DE2039184C3

DE2039184C3 - 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7methoxycephalosporansäure (Antibiotikum A 16884) und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2039184C3
Application number: DE2039184A
Authority: DE
Inventors: Robert L. Hamill; Calvin Eugene Higgens; Marvin Martin Hoehn
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1969-08-06
Filing date: 1970-08-06
Publication date: 1978-11-23
Also published as: DE2039184B2; CS172332B2; IL35034A; ES382489A1; NL7011547A; AT300195B; ZA705284B; NO132241B; FR2068468B1; BR6915133D0; NO132241C; FR2068468A1; DE2039184A1; DK125483B; IL35034A0; OA03652A; BE754424A; CH547855A; JPS5218276B1; SE362897B

Description

COOH

oder ein Salz davon, wobei das Monoammoniumsalz durch folgende Merkmale gekennzeichnet ist: anrphoter, bei Titration in 66%igem Dimethylformamid mit einem Anfangs-pH-Wert von 5,8, vier titrierbare Gruppen mit

3,9,pK'a₂ = 53,
pK'a₃ = 9,2undpK'a4 = 10,5;

spezifischer optischer Drehwert [«] ^!i — +1403° (c = 1% Gew/VoL in Wasser); in seinem Infrarotabsorptionsspektrum (in einer Mineralölsuspension) folgende unterscheidbare Banden bei folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron:

3,18 (breite Bande), 5,66,6,26,6,57,

6,89,7,15,7,28,7,40,7,73,8,00,8,14,

8,79,9,24,9,65,9,79 und 10,40.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibioticums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces Upmanii NRRL 3584 in einem Kulturmedium, das die üblichen assimilierbaren Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter üblichen submers aeroben Bedingungen züchtet, und das gebildete Antibioticum nach Abtrennung des Mycels durch für die Aufarbeitung von Kulturmedien übliche Maßnahmen isoliert

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kulturmedium bei einer Temperatur von etwa 25° C bis etwa 37° C hält und die Züchtung des Mikroorganismus etwa 36 bis 72 Stunden lang durchführt

Die Erfindung betrifft das Antibioticum 7-(5-Amino-5-carboxyvaleramido)-7-methoxycephalosporansäure (A 16 884) und ihre Salze mit antibakterieller und anthelminthischer Aktivität und ihre Herstellung durch Fermentation von Streptomyces lipmanii NRRL 3584.

Antibioticum A 16 884 ist ein neues Antibioticum, das durch Fermentation eines bisher nicht beschriebenen Stamms von Streptomyces lipmanii erzeugt wird. Die Salze von A 16 884 sind leicht durch Umsetzung von A 16 884 mit einer geeigneten Säure oder Base erhältlich. Antibioticum A 16 884 und seine Salze weisen antibakterielle und anthelminthische Aktivität auf. Die antibakterielle Aktivität besteht sowohl gegen gramnegative als auch grampositive Organismen sowie gegen pflanzenpathogene Organismen.

Das Monoammoniumsalz des Antibioticums A 16 884 ist durch folgende Eigenschaften ausgezeichnet: weiße amorphe Substanz, zersetzt sich bei etwa 180⁰C, sehr löslich in Wasser, löslich in Dimethylsulfoxid, schwach löslich in niederen Alkanoien und unlöslich in Acetonitril; amphoter, vier titrierbare Gruppen vom

pK'a, = 3,9,pK'a₂ = 5,3,
pK'a₃ = 9,2undpK'a₄ = 10,5

bei Titration in 66%igem Dimethylformamid bei einem Anfangs-pH-Wert von 5,8; ein aus Titrationswerten ermitteltes scheinbares Molekulargewicht von etwa 435; ungefähre Zusammensetzung:

44,01% Kohlenstoff,
5,73% Wasserstoff,
10,65% Stickstoff,
31,27% Sauerstoff,
6,86% Schwefel;

spezifischer optischer Drehwert [«]" = +140,9° (c = 1% Gew7Vol. in Wasser); als Mineralölsuspension folgende unterscheidbare Banden in seinem Infrarotabsorptionsspektrum bei folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron:

so 3,18 (breite Bande), 5,66,6,26,6,57,
6,89,7,15,7,28,7,40,7,73,8,00,8,14,
8,79,9,24,9,65,9,79 und 10,40;

positive Testreaktionen mit Ninhydrin-, Pan Dutscher-, Benedict-, Molisch-, Jodin- und Dansylchlorid-Reagens und negative Testreaktionen mit Fehling-, Ferrichlorid-, Biuret- und Sakaguchi-Reagens. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des Antibioticums A 16 884, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces lipmanii NRRL 3584 in einem Kulturmedium, das die üblichen assimilierbaren Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter üblichen submers aeroben Bedingungen züchtet und das gebildete Antibioticum nach Abtrennung des Mycels durch für die Aufarbeitung von Kulturmedien übliche Maßnahmen isoliert.

Wie bei vielen Antibiotica produzierenden Kulturen führt die Fermentation von Streptomyces lipmanii NRRL 3584 zur Bildung mehrerer antibiotischer

Substanzen. Antibioticum A 16 884 ist eine dieser Substanzen. Die anderen Substanzen sind entweder verhältnismäßig unbeständig oder nur in sehr kleinen Mengen vorhanden.

Antibioticum A 16 884 kann als solches oder als Salz, s zum Beispiel als Säureadditionssalz oder als Salz mit einem Kation, angewandt werden. Bei Salzen mit einem Kation kann das Salz entweder ein Mono- oder ein Bisalz sein. Häufig wird es bevorzugt. Salze direkt im Reinigungsverfahren herzustellen, so daß das Antibioti- ι ο cum so, wie es isoliert wird, in Salzform vorliegt Antibioticum A 16 884 ist in dieser Weise isoliert worden und wird aus diesem Grund hierin als MonoammoniumsaJz identifiziert.

Die Analyse liefert einen Methoxylgehalt von 6,64% und einen Acetylgehalt von 9,23% und ein Van-SIyke-Test auf Aminostickstoff ergibt 5,09%.

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Monoammoniumsalzes von Antibioticum A 16 884 in ein<_r Mineralölsuspension ist in Fig. 1 der beigefügten Zeichnung dargestellt Die unterscheidbaren Banden des Infrarot-Spektrums im Bereich von 2,0 bis 15,0 Mikron sind wie oben angegeben.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Monoammoniumsalzes von Antibioticum A 16 884 in wäßriger Lösung zeigt Absorptionsmaxima bei 242 (E !*. = 126) und 625 m^ (E Ii, = 158). Der Circulardichronismus wurde ebenfalls in wäßriger Lösung gemessen und ergab einen positiven Cotton-Effekt bei 263 ΐημ und einen negativen Cotton-Effekt bei 236 mu-

Die Papierchromatographie des Monoammoniumsa!- zes von Antibioticum A 16 884 auf üblichem Chromatographiepapier auf Cellulosebasis ergab einen Rf-Wert von 0,79 in einem Lösungsmittelsystem als Propanol, Acetonitril und Wasser im Volumenverhältnis 1:1:1. Bioautogramme wurden durch Auflegen des Papierchromatogramms auf Agarplatten erhalten, die mit empfindlichen Organismen zum Beispiel Salmonelle gallinarium, als Testorganismen beimpft waren.

