DE2034708C3

DE2034708C3 - Verfahren zur Herstellung eines antihypertensiv wirksamen Extraktes der Anacardium occidentale L.-Rinde

Info

Publication number: DE2034708C3
Application number: DE2034708A
Authority: DE
Inventors: Paulette Crouy-Sur-Ourcq Giono-Barber Geb. Michel; Yvonne Paris Thuillier
Original assignee: Albert Rolland Sa Paris
Current assignee: Albert Rolland Sa Paris
Priority date: 1969-07-19
Filing date: 1970-07-13
Publication date: 1980-10-09
Also published as: BE752966A; CA940454A; CS150633B2; SE360563B; IL34901A; GB1303817A; ZA704836B; NL7010735A; RO58857A; AT300185B; IL34901A0; OA03643A; ES381750A1; LU61356A1; FI50297C; JPS5414166B1; DE2034708A1; DE2034708B2; CH523688A; NO132022C

Description

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Gegenstand der Erfindung ist ein neuer vegetabilischer Extrakt, der ausgehend von der Rinde des Anacardium occidentale L (auch bekannt unter dem Namen Anacardium senegalensis) in der im Anspruch genau gekennzeichneten Weise erhalten wird. Der Anacardium occidentale L gehört zur Familie der Anakardiazeen, zu der ebenfalls der Rhus, die Pistazie und die Terebinthe gehören.

Der Anacardium occidentale L oder Kaschu-Acajou- jo baum ist nordamerikanischen Ursprungs und wird laufend im Senegal angepflanzt Seine Frucht, die Acajounuß, wird für verschiedene äußerliche Anwendungen, wie beispielsweise für die Behandlung von Geschwüren und Warzen, benutzt Therapeutisch wird die Frucht hauptsächlich als antilepröses Topicum verwendet Dabei tropft man den Mesokarpsaft auf die Lepraflecke und trägt auf die mit Hilfe des Vesicatoriums künstlich erzeugten Wunden antilepröse Pasten auf.

Die Rinde enthält einen Gummi bzw. ein Baumharz, das hervorquillt wenn der Baum eingekerbt wird, und unter Farbveränderung von rot nach gelb dick wird. Dieser Gummi wird für das erfindungsgemäße Verfahren nicht verwendet. 4>

Insbesondere seit der Veröffentlichung der Costa de Aguiar in der brasilianischen Zeitschrift »Anais da Faculdade de Medecina da Universidade do Recife«, Vol. 18, Nr. 2, Seiten 193-7 (1958), ist bekannt, daß die Rinde des Anacardium occidentale L einen blutzucker- v> senkenden Wirkstoff enthält. Nach diesem Autor werden die blutzuckersenkenden Eigenschaften bei Ratten nachgewiesen, die mit einem folgendermaßen hergestellten Produkt behandelt wurden: Abkochen von 50g Rinde in einem Liter Wasser, Einengen auf 25% -,ι und anschließendes Verdünnen auf ein Zehntel mit einer physiologischen Salzlösung von 8,5%, wobei der End-pH-Wert bei 7 liegt.

Aus CA. 1951, Bd. 45, Nr. 10396e, ist ferner bekannt, daß eine Tinktur bzw. ein Extrakt von Anacardium m> occidentale eine blutzuckersenkende Wirkung bei oraler Verabreichung hat. Von einer antihypertensiven Wirksamkeit ist jedoch nicht die Rede. Obwohl aus dieser kurzen Zusammenfassung die Herstellungsmeihode der Tinktur nicht zu entnehmen ist, weisen die <,·, Wirkungsart und der Ausdruck »Tinktur« darauf hin, daß es sich um einen alkoholischen Auszug und nicht um einen wässerigen Fixtrakt handelt.

Überraschenderweise wurde nun festgestellt, daß die Rinde des Anacardium occidentale L einen antihypertensiv wirksamen Wirkstoff enthält, der durch spezielle Methoden extrahiert werden kann, die sich von bekannten durch wässerige Mazeration der Rinde, Licht- bzw. Luftabschluß und niedrige Temperatur (0 bis 5°C) unterscheidet Die antihypertensive Wirkung ist völlig überraschend, denn ein Absud, der durch Eintauchen der Rinde in kaltes Wasser und Siedenlassen dieses Ansatzes über eine gewisse Zeit erhalten wird, zeigt keinerlei antihypertensive Wirksamkeit

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines antihypertensiv wirksamen Extraktes der Anacardium occidentale L.-Rinde ist dadurch gekennzeichnet, daß man frische pulverisierte Rinde unter Lichtabschluß einer wässerigen Mazeration bei einer Temperatur zwischen 0 und 5° C unterwirft, danach ebenfalls unter Lichtabschluß bei einer Temperatur zwischen 0 und 5° C filtriert, das Filtrat im Vakuum einengt, gefriertrocknet und einen Trockenextrakt mit 20 bis 30% Trockengewicht bezogen auf das Gewicht der zerkleinerten Rinde, gewinnt

Somit wird Extrakt erhalten, der für die Herstellung antihypertensiv wirksamer Mittel brauchbar ist und für pharmazeutische Zusammensetzungen zusammen mit physiologisch akzeptablen Trägern verwendet wird.

