DE2041224B2 - Method and device for preparing a liquid sample for automatic analysis - Google Patents
Method and device for preparing a liquid sample for automatic analysisInfo
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Description
Beschreibungdescription
Die photometrische Analyse flüssiger Proben ist ein bekanntes und wichtiges Hilfsmittel bei der chemischen Analyse, insbesondere auf dem klinischen Anwendungsgebiet, wo die Notwendigkeit der raschen Untersuchung von Körperflüssigkeiten zur Entwicklung einer Vielzahl automatischer Instrumente geführt hat, die zur raschen und genauen Durchführung einer Reihe von analytischen Tests bestimmt sind. Die meisten dieser Instrumente benutzen gut bekannte biochemische Tests auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines speziellen Bestandteiles in einer flüssigen Probe, wobei ein Reagens, das eine Reaktion in der flüssigen Probe verursacht, wenn der spezielle Bestandteil anwesend ist, zur flüssigen Probe gegeben wird. Die verursachte Reaktion beeinflußt die photometrische Dichte der flüssigen Probe und die Veränderung wird von einem Photometer angezeigt. Tests zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Konzentration des Harnstoff-Stickstoffs oder der Blutglucose, wie sie in den Beispielen der US-Patentschrift 34 76 515 beschrieben sind, stellen übliche Beispiele dieses Analysentyps dar.The photometric analysis of liquid samples is a well-known and important tool in chemical Analysis, especially in clinical applications, where there is a need for rapid investigation of body fluids has led to the development of a wide variety of automatic instruments that are used for rapid and accurate performance of a number of analytical tests are intended. Most of these Instruments use well known biochemical tests for the presence or absence of a particular one Constituent in a liquid sample, being a reagent that causes a reaction in the liquid sample caused when the special ingredient is present, is added to the liquid sample. That caused The reaction affects the photometric density of the liquid sample and the change is caused by one Photometer displayed. Tests to determine the presence or concentration of urea nitrogen or blood glucose as described in the examples of US Pat. No. 3,476,515 are common examples of this type of analysis.
In einigen Fällen jedoch verlieren diese Tests ihre Wirksamkeit, da die zur Erzeugung der gewünschten Reaktion verwendeten Reagentien mit den in der flüssigen Probe vorhandenen Makromolekülen reagieren. Diese Reaktionen stören die Analyse gewöhnlich dadurch, daß sie einen Niederschlag erzeugen, der die flüssige Probe so trübe macht, daß die photometrische Analyse unzuverlässig wird. Das Problem ist besonders gravierend, wenn die flüssige Probe eine Körperflüssigkeit ist, wobei in diesem Falle das störende Makromolekül gewöhnlich ein Proteinmolekül ist. Infolgedessen ist es bei vielen analytischen Routinetests nötig, vor der Analyse die Makromoleküle auf chemischem Wege ausIn some cases, however, these tests lose their effectiveness as they are used to generate the desired Reagents used in the reaction react with the macromolecules present in the liquid sample. These reactions usually perturb the analysis by producing a precipitate which the makes the liquid sample so cloudy that the photometric analysis becomes unreliable. The problem is special serious if the liquid sample is a body fluid, in which case the disruptive macromolecule is usually a protein molecule. As a result, many routine analytical tests require that the Analysis of the macromolecules by chemical means
der flüssigen Probe zu entfernen. Wenn die Analyse mit der Hand durchgeführt wird, kann die Entfernung der Makromoleküle durch Ausfällen und Zentrifugieren erreicht werden. Bei der Anwendung automatischer Instrumente ist jedoch ein derartiges Vorgehen unpraktisch. Die Notwendigkeit im Rahmen eines automatischen Verfahrens Makromoleküle aus Probeflüssigkeiten vor der Analyse zu entfernen, wurde bei der Entwicklung automatischer Analyseninstrumente früh erkannt L. T. Skeggs nahm das Problem in Angriff (vergl. US-Patentschrift 27 97 149), indem er eine Dialysevorri'.-htung in sein Instrument einbaute, die dazu diente, das, was er als »kristalloide« Bestandteile bezeichnete, aus einer Lösung zu entfernen, die aus »kristalloiden« und »nicht-kristalloiden« (oder kolloidalen) Bestandteilen, im Verhältnis zum Anteil der kristalloiden Substanz in der Flüssigkeit, bestand. Diese Technik ist von einem mehr oder weniger kontinuierlichen Fließen der Probenflüssigkeit abhängig und daher zur Anwendung bei der diskontinuierlichen Analyse unpraktisch. Außerdem hat diese Techm* mehrere eindeutige Nachteile. Da eine Dialyse von der Diffusion der kristalloiden Bestandteile durch eine semipermeable Membran abhängig ist, handelt es sich um einen langsamen Prozeß, bei dem mehr flüssige Probe als für die Analyse erforderlich ist, in das Instrument eingebracht werden muß, damit eine ausreichende Menge der flüssigen Probe, die in einer vernünftigen Zeitdauer analysiert werden soll, durch die Mt nibran geht.to remove the liquid sample. If the analysis is with Macromolecules can be removed by precipitation and centrifugation can be achieved. However, such an approach is used when using automatic instruments impractical. The need for macromolecules from sample liquids as part of an automated process to remove prior to analysis has been used in the development of automatic analysis tools recognized early on L. T. Skeggs tackled the problem (See. US Pat. No. 2,797,149) by installing a dialysis device in his instrument, which for this purpose served to remove what he called "crystalloid" constituents from a solution that was made up of "Crystalloid" and "non-crystalloid" (or colloidal) Components, in relation to the proportion of the crystalloid substance in the liquid, existed. These Technology is dependent on a more or less continuous flow of the sample liquid and therefore impractical for use in discontinuous analysis. In addition, this techm * has several clear disadvantages. As a dialysis of the diffusion of the crystalloid constituents through a semipermeable Membrane dependent, it is a slow process in which more liquid sample than for the analysis required must be introduced into the instrument so that sufficient Amount of the liquid sample to be analyzed in a reasonable amount of time by the Mt nibran goes.