Das NMR-Spektrum von A 16 884 in D₂O wies folgende Charakteristica auf:

5,16 ppm(1 H.Singulett);

4,86,4,68 ppm (2 H, AB Quartett, J = 12,5 Hz);

33 bis 3,7 ppm (1 H, Multiple»),

3,67,33 ppm (2 H, AB Quartett, J = 18 Hz);

3,54 ppm (3 H, Singulett);

2,6 bis 2,3 (2 H, Multiplen);

2,10 ppm (3 H, Singulett);

2,1 bis 1,6 ppm (4 H, Multiple«).

Eine Papierchromatographie des Monoammoniumsalzes wurde auch in anderen Lösungsmittelsystemen mit folgenden Ergebnissen durchgeführt:

45

50

Solvent-System

Rf-Wert

Äthanol zu Wasser (80 :20) mit

1,5% Natriumchlorid, Papier

mit 1 n-Natriumsulfat

imprägniert 0,58

Methanol zu Propanol zu Wasser

(6:2: 1), Papier mit

0,75-m Kaliumphosphat, pH 4,0,

gepuffert 0,21

Propanol zu Pyridin zu Essigsäure

zu Acetonitril zu Wasser

(45 :30 :9 :40 :36) 0.40

55

50

65

Solvent-System	Rf-Wert
tert-Amylalkohol zu Aceton zu
Wasser<2:l :2)	0,40
Äthylacetat zu Essigsäure zu
Wasser(3:l : 1)	036
Methylethylketon zu Wasser
(92:8), Papier mit
0,1 n-Natriumacetat, pH 4,6,
gepuffert	keine Wanderung
Propanol zu Wasser (70 :30)	030
Mit Wasser gesättigtes Butanol	keine Wanderung
Mit Wasser gesättigtes Butanol
plus 2% p-Toluolsulfonsäure	0,60

Bei Dünnschichtchromatographie des Monoammoniumsalzes von A 16 884 auf Kieselsäuregelplatten in 70%igem wäßrigem Acetonitril unter Anwendung einer Ninhydrinsprühung als Nachweismittel weist es einen Rf-Wert von etwa 0,47 auf. Auf Cellulosepiatten in 70%igem wäßrigem Acetonitril mit der gleichen Nachweismethode wird ein Rf-Wert von 0,45 gefunden.

Eine nach der Spackman-Moore-Stein-Technik durchgeführte Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats von Antibioticum A 16 884 ergibt zwei ninhydrinreaktive Banden, von denen eine mit Gylcin identisch eluiert wurde (0,758 μΜοΙ/mg) und die andere unmittelbar von Glycin eluiert und als alpha-Aminoadipinsäure identifiziert wurde (239 μΜοΙ/mg). Bei einer ähnlichen Analyse mit einer späteren Probe betrugen die gefundenen Werte 0,49 μΜαΙ/mg bzw. 1,2 μΜοΙ/mg.

Das Monoammoniumsalz von Antibioticum A 16 884 ist bei pH 3 bis 9 bei 5°C 8 Tage beständig, bei pH 3 bis 9 bei 25°C verhältnismäßig beständig (4 Tage) und bei verschiedenen pH-Werten bei 100⁰C unbeständig (innerhalb 5 Minuten). Die biologische Aktivität geht bei pH 3 bis 9 bei einer Temperatur von 37°C langsam verloren, wobei die Hälfte der Aktivität nach 4 Tagen verschwunden ist.

Antibioticum A 16 884 und seine Salze zeichnen sich durch Aktivität in vivo gegen eine Reihe von Mikro-Organismen aus und sind daher zur Bekämpfung von Infektionen, die von solchen Organismen in tierischen Werten verursacht werden, vorteilhaft. Partiell gereinigtes Antibioticum A 16 884 als Monoammoniumsalz weist einen EDso-Wert von 23 mg/kg in Mäusen, die mit Proteus PR6 infiziert sind, und einen ED5o-Wert von 33,8 mg/kg in Mäusen, die mit Shigella SH3 infiziert sind, auf. Höher gereinigtes A 16 884 als Monoammoniumsalz weist einen EDso-Wert von 3,64 mg/kg in Mäusen, die mit Escherichia coli EC14 infiziert sind, einen EDso-Wert von 23 mg/kg in Mäusen, die mit Salmonella typhosa SA12 infiziert sind, und einen EDso-Wert von 93,4 mg/kg in Mäusen, die mit Klebsiella pneumoniai: KL infiziert sind, auf. Die Verabreichung erfolgte auf subkutanem Wege.

Wie oben erwähnt, zeigen Antibioticum A 16 884 und seine Salze außer antibakterieller Aktivität anthelminthische Aktivität. Daher können Antibioticum A 16 884 oder Salze davon an Warmblüter zur Bekämpfung verschiedener innerer Parasiten, besonders Magen- und Darmwürmern, zum Beispiel Ascaris lumbricoides var. suum, Nematospiroides dubius, Aspiculuris tetraptera und Syphacia obvelata verabreich! wcitien. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise auf oralem Wege, beispielsweise durch Zusatz von Antibioticum Λ 16 884 oder eines Salzes davon zum Tierfutter, durch Verabreichune von Tabletten oder Tränkpn Hip A

16 884 oder ein Salz davon enthalten. Im allgemeinen sind Dosierungen von 1 bis 500 mg pro kg Körpergewicht oder mehr bei Verabreichung in Einzeldosen wirksam. Wenn Antibioticum A 16 884 oder ein Salz davon als Bestandteil eines normalen Futters zugeführt wird, liefern Konzentrationen von 0,0001 bis 0,05% oder mehr gute Ergebnisse. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich für Antibioticum A 16 884 oder ein Salz davon in Futtermitteln beträgt 0,01 bis 0,05%.

