DE2153151A1

DE2153151A1 - Yeast-fermentable starch prepd by bacteria alpha-amylase - activity on raw materials for beer and spirits

Info

Publication number: DE2153151A1
Application number: DE2153151A
Authority: DE
Inventors: Ekkehard Dr Grampp; Bruno Dipl Chem Dr Sproessler; Helmut Dipl Chem Dr Uhlig
Original assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Current assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Priority date: 1971-10-26
Filing date: 1971-10-26
Publication date: 1973-05-03

Abstract

Yeast-fermentable starch products are prepd. by action of amylolytic enzymes on initial mixtures of beer and spirit mfr. by using, as amylolytic enzyme, opt. together with other amylases, an enzyme prepn. which has an amylase activity based entirely or mainly on a heat-labile bacteria alpha-amylase content and which (a) loses >75% of its activity at 70 degrees C also in the presence of Ca ions and starch within 30 min., (b) loses 10% of its activity at 40 degrees C in an aq. soln. of tetra- Na ethylenediamine tetra-acetate within 30 min., (c) forms >50 (>65)% fermentable sugar, calc. on initial starch, within the time that starch is degraded up to non-occurrent of I2-starch reaction and (d) has optimum activity against starch at 30 degrees C at pH 5.3-5.5. Pref. enzymes are prepd. from culture liquors of Bacillus subtilis.

Description

Verfahren zur Herstellung von hefevergärbaren Stärkeprodukten Die Erfindung betrifft die Herstellung von Stärkeprodukten, die mit Hefe vergärbar sind, aus Stärke oder stärkehaltigen Rohstoffen, unter Verwendung von Amylasen. Die Erfindung betrifft insbesondere die Herstellung von Bier und Spirituosen bzw.Process for the manufacture of yeast fermentable starch products Invention relates to the production of starch products that can be fermented with yeast, from starch or raw materials containing starch, using amylases. The invention relates in particular to the production of beer and spirits or

von deren zum Brennen geeigneten Vorprodukten unter Mitverwendung von Amylasen.of their preliminary products that are suitable for firing, with the use of them of amylases.

Die Bildung von Alkohol bei der Bier- und Spirituosenherstellung beruht auf dem Wachstum von Hefe. Es kann nur stattfinden, wenn der Hefe in ausreichender Menge fermentierbare Zucker als Nanrung zur Verfügung stehen. Bei der Weinherstellung ist dies durch den natürlichen Zuckergehalt der Trauben der Fall. Dagegen muß bei Verfahren, bei denen die ursprüngliche Nahrungsquelle der Hefe aus Stärke besteht, ein enzymatischer Prozeß vorgeschaltet werden, der die Stärke teilweise oder vollständig zu vergärbaren Zuckern abbaut. Hierzu verwendet man Amylasen.The formation of alcohol in beer and spirits production is based on the growth of yeast. It can only take place when the yeast is in sufficient quantity Amount of fermentable sugars are available as an indication. In winemaking this is the case due to the natural sugar content of the grapes. Against it must be Processes in which the yeast's original nutritional source is starch, an enzymatic process can be used upstream, which partially or completely absorbs the starch breaks down into fermentable sugars. Amylases are used for this.

Bei der Herstellung von Bier wird seit Alters her durch Keimung des Getreides bei der Vermälzung die Bildung von Alpha-Amylase angeregt. Da jedoch die Getreide je nach den unterschiedlichen Wachstums- und Lagerungsverhältnissen bei der Malzherstellung nicht immer die gleiche Menge an Amylasen bilden, ist auch der Grad der Verzuckerung von Jahr zu Jahr und von Provenienz zu Provenienz verschieden. Bei der herkömmliohen Arbeitsweise lassen sich solche Unterschiede durch eine sorgfältig gelenkte VerfahrensfUhrung ausgleichen, jedoch treten zunehmende Schwierigkeiten in dem Maße auf, wie die einzelnen Arbeitsgänge deF Bierherstellung kontinuierlich gestaltet werden. Xhnliche Verhältnisse gelten für die Spirituosenherstellung oder Brennerei. Zur Herstellung von Spiritus und Kornbranntweinen wird Kartoffel- oder Getreidestärke verkleistert und durch Zusatz von Malz zu vergärbaren Zuckern abgebaut. Da der Amylasegenalt des Malzes nicht sehr hoch ist, werden ernebliche Mengen an Malz gebraucht. Auch hier stehen der Automatisierung und Standardisierung der Verfanren die unterschiedlichen Malzeigenschaften entgegen.In the production of beer, the germination of the Grain stimulates the formation of alpha-amylase during malting. However, since the Cereals depending on the different growth and storage conditions malt production does not always form the same amount of amylases, this is also the case Degree of saccharification varies from year to year and from provenance to provenance. In the conventional way of working, such differences can be carefully identified Compensate for guided procedural conduct, but increasing difficulties arise to the extent that the individual operations deF beer production are continuous be designed. Similar conditions apply to the production of spirits or Distillery. For the production of alcohol and Wheat brandy will be Potato or corn starch gelatinizes and can be fermented by adding malt Sugars broken down. Since the amylase content of the malt is not very high, there will be discomforts Quantities of malt needed. Again, automation and standardization are available to counteract the different malt properties.