Auch bei der Anwendung des in der DE-OS 14 98 959 beschriebenen automatischen Analysierger äts werden störende Komponenten aus der zu analysierenden Probe durch Ausfällen mit einem Fällungsreagens und Abfiltrieren des Niederschlags entfernt. Dabei treten 3; zwangsläufig die obigen Nachteile auf.Also when using the automatic analyzer described in DE-OS 14 98 959 are äts interfering components from the sample to be analyzed by precipitation with a precipitation reagent and Filtering off the precipitate removed. Thereby 3; inevitably have the above disadvantages.
Auch die Verwendung bestimmter Ionenaustauscherharze zur Adsorption von Makromolekülen, insbesondere von Proteinmolekülen, ist bekannt. Dieser Vorgang stellt die Grundlage der Proteinchromatographie dar, wobei Proteinmoleküle zuerst durch eine lonenaustauscherkolonne aus der Trägerflüssigkeit entfernt werden, dann in der Kolonne getrennt und schließlich selektiv aus der Kolonne eluiert werden. In einem Artikel im Technicon Symposium über »Automation in Analytic Chemistry« (1966), veröffentlicht von Mediad, beschreibt D. L. Bettner eine ähnliche Anwendung von lonenaustauscherharzen bei der Bestimmung von Serumthyroxin. Die Methode besteht darin, daß Aminosäuren, einschließlich Thyroxin und Thyronin, auf dem Harz adsorbiert werden, dann die Proteinmoleküle und andere Verunreinigungen unter Verwendung einer Reihe von Acetatlösungen aus dem Harz eluiert werden und schließlich das Thyroxin und Thyronin unter Anwendung einer Essigsäurewäsche aus dom Harz eluiert werden. Das Schlußeluat, welches das zu analysierende Material enthält, wird aufgefangen und automatisch auf Jodgehalt analysiert.Also the use of certain ion exchange resins for the adsorption of macromolecules, in particular of protein molecules is known. This process is the basis of protein chromatography, where protein molecules are first removed from the carrier liquid by an ion exchange column, then separated in the column and finally selectively eluted from the column. In an article in the Technicon Symposium on "Automation in Analytic Chemistry" (1966) published by Mediad describes D. L. Bettner a similar application of ion exchange resins in the determination of Serum thyroxin. The method is to put amino acids, including thyroxine and thyronine, on adsorbed onto the resin, then the protein molecules and other contaminants using a Series of acetate solutions are eluted from the resin and finally the thyroxine and thyronine are below Applying an acetic acid wash can be eluted from dom resin. The key eluate which this to material to be analyzed is collected and automatically analyzed for iodine content.
Diese bekannte Methode ist daher durch die Tatsache gekennzeichnet, daß das zu analysierende Material zuerst vollständig aus einer Trägerflüssigkeit durch Adsorotion auf dem Harz entfernt wird und dann durch Eluieren aus dem Harz gewonnen wird. Die Trägerflüssigkeit wird verworfen und wenn das zu analysierende Material schließlich zur Analyse gebracht wird, befindet b5 es sich in einer Flüssigkeit, die vom ursprünglichen Medium verschieden ist.This known method is therefore characterized by the fact that the material to be analyzed is first completely removed from a carrier liquid by adsorotion on the resin and then by Elute from the resin is recovered. The carrier liquid is discarded and if that is to be analyzed Material is finally brought for analysis is located at b5 it is in a liquid that is different from the original medium.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Vorbereitung einer störende makromolekulare Bestandteile enthaltenden flüssigen Probe für die automatische Analyse auf einen besonderen Bestandteil zu schaffen, wobei eine möglichst geringe Menge an flüssiger Probe benötigt wird und die unerwünschten geladenen Makromoleküle selektiv ausgefiltert werden können, ohne daß Probeflüssigkeit oder eine wesentliche Menge des erwünschten Makromolekülgehalts entfernt wird.The invention is based on the object of a method and a device for preparing a interfering macromolecular components containing liquid sample for the automatic analysis on a to create a special component, whereby the smallest possible amount of liquid sample is required and the undesired charged macromolecules can be selectively filtered out without the need for sample liquid or a substantial amount of the desired macromolecule content is removed.
Die Erfindung wird durch die Patentansprüche wiedergegeben.The invention is represented by the claims.