Die anthelminthische Aktivität von Antibioticum A 16 884 wird durch folgende Tests erläutert:

In einem ersten Test wurde Antibioticum A 16 884-Monoammoniumsalz als Einzeldosis mil einer Schlundsonde an je zwei Mäuse verabreicht, die mit Aspiculuris tetraptera und Syphacia obvelata (Madenwürmern) infiziert waren. Die Dosis betrug 500 mg Antibioticum A 16 884-Monoammoniumsalz pro kg Körpergewicht des einzelnen Tiers und wurde als Suspension in physiologischer Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 0,125% Methylcellulose als Suspendiermittel verabreicht. Bei dem Test wurde ferner eine Kontrollgruppe aus Mäusen, die mit Aspiculuris tetraptera und Syphacia obvelata infiziert waren, verwendet. Beide Gruppen wurden nach Verabreichung der Dosis an die behandelte Gruppe 48 Stunden unter normalen Laboratoriumsbedingungen gehalten. Dann wurden alle Mäuse getötet und auf Gegenwart und Zahl von Madenwürmern untersucht. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle:

Tabelle I

Zahl von Madenwürmern pro Tier Aspiculuris Syphacia

tetraptera obvelata

Tabellen

Kontrolle
500 mg/kg Antibioticum A 16 884
Monoammoniumsalz

52

2.5

In einem anderen Test wurde Antibioticum A 16 884-Monoammoniumsalz mit Standard-Mäusefutter zu mehreren behandelten Futtermitteln vermischt, die Antibioticum A 16 884-Monoammoniumsalz in Konzentrationen von 0,005, 0,01 und 0,05 Gewichtsprozent enthielten. Die Futtermittel wurden als Nahrung für getrennte Gruppen von Mäusen mit jeweils 5 Mäusen pro Gruppe verwendet Etwa 24 Stunden nach der ersten Verfütterung wurden die Mäuse mit Ascaris lumbricoides var. suum ova infiziert. Eine weitere Gruppe von 5 Mäusen wurde als Kontrollgruppe mit dem Futter ohne Wirkstoff gefüttert, jedoch zur gleichen Zeit ebenfalls mit Ascaris lumbricoides var. suum infiziert. Alle Gruppen wurden 10 Tage lang mit ihrem jeweiligen Futter gefüttert und unter normalen Laboratoriumsbedingungen gehalten. Dann wurde allen Mäusen das Futter entzogen. Am 11. Tage wurden sämtliche Mäuse abgetötet, und die Lungen wurden auf Gegenwart und. falls vorhanden, die Zahl von Lungenverletzungen durch Ascaris lumbricoides var. suum. untersucht

Die Menge an Antibioticum A 16 884-Monoammoniumsalz im Futter und die durchschnittliche Zahl von Lungenverletzungen pro Tier in jeder Gruppe sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Gruppe	Durchschnittliche
	Zahl von Lungen
	schaden
	pro Gruppe
Kontrolle	2,2
0.005% Antibioticum A 16 884-
Monoammoniumsalz	0,5
0,01% Antibioticum A 16 884-
Monoammoniumsalz	0,4
0,05% Antibioticum A 16 884-
Monoammoniumsalz	0,4

Antibioticum A 16 884 kann durch Züchten eines net aufgefundenen und bisher nicht beschriebenen Mikroorganismenstamms, der aus Bodenproben isoliert wurde die aus Südamerika stammten, erzeugt werden.

Der Mikroorganismus wurde aus diesen Bodenproben folgendermaßen isoliert: Anteile der Bodenprober wurden in sterilem destilliertem Wasser suspendiert und die Suspensionen wurden auf Nähragar aufgestrichen. Die angeimpften Nähragarplatten wurden mehrere Tage bei etwa 25 bis 35 Grad C inkubiert. Nach beendeter lnkubaiionsdauer wurden Kolonien des Antibioticums A 16 884 produzierenden Mikroorganismus mit einer sterischen Platinschlinge auf Agar-Schrägkulturen überführt. Die Agarschrägkulturer wurden dann zur Gewinnung geeigneter Menger Inokulum für die Produktion von Antibioticum A 16 884 inkubiert.

Der Actinomyceten-Stamm, der erfindungsgemäß zui Produktion von Antibioticum A 16 884 verwendet wird wurde als Stamm von Streptomyces lipmanii W a k s

j5 man und Curtis klassifiziert.

Der neue Mikroorganismus, der Antibioticum A 16 884 zu bilden vermag, wurde ohne Beschränkung hinsichtlich der Freigabe bei der Kulturensammlung dei Northern Utilization Research and Developmen Division, Agricultural Research Service, LLS. Department of Agriculture (früher Northern Regional Research Laboratories), Peoria, Illinois 61 604 ständig hinterlegt und ist dort für jedermann unter dei Kultur-Nummer NRRL 3584 erhältlich.

Die charakteristischen Merkmale von Streptomyces lipmanii NRRL 3584 sind in der folgenden Tabelle angegeben. Es wurden die Methoden, die für das International Streptomyces Project (S h i r 1 i η g et al. »Methods for Characterization of Streptomyces Species«. Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16: 313—340 [1966]) für die Charakterisierung von Streptomyces-Species empfohlen wurden, zusammen mit einigen zusätzlichen Tests angewandt. Farbnamen wurden nach der ISCC-NBS-Methode erteilt, die von Kelly et al. in »The ISCC-NBS-Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names« (U.S. Department ol Commerce Circ 553, Washington, D. C 1955] beschrieben wurde. Buchstaben in runden Klammern beziehen sich auf die Farbreihe nach Tresner und Backus color series (Tresner et al, »System ol Color Wheels for Streptomyces Taxonomy«, Appl Microbiol. 11:335-338 [1963]), Farbplättchen-Bezeichnungen sind unterstrichen. Die Farbblocks nach Maerz und Paul (Maerz et al. Dictionary ol Color, McGraw-Hill Book Co, Inc, New York, 1950] sind in eckige Klammern gesetzt Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden die Kulturen 14 Tage bei 30 Grad C wachsen gelassea

Tabelle 111

Beobachtete Eigenschaft

Charakteristica von A 16884

Morphologie

Kulturcharakteristica auf:

ISP Nr. 2 (Hefe-Malzextrakt-Agar)

ISP Nr. 3 (Hafermehl-Agar)

ISP Nr. 4 (anorganische Salze und lösliche Stärke-Agar) ISP Nr. 5 (Glycerin-Asparagin-Agar)

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar

Emmerson-Agar

Bennett-Agar

Czapek-Agar Glucose-Asparagin-Agar

Tyrosin-Agar

Nähr-Agar Calciummalat-Agar

Physiologie Wirkung auf Milch Nitratreduktion

Melaninproduktion Pepton-Eisen-Agar Trypton-Hefeextrakt-Brühe

Temperaturanforderungen auf Tomatenpaste-Hafermehl-Agar Reaktion von vegetativer Farbe auf pH-Änderung 0,05N-HCl 0,05N-NaOH