Man hat sich deshalb seit langem bemüht, den Abbau der Stärke zu vergärbaren Zuckern dadurch reproduzierbar und kontrollierbar zu machen, daß man die wechselnde Amylaseaktivität des Getreides oder Malzes durch Zusatz von technischen Amylasepräparaten von genau bekannter Aktivität auf stets gleiche Ausgangswerte erhöhte oder daß man auf Malz als "Enzympräparat" zugunsten definierter technischer Amylasen gänzlich verzichtete. Damit waren indessen nicht alle Schwierigkeiten überwunden. Der Abbau von Stärke mit technischen Enzymen verläuft je nach Enzymtyp in unterschiedlicher und nicht immer gewunschter Weise. So spaltet zwar Pilzamylase innerhalb der Zeit, die bis zum Verschwinden der Jod-Stärke-Reaktion vergeht, die Stärke zu 50 bis 40% in vergärbare Zucker, jedoch ist die Verzuckerungsgeschwindigkeit so niedrig, daß man entweder sehr große Mengen dieses verhältnismäßig teuren Enzyms braucht oder lange Einwirkungszeiten in Kauf nehmen muß. Bakterienamylase ist billiger und baut Stärke schneller ab, jedoch bildet sie unter den gleichen Bedingungen nur etwa 15 vergärbare Zucker.For a long time, efforts have therefore been made to ferment the starch degradation To make sugaring reproducible and controllable that one changes Amylase activity of the grain or malt through the addition of technical amylase preparations increased from exactly known activity to always the same starting values or that one on malt as an "enzyme preparation" in favor of defined technical amylases entirely renounced. However, not all difficulties were overcome. The mining of starch with technical enzymes proceeds in different ways depending on the type of enzyme and not always in the desired way. So although fungal amylase splits within time, which passes until the iodine-starch reaction disappears, the strength to 50 to 40% in fermentable sugars, but the saccharification rate is so slow that you either need very large amounts of this relatively expensive enzyme or long exposure times must be accepted. Bacterial amylase is cheaper and builds up Strength decreases faster, but under the same conditions it only produces about 15 fermentable sugars.

Der verbleibende Teil der Stärkehydrolysate besteht aus niederen Dextrinen, die nicht vergärbar sind Bei der Bierherstellung läßt sich durch Mitverwendung handelsüblicher Bakterienamylasen eine definierte und stets gleichbleibende Ausgangsaktivität für die Verzuckerung der Stärke aus Malz auch bei verwendung von Rohfrucht einstellen. Man erreicnt rasch eine Verflüssigung der Stärke, aber die Verzuckerung dauert unverhältnismäßig lange und es fehlt ein ausgewogenes Vernältnis zwischen Dextrinen und Zuckern, das für die Bierqualität von wesentlicher Bedeutung ist.The remaining part of the starch hydrolysates consists of lower dextrins, which cannot be fermented Bacterial amylases have a defined and always constant initial activity for Stop the saccharification of the starch from malt even when using raw fruit. A liquefaction of the starch is quickly achieved, but the saccharification take disproportionately long and there is a lack of balance between dextrins and sugars, which are essential for beer quality.

Ein weiterer Abbau der Dextrine ist nur mit der Beta-Amylase des Malzes möglich. Da sie nicht nur die aus dem Malz gebildeteten Dextrine abbauen muß, sondern auch die, die aus dem Rohfruchtanteil hervorgehen, sind nicht nur lange, sondern auch in Abhängigkeit vom Beta-Amylasegehalt des Malzes wechselnde Einwirkungszeiten notwendig. Die angestrebte Standardisierung und Rationalisierung des Verzuckerungsprozesses ist daher auf diesem Wege nicht möglich.Another breakdown of the dextrins is only with the beta-amylase of the malt possible. Because it not only has to break down the dextrins formed from the malt, but also even those that result from the raw fruit portion are not only long, but also depending on the beta-amylase content of the malt, varying exposure times necessary. The desired standardization and rationalization of the saccharification process is therefore not possible in this way.

Auch hier bringen Pilzamylasen, die in einem höheren Grad verzuckernd wirken, wegen ihrer Langsamkeit keine Vorteile.Also here bring fungal amylases, which are saccharifying to a higher degree have no benefits because of their slowness.

In der Brennerei hat man scnon im Anschluß an die durch Bakterienamylasen bewirkte Verflüssigung der Getreidestärke eine weitgenende Verzuckerung der in der ersten Stufe gebildeten Dextrine durch Zusatz von Glukamylasen erreicnt. Bei diesem zweistufigen Verfahren ist mit einer Einwirkungszeit von insgesamt mindestens 72 Stunden zu rechnen.In the distillery one has this in connection with the bacterial amylases liquefaction of the corn starch caused a large degree of saccharification of the dextrins formed in the first stage by the addition of glucamylases. With this one two-stage procedure is with a total exposure time of at least 72 Hours to count.