Erfindungsgemäß werden mit Hilfe des selektiven lonenaustauschermediums praktisch alle störenden Makromoleküle entfernt, während praktisch nichts von dem besonderen Bestandteil verlorengeht.According to the invention, with the aid of the selective ion exchange medium, practically all of the interfering Macromolecules are removed while virtually none of the particular ingredient is lost.
Erfindungsgemäß können je nach den Analysenerfordernissen verschiedene geladene Makromoleküle entfernt werden, indem man das lonenaustauscherharz so wählt, daß es selektiv (gewöhnlich aufgrund der Ladung) das gewünschte Makromolekül entfernt und den Rest der flüssigen Probe unbeeinflußt läßt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform, die brauchbar ist, wenn das Makromolekül ein Proteinmolekül oder ein anderes Zwitterion ist, dessen Ladung vom pH-Wert des Mediums abhängt, in welchem es vorliegt, wird der pH-Wert der flüssigen Probe so eingestellt, daß das Makromolekül für die selektive Entfernung aus der flüssigen Probe die richtige Ladung besitzt.According to the invention, different charged macromolecules can be removed depending on the analysis requirements by choosing the ion exchange resin so that it is selective (usually due to the charge) removes the desired macromolecule and leaves the remainder of the liquid sample unaffected. At a preferred embodiment which is useful when the macromolecule is a protein molecule or other zwitterion whose charge depends on the pH of the Depending on the medium in which it is present, the pH of the liquid sample is adjusted so that the Macromolecule has the correct charge for selective removal from the liquid sample.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt eine lonenaustauscheinrichtung, die ein selektives lonenauslauschermedium enthält, das so beschaffen ist, daß es im wesentlichen alle geladenen Makromoleküle wenigstens eines Typs aus der flüssigen Probe entfernt und eine Probeentnahmeeinrichtung, die so beschaffen ist, daß sie die flüssige Probe aus einem Probenbehälter entnimmt und praktisch vollständig durch das lonenaustauschermedium in eine Reaktionskammer drückt. Das lonenaustauschermedium kann positiv und/oder negativ geladene Ionenaustauscherharze enthalten, so daß positiv und/oder negativ geladene Makromoleküle entfernt werden können. Verschiedene Typen von lonenaustauscherharzen, wie Celluioseionenanstauscherharzc oder Dextranionenaustauscherharze. sind geeignet. Bei einer Ausführungsform wird das lonenaustauschermedium mit einer ersten Menge Verdünnungsmittel gesättigt und die flüssige Probe wird durch das lonenaustauschermedium gedrückt, indem man eine zweite Menge von entweder dem gleichen oder einem anderen Verdünnungsmittel hinter der flüssigen Probe in das lonenaustauschermedium einführt, so daß es im wesentlichen die gesamte flüssige Probe verdrängt und eine der zweiten Verdünnungsmittelmenge entsprechende Menge Verdünnungsmittel in das Reaktionsgefäß gelangt. Da im wesentlichen die gesamte flüssige Probe durch das lonenaustauschermedium in das Analysiergerät gelangt, kann eine kleinere Ausgangsmenge an flüssiger Probe verwendet werden. Da ferner als lonenaustauscheinrichtung eine kleine billige Patrone verwendbar ist, kann die flüssige Probe durch eine austauschbare Patrone in das automatische Analysiergerät eingeführt werden, wodurch das Problem der Verunreinigung umgangen wird.The device according to the invention comprises an ion exchange device which is a selective ion exchange medium which is such that it contains at least substantially all of the charged macromolecules of a type removed from the liquid sample and a sampling device designed to that it takes the liquid sample from a sample container and practically completely through the ion exchange medium pushes into a reaction chamber. The ion exchange medium can be positive and / or negative contain charged ion exchange resins, so that positively and / or negatively charged macromolecules can be removed. Various types of ion exchange resins such as cellulose ion exchange resin c or dextranion exchange resins. are suitable. In one embodiment, the ion exchange medium is saturated with a first amount of diluent and the liquid sample is passed through the ion exchange medium pressed by adding a second amount of either the same or a introduces other diluent behind the liquid sample in the ion exchange medium so that it is in the essentially displaces the entire liquid sample and a corresponding amount of the second diluent Amount of diluent reaches the reaction vessel. Because essentially all of the liquid Sample entering the analyzer through the ion exchange medium can have a smaller initial quantity can be used on liquid samples. Furthermore, as an ion exchange device, it is a small, inexpensive cartridge is usable, the liquid sample can be inserted into the automatic analyzer through a replaceable cartridge can be introduced, thereby circumventing the problem of contamination.