Zur Vorbereitung der von Gummi bzw. Baumharz befreiten, beispielsweise mit Hilfe eines Siebzerkleinerers fein gepulverten Rinde erfolgt unter Rühren mit destilliertem Wasser eine Suspension bei einer Temperatur zwischen 15 und 25°C. Danach wird unter Lichtabschluß bei einer Temperatur zwischen 0 und 5° C in einer Konzentration von 20 bis 50 g zerkleinerte Rinde pro Liter mazeriert

Am Ende der Mazeration wird die Suspension filtriert, wobei sie immer noch unter Lichtabschluß und bei einer niedrigen Temperatur zwischen 0 und 5° C gehalten wird. Man engt im Vakuum ein, und nach Ruhenlassen im Dunkeln bei niedriger Temperatur wird gefriergetrocknet

Es folgen Beispiele zur Erläuterung der Erfindung. Beispiel I

100 g Rinde wurde unter Verwendung eines Siebgitters bzw. -rostes unter Gewinnung von 88 g eines feiner als Sägespäne pulverisierten Produktes zerkleinert Dieses Pulver wurde in 4,4 1 destilliertem Wasser bei 20⁰C in einer Konzentration von 20 g/l suspendiert Es wurde etwa 5 Minuten lang gerührt. Die Mazeration in einer Kühlkammer von +2⁰C unter Lichtabschluß dauerte 48 Stunden, wobei am Tag alle 2 bis 4 Stunden gerührt wurde. Filtriert wurde ebenfalls in der Kühlkammer bei +2⁰C unter Lichtabschluß, und zwar durch eine erste Filterscheibe (trüber Saft) und dann durch eine weniger poröse zweite Filterscheibe (blaßroter durchsichtiger Saft).

Das Filtrat (3,81) hatte einen pH-Wert von 5,8 und eine Trockenextraktkonzentration von 0,68 Gew.-% entsprechend einer Gesamtmenge gelösten Produktes von 25,64 g. Es wurde im Vakuum auf einem Wasserbad von 25⁰C bis auf ein Volumen von 380 ml entsprechend 6,8 Gew.-% Trockenextrakt eingeengt. Nach Ruhenlassen bei + 2"C bildete sich in der Lösung eine Ausfällung. Eine homogene Probe wurde durch ein Faltenfilter filtriert. Der auf dem Filter verbliebene Niederschlag wandelte sich beim Aufheizen in ein braunes gummöses Harz um. Der Rest der Lösung, d. h. J20 ml, wurde zur Lyophilisicrung über Platten geschickt. Man erhielt 20 g

eines chamois-farbenen Produktes von sehr geringer Dichte,

Beispiel 2

Als Ausgangsmaterial wurden 90 g Rir.de verwendet Während der Zerkleinerung bzw. des Mahlvorgangs zeigten sich Schwierigkeiten, die von dem noch zu feuchten Zustand des Ausgangsmaterials herrühren konnten (leichte Neigung zum Anbräunen bzw. zur Karamelbildung an der Mahlvorrichtung). In diesem Fall wurde mit zwei Durchgängen ohne Siebrost gearbeitet Das gesammelte, zerstückelte und gemahlene Produkt wog 90 g. Es wurde unter etwa 5 Minuten langem manuellen Rühren in 4,51 destilliertem Wasser von 20⁰C mit einer Konzentration von 20 g/l in Suspension gebracht Anschließend wurde die Suspension in einer Kühlkammer von + 2° C unter Lichtabschluß 9 Tage lang ruhengelassen, wobei zweimal am Tag einige Minuten lang durchgerührt wurde. Filtriert wurde in der Kühlkammer bei +2⁰C unter Lichtab-Schluß, und zwar dorch eine erste Filterscheibe (trüber Saft) und dann durch eine zweite, weniger poröse Filterscheibe (blaßroter durchsichtiger Saft).