Die Erfindung berunt auf der Erkenntnis, daß handelsübliche Bakterienamylase, beispielsweise aus Bacillus-subtilis-Kulturen, wenigstens zwei verschiedene Alpha-Amylasen enthalten kann, wovon die eine bis über die Verkleisterungstemperatur der Stärke stabil ist, während die andere, in der Regel in geringer Menge vorliegende Alpha-Amylase bereits unterhalb dieser Temperatur inaktiviert wird. Unter Bezug auf das Verhalten bei hoher Temperatur wird die erstere nacnfolgend als "hitzestabile Alpha-Amylase" und die letztere als "hitzelabile Alptza-Amylase bezeichnet. Die nitzestabile Amylase liegt in den handelsüblichen Präparaten in überwiegender Menge vor und prägt deren Eigenschaften. Eine sorgfältige Trennung beider Komponenten weist sie als zwei völlig verseniedene Enzyme aus. Dies wird durcn die in Tabelle I angegebene Charakterisierung deutlich. Tabelle I hitzestabile Bakte- hitzelabile Bak- rien-Alpha-Amylase terien-Alpha-Amylase Isoelektrischer Punkt pH 5,6 pH 6,o Wirkungsoptimum pH 5,9, 70-80°C pH 5,3; 50-60°C Molare Extinktions- koeffizienten bei 280 nm 25,o 19,8 bei 260 nm 15,4 10,2 Haupthydrolyseprodukte 0% Glucose 5 % Glucose nach Abbau von 5% Maltose 20 ffi Maltose Amylose bis zur 10% Maltotriose 40 % Maltotriose Jodentfärbung (Gew.-%) 15% vergärbare 65 % vergärbare Zucker Zucker 85% Oligosaccharide 35 % Oligosaccharide und Dextrine und Dextrine Hitzebehandlung Restaktivität vollständige 30 min, 70 C 75 bis 90% Inaktivierung Stßbilisierung durch Ca -Ionen ja nein Hemmung durch EDTA ja nein In ihrer Fähigkeit, Stärke und Dextrine bzw. Oligosaccharide bis herab zu Maltopentaose und Maltotetraose in hoher Ausbeute zu vergärbarem Zucker zu spalten, ist die hitzelabile Bakterien-Alpha-Amylase der oben schon beschriebenen Pilz-alpha-Amylase sehr ähnlich. Mit dieser hat sie auch die Instabilität bei höheren Temperaturen gemeinsam. Überraschenderweise übertrifft sie jedoch die Pilzamylase in der Spaltungsgescnwindigkeit erheblich. Die Geschwindigkeiten der Bildung vergärbarer Zucker aus verkleisterter Kartoffelstärke werden für Pilz-alpha-Amylase und hitzelabile Bakterien-alpna-Amylase in Tabelle II einander gegenübergestellt.The invention is based on the knowledge that commercial bacterial amylase, for example from Bacillus subtilis cultures, can contain at least two different alpha amylases, one of which is stable above the gelatinization temperature of the starch, while the other, usually in small amounts Alpha-amylase present is already inactivated below this temperature. With reference to the behavior at high temperature, the former is hereinafter referred to as "heat-stable alpha-amylase" and the latter as "heat-stable alptza-amylase. The heat-stable amylase is predominantly present in the commercial preparations and determines their properties. Careful separation It identifies both components as two completely different enzymes, as is clear from the characterization given in Table I. Table I heat-stable bacteria heat-labile bacteria rien-alpha-amylase terien-alpha-amylase Isoelectric point pH 5.6 pH 6, o Optimum effect pH 5.9, 70-80 ° C pH 5.3; 50-60 ° C Molar extinction coefficients at 280 nm 25.0 19.8 at 260 nm 15.4 10.2 Main hydrolysis products 0% glucose 5% glucose after degradation of 5% maltose 20 ffi maltose Amylose up to 10% maltotriose 40% maltotriose Iodine decolouration (wt .-%) 15% fermentable 65% fermentable Sugar sugar 85% oligosaccharides 35% oligosaccharides and dextrins and dextrins Heat treatment residual activity complete 30 min, 70 C 75 to 90% inactivation Shock bilization through Ca ions yes no Inhibition by EDTA yes no In its ability to break down starch and dextrins or oligosaccharides down to maltopentaose and maltotetraose in high yield to fermentable sugar, the heat-labile bacterial alpha-amylase is very similar to the fungal alpha-amylase already described above. It also has in common with this the instability at higher temperatures. Surprisingly, however, it exceeds the fungal amylase considerably in terms of the rate of cleavage. The rates of formation of fermentable sugars from gelatinized potato starch are compared for fungal alpha-amylase and heat-labile bacterial alpna amylase in Table II.

Tabelle II Abbau von 1 kg verkleisterter Kartoffelstärke mittels Pilz-alpha-Amylase ()2 ooo SKB-Einheiten) und hitzelabiler Bakterien-alpha-Amylase (io ooo SKB-Einheiten) während so bzw. 60 min bei So°C zu vergärbaren Zuckern (in Gew.- auf eingesetzte Stärke).Table II Degradation of 1 kg of gelatinized potato starch by means of fungal alpha-amylase () 2,000 SKB units) and heat-labile bacteria alpha-amylase (10,000 SKB units) to fermentable sugars (in weight-based on Strength).

Vergärbare Zucker Pilz--Amylase hitzelabile Bakterien-52 ooo SKB-E Amylase lo ooo SKB-E 5o min 60 min So min 60 min Glucose 0% o 7 8% Maltose 2% 8% 20% Maltotriose 12% 5c% 55% 42% Summe vergär- 14% D8 58 80 barer Zucker Uberraschenderweise ist die Verzuckerungsgescnwindigkeit der Bakterienamylase bedeutend höher als die der Pilzamylase, obwohl die letztere bei den obigen Versuchen die höhere Aktivität hatte. Gleiche Amylaseaktivität zweier Präparate bedeutet definitionsgemäß, daß gleiche Mengen davon hochmolekulare Stärke mit gleicher Geschwindigkeit abbauen, was am Verschwinden der bekannten Jod-Stärke-Reaktion quantitativ verfolgt werden kann. Beide hier untersuchten Enzyme sind Endo-Amylasen, d.h. sie spalten Stärkemoleküle an beliebigen Stellen innerhalb der Kette. Man.Fermentable sugar fungus - Amylase heat-labile bacteria-52 ooo SKB-E Amylase lo ooo SKB-E 50 min 60 min So min 60 min Glucose 0% o 7 8% Maltose 2% 8% 20% maltotriose 12% 5c% 55% 42% total fermenting 14% D8 58 80 bar sugar Surprisingly the saccharification rate of bacterial amylase is significantly higher than that the fungal amylase, although the latter has the higher activity in the above experiments would have. The same amylase activity of two preparations means by definition that equal amounts of it break down high molecular starch at the same rate, what can be quantified in the disappearance of the well-known iodine-starch reaction can. Both of the enzymes examined here are endo-amylases, i.e. they break down starch molecules at any point within the chain. Man.