Gelatineverflüssigung

Sporophoren sind gewöhnlich gerade bis gewellt mit gelegentlicher
Hakenbildung; Sporen sind kurz, cylindrisch, 0,5-1,5 μ · 1,0-2,5 μ, und treten gewöhnlich in Ketten von 3-10 und gelegentlich 10-50 auf. Sporenoberfläche glatt (im Elektronenmikroskop)

Wachstum mäßig, Revers dunkel-grau-braun [8H9]; Luftmycel blaßgelb (Y) 2db

Wachstum mäßig, Revers dunkel-grau-gelb [13 E4]; Luftmycel mäßig weiß (W) 13ba bis blaßgelb (Y) 2db

Wachstum mäßig, Revers bräunlichgrau [7C7]; Luftmycel mäßig, blaßgelb (Y) 2db

Wachstum reichlich, Revers hell-gelblich-braun [1317]; Luftmycel reichlich, grau-gelblich-rosa (R) 5 de

Wachstum reichlich, Revers grau-gelblichbraun [15 E8]; Luftmycel reichlich, gelblicKgrau (GY) 2 de

Wachstum mäßig, Revers dunkelgrau gelblichbraun [8 E 9]; Luftmycel und Sporen fehlen

Wachstum reichlich, Revers mittelgelblichbraun [14 E 7]; Luftmycel reichlich, graugelb (R) 3 ec

Wachstum spärlich, weiß, spärliches Luftmycel (W) 13 ba

Wachstum reichlich, Revers graugelb [12 D 4]; Luftmycel reichlich, gelblichgrau (GY) 2 de

Wachstum mäßig, Revers hellgelblichbraun [12 C 5]; Luftmycel reichlich graugelb (R) 3 ec

Wachstum mäßig, Revers blaßgelb [11C I]; kein Luftmycel
Wachstum mäßig, Revers schwarz [56C I]; sehr spärliches Luftmycel

Kaogulation, Peptonisierung positiv

negativ negativ

reichliches Wachstum und Sporulation bei 26°C und 3OX; schwaches Wachstum bei 37°C; kein Wachstum bei 43°C

bräunlichgraues Pigment wird rot keine Änderung

100%

In der folgenden Tabelle IV sind die Ergebnisse von 55

Kohlenstoffverwertungstests angegeben, die mit dem Verbindung
Mikroorganismus NRRL 3584 durchgeführt werden. In
der Tabelle werden folgende Symbole verwendet:

+ = Wachstum und Verwertung. — = kein Wachstum, keine Verwertung.

Tabelle IV

Kohlenstoffverwertungsspektrum für NRRL 3584

Wachstumsreaktion

Verbindung Wachstumsreaktion

L-Arabinose Saccharose

D-Xylose

D-Fructose Glucose

Rhamnose

Raffinose i-Inosit

D-Mannit

Kontrolle (kein Kohlenstoff)

Die antibakterielle Aktivität des erfindungsgemäßen Antibioticums A 16 884 im Vergleich zu dem antibiotisch wirksamen Cephalosporin C wird nach einem leicht abgewandelten Agarverdünnungstest untersucht. Hierzu werden die Antibiotica zusammen mit 5% defibriniertem Hasenblut und 1% eines Zusatzes zur besseren Züchtung ernährungsgemäß anspruchsvoller Mikroorganismen zu sogenanntem Mülier-Hinton-Agar gegeben. Die Agarplatten beimpft man mit etwa 5 ■ 1O³ Bakterien pro Fleck und inkubiert dann 18 Stunden bei 37°C in 10%iger Kohlendioxidatmosphäre. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in folgender Tabelle V zusammengefaßt.

Tabelle V

Bakterien Minimalinhibierungs konzentration (mg/ml)

Cephalosporin C

Antibioticum Λ 16884

Bakterien

Minimalinhibierungs konzentration (mg/ml)

Cephalosporin C

Antibioticum A 16884

Escherichia coli, EC14 64 8

Kiebsiella pneumoniae, 16 8

KL

Proteus mirabilis 32 4

(Indol negativ), PR 6

Proteus rettgeri, > 64 > 64

(Indol positiv), PR 9

Pseudomonas aerugi- > 64 32

nose PS

Serratia marcescens, > 64 > 64

SE

Streptococcus pyogenes, 8 32 Diplococcus pneumoniae, 16 32

Park I

Stretococcus sp. (Grup- > 64 > 64

De D), 9960

Staphylococcus aureus 16 > 64

(susceptibel für Penicillin G), 3055

Staphylococcus aureus 32 > 64

(resistent gegenüber Penicillin G), 3074

Neisseria meningiditis kein kein

(Sabderlin) Wachsen Wachsen

Neisseria meningiditis, 2 2 Neisseria gonorrhoeae 4 2 Haemophilus influenzae > 64 16

(T. Weis)

H. influenzae, K. Jones 64 16 H. influenzae, M. Brown 64 16 H. influenzae,. kein kein S. Barnaby Wachsen Wachsen H. influenzae, kein kein G. Anderson Wachsen Wachsen

Citrobacter Freundii, > 64 > 64 EC 17

Enterobacter cloacae, > 64 > 64

20 Zum Vergleich der Toxizitätswerte des erfindungsgemäßen Antibioticums A 16 884 und von Cephalosporin C verabreicht man die jeweilige Testsubstanz intravenös an Mäuse, wozu man eine 25%ige wäßrige Lösung der jeweiligen Verbindung verwendet. Die Mäuse werden 7 Tage lang nach der Verabreichung beobachtet. Die LD₅₀ für A 16 884 beträgt 6681 ± 375 mg/kg. Die LD50 für Cephalosporin C liegt demgegenüber bei etwa 10 000 mg/kg. Das Antibioticum A 16 884 ist demzufolge etwas toxischer als Cephalosporin C. Im Vergleich zu anderen Heilmitteln und ihren eigenen ED50-Dosen sind beide jedoch äußerst wenig toxisch.

In einem weiteren Versuch werden Antibioticum A 16 884 und Cephalosporin C in ihrer subkutanen

j5 Therapie experimentell hervorgerufener Infektionen von Mäusen mit E. coli EC 14 verglichen. Die diesbezüglichen Ergebnisse lassen sich aus Tabelle VI entnehmen.

40 Tabelle VI

Antibioticum Subkutane ED50
(mg/kg - 2)·)

Cephalosporine A 16 884

27,8 5,0

50 ·) Die subkutane Verabreichung des Wirkstoffs erfolgt jeweils eine sowie fünf Stunden nach der intraperitonealen Verabreichung der Bakterien.