Das Filtrat hatte ein Volumen von 4,21, der pH-Wert lag bei 5,25 und die Konzentration an Trockenextrakt bei 0,62 Gew.-%. Es wurde im Vakuum auf einem Wasserbad von 25° C bis auf 400 ml eingeengt, d. h. auf einen Trockenextraktgehalt von etwa 6,5 Gew.-%, und anschließend bei +2⁰C ruhengelasssn, wobei sich in der Lösung Ausscheidungen bildeten. Eine homogene Probe wurde durch ein Faltenfilter filtriert; der auf dem Filter zurückgehaltene Niederschlag wandelte sich beim Aufheizen in einen braunen gummöäen Lack um. Der Rest der Lösung (320 ml) wuide zur Lyophilisierung über Platten geschickt Man erh.jlt 25 g eines a chamois-farbenen Produktes von sehr geringer Dichte.

Dieser Extrakt wurde an Cellulosepulver mit einer Wanderungszeit von 5 Stunden zweidimensional Chromatographien unter Verwendung unterschiedlicher Lösungsmittel und Farbreagenzien, je nach nachzuweisenden Wirkstoffen.

Die erhaltene Fraktion hat keinen Eiweißcharakter und enthält sehr wenig Aminosäuren.

Indolkerne wurden mit p-Dimethylaminobenzaldehyd in 1 n-Salzsäurelösung nachgewiesen. Es wurden rosaviolette Flecke beobachtet

Der Extrakt scheint keine Purinderivate zu enthalten (rosaviolette Färbung mit Eosin) und keine reduzierenden Zucker oder deren Phosphorsäureester (Abwesenheit von orange-farbenen Flecken mit Pikrinsäure). Es >o ist allerdings zu bemerken, daß die Erkennung gewisser Einfärbungen, wie insbesondere diejenigen reduzierender Zucker, die Eigenfärbung des erfindungsgemäßen Extraktes schwierig gemacht wird.

Dagegen wurde das Vorhandensein von Desoxyribosiden (nachgewiesen mit einer Lösung von Cystein-hydrochlorid in 3 η-Schwefelsäure), von Thiolen in sehr großer Menge, von Disulfiden, phosphorhaltigen Verbindungen und schließlich von Spuren von Aminosäuren festgestellt. _ho

Mit dem Draggendorf-Reagenz wurde das Fehlen von Alkaloid-Reaktionen festgestellt.

Die Chromatogramms des Anacardium occidentale L-Extraktes wurden mit Chromatogrammen von Nierenextrakteii gemäß der britischen Patentschrift (,-> 9 91491 verglichen. Der für die Anwesenheit von Indolkernen in der vegetabilischen Fraktion sprechende rosa Fleck entspricht dem violetten Fleck der Nierenfraktion. Die beiden Extrakte zeigen ähnliche Flecke, was die Desoxyriboside betrifft Die Nierenfraktion enthält dagegen reduzierende Zucker, Disulfide in geringer Menge und keine Thiole.

Der erfindungsgemäße Pflanzenextrakt wurde pharmakologiseh untersucht und erwies sich als antihypertensiv wirksames Mittel.

Dabei wurde die Technik nach Page-Patton-Ogden angewandt, bei der eine herausgenommene bzw. vorverlagerte Niere mit Kollodium überpinselt und die gegenüberliegende Niere 1 bis 4 Wochen danach entnommen wird. Diese Technik führt theoretisch zu chronischen Hypertensionen bei zwei Drittem der so behandelten Tiere.

Tiermaterial

Wistar-Ratten mit einem mittleren Gewicht von 230 g während des ersten Eingriffs.

Druckmeßgerät

Es wurde ein Oszillometer verwendet, das die indirekte Messung des arteriellen Drucks am rückfließenden Blutstrom in der Distalpartie eines Organs, im vorliegenden Fall der Basis des Rattenschwanzes, während der langsamen Dekompression der Manschette ermöglicht

Das Tier wird zur Erzielung einer Vasodilatation 30 Minuten lang bei einer Temperatur in der Gegend von 30° C gehalten, wobei die Oszülometermanschette von Anfang an an Ort und Stelle ist Für die Messung muß das Tier absolut bewegungslos sein, was bisweilen sehr lange Wartezeiten erfordert Man verwendet mit Vorteil einen zusätzlichen Käfig, in dem mehrere Ratten bei 30°C gehalten werden können, und gewinnt so beträchtlich an Zeit

Arbeitsweise

DU; Ratten wurden mit Äther anästhesiert. Nach Durchschneiden von Haut und Muskels "hicht wurde die Niere herausgenommen bzw. vorverlagert und dann, ohne das Parenchym zu verletzen, vorsichtig die Bindegewebskapsel entfernt. Nach einem linden Austrocknen der Niere wurde auf die gesamte Oberfläche eine Kollodiumschicht aufgetragen, wobei die Niere an einem Faden aufgehängt war. Es wurden nacheinander mehrere Schichten aufgetragen und der Faden dann in Höhe des Parenchyms abgeschnitten. Nach dem Eingriff und am folgenden Tag wurden 10 000 E und 8 000 E Penicillin injiziert. 10 ois 15 Tage später erfolgte die Nephrektomie der nicht behandelten Niere.