muß daher auch erwarten, daß beide Präparate die Stärke durch fortgesetzte Weiterspaltung der Bruchstücke in der gleichen Zeit mit der gleichen Ausbeute bis zu vergärbaren Zuckern abbauen. Daß dies nicht der Fall ist, sondern daß die hitzelabile Bakterien-alpha-Amylase die beim Stärke abbau entstehenden Bruchstücke offensichtlich schneller abbaut als die Pilzamylase, war nicht vorherzusehen und ist mit den gültigen Vorstellungen über den Mechanismus des Stärkeabbaues nicht zu erklären. Es muß eine erhonte Aktivität des Enzyms gegenüber kürzeren Bruchstücken von Stärkemolekülen oder ein ganz anderer Spaltungsmechanismus angenommen werden. Aufgrund dieser überwaschenden Eigenschaften ist die hitzelabile Bakterien-alpea-Amylase für die Umwandlung stärkehaltiger Rohstoffe in hefevergärbare Produkte hervorragend geeignet.must therefore also expect that both preparations will increase their strength through continued Further cleavage of the fragments in the same time with the same yield up to break down into fermentable sugars. That this is not the case, but that the heat-labile one Bacteria-alpha-amylase obviously shows the fragments that arise during starch breakdown degrades faster than the fungal amylase, could not be foreseen and is with the valid imaginations cannot be explained about the mechanism of starch degradation. There must be an increased activity of the enzyme towards shorter fragments of starch molecules or a completely different mechanism of splitting can be adopted. Because of this overwhelming Properties is the heat-labile bacterial alpea amylase for the conversion of starchy Raw materials in yeast fermentable products are excellently suited.

Da die hitzelabile Bakterien-alpha-Amylase in allen untersuchten Fällen nicht allein, sondern zusammen mit hitzestabiler Amylase gebildet wird, setzt die Reindarstellung des erstgenannten Enzyms eine sorgfältige Trennung des ursprünglichen Enzymgemisches voraus. Der mit der Reindarstellung des Enzyms verbundene Aufwand ist für die Herstellung eines technischen Enzyms zu groß. Für die Anwendung in den oben beschriebenen Verfahren der Brauerei und Brennerei ist es jedoch nicht erforderlich, die Einwirkung der hitzestabilen Amylase völlig auszuscnalten. Enzymgemische, die zum größten Teil aus der hitzelabilen Alpha-Amylase und nur zu einem kleinen Teil aus der hitzestabilen Alpha-Amylase bestehen, sind für die diskutierten Verfahren vor allem deshalb gut verwendbar, weil die durch die hitzestabile Alpha-Amylase gebildeten Oligosaccharide durch die hitzelabile Alpha-Amylase vollends zu vergärbaren Zuckern gespalten werden.As the heat-labile bacteria alpha-amylase in all cases examined is not formed alone, but together with heat-stable amylase, continues the Pure preparation of the former enzyme requires careful separation of the original Enzyme mixture ahead. The effort associated with the pure preparation of the enzyme is too large for the production of an industrial enzyme. For use in the The brewery and distillery processes described above, however, do not require to completely switch off the action of the heat-stable amylase. Enzyme mixtures that for the most part from the heat-labile alpha-amylase and only to a small extent consist of the heat-stable alpha-amylase are for the processes discussed especially useful because the heat-stable alpha-amylase The oligosaccharides formed can be completely fermented by the heat-labile alpha-amylase Sugars are split.

Gegenstand der Erfindung ist daner ein Verfahren zur Herstellung von hefevergärbaren Stärkeprodukten durch Einwirkung von amylolytischen Enzymen auf die Ausgangsgemische der Bier- und Spirituosenherstellung, wobei man als amylolytisches Enzym - gegebenenfalls neben anderen Amylasen - ein Enzympräparat einsetzt, dessen Amylaseaktivität ganz oder im wesentlichen auf einem Gehalt an hitzelabiler Bakterien-alpha-Amylase beruht und das a) bei 70 C auch in Gegenwart von Calciumionen und Stärke innerhalb von o min wenigstens 75k seiner Aktivität verliert, b) bei 40°C in einer wäßrigen Lösung des Tetranatriumsalzes der Äthylendiamin-tetraessigsäure innerhalb von vo min nicht mehr als lot seiner Aktivität verliert, c) innerhalb der Zeit, in der Stärke bis zum Ausbleiben der Jod-Stärkereaktion abgebaut wird, mehr als 5o%, vorzugsweise mehr als 65, bezogen auf eingesetzte Stärke, vergärbare Zucker bildet und d) bei 5o0C sein Aktivitätsoptimum gegenüber Stärke bei pH 5,5 bis 5,5 hat.The invention also relates to a process for the production of yeast fermentable starch products through the action of amylolytic enzymes the starting mixtures of beer and spirits production, where one is called amylolytic Enzyme - possibly in addition to other amylases - uses an enzyme preparation whose Amylase activity entirely or essentially due to a content of heat-labile bacteria alpha-amylase is based and that a) at 70 C also in the presence of calcium ions and Starch loses at least 75k of its activity within o min, b) at 40 ° C in an aqueous solution of the tetrasodium salt of ethylenediamine-tetraacetic acid does not lose more than a lot of its activity within vo min, c) within the time in which starch is broken down until the iodine-starch reaction does not occur, more than 50%, preferably more than 65, based on the starch used, fermentable Sugar forms and d) at 5o0C its activity optimum compared to starch at pH 5.5 to 5.5 has.