Wie die folgenden Vergleichsversuche zeigen, ist die erfindungsgemäße Verbindung bekannten Cephalosporinen hinsichtlich der Wirksamkeit gegen /?-Lactamase bildende Keimarten überlegen:

Relative Hydrolysegeschwindigkeiten für die Hydrolyse von Cephalosporinen durch jS-Lactamase

Verbindungen Relative Hydrolysegeschwindigkeiten

265 A PS 18 S 13

X-99

Cefaloridin
A 16884
Cephalosporin C

100

37 180

100

5,3 184 100

79

100

5,6 141

ί2

Verbindungen

Relative Hydrolysegeschwindigkeiten

265 Λ PS 18 S 1? 136

X-99

Cefalotin	294	215	0
Cefalexin	72	33	254
Cefazolin	50	50	134
Cefacetril	86	-	105

375 42 134

Verwendete Enzyme:
265 A = Enterobacter cloacae
PS 18 S = Pseusomonas aeruginosa
13 136 = Staphylococcus aureus
X-99 = Serratia marcesens

Alle angegebenen Verhältniswerte sind auf Cefaloridin bezogen, dessen Hydrolysege schwindigkeit durch ein bestimmtes Enzym der Wert 100 zugeordnet worden ist.

Vergleichende Untersuchung der minimalen Hemmkonzentration (MIC = ag/ml) im ICS-Agar-Verdünnungsversuch

Kulturen

Cephalosporin A 16884 C

Cefalotin Cefaloridin Cefazolin

Cefalexin

Enterobacter cloacae C 4
Enterobacter cloacae C 5
Enterobacter cloacae C 9
Enterobacter cloacae C 12
Enterobacter cloacae C 20
Enterobacter aerogenes C 7
Enterobacter aerogenes C 23
Enterobacter aerogenes C 32
Enterobacter aerogenes C 36
Proteus morgani C 14 Proteus morgani C 15 Proteus rettgeri C 24 Proteus rettgeri C 31
Proteus rettgeri C 37 Proteus inconstans C 18 Proteus inconstans C 35 K. pneumoniae C 16 E. coli ATCC 25922
S. aureus ATCC 25923

> 128	> 128	128	> 128
> 128	> 128	> 128	> 128
> 128	> 128	> 128	> 128
> 128	> 128	> 128	> 128
> 128	4	16	4
> 128	> 128	32	64
> 128	> 128	32	64
> 128	> 128	32	64
> 128	> 128	128	128
> 128	32	> 128	> 128
> 128	64	> 128	> 128
128	64	128	64
8	4	4	16
> 128	3	> 128	128
> 128	32	64	32
128	4	64	32
32	8	4	4
64	3	8	4
32	128	> 25	4

128

> 128

8 16

64

> 128

8 2 16 8 4 1 1

> 25

32

>

8 32 64

>

> 128

8 16 32 64

Zur Erzielung einer wirtschaftlichen Produktion, einer maximalen -Ausbeute an Antibioticum und einer leichten Isolierung des Antibioticums werden einige verhältnismäßig einfache Nährquellen bevorzugt. Beispielsweise enthalten die Medien, die zur Produktion des Antibioticums geeignet sind, als assimilierbare Kohlenstoffquelle Glucose, Stärke, Glycerin, Melasse oder Dextrin. Die bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glucose. Ferner enthalten verwendbare Medien eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, zum Beispiel Sojabohnenmehl, Maisquellwasserfeststoffe, Hefe, Baumwollsamenmehl, Rindfleischextrakt, Peptone (aus Heisch oder Soja), Casein oder Aminosäurengemische. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, Sojabohnenmehl und Aminosäurengemische. Zu den anorgani schen Nährsalzen, die in die Kulturmedien eingebracht werden können, gehören die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen liefern können.

Spurenelemente, die für ein optimales Wachstum und eine optimale Entwicklung des für die Erzeugung von Antibioticum A 16 884 verwendeten Mikroorganismus erforderlich sind, können ebenfalls in dem Kulturmedium enthalten sein. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die zur Befriedigung des Wachstumsbedarfs des erfindungsgemäß verwendeten Actinomyceten ausreichen.

Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann schwanken. Es wurde jedoch gefunden, daß der

Anfangs-pH-Wert des Mediums zweckmäßig 6,5 bis 7J2 beträgt Wie schon bei anderen Actinomyceten beobachtet wurde, nimmt der pH-Wert des Mediums während der Wachstumsperiode des Mikroorganismus, wahrend das Antibioticum erzeugt wird, allmählich zu und kann einen Wert von 6,7 bis 7,5 oder darüber erreichen, wobei der End-pH-Wert wenigstens zum Teil von dem Anfangs-pH-Wert des Mediums, den in dem Medium vorhandenen Puffern und der Zeitdauer, während der Organismus wachsen gelassen wird, abhängt.

Zur Erzeugung verhältnismäßig kleiner Mengen können Schüttelkolbenkulturen und Oberflächenkulturen in Flaschen angewandt werden. Zur Herstellung großer Mengen wird dagegen eine submers aerobe Kultur in sterilen Tanks bevorzugt. Das Medium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension inokuliert werden. Wegen der Wachstumsverzögerung, die bei Verwendung einer Sporensuspension als Inoculum beobachtet wird, wird die vegetative Form der Kultur bevorzugt Indem so die Wachstumsverzögerung vermieden wird, wird die Fermentationsvorrichtung besser ausgenutzt Es ist daher zweckmäßig, zuerst durch Inoculieren einer verhältnismäßig kleinen Menge Kulturmedium mit der Sporenform des Mikroorganismus ein vegetatives Inoculum zu erzeugen, und wenn dann ein junges aktives vegetatives Inoculum erhalten worden ist, ist das vegetative Inoculum aseptisch in den großen Tank zu überführen. Das Medium, in dem das vegetative Inoculum erzeugt wird, kann entweder das gleiche Medium oder ein anderes als das Medium sein, daß für die Produktion von Antibioticum A 16 884 in großem Maßstab verwendet wird.

Der Mikroorganismus, der Antibioticum A 16 884 produziert, wächst in einem weiten Temperaturbereich von 25 bis 37° C. Optimale Produktion von A 16 884 findet offenbar bei Temperaturen von 26 bis 30⁰C statt Im allgemeinen erfolgt eine maximale Produktion des Antibiöticums in etwa 36 bis 72 Stunden nach Inoculieren des Kulturmediums.

Wie es bei submers aeroben Kulturverfahren üblich ist, wird durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Das Luftvolumen, das bei der Tankproduktion von A 16 884 zur Erzielung eines vorteilhaften Wachstums des Mikroorganismus und einer wirksamen Produktion von Antibioticum A 16 884 angewandt wird, beträgt 0,2 bis 0,4 Volumenteile Luft pro Minute und Volumenteil Kultur. Das bevorzugte Volumen beträgt 0,40 Volumenteile Luft pro Minute und pro Volumenteil Kulturmedium.