Ergebnisse

Es wurden zwei Versuchsreihen durchgeführt, und zwar die eine mit einer Dosis von 1 ml/kg einer wässerigen Lösung mit 50 g/l des erfindungsgemäßen Pflanzenextraktes und die andere mit einer wässerigen Lösung mit 100 g/l des erfindungsgemäßen Extraktes. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mit solchen verglichen, die bei Versuchen an Vergleichstieren erhalten wurden, die in der gleichen Weise wie oben angegeben wurde in experimentelle Hypertension versetzt worden waren, jedoch nur identische Mengen von physiologischer Lösung erhielten.

Es wurde eine deutliche Senkung des arteriellen Druckes (TA) von 1 bis 3 Einheiten beim diastolischen Druck (Tm) und von 2 bis 4 Einheiten beim systolischen Druck (TM) beobachtet. Diese in der fünften Stunde festgestellte Drucksenkung hält mehrere Tage nach der

letzten Injektion an. Die in den nachfolgenden Tabellen angegebenen Versuchsergebnisse lassen auf eine antihypertensive Wirkung bei unter experimentelle Hypertension versetzten Tieren (renale Hypertension) schließen.

In den Tabellen Ia und Ib werden die Ergebnisse wiedergegeben, die bei 2 Gruppen von Vergleichsüeren gefunden wurden, die eine Dosis von 1 ml/kg physiologischer Lösung mit 5 Gew.-% erhielten und in den Tabellen HIa und IHb die Ergebnisse von Vergleichsgruppen, die 1 ml/kg physiologischer Lösung mit 10 Gew.-% erhielten.

Die mit dem erfindungsgemäßen Extrakt behandelten Tiere wurden in 6 Gruppen eingeteilt 3 Gruppen

erhielten 1 ml/kg Anacardium occidental L-Extrakt in wässeriger Lösung mit einer Konzentration von 'JO g/l (Tabellen Ha, Ub und lic), die drei anderen Gruppen erhielten 1 ml/kg erfindungsgemäE— Anacardium-Extrakt in wässeriger Lösung mit 100 g/I (Tabellen IVa, IVb und IVc).

Verglichen mit Ergebnissen, die mit Reserpin in einer Dosis von 1 ml/kg (subkutan), mit «-Methyldopa in einer Dosis von 200 mg/kg und mit Guanethidinismelin in einer Dosis von 30 mg/kg erhalten wurden, scheint die antihypertensive Wirkung im Fall der antihypertensiv wirksamen Pflanzenfraktion anhaltender zu sein als bei den drei genannten Substanzen, die über das sympathische Nervensystem einwirken.

Tabelle Ia

	T.A. vor der Injektion	TM	T.A. 4 bis 5 Injektion	i Std. nach der	Wirkung	JTM
	Tm	14	Tm	TM	JTm	0
Ratte 1	12	16	11,5	14	-0,5	0
Ratte 2	12	13,5	12	16	0	η
Ratte 3	10,5	15	10,5	13,5	0	0
Ratte 4	11,5	14,6	11	15	-0.5	0
Mittel	11,4		11,2	14,6	-0,25
Tabelle Ib
	T.A. vor der Injektion	TM	T.A. 4 bis : Injektion	5 Std. nach der	Wirkung	JTM
	Tm	14	Tm	TM	JTm	-1
Ratte 1	11	15	10	13	-1	-1,5
Ratte 2	11	14	10,5	13,5	-0,5	0
Ratte 3	11,5	11,5	11	14	-0,5	0
Ratte 4	9	17	9	11,5	0	0
Ratte 5	13	12	13	17	0	0
Ratte 6	9	13,9	9	12	0	-0,4
Mittel	10,7		10,4	13,5	-0,3
Tabelle Ha
	T.A. vor dei Injektion	TM	T.A. 4 bis injektion	5 Std. nich der	Wirkung	JTM
	Tm	Tm	TM	JTm