Diese Kennzeichnung scnließt außer der reinen hitzelabilen Alpha-Amylase auch deren Gemische mit bis zu etwa 25% des Enzymgewichtes an hitzestabiler Alpha-Amylase ein. Tabelle III zeigt den für die erfindungsgemäß verwendeten tecnniscnen Amylasepräparate charakteristiscnen Aktivitätsverlust bei 70 0C innerhalb vo min in Gegenwart von Calciumionen im Vergleich zu bekannten Alpha-Amylase -Präparaten.This label includes the pure heat-labile alpha-amylase also their mixtures with up to about 25% of the enzyme weight of heat-stable alpha-amylase a. Table III shows that for the technical amylase preparations used according to the invention characteristic loss of activity at 70 ° C. within minutes in the presence of Calcium ions compared to known alpha-amylase preparations.

Tabelle III Akkivitätsverlust nac+5o min 70°C, in Gegw. von Ca -Ionen stark gereinigtes hitzelabiles Bakt.-alpha-Amylase-Präparat 93,5 ein erfindungsgemäß noch verwendbares Enzymgemiscn 77 reine hitzestabile Bakterien- 0% alpha-Amylase übliches Handelsprodukt 1 15% " II II 8% 11 " III 22 Zur Herstellung von Enzympräparaten, die für das Verfahren der Erfindung geeignet sind, geht man zweckmäßig von sachen Bakterienkulturen aus, die einen hohen Anteil an hitzelabiler Alpha-Amylase erzeugen. Ein solches Bacterium ist z.B. Bacillus subtilis var. amylosacchariticus. Das Kulturfiltrat dieses Bakteriums wird mit 30% der zur Sättigung erforderlichen Menge Ammoniumsulfat versetzt. Der daraufhin ausfallende Niederschlag wird abfiltriert oder -zentrifugiert und verworfen. Das Filtrat wird weiterhin mit Ammoniumsulfat versetzt, bis 70% der Sättigungskonzentration erreicht sind. Nun fällt ein weitgehend aus hitzelabiler Amylase bestenender Niederschlag aus.Table III Loss of activity after + 50 min 70 ° C, in cont. of Ca ions highly purified heat-labile bacterial alpha-amylase preparation 93.5 according to the invention Enzyme mixture that can still be used 77 pure heat-stable bacteria - 0% alpha-amylase Common commercial product 1 15% "II II 8% 11" III 22 For the production of enzyme preparations, which are suitable for the method of the invention, one expediently goes out of things Bacteria cultures that produce a high proportion of heat-labile alpha-amylase. Such a bacterium is e.g. Bacillus subtilis var. Amylosacchariticus. The culture filtrate this bacterium is supplied with 30% of the amount of ammonium sulfate required for saturation offset. The precipitate which then separates out is filtered off or centrifuged and discarded. The filtrate is still mixed with ammonium sulfate, up to 70% of the Saturation concentration are reached. Now one largely falls out of heat-unstable Amylase besting precipitate.

Er wird getrocknet und in üblicher Weise nach Wiederauflösen in Wasser an einer Austauschersäule durch Gelfiltration entsalzt. Aus dem Filtrat kann durch Gefriertrocknen ein für den technischen Gebrauch geeignetes Enzympräparat gewonnen werden.It is dried and in the usual way after redissolving in water desalted on an exchange column by gel filtration. From the filtrate can through An enzyme preparation suitable for industrial use is obtained by freeze-drying will.

Die Alpha-Amylaseaktivität typischer Produkte liegt bei looo SKB-Einheiten je Gramm Enzym. Unter den Ausgangsgemischen der Bier-und Spirituosenherstellung werden die in diesen Gewerben üblichen Gemische verstanden, auf die man die Hefe einwirken läßt, also im Falle der Brauerei und Brennerei die nach Verkleisterung und Verzuckerung der Getreide- oder Kartoffelstärke entstehende Würze bzw. Maische. Die Rohstoffe für diese Ausgangsgemische sind vorwiegend Mehle und Schrote, die aus Getreiden, wie Gerste, Weizen, Rogen, Mais oder Reis gewonnen werden.The alpha-amylase activity of typical products is 1000 SKB units per gram of enzyme. Among the starting mixtures of beer and spirits production are understood to mean the mixtures customary in these trades to which the yeast is applied can act, so in the case of the brewery and distillery after gelatinization and Saccharification of the cereal or potato starch resulting in the wort or mash. The raw materials for these starting mixtures are predominantly flours and meals, which obtained from grains such as barley, wheat, roe, maize or rice.

Für die Brennerei spielt neben den Getreideerzeugnissen die Kartoffelstärke eine wichtige Rolle. Ebenso kann Stärke beliebiger anderer Herkunft eingesetzt werden.In addition to grain products, potato starch plays a role in the distillery an important role. Starch of any other origin can also be used.

Allen Verfahren ist gemeinsam, daß man die Enzymprodukte vorzugsweise bei einem pH-Wert zwiscnen Ó und 7 und bei 50 bis 650C auf die Stärke bzw. stärkehaltigen Produkte einwirken läßt. Gegenüber den herkömmlichen, mit handelsüblichen Amylasen oder Malz durchgeführten Verfahren zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren vor allem im Bereich der Brauerei und Brennerei durch seine Kürze aus. Die Hefe kann nach Aufschluß der Stärke unter den bekannten, für die verschiedenen Gewerbe typischen Bedingungen angewandt werden.All processes have in common that the enzyme products are preferred at a pH between Ó and 7 and at 50 to 650C on the starch or starchy Allow products to act. Compared to the conventional, with commercially available amylases The method according to the invention is characterized by the method carried out or malt especially in the area of breweries and distilleries due to its brevity. Yeast can after digestion of the starch among the well-known, for the various trades typical conditions are used.