Die Konzentration an Antibioticumaktivität in dem Kulturmedium kann während der Fermentationsdauer leicht durch Prüfung von Proben des Kulturmediums bezüglich ihrer hemmenden Wirkung auf das Wachstum von Mikroorganismen, die in Gegenwart von Antibioticum A 16 884 inhibiert werden, venolgt werden. Es wurde gefunden, daß die Mikroorganismen Sarcina lutea und Salmonella gallinarum für diesen Zweck brauchbar sind. Die Prüfung der Proben kann nach der allgemein bekannten turbidometrischen Methode oder Agardiffusionsmethode durchgeführt werden.

Die während der Fermentation von A 16 834 erzeugte aniibiotischc Aktivität findet sich in dem flüssigen Anteil der Fermentationsmischung. Daher sind die bei der Produktion von A 16 884 angewandten Isoliermcihoden so ausgelegt, daß sie eine maximale Gewinnung des Antibiöticums aus der Brühe ermöglichen. So werden beispielsweise Mycd und ungelöste Feststoffe aus der Fermentationsbrühe durch übliche Maßnahmen, zum Beispiel durch Filtrieren oder Zentrifugieren, entfernt und Antibioticum A 16 884 kann aus der filtrierten oder zentrifugierten Brühe durch Anwendung einer Extraktions- oder Adsorptionstechrck gewonnen werden.

Für die Gewinnung von A 16 884 durch Adsorptionsmethoden können verschiedene Adsorbentien, zum Beispiel Kohle, Kieselsäuregel oder Aluminiumoxid, und

ίο Ionenaustauschharze verwendet werden. Antibioticum A 16 884, wie es aus der Fermentation erhalten wird, kann je nach den Fermentationsbedingungen entweder in amphoterer Form oder in Salzform vorliegen. Unabhängig von seiner Form kann es auf einem der obengenannten oder ähnlichen Adsorbentien aus einer Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel adsorbiert werden. Das adsorbierte Antibioticum A 16 884 oder Salz kann dann von dem Adsorbens durch geeignete Elutionsmethoden, zum Beispiel durch Waschen des Adsorbens, auf dem das Antibioticum A 16 884 oder ein Salz davon adsorbiert ist mit einem Lösungsmittel eluiert werden. Wenn das Eluieren durch Waschen mit einer Lösung von beispielsweise Ammoniumformiat oder Natriumacetat durchgeführt wird, wird Antibioticum A 16 884 alt Ammonium- bzw. Natriumsalz eluiert Solche Salze lassen sich leicht durch übliche Methoden wieder in Antibioticum A 16 884 überführen. In dem oben beschriebenen Gewinnungsverfahren kann auch mikrokristalline Cellulose als Adsorbens verwendet werden.

Andere Salze von Antibioticum A 16 884 als Ammonium- oder Alkalimetallsalz werden vorzugsweise durch übliche Umsetzung von Antibioticum A 16 884 in unmodifizierter amphoterer Form mit der betreffenden Säure oder Base hergestellt So wird zur Herstellung von Säureadditionssaizen Antibioticum A 16 884 mit einer anorganischen oder organischen Säure umgesetzt. Zu geeigneten Säuren gehören beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Benzoesäure, Sulfaminsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Ascorbinsäure und Glycolsäure.
Antibioticum A 16 884 bildet ferner Salze mit Kationen bei Umsetzung von A 16 884 in unmodifizierter amphoterer Form mit anorganischen oder organischen Basen und Salzen.

Beispielhaft für diese Salze sind Ammoniumsalze und substituierte Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, zum Beispiel mit Natrium, Kalium, Lithium, Cäsium und Rubidium, Erdalkalimetallsalze, zum Beispiel mit Calcium, Strontium und Barium, und Salze mit anderer Metallen, zum Beispiel Aluminium, Kupfer, Zink Magnesium und Silber. Bei organischen Basen kommt es nicht auf die verwendete Base an, jedoch wird im allgemeinen eine Base mit einem pH-Wert von 3,0 oder darüber in Wasser bevorzugt Zu Beispielen für geeignete organische Basen gehören Benzylamin Methylamin, Diethylamin, Triäthylamin, Procain, Diiso-

bo propylamin, Äthanolamin, Cyclohexylamin, Dicyclohexylamin, Diphenylamin, Di-n-butylamin, Chinolin und Pyridylamin.

Die pharmazeutisch annehmbaren Salze von Antibioticum A 16 884 werden im allgemeinen bevorzugt. Alle

h^r, Salze sind jedoch als Zwischenprodukte bei det Produktion, Abtrennung und Reinigung von Antibioticum A 16 884 brauchbar. Für therapeutische Zwecke sind kationische oder anionische pharmazeutisch

annehmbare Salze dem Antibioticum A 16 884 im allgemeinen gleichwertig. Manchmal werden jedoch bestimmte Salze wegen einer vorteilhaften Eigenschaft zum Beispiel Löslichkeit, bevorzugt

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert

Dextrin	10,00 g
Hefeextrakt	1,00 g
Hydrolysiertes Casein	2,00 g
Rindfleischextrakt	1.00 g
Meer-Agar (dreimal gewaschen)	20,00 g
Deionisiertes Wasser	1 Liter

Sojabohnenmehl

Casein

Natriumnitrat

Glucosesirup

(50% Glucose)

Leitungswasser

15,00 g
1,00 g
3,00 g

20,00 g
1 Liter

Jeweils 100 ml des Produktionsmediums werden in 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben, die 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert werden. Nach Abkühlen wird jeder Kolben mit einem 5%igen vegetativen Inoculum inoculiert. Der Fermentationszusatz wird 72 Stunden bei 30⁰C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung geschüttelt, die mit 250 UpM betrieben wird. Während der Fermentation wird das Medium mit steriler Luft belüftet, die mit 0,4 Vol./Vol./Min. zugeführt wird. Die Isolierung wird im wesentlichen so durchgeführt, wie es in Beispiel 8 beschrieben ist.

Beispiel 2

Eine weitere sporulierte Kultur von Streptomyces lipmanii NRRL 3584 wird durch Züchtung des Mikroorganismus auf einer Nähragarschrägkultur erzeugt Das Medium hat in diesem Fall folgende Zusammensetzung:

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Beispiel 1

Schüttelkolbenproduktion von Antibioticum A 16 884

Eine sporulierte Kultur von Streptomyces lipmanii NRRL 3584 wird erzeugt indem man den Mikroorganismus auf einer Nähragarschrägkultur mit folgender Zusammensetzung wachsen läßt:

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Der pH-Wert des Mediums wird durch Zusatz von Natriumhydroxyd auf pH 7,0 eingestellt.