Die vorliegende Methode besitzt einen Vorteil gegenüber der bekannten Methode von Bettner, insbesondere, wenn sie in Verbindung mit einem automatischen Analysiergerät angewendet werden soll, weil keine intermediären Beseitigungs- und Gewinnungsstufen erforderlich sind. Die flüssige Probe wirdThe present method has an advantage over the known Bettner method, especially if it is to be used in conjunction with an automatic analyzer, because no intermediate removal and recovery steps are required. The liquid sample will
direkt durch das lonenaustauschermedium, welches die unerwünschten Makromoleküle entfernt, in die Reaktionskammer geschickt. Trotz dieses Vorteiles muß jedes Verfahren, das ein lonenaustauschermedium zur Entfernung geladener Makromoleküle aus einer flüssigen Probe benutzt, das in ein automatisches Instrument integriert werden soll, wenigstens zwei Probleme lösen, die es nicht gibt, wenn die Entfernung vor der Einführung der flüssigen Probe in das Instrument vorgenommen wird. Vor allem muß die Methode im wesentlichen alle unerwünschten Makromoleküle beseitigen, und sie muß es in den von dem Instrument gesetzten Grenzen von Zeit und Raum erledigen. Das Medium, durch welches die flüssige Probe geht, kann nur einige Zentimeter lang sein, wenn es ein integrierter Bestandteil des Instrumentes sein soll, und die Zeit, welche die flüssige Probe benötigt, um durch das Medium zu gehen, kann einige Minuten nicht übersteigen, ohne die Leistungsfähigkeit des Instrumentes signifikant zu beeinträchtigen. Das zweite Problem, das die vorliegende Erfindung bewältigen muß, ist das Problem, wie man die flüssige Probe in einer Form zur Reaktionskammer bringt, die für die Analyse nach einem automatisierten Verfahren geeignet ist, das aufgrund seines Charakters mit genauen vorbestimmten Volumina und Konzentrationen der zu analysierenden Probe und der bei der Analyse verwendeten Reagentien fertig werden muß. Normalerweise wird die Probenflüssigkeit mit einem Verdünnungsmittel vermischt, bevor man die Reagentien zugibt. Wenn das zur Entfernung der störenden Makromoleküle verwendete Hilfsmittel die Konzentration der flüssigen Probe in der Mischung in einer nicht vorhersagbaren Weise ändert, kann die Analyse nicht mit Genauigkeit automatisch durchgeführt werden. Bisher waren die Fachleute der Ansicht, daß eine weitgehende Beseitigung von Makromolekülen, wie Proteinmolekülen, aus einer flüssigen Probe nicht unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen in den durch die Automation gezogenen zeitlichen und räumlichen Grenzen durchgeführt werden kann, ohne die Eigenschaften oder die Konzentration der flüssigen Probe wesentlich zu verändern.directly through the ion exchange medium, which removes the undesired macromolecules, into the reaction chamber sent. Despite this advantage, any method that uses an ion exchange medium for Removal of charged macromolecules from a liquid sample used in an automated instrument should be integrated to solve at least two problems that do not exist if the removal before the Introduction of the liquid sample into the instrument is made. Above all, the method in the essentially eliminate all unwanted macromolecules and they must be present in those of the instrument set limits of time and space. The medium through which the liquid sample passes can only be a few centimeters long if it is to be an integral part of the instrument, and the time which the liquid sample needs to pass through the medium cannot exceed a few minutes, without significantly impairing the performance of the instrument. The second problem, that the present invention must overcome the problem of how to get the liquid sample in a form Brings reaction chamber that is suitable for analysis by an automated process that due to its character with precise predetermined volumes and concentrations of those to be analyzed Sample and the reagents used in the analysis must be prepared. Usually the sample liquid mixed with a diluent before adding the reagents. If that for distance of the interfering macromolecules used aids the concentration of the liquid sample in the mixture changes in an unpredictable manner, the analysis cannot be performed automatically with accuracy will. So far, the experts were of the opinion that an extensive elimination of macromolecules, like protein molecules, not using ion exchange resins in a liquid sample the temporal and spatial limits drawn by automation can be carried out without Substantially change the properties or the concentration of the liquid sample.