FUr die Brauerei und Brennerei besteht ein besonders vorteilhaftes Verfahren darin, die Stärke zunächst mit hitzestabiler Bakterien-alpha-Amylase zu verflüssigen und die Stärkeabbauprodukte in einem zweiten Verfanrensschritt mit einem hitzelabilen Alpha-Amylasepräparat zu verzuckern. Wenn dieses Vorgehen auch den Nachteil hat, daß man zweimal Enzyme zusetzen muß, so bietet es doch den Vorteil, daß sich die hohe Spaltungsgeschwindigkeit der hitze stabilen Amylase bei erhöhten Temperaturen ausnutzen läßt.There is a particularly advantageous one for the brewery and distillery The process consists in first adding heat-stable bacterial alpha-amylase to the starch liquefy and the starch degradation products in a second process step to saccharify a heat-labile alpha-amylase preparation. If this procedure too has the disadvantage that you have to add enzymes twice, it has the advantage that the high rate of cleavage of the heat-stable amylase increased at Temperatures can be exploited.

Man erhält eine Würze für die Bierherstellung z.B. so, daß' man gleiche Teile Malz und unvermälzte Gerste verschrotet, mit Wasser autsonlämmt, mit hitzestabiler Amylase - z.B.A wort for beer production is obtained, for example, in such a way that 'one makes the same Parts of malt and unmalted barley are scrapped, washed with water, with heat-stable Amylase - e.g.

aus Bacillus subtilis-Kulturen - versetzt und durch allmähliches Erhitzen auf 750C verflüssigt. Dann wird auf 60°C abgekühlt und hitzelabile Amylase zugegeben. Wenn die Verzuckerung bis zu einem ausgewogenen Verhältnis von Dextrinen zu vergärbaren Zuckern fortgeschritten ist, wird durch Filtration geläutert, nach Zusatz von Hopfen gekocht und wiederum filtriert. Daran schließt sich die 0 übliche Gärung mit Hefe bei 0 bis 5 C. In ähnlicher Weise verfährt man bei der Maischenherstellung für die Kornbrennerei und Spiritusherstellung. Stärke aus Getreide oder Kartoffeln wird unter Druck bei 1500 v-rkleistert und bei 70°C mit hitzestabiler Amylase verflüssigt. Dann wird auf 55 bis 60°C gekühlt und mit hitzelabiler Amylase verzuckert.from Bacillus subtilis cultures - offset and through gradual Heat Liquefied at 750C. It is then cooled to 60 ° C. and heat-labile amylase is added. When the saccharification up to a balance of dextrins to fermentable Sugaring is advanced, it is refined by filtration, after adding hops boiled and again filtered. This is followed by the usual fermentation with yeast at 0 to 5 C. A similar procedure is followed in the production of the mash for the Grain distillery and alcohol production. Starch is made from cereals or potatoes pasted under pressure at 1500 and liquefied at 70 ° C with heat-stable amylase. Then it is cooled to 55 to 60 ° C and saccharified with heat-labile amylase.

Der letzte Verfahrensschritt kann in den Gärbottich verlegt werden und gleichzeitig mit der Gärung bei Temperaturen von 22 bis 30°C stattfinden. Die Verzuckerung nimmt bei diesem Verfahren weniger als 60 Stunden in Anspruch. Auch wenn man auf die verkleisterte Stärke unmittelbar die hitzelabile Amylase einwirken läßt, ergibt sich eine beträchtliche Zeiteinsparung gegenüber den bekannten Verfahren.The last step in the process can be moved to the fermentation vat and take place simultaneously with fermentation at temperatures of 22 to 30 ° C. the In this process, saccharification takes less than 60 hours. Even when the heat-labile amylase acts directly on the gelatinized starch can, there is a considerable time saving compared to the known method.

Beispiele Herstellung einer hitzelabilen Bakterien-alpha-Amylase Aus einer Vielzahl von amylasebildenden Bakterienstämme werden solche, die hitzelabile Alpha-Amylase bilden, auf folgende Weise selektiert: Eine wäßrige Nährlösung aus 1 bis 5 Gew.-% löslicher Stärke 1 bis 5 Gew.-% Sojabohnenmehl o,o6 Gew.- Magnesiumsulfat o,5 bis 1,5 tX Diammoniumhydrogenphosphat 0,5 " Calciumcarbonat wird mit der zu prüfenden Bakterienkultur in einem Schrägagarröhrchen beimpft und 24 bis 48 Stunden bei so bis 40°C geschüttelt. Ein Teil der Kulturflüssigkeit wird 5o min auf 70 0C erhitzt. Proben der erhitzten und nicht erhitzten Kulturflüssigkeit werden in ausgestanzte Löcher einer Stärke-Agar-Platte gegeben und 20 Stunden bei do°C inkubiert.Examples Preparation of a heat-labile bacterial alpha-amylase From of a large number of amylase-producing bacterial strains are those that are heat-labile Alpha-amylase form, selected in the following way: An aqueous nutrient solution from 1 to 5% by weight of soluble starch, 1 to 5% by weight of soybean meal, 0.06% by weight magnesium sulfate 0.5 to 1.5 tX diammonium hydrogen phosphate 0.5 "calcium carbonate is used with the to test bacterial culture in an agar slant and inoculated for 24 to 48 hours shaken at so up to 40 ° C. Part of the culture fluid is at 70 ° C. for 50 minutes heated. Samples of the heated and unheated culture fluid are punched into Holes of a starch agar plate are placed and incubated at do ° C for 20 hours.

