat wurden 4 Volumina Methanol zugegeben, und die ausgefällte Substanz wurde abfiltriert Es wurde Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid erhalten (Menge 6,17 g, Reinheit: 80,2%, Ausbeute: 92%).

Beispiel 7

Es wurden 100 mg an gemäß Beispiel 1 gewonnenen Tuberactinomycin-N-Hydrochlorid in 5 ml einer Lö sung, bestehend aus n-Butanol zu Pyridin zu Essigsäure zu Wasser (15 :10:3 :12, V/V) gelöst, und die Lösung wurde an einer Säule (1 cm χ 130 cm) aus Cellulosepul ver in dem gleichen Lösungsmittelgemisch absorbiert Dann wurde das gleiche Lösungsmittelgemisch mi

ίο einer Durchflußgeschwindigkeit von lOml/Stundc durch die Säule hindurchgeleitet Das Eluat wurde ir Fraktionen von je 3 ml aufgefangen. Tuberactinorny cin-N wurde in den Fraktionen No. 39—46 gefunden Die aktive Fraktion wurde im Vakuum auf 1 m

is konzentriert Es wurden 5 ml Methanol hinzugegeben und es fielen 60 mg an Tuberactinomycin-N-Hydrochlo rid an.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

I. Tuberactinomycin-N der Formel

OH CH₂

OH CH₂