Durch die vorliegende Erfindung wird eine wesentliche Entfernung der störenden Makromoleküle durch die Verwendung eines lonenaustauschermediums erreicht, das so angepaßt ist, daß es nur auf die gewünschten Makromoleküle einwirkt, so daß die verbleibende flüssige Probe unangegriffen durch das Ionenaustauschermedium geschickt werden kann. Eine kurze Kolonne des richtigen lonenaustauschermediums beseitigt wirkungsvoll im wesentlichen das gesamte makromolekulare Material und man fand, daß die flüssige Probe in weniger als 2 Minuten vollständig durch die Kolonne geschickt werden kann, wenn man die flüssige Probe unter Druck durch die kurze lonenaustauscherkolonne preßt Die flüssige Probe wird gewöhnlich durch die Kolonne gepreßt, indem man unter Druck hinter der Probe ein Verdünnungsmittel verwendet und in einer Ausführungsform wird die Kolonne zuerst mit dem gleichen oder einem anderen Verdünnungsmittel als demjenigen, das zum Durchdrücken der flüssigen Probe durch die Kolonne verwendet wird, gesättigt Wenn die richtige Menge Verdünnungsmittel verwendet wird, geht die ganze flüssige Probe und eine bekannte Menge Verdünnungsmittel in die Reaktionskammer, so daß keine Unsicherheit über die Konzentration oder die Eigenschaften der Mischung in der Reaktionskammer besteht The present invention achieves substantial removal of the interfering macromolecules through the use of an ion exchange medium which is adapted to act only on the desired macromolecules so that the remaining liquid sample can be passed through the ion exchange medium unaffected. A short column of the proper ion exchange medium effectively removes essentially all macromolecular material, and it has been found that the liquid sample can be completely passed through the column in less than 2 minutes by forcing the liquid sample under pressure through the short ion exchange column. The liquid sample is usually forced through the column using a diluent under pressure behind the sample, and in one embodiment the column is first saturated with the same or a different diluent than that used to force the liquid sample through the column If the correct amount of diluent is used, all of the liquid sample and a known amount of diluent will go into the reaction chamber so that there is no uncertainty about the concentration or properties of the mixture in the reaction chamber
Andere Vorteile und die Arbeitsweise der vorliegenden Erfindung werden anhand der Figuren dargelegt:Other advantages and the mode of operation of the present invention are illustrated with reference to the figures:
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer einfachen Ausführungsform eines automatischen Analysiergeräts, das eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Probenvorbereitung umfaßt;Fig. 1 is a schematic representation of a simple embodiment of an automatic analyzer, which comprises a device according to the invention for sample preparation;
Fig.2 ist ein Querschnitt durch eine lonenaustauscherkolonne, die als lonenaustauscheinrichtung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung im Rahmen eines2 is a cross section through an ion exchange column, as an ion exchange device of a device according to the invention in the context of a
ίο automatischen Analysiergeräts, wie es in Fig. 1 dargestellt ist, verwendet werden kann; undίο automatic analyzer, as shown in Fig. 1 shown can be used; and
Fig. 3 ist eine Darstellung einer analytischen Testpackung für die Verwendung in einem automatischen
Analysiergerät, das eine erfindungsgemäß ausgebildete Ionenaustauscherkolonne, eine Reaktionskammer
und Analysenreagentien umfaßt.
Es folgt eine Beschreibung der Zeichnungen.
In Fig. 1 ist die zu analysierende Flüssigkeit anfangs
in dem Probenbehälter 11 enthalten. Ein Teil der flüssigen Probe wird mit Hilfe der Pumpe 13 aus diesem
Behälter in die Sonde 12 hochgezogen und unter so viel
Druck in die lonenaustauscherkolonne 14 entleert, daß sie ganz durch das in der Kolonne enthaltene
lonenaustauschermedium 21 geht und in kurzer Zeit in die Reaktionskammer 15 austritt. Ein Weg, der
gewährleistet, daß die gesamte flüssige Probe durch die Kolonne geht, ist der, daß die Pumpe genügend
Verdünnungsmittel einsaugt, bevor die flüssige Probe eingesaugt wird, so daß die flüssige Probe durch den
Druck des hinter ihr eintretenden Verdünnungsmittels durch die Kolonne gedrückt wird. Wenn das in der
Kolonne enthaltene lonenaustauschermedium trocken ist, kann es etwas schwierig sein, sicherzustellen, daß die
gesamte flüssige Probe durch die Kolonne geht, da etwas von der Probe in einer Weise durch das Medium
absorbiert werden kann, die eine Verdrängung erschwert. Vermutlich wird, falls genügend Verdünnungsmittel
verwendet wird, im wesentlichen die gesamte flüssige Probe aus der Kolonne gewonnen; es gibt
jedoch einen einfacheren Weg zur Erreichung des gleichen Ergebnisses, wobei man nur eine geringe
Menge Verdünnungsmittel benutzt. Die Kolonne wird zuerst mit einer ersten Menge Verdünnungsmittel
gesättigt. Die Pumpe 13 zieht eine zweite Menge des gleichen oder eines anderen Verdünnungsmittels in die
Sonde hinein und zieht dann die gewünschte Menge flüssige Probe hinter dem Verdünnungsmittel in die
Sonde. Sobald der Inhalt der Sonde in die Ionenaustauscherkolonne injiziert wird, tritt zuerst die flüssige
Probe in die Kolonne aus und danach das Verdünnungsmittel. Sowie die Flüssigkeit in der Sonde in die Kolonne
eingeführt wird, verdrängt sie die bereits in der Kolonne vorhandene Flüssigkeit Wenn die zweite Menge an in
die Sonde gezogenem Verdünnungsmittel größer als die erste Verdünnungsmittelmenge ist die ursprünglich in
der Kolonne enthalten war, wird mit dem Eintreten des Sondeninhalts in die Kolonne die erste Verdünnungsmittelmenge zuerst aus der Kolonne verdrängt, dann
wird die flüssige Probe verdrängt und es folgt der Teil der zweiten Verdünnungsmittelmenge, der die Sättigungskapazität der Kolonne übersteigt Am Ende der
Pumpwirkung ist praktisch die gesamte flüssige Probe und eine Verdünnungsmittelmenge, die der zweiten
Verdünnungsmittelmenge entspricht in die Reaktions kammer ausgelaufen, so daß die genaue in die
Reaktionskammer eingebrachte Flüssigkeitsmenge und die Konzentration der Probe in der Flüssigkeit in dei
Reaktionskammer gesteuert werden können. Dann Fig. 3 is an illustration of an analytical test pack for use in an automatic analyzer comprising an ion exchange column constructed in accordance with the invention, a reaction chamber, and analytical reagents.