Ratte 1
Ratte 2
Ratte 3
Ratte 4
Ratte 5
MiUcI

14
13
15
14
15

19 17 19 17 20 18.4

17
16
16
16
17
I (,.4

-2

3	-3
2	-1
2	-3
IX	-7

"libelle Hh

I λ. vor der Ini.kliiiri

Im

IM

Ί.Λ. 4 bis S SId. mich der Wirkung Injektion

IM

.ι ι

Kiitlc 1
Ratte 2
Ratte 3
Ralte 4
Ratte 5
Mittel

14 13 15 15 18 15

l¹'. 5

17

19

2?,

19.5

15 15 Ui 18 16.2

2	2.5
-I	1
-4	4
2	3
-4	-5
-2.6	-3.3

I anelle Mc	Γ.Λ. vor der	TM	TA. t bis	I	Wirkung	.1TM
	Injektion	17	Injektion	5 SId mich der		-2
	Im	17	Im		.1 Im
	13	19.4	12	TM	-1	-3.4
Ratte I	13	19.1	12	15	-1	-3.1
Ratte 2	15.1	18.1	14	ι:	-ι.ι	-2,9
Ratte 3	14		13	16	-I
Ratte 4	13.5	12.5	16	-I
Miltel		15.2

Tabelle IMa	I.A. vor der	TM	T.Λ 4 bis	5 Sid. nach de	Wirkung	JTM
	Injektion	17	Injcklion			0
	Tm	18	Tm	TM	JTm	I ~ I
	14	19	14	17	0	0
Ratte 1	14	20	14	19	0	0
Ratte 2	15	18	15	19	0	-1
Ratte 3	15	18.4	15	20	0	-0,4
Ratte 4	14		14	19	0
Ratte 5	14.4	14.4	18.8	0
Mittel

Tabelle 1Mb	TA. vor der	TM	T.A. 4 bis	5 Std. nach der	Wirkung	JTM
	Injektion	14	Injektion			0
	Tm	13	Tm	TM	JTm	0
	10	15	10	14	0	-1
Ratte 1	10	14	10	13	0	0
Ratte 2	11,5	13	11,5	14	0	-1
Ratte 3	10	13,8	10	14	0	-0.4
Ratte 4	9.5		9	12	-0,5
Ratte 5	10,2	10,1	13,4	-0.1
Mittel

Tabelle IV₁,	I.A. vor der	IM
	Injektion	21
	Im	IS
	16	K-
Ratte I	14	17
Ratte 2	13	17
Ratte 3	13	17.8
Ratte 4	13
Ratte 5	13,8
Mittel
Tabelle IVb	i Λ. vor der	IM
	Injektion	18
	Im	I¹J
	13	19
Ratte I	14	18
Ratte 2	14	20
Ratte 3	14	16
Ratte 4	15	18,6
Ratle 5	13
Ratte 6	13,8
Mittel
Tabelle IVe	Τ.Λ. vor der	TM
	Injektion
	Tm

Ratte I O..11., 1

Ratte 3 Ratte 4 Ratte 5 Mittel

14

1 1 Z

12 9,5 14 12,2

18

15 13,5 17 15,6

IV I his	·> Stil, nach der	Wirkung	I IM
Injektion			3
Im	IM	I I in	2
14	16	2	I
Il	Ui	.1	3
Il	15	2	3
Il	14	-2	2,4
Il	14	2
11.5	15,4	2.3

I.Λ 1 bis	.S SId. nach der	Wirkung	.1 I
Injektion			3
fm	IM	.1 Im	2
12	15	I	2
12	17	2	4
13	17	I	3
Il	14	■>	-2
14	17	I	3
Il	14	-2
12,1	15.6	1.7

Τ.Λ. 4 bis	5 Std. naeh der	Wirk
Injektion
Tm	TM	ι Tm
12	14	-2
!')	ι -»	I C
IO	12	■2
8	Il	1.5
12,5	14,5	-1,5
10,5	12,7	1,7

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines antihypertensiv wirksamen Extraktes der Anacardium occidentale s L-Rinde, dadurch gekennzeichnet, daß man frische pulverisierte Rinde unter Lichtabschluß einer wässerigen Mazeration bei einer Temperatur zwischen 0 und 5° C unterwirft, danach ebenfalls unter Lichtabschluß bei einer Temperatur zwischen 0 und 5° C filtriert, das Fdtrat im Vakuum einengt, gefriertrocknet und einen Trockenextrakt mit 20 bis 30% Trockengewicht, bezogen auf das Gewicht der zerkleinerten Rinde, gewinnt.

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