Beim Übergießen der Platte mit Lugol'scher Lösung färbt sich die unveränderte Stärke schwarz. Die Stärkespaltung durch Amylase ist durch klare, ungefärbte konzentrische Höfe um die beimpften Löcher erkennbar. Das Vorliegen der hitzelabilen Bakterien-alpha-amylase ist daran zu erkennen, daß die mit nicht erhitzter Kulturflüssigkeit beimpften Löcher Hydrolysehöfe haben, wahrend die mit erhitzter Kulturflüssigkeit beimpften Löcher keine Höfe haben.When Lugol's solution is poured over the plate, the unchanged color changes Strength black. The breakdown of starch by amylase is through clear, uncolored concentric Courtyards around the inoculated holes recognizable. The presence of the heat-labile bacteria alpha-amylase can be recognized by the fact that the holes inoculated with unheated culture fluid Have hydrolysis yards, while the holes inoculated with heated culture liquid have no yards.

Eine Bakterienkultur, die nacn der oben beschriebenen Prüfmethode praktisch nur hitzelabile Amylase erzeugt, wird in einem Laborfermenter in 10 Litern einer Nährflüssigkeit aus 5 % löslicher Stärke 2 ffi Sojabohnenmehl 1,)% Diammoniumhydrogenphosphat o,6 ß Magnesiumsulfat 1,o ß Calciumcarbonat kultiviert, indem man loo bis 500 ml Impfgut zusetzt und 42 bis 48 Stunden bei 30 bis 40°C rührt. Während dieser Zeit wird mit o,5 bis 1,o 1 Luft pro min und Liter Nährlösung belüftet. Dann wird zentrifugiert und in dem klaren Überstand die Amylaseaktivität nach Sandstedt, Kneen und Blish (Cereal Chemistry, 16, S. 712; 19)9) bestimmt. Man findet 10 bis 50 SKB-Einheiten pro Milliliter. Durch Zusatz von 70 bis 90% der zur Sättigung erforderlichen Menge an Ammoniumsulfat wird die Amylase ausgefällt. Sie wird abfiltriert> etrocknet und fein pulverisiert und hat eine Amylaseaktivität von 500 bis 1500 SKB-Einheiten je Gramm.A bacterial culture obtained according to the test method described above practically only produces heat-labile amylase, is in a laboratory fermenter in 10 liters of a nutrient liquid made from 5% soluble starch 2 ffi soybean meal 1,)% diammonium hydrogen phosphate, 6 ß magnesium sulfate 1, ß calcium carbonate cultivated, by adding 100 to 500 ml of inoculum and stirring at 30 to 40 ° C. for 42 to 48 hours. During this time, 0.5 to 1.0 1 air per minute and liter of nutrient solution is aerated. Then it is centrifuged and in the clear supernatant the amylase activity according to Sandstedt, Kneen and Blish (Cereal Chemistry, 16, p. 712; 19) 9). One finds 10 to 50 SKB units per milliliter. By adding 70 to 90% of what is needed to saturate Amylase is precipitated by the amount of ammonium sulfate. It is filtered off> dried and finely powdered and has an amylase activity of 500 to 1500 SKB units per gram.

Sofern nicht anders angegeben, wird in den nachfolgenden Anwendungsbeispielen die so erhaltene hitzelabile Bakterienalpha-Amylase verwendet.Unless otherwise stated, in the following application examples the heat-labile bacterial alpha-amylase thus obtained is used.

Alkoholgewinnung aus Weizen loo kg Weizenmehl werden mit 270 1 Wasser 4o min bei 180°C und 5 at gedämpft. Dabei wird die Stärke verkleistert. Die Dextrinierung und Verzuckerung kann nach den folgenden Arbeitsweisen durchgeführt werden: a) Die erhaitenc Maische wird auf 55 bis 580C gekühlt und mit 250 g hitzelabiler Bakterien-alpha-Amylase (1000 SKB-Einheiten/g) versetzt.Alcohol production from wheat 100 kg of wheat flour are mixed with 270 liters of water Steamed for 4o min at 180 ° C and 5 atm. The starch is gelatinized in the process. The dextrination and saccharification can be carried out according to the following procedures: a) The The mash obtained is cooled to 55 to 580C and treated with 250 g of heat-labile bacteria alpha-amylase (1000 SKB units / g) offset.

b) Die Maische wird auf 70°C gekühlt; es werden 20 g handelsübliche hitzestabile Bakterienamylase (6000 SKB-Einheiten/g) zugesetzt. Nach allmählicher Abkühlung auf 55 - 580C werden 150 g hitzelabile Bakterien-alpha-Amylase zugesetzt.b) The mash is cooled to 70 ° C; it will be 20 g commercially available heat-stable bacterial amylase (6000 SKB units / g) added. After gradually After cooling to 55-580C, 150 g of heat-labile bacterial alpha-amylase are added.