A description of the drawings follows.
In FIG. 1, the liquid to be analyzed is initially contained in the sample container 11. A part of the liquid sample is drawn up from this container into the probe 12 with the aid of the pump 13 and emptied into the ion exchange column 14 under so much pressure that it passes completely through the ion exchange medium 21 contained in the column and into the reaction chamber 15 in a short time exit. One way to ensure that all of the liquid sample passes through the column is to have the pump draw in sufficient diluent before the liquid sample is drawn in so that the liquid sample is forced through the column by the pressure of the diluent entering after it will. If the ion exchange medium contained in the column is dry, it can be somewhat difficult to ensure that all of the liquid sample passes through the column because some of the sample can be absorbed by the medium in a manner that makes displacement difficult. Presumably, if sufficient diluent is used, essentially all of the liquid sample will be recovered from the column; however, there is an easier way to achieve the same result using only a small amount of diluent. The column is first saturated with a first amount of diluent. The pump 13 draws a second amount of the same or a different diluent into the probe and then draws the desired amount of liquid sample behind the diluent into the probe. As soon as the contents of the probe are injected into the ion exchange column, the liquid sample first exits the column and then the diluent. And the liquid is introduced into the probe into the column, it displaces the existing already in the column liquid when the second amount of drawn in the probe diluent is greater than the first amount of diluent which was originally contained in the column is charged with the occurrence of the Probe contents into the column, the first amount of diluent is first displaced from the column, then the liquid sample is displaced and that part of the second amount of diluent that exceeds the saturation capacity of the column follows second amount of diluent corresponds to leaked into the reaction chamber, so that the exact amount of liquid introduced into the reaction chamber and the concentration of the sample in the liquid in the reaction chamber can be controlled. then
werden verschiedene Reagentien aus den Reagentienkammern 16, 17 und 18 in die Reaktionskatnmer eingeführt, um eine Reaktion zu verursachen, und nach einer bestimmten Zeit wird die Lichtdurchlässigkeit der Flüssigkeit in der Reaktionskammer oder die Änderung der Lichldurchlässigkeit über einen bestimmten Zeilraum photometrisch gemessen, indem man die Flüssigkeit mit der Lichtquelle 20 bestrahlt und die Intensität des durchgetretenen Lichtes mit dem Photometer 19 mißt. Anstelle der photometrischen Analyse können zur Bestimmung der Konzentration des besonderen Bestandteils auch andere analytische Verfahren, wie die kolorimetrische Analyse, herangezogen werden.various reagents are removed from the reagent chambers 16, 17 and 18 introduced into the reaction chamber to cause a reaction, and after a certain time will be the transparency of the liquid in the reaction chamber or the change the light transmission over a certain cell space is measured photometrically by looking at the liquid irradiated with the light source 20 and the intensity of the light which has passed through with the photometer 19 measures. Instead of photometric analysis you can use it to determine the concentration of the particular ingredient other analytical methods, such as colorimetric analysis, can also be used.
Ein Analysiergerät, das besonders gut an das erfindungsgemäße Verfahren angepaßt ist, ist in der is DE-OS 19 41 506 beschrieben. Eine spezielle Probenübertragungsvorrichtung, die sich ebenfalls besonders gut für die Zwecke der Erfindung eignet, ist in der DE-OS 19 41 481 beschrieben.An analyzer which is particularly well adapted to the method according to the invention is shown in the is DE-OS 19 41 506 described. A special sample transfer device that is also special Well suited for the purposes of the invention is described in DE-OS 19 41 481.
Da die Ionenaustauscheinrichtung in einem automatisehen Instrument verwendet werden soll, muß das Instrument so konzipiert sein, daß in einem Zeitraum, der genügend kurz ist, daß er mit den anderen Arbeitsschritten des Instrumentes im Einklang steht, die flüssige Probe durch das Ionenaustauschermedium geht und praktisch alle gewünschten Makromoleküle entfernt werden. Da die meisten analytischen Instrumente dazu bestimmt sind, ihre Analysen in einer Zeit im Bereich von 10 bis 20 Minuten durchzuführen, muß die vorliegende Erfindung so geplant sein, daß die flüssige Probe nicht mehr als einige Minuten und vorzugsweise weniger als 1 Minute im lonenaustauschermedium verbringt. Eine Ausdehnung dieses Zeitraumes wird die zeitsparenden Merkmale des automatisierten Instrumentes wesentlich beeinträchtigen. In der lonenaustau-Scherchromatographie dauert es gewöhnlich mehr als 2 Stunden, bis die Flüssigkeit durch die Kolonne gegangen ist. Um diesen Zeitraum zu verkürzen, wurde die in der vorliegenden Erfindung verwendete Kolonne erheblich gekürzt und die flüssige Probe wird unter Druck, vorzugsweise im Bereich von 0,07 bis 7 kg/cm2, durch die Kolonne gedrückt. Dies bedeutet, daß eine Pumpe verwendet werden muß, um die Flüssigkeit direkt in die lonenaustauscherkolonne zu drücken und die Ionenaustauscherkolonne muß so gebaut sein, daß der Weg von der Pumpe zur Ausflußstelle und in die Reaktionskammer praktisch dicht ist, so daß die von der Pumpe entwickelte Druckkraft dazu verwendet wird, die Flüssigkeit durch die Kolonne zu drücken und nicht durch Löcher im System verloren geht. Wie in F i g. 1 dargestellt ist, ist die lonenaustauscherkolonne ein Rohr mit einer Eintrittssteile 22, die so gebaut ist, daß sie sich dicht mit der Sonde 12 verbindet. Weiter unten ist ein bevorzugter Weg beschrieben, wie man dies erreicht.Since the ion exchange device is to be