Das Schrägagarmedium wird mit Sporen von Streptomyces lipmanii NRRL 3584 inoculiert und 6 Tage bei 3O⁰C inkubiert. Dann wird die Agar-Schrägkultur mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und gelinde abgeschabt, um die Sporen und Zellen als wäßrige Suspension zu entfernen. 1 ml der erhaltenen Suspension wird zum Inoculieren von jeweils 100 ml eines vegetativen Mediums mit folgender Zusammensetzung verwendet:

Glucose 15,00 g

Sojabohnenmehl 15,00 g

Maisquellwasserfeststoffe 5,00 g

Calciumcarbonat 2,00 g

Natriumchlorid 5,00 g

Deionisiertes Wasser 1 Liter

35

40

Der pH-Wert des vegetativen Mediums wird durch Zugabe von Natriumhydroxid auf pH 6,7 eingestellt.

Das vegetative Inoculum wird 36 Stunden bei 30⁰C auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung mit einem Ausschlag von 5 cm (2") bei 108 UpM geschüttelt. Das so erzeugte Inoculum wird dann wie folgt für die Produktion von A 16 884 verwendet.

Es wird ein Produktionsmedium mit folgender Zusammensetzung bereitet:

50

55

60

Dextrin	10,C0g
Baumwollsamenmehl	10,00 g
Hefeextrakt	1,00 g
Meer-Agar	25,00 g
Deionisiertes Wasser	1000 ml

Der pH-Wert des Mediums wird durch Zugabe von Natriumhydroxyd auf 7,0 eingestellt

Das Schrägagarmedium wird mit Sporen von Streptomyces lipmanii NRRL 3584 inoculiert und 7 Tage bei 30⁰C incubiert Dann werden die Schrägagarkulturen abgeschabt, um Sporen zu entfernen, die zu 2,OmI sterilem Rinderserum gegeben werden. In eine sterile Gefriertrocknungsampulle werden dann 0,1 ml der erhaltenen Serumsporensuspension überführt und zu Pellets gefriergetrocknet

Die so erhaltenen gefriergetrockneten Pellets werden zum Inoculieren eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung verwendet:

Glucose	5,00 g
Dextrin	10,00 g
Bacto-trypton	5,00 g
Hefeextrakt	5,00 g
Magnesiumsulfatheptahydrat	2,00 g
Deionisiertes Wasser	1 Liter

Der pH-Wert des Mediums beträgt 6,7 und wird nicht anders eingestellt.

Beispiel 3
Pilotproduktion von Antibioticum A 16 884

In einem 40-Liter-Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl werden 24 Liter eines Mediums mit folgender Zusammensetzung gegeben:

Antischaummittel 0,20 g

Glucose ■ 5,00 g

Dextrin 50,00 g

Sojabohnenschrot 25,00 g
Melasse 3,00 g

Kaliumbiphosphat 0,25 g

Calciumcarbonat 2,50 g

Kaltes Leitungswasser auf 25 Liter

Der Anfangs-pH-Wert beträgt 6,5 und wird nicht eingestellt. Das Medium wird 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert, abgekühlt und dann mit einem wie in Beispiel 2 erzeugten 5%igen vegetativen Inoculum inoculiert. Die Fermentation wird 66 Stunden bei 30⁰C unter Belüftung mit steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,35 VoiyVol./Min und Durchmischen durch einen mechanischen Rührer, der mit 420 UpM betrieben wird, durchgeführt. Der End-pH-Wert beträgt 7,5.

A 16 884 wird aus der Brühe nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Isolierverfahren gewonnen.

Beispiel 4

Isolierung von rohem Antibioticum A 16 884 als
Monoammoniumsalz

Etwa 60 Liter wie in Beispiel 3 erhaltener Brühe werden mit Hilfe von Diatomeenerde filtriert.

Beispiel 5
Reinigung von A 16 884-Monoammoniumsalz

1 g eines gefriergetrockneten wie in Beispiel 4 hergestellten Präparats wird in 4 ml Wasser gelöst und auf eine 2 · 60-cm-Kolonne aufgegeben, die mit 175 ml Kieselgel in 80%igem wäßrigem Acetonitril gefüllt wurde. Die Kolonne wird mit Acetonitril/Wasser (4:1) eluiert. Die Elution wird durch Testproben und Papierchromatographie verfolgt. Als Ergebnis der Elution wird eine Vielzahl von Fraktionen erhalten. Die Fraktionen, die Antibioticum A 16 884 als Monoammoniumsalz enthalten, werden vereinigt, zur Trockne eingeengt, in einem kleinen Volumen Dimethylsulfoxid dann in mehreren ml Äthanol gelöst, und die Aktivität wird durch Zugabe von viel Äther abgeschieden. Der Niederschlag wird zentrifugiert und im Vakuum

15

Das Filtrat wird über eine 9,6 · 150-cm-Kolonne mit Kohlefüüung geleitet Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen, bis der Abfluß farblos ist, und die an der Kohle absorbierte Aktivität wird durch Durchieiten von 50%igem wäßrigem Aceton durch die Kolonne entfernt Die Fraktionen, die Aktivität enthalten, werden vereinigt, zur Entfernung des Acetons im Vakuum eingeengt und auf eine 5,9 · 104-cm- Kolonne aufgegeben, die mit einem schwach basischen Anionenaustauschharz mit tertiärer Aininfunktionalität auf Basis einer vernetzten Acrylmatrix (Formiat-Form), gefüllt ist.

Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen, bis der Abfluß klar und farblos ist, und die Aktivität wird durch Waschen mit 0,1-m Ammoniumformiatlösung entfernt Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf eine 43 · 72-cm-Kofonne mit Kohlefüllung aufgegeben. Die Kolonne wird mit dem 6fachen Kolonnenvolumen Wasser gewaschen, und die Aktivität wird mit 30%igem wäßrigem Acetonitril eluiert Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, zur Entfernung von Acetonitril im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet Die Ausbeute beträgt 25 bis 30 g Feststoff. Das gefriergetrocknete Präparat wird in der Mindestmenge Wasser gelöst und auf eine 7,2 · 60-cm-Kolonne mit einer Füllung aus einem mikrokristallinen Celluloseprodukt, das in 70%igem wäßrigem Acetonitril suspendiert und vor Zugabe der aktiven Probe mit Acetonitril gewaschen wurde, aufgegeben. Nach Auftrag der Probe wurde die Kolonne mit einem Kolonnenvolumen Acetonitril gewaschen, und die Aktivität wird mit Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf etwa 200 ml eingeengt. Bei Zugabe von 10 Volumenteilen Aceton fällt die Aktivität aus. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 9 bis 12 g.