Wenn die Temperatur der Ansätze auf 27°C gefallen ist, wird auf ph 5,6 eingestellt und die Gärung durch Zugabe von Hefe in Gang gesetzt. Die Stärkeverzuckerung läuft gleichzeitig weiter. Nach Abschluß der Gärung wird in bekannter Weise destilliert. Die Alkoholausbeute, jeweils auf loo kg Weizen bezogen, beträgt bei Verfahren a) 39,5 1 (Gesamtdauer 59 Stunden) 1t b) 40,1 1 (Gesamtdauer 55 Stunden) Bierherstellung a) "Dekoktionsverfahrenn oder t'Zwei-Maisch-Verfahrent' Bei 52 0 werden 55 Gew.-Teile Gerste, 20 Gew.-Teile Reis, o,o6 Gew.-Teile handelsübliche hitzestabile Bakterienalpha-Amylase (looo SKB-Einheiten/g) eingemaischt, d.h.When the temperature of the approaches has fallen to 27 ° C, it is set to ph 5.6 and fermentation started by adding yeast. The starch saccharification continues to run at the same time. After fermentation is complete, it is distilled in a known manner. The alcohol yield, based in each case on 100 kg of wheat, is for method a) 39.5 1 (total duration 59 hours) 1t b) 40.1 1 (total duration 55 hours) beer production a) "Dekoktionsverfahrenn or t'Zwei-Mash-Verfahrent 'At 52 0 55 parts by weight Barley, 20 parts by weight of rice, 0.06 parts by weight of commercially available, heat-stable bacterial alpha-amylase (looo SKB units / g) mashed, i.e.

mit Wasser verrührt. Von dieser Maische wird ein Drittel abgenommen. 15 min auf 850C und 15 min zum Sieden erhitzt und wieder mit der übrigen Maische vereinigt. Dann werden 25 Gew.-Teile Pilsener Malz und o,o6 Gew.-Teile hitzelabile' Bakterien-Alpha-Amylase (looo SKB-Einheiten/g) zugesetzt.stirred with water. A third of this mash is removed. Heated to the boil for 15 min at 850C and 15 min and again with the rest of the mash united. Then 25 parts by weight of Pilsener malt and o, o6 parts by weight of heat-labile ' Bacterial alpha amylase (looo SKB units / g) added.

Die Temperatur beträgt jetzt 650C. Nach 40 bis 5o min ist die Verzuckerung abgeschlossen. Wiederum wird ein Drittel der Maische abgenommen, jeweils 15 min auf 85°C und zum Sieden erhitzt und wieder mit der Hauptmenge vereinigt, wodurch die Temperatur auf 75°C steigt.The temperature is now 650C. The saccharification takes place after 40 to 50 minutes closed. Again, a third of the mash is removed, 15 min each time to 85 ° C and to Heated to the boil and reunited with the main quantity, whereby the temperature rises to 75 ° C.

Aus je loo 1 des erhaltenen sogenannten 'tHauptgusses" werden 75 1 Vorderwürze und 95 1 Nachgüsse mit 14,5 bzw.For every loo 1 of the so-called 't main cast' obtained, 75 1 First wort and 95 1 additional infusions with 14.5 resp.

2s8 Gew.-% Extrakt (Trockengehalt) erhalten. Die Weiterverarbeitung zur Würze erfolgt in bekannter Weise. Anschließend wird mit Hefe vergoren.28% by weight extract (dry content) obtained. The further processing for flavoring takes place in a known manner. Then it is fermented with yeast.

b) 11lnfusionsverfahren Bei 60 - 620C werden 25 Gew. -Teile Pilsener Malz, 70 Gew.-Teile Gerste, je o,o6 Gew.-Teile hitzestabile und hitzelabile Bakterien-alpha-Amylase (je looo SKB-Einheiten/g) eingemaiscnt, Man rührt 40 bis 45 min und erhitzt durch Zusatz von heißem Wasser auf 7o0C. Nach 45 bis 60 min ist die Verzuckerung abgeschlossen. Anschließend wird in bekannter Weise die Würze hergestellt.b) 11infusion process At 60 - 620C 25 parts by weight of Pilsener Malt, 70 parts by weight of barley, o, o6 parts by weight of heat-stable and heat-labile bacteria alpha-amylase (per looo SKB units / g) corncnt, it is stirred for 40 to 45 minutes and heated thoroughly Adding hot water to 7o0C. The saccharification is complete after 45 to 60 minutes. The wort is then produced in a known manner.

In der Sudpfanne werden noch 5 Gew.-Teile Zucker zugegeben. Die Vergärung mit Hefe erfolgt in üblicher Weise.Another 5 parts by weight of sugar are added to the brewing pan. The fermentation with yeast is done in the usual way.

Claims

1. Process for the production of yeast fermentable starch products by Effect of amylolytic enzymes on the starting mixtures of beer and spirits production, characterized by the fact that the amylolytisone enzyme - possibly in addition to other amylases - an enzyme preparation is used whose amylase activity wholly or substantially based on a content of heat-labile bacteria alpha-amylase and that a) at 7o C even in the presence of calcium ions and starch within 30 minutes at least 75% of its activity is lost b) at 40 ° C. in an aqueous solution of the tetrasodium salt of the ethylenediamine tetraacetic acid within 30 minutes no more than 10% of its Loses activity, c) within the time in the strength to the absence of Iodine starch reaction is degraded by more than 50, preferably more than 65, based on starch used, fermentable sugar forms and d) at joOC its activity optimum compared to starch at pH 5.5 has j to 5.5.

2. The method according to claim 1> characterized in that als.Ausgangslösung Mashes are used in beer and spirits production, which are predominantly are made from water and cereal flours or grains or potato starch.

5. The method according to claims 1 and 2, characterized in that that the enzyme preparation in the presence of water at a pH of 6 to 7 at 50 - 650C comes into effect.

4. The method according to claims 1 to 3, characterized gekennzeicnnet, that enzyme preparations are used which are obtained from the culture fluid of Bacillus subtilis have been obtained by separation measures known per se.

5. Process according to claims 1 to 4, characterized in that that you can use the native or gelatinized starch at temperatures of 70 - 750C C heat-stable bacterial alpha-amylase and then at temperatures from 50 to 65 ° C heat-labile bacteria alpha-amylase can act.