used in an automatic instrument, the instrument must be designed so that the liquid sample passes through the ion exchange medium and practically all of it in a period of time which is short enough to be consistent with the other operations of the instrument desired macromolecules are removed. Since most analytical instruments are designed to perform their analyzes in a time in the range of 10 to 20 minutes, the present invention must be designed so that the liquid sample does not spend more than a few minutes, and preferably less than 1 minute, in the ion exchange medium. Extending this time period will significantly affect the time-saving features of the automated instrument. In ion exchange shear chromatography, it usually takes more than 2 hours for the liquid to pass through the column. In order to shorten this period of time, the column used in the present invention has been shortened considerably and the liquid sample is forced through the column under pressure, preferably in the range of 0.07 to 7 kg / cm 2. This means that a pump must be used to push the liquid directly into the ion exchange column and the ion exchange column must be constructed in such a way that the path from the pump to the outflow point and into the reaction chamber is practically tight so that that developed by the pump Compressive force is used to push the liquid through the column and is not lost through holes in the system. As in Fig. As shown in FIG. 1, the ion exchange column is a tube having an inlet portion 22 which is constructed so that it connects to the probe 12 in a sealed manner. A preferred way of doing this is described below.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Ionenaustauscheinrichtung kann in jeder Form vorliegen, die bei spezieller Instrumentenausführung für den Gebrauch geeignet ist Wie in den Figuren dargestellt, ist es eine lonenaustauscherkolonne 14, die mit einem lonenaustauschermedium 21 gefüllt ist Das Ionenaustauschermedium kann irgendein Ionenaustauscherharz sein, das die Fähigkeit besitzt, die gewünschten geladenen Makromoleküle zu entfernen. Dieses ist im allgemeinen sin lonenaustauscherharz mit einer Ladung, welche derjenigen des zu entfernenden Makromoleküles entgegengerichtet ist Unter gewissen Umständen jedoch besitzt das Makromolekül eine Ladung, welche die gleiche ist wie diejenige eines Probebestandteiles, der nicht entfernt werden kann. In diesem Falle ist das Verfahren nicht langer geeignet. Aus diesem Grunde ist das Verfahren besonders brauchbar in einer Situation, wo das zu entfernende Makromolekül ein dipolares Ion oder Zwitterion ist, dessen Ladung vom pH des Mediums, in dem es vorliegt, abhängt. In diesem Falle kann der pH der flüssigen Probe oder der Mischung aus flüssiger Probe und Verdünnungsmittel bis zu dem Punkt verändert werden, wo die effektive Ladung des dipolaren Ions von derjenigen der gewünschten Bestandteile verschieden ist, so daß ein lonenaustauschermedium gefunden werden kann, das die Makromoleküle entfernt, ohne die gewünschten Bestandteile zu entfernen. Das Körperflüssigkeiten im allgemeinen Proteinmoleküle enthalten, die eine Art dipolares lon sind, findet das Verfahren seine brauchbarste Nutzanwendung in der Entfernung von Proteinmolekülen aus der flüssigen Probe vor der Analyse. Dann wählt man das lonenaustauscherharz nach seiner Fähigkeit aus, Proteinmoleküle aus der Flüssigkeit zu entfernen. Nicht alle Ionenaustauscherharze tun dies oder sie tun es wenigstens in einem Umfang, der sie leistungsfähig genug macht, um in dem automatisierten Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden. Um das Problem der Wechselwirkung der Proteinmoleküle mit den in der Analyse verwendeten Reagentien auszuschalten, müssen im wesentlichen alle störenden Proteinmoleküle aus der flüssigen Probe entfernt werden. In einigen Fällen genügt es, wenn 80% der Proteinmoleküle entfernt v/erden, in anderen müssen alle störenden Proteinmoleküle beseitigt werden. The ion exchange device used in the present invention can be in any form which is suitable for use with special instrument design As shown in the figures, it is an ion exchange column 14 which is filled with an ion exchange medium 21 The ion exchange medium can be any ion exchange resin that has the ability to produce the desired remove charged macromolecules. This is generally sin ion exchange resin with a charge which is opposite to that of the macromolecule to be removed Under certain circumstances however, the macromolecule has a charge which is the same as that of a sample component, which cannot be removed. In this case, the method is no longer suitable. For this Basically, the method is particularly useful in a situation where the macromolecule to be removed is a is a dipolar ion or zwitterion, the charge of which depends on the pH of the medium in which it is present. In this The pH of the liquid sample or the mixture of liquid sample and diluent can be the case can be changed to the point where the effective charge of the dipolar ion differs from that of the desired constituents is different, so that an ion exchange medium can be found which removes the macromolecules without removing the desired constituents. The body fluids in the generally contain protein molecules which are a kind of dipolar ion, the method finds its most useful Useful application in the removal of protein molecules from the liquid sample prior to analysis. The ion exchange resin is then selected based on its ability to remove protein molecules from the liquid remove. Not all ion exchange resins do this, or at least they do it to an extent that they do powerful enough to be used in the automated process of the present invention will. To solve the problem of the interaction of the protein molecules with those used in the analysis To turn off reagents, essentially all interfering protein molecules must be in the liquid sample removed. In some cases it is sufficient if 80% of the protein molecules are removed, in others all interfering protein molecules must be eliminated.
Die folgenden Ionenaustauscherharze haben sich als die leistungsfähigsten für die Entfernung von positiv geladenen Proteinmolekülen erwiesen:The following ion exchange resins have proven to be the most powerful for removing positive charged protein molecules proved:
1. Carboxymethylcellulose;1. carboxymethyl cellulose;
2. Carboxymethyldextran;2. carboxymethyldextran;
3. Sulfoäthylcellulose und Sulfatcellulose; und3. sulfoethyl cellulose and sulfate cellulose; and
4. Styroi-divinyibenzoisuifonsäure.4. Styrofoam-divinyibenzoic acid.
Die folgenden Ionenaustauscherharze haben sich als die leistungsfähigsten für die Beseitigung von negativ geladenen Proteinmolekülen erwiesen;The following ion exchange resins have proven to be the most powerful for eliminating negative charged protein molecules proved;
1. Diethylaminoethylcellulose; und1. Diethylaminoethyl cellulose; and
2. Diäthylaminoäthyldextran.2. Diethylaminoethyldextran.
Die folgenden Ionenaustauscherharze sind nicht getestet worden, es wird jedoch angenommen, daß sie für die Entfernung von Proteinmolekülen geeignet sind:The following ion exchange resins have not been tested but are believed to be suitable for the removal of protein molecules are:
1. Cellulosephosphat;1. cellulose phosphate;
2. Ecteolacellulose; und2. ecteolacellulose; and
3. Sulfoäthyldextran.3. Sulfoethyldextran.
Es sei darauf hingewiesen, daß diese Austauscher nur Beispiele für die Ionenaustauscherharztypen sind, die Proteinmoleküle wirkungsvoll beseitigen und im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht die einzigen wirkungsvollen Materialien darstellen sollen. Die meisten der obigen Ionenaustauscherharze können ganz allgemein als Cellulose-Ionenaustauscherharze oder Dextran-Ionenaustauscherharze beschrieben werden. Es ist zu erwarten, daß alle derartigen Harze in gewissem Umfang Proteinmoleküle entfernen, daß aber einige, unter denen die getesteten sind, leistungsfähiger sind als andere.It should be noted that these exchangers are only examples of the types of ion exchange resins that Effective elimination of protein molecules and not the only ones in the context of the present invention should represent effective materials. Most of the above ion exchange resins can can be described very generally as cellulose ion exchange resins or dextran ion exchange resins. All such resins are expected to remove some protein molecules, but that some, among which those tested, are more powerful are than others.
In einigen Fällen müssen sowohl positive als auch negative Proteinmoleküle aus der flüssigen Probe entfernt werden. In diesem Falle kann eine Zweikom-In some cases, you need both positive and negative protein molecules from the liquid sample removed. In this case a two-component
ponentenkolonne verwendet werden, wobei sie an einem Ende positive Ionenaustauscherharze und am anderen Ende negative Ionenaustauscherharze enthält. Die folgende Kombination hat sich als leistungsfähig erwiesen:Component column are used, with positive ion exchange resins at one end and positive ion exchange resins at one end the other end contains negative ion exchange resins. The following combination has been found to be powerful proven:
2Ii Sulfoäthylcellulose und
'AStyrol-divinylbenzolsulfonsaure. 2 Ii sulfoethyl cellulose and
'Astyrene-divinylbenzenesulfonic acid.
Es ist auch denkbar, daß auch integrale Gemische der beiden Harztypen eher als separate Regionen wirksam sein würden.It is also conceivable that integral mixtures of the two types of resin may also be effective as separate regions would be.
Fig.2 veranschaulicht eine einfache lonenaustauscherkolonne, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. In Fig. 2A enthält die Ionenaustauscherkolonne 14 ein einziges lonenaustauscherharz 21. In Fig.2B enthält die lonenaustauscherkolonne 14 ein positives Ionenaustauscherhan1: 21 und ein negatives lonenaustauscherharz 27. In beiden Fällen wird das Rohr 14 durch zwei Kautschukkappen 24 und 25 abgeschlossen, von denen eine eine Austrittsstelle 26 besitzt. Die Sonde 12, wie sie in dieser Anordnung dargestellt ist, ist eine Injektionsnadel, welche durch die Kautschukwand 24 unter Bildung einer dichten Verbindung zwischen der Sonde und der Kolonne eingeführt werden kann. Durch die Sonde gedrückte Flüssigkeit wird direkt durch die