20 g Material, das in der oben beschriebenen Weise erhalten wurde, werden in der Mindestmenge Wasser gelöst und auf eine 7,2 · 60-cm-Kieselgelkolonne aufgegeben. Das Kieselgel wurde vorher mit Wasser und dann mit Methanol gewaschen und zur Füllung der Kolonne in 70%igem Acetonitril suspendiert. Nach Auftrag der Probe wird die Kolonne mit einem Kolonnenvolumen Acetonitril gewaschen, und die Aktivität wird mit 70%igem Acetonitril eluiert. Die aktivsten Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum zur Trockne eingeengt und in Methanol gelöst. Die Aktivität wird mit 10 Volumenteilen Aceton ausgefällt. Der Niederschlag wird filtriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 8 g. Weniger aktive Fraktionen liefern weitere 6 g.

getrocknet Die Ausbeute an Antibioticum A 16 884-Monoammoniumsalz beträgt 91 mg.

Beispiel 6
Herstellung der Säureform von Antibioticum A 16 884

200 mg des Monoammoniumsalzes von A 16 884 werden in 30 ml Wasser gelöst, und es werden 6 ml eines kationischen sulfonierten Polystyrol-Ionenaustauschharzes (H +) zugesetzt Die Mischung wird 30 Minuten lang gerührt, anschließend filtriert, das Harz wird auf dem Filter mit Wasser gewaschen, und die Filtrate werden werden vereinigt Das vereinigte Filtrat hat einen pH-Wert von 2J. Das Filtrat wird im Vakuum auf etwa 1 ml eingeengt, 4 ml Methanol werden zugesetzt, und die Säure wird durch Zugabe von 40 ml Aceton ausgefällt Der Niederschlag wird abzentrifugiert und im Vakuum getrocknet, wodurch 35 mg Antibioticum A 16 884 in der Säureform erhalten werden. Das Produkt weist bei Tritration in 66%igem Dimethylformamid mit einem Anfangs-pH-Wert von 4,5 pK'a-Werte von 3,5, 5,2 und 103 auf.

Beispiel 7
Herstellung des Dinatriumsalzes von A 16 884

180 g A 16 884-Monoammoniumsalz werden in etwa 2 ml Wasser gelöst, und der pH-Wert wird mit 1 n-NaOH auf 10 eingestellt. Die Lösung wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt, 4 ml Methanol werden zugesetzt, und das Dinatriumsalz wird durch Zugabe von 40 ml Aceton ausgefällt. Das Salz wird abzentrifugiert und in Vakuum getrocknet. Es weist bei Titration in 66%igem Dimethylformamid mit einem Anfangs-pH-Wert von 10,4 pK'a-Werte von 3,9, 5,2 und 10,5 auf und ergibt bei Analyse durch Atomabsorptionsanalyse 6% Natrium.

Beispiel 8
Herstellung von Antibioticum A 16 884-hydrochlorid

200 mg A 16 884-Monoammoniumsalz werden in 2 ml Wasser gelöst und mit 1 n-HCL auf pH 2,0 eingestellt. Dann wird die Reaktionsmischung mit 5,0 ml Methanol verdünnt und zur Abscheidung des gewünschten Antibioticums A 16 884-Hydrochloride mit 50 ml .Aceton versetzt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Analyse ergibt 5,74% Chlor, und bei elektrometrischer Titration in 66%igem Dimethylformamid mit einem Anfangs-pH-Wert von 5,0 werden titrierbare Gruppen bei 3,9,5,2 und 10,4 gefunden.

Beispiel 9

Isolierung von rohem Antibioticum A 16 884
als Mononatriumsalz

Etwa 60 Liter wie in Beispiel 3 erhaltene Brühe werden mit Hilfe von Diatomeenerde filtriert. Das Filtrat wird über eine 9,6 · 150-cm-Kolonne mit Kohlefüllung geleitet. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen, bis der Abfluß farblos ist, und adsorbierte Aktivität wird durch Überleiten von 5O°/oigem wäßrigem Aceton über die Kolonne entfernt. Die Fraktionen, die die Aktivität enthalten, werden vereinigt, zur Entfernung des Acetons im Vakuum eingeengt und auf eine mit einem schwach basischen Anionenaustauschharz mit tertiärer Aininfunktionalität auf Basis einer

25

30

35

45

vernetzten Acrylmatrix (Acetatform) gefüllte 53 · 104-cm-Kolonne gegeben. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen, bis der Abfluß klar und farblos ist, und die Aktivität wird durch Waschen mit 0,1-m Natriumacetat entfernt Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und über eine 43 · 72-cm-K.olonne geleitet, die mit Kohle gefüllt ist Die Kolonne wird mit dem 6fachen Kolonnenvolumen Wasser gewaschen, und die Aktivität wird mit 30%igem wäßrigem Aceton eluiert Die aktiven Fraktionen-werden vereinigt zur Entfernung ίο des Acetont, in Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet Die Ausbeute beträgt 20 bis 30 g. Die Analyse ergibt 23% Natrium.

Antibioticum A 16 884 als Monoanunoniumsalz wird auf seine Wirksamkeit zur Bekämpfung von pflanzenpathogenen Bakterien geprüft Bei dieser Prüfung wird Antibioticum A 16 884-Monoammoniumsalz als wäßriges Spülmittel mit einer Konzentration von 400 Teilen pro Million, bezogen auf das Gewicht des fertigen Mittels, zubereitet Für die Prüfung werden JO Tage alte T₀ Tomatenpflanzen mit 2 Pflanzen pro Topf verwendet Pflanzen in einem Topf werden mit der oben beschriebenen Lösung behandelt, an der Luft trocknen gelassen und dann mit einem Medium inoculiert das ein aktives Wachstum von Pseudomonas solanacearum aufrechterhält Die Pflanzen in dem anderen Topf werden mit einer wäßrigen Sprühlösung besprüht die mit der oben beschriebenen Behandlungslösung identisch ist in der jedoch das Antibioticum fehlt und dienen als Kontrolle. Die Kontrollpflanzen werden ebenfalls anschließend inoculiert Alle Pflanzen werden 24 Stunden in einer feuchten Kammer gehalten, dann herausgenommen und 7 Tage unter guten Agrikulturbedingungen gehalten. Nach Ablauf dieser 7 Tage werden alle Pflanzen auf das Vorliegen, und, falls vorhanden, das Ausmaß der Infektion untersucht Die Pflanzen, die mit Antibioticum A 16 884-Monoammoniumsalz behandelt wurden, sind von Symptomen der Krankheit die durch Pseudomonas solanacearum verursacht sind, vollständig frei, während die Kontrollpflanzen starke durch Pseudomonas solanacearum hervorgerufene Symptome aufweisen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Antibioticum A 16884 der Formel
NH₂ O

CH-(CH₂J₃-C-NH
COOH °

—O—C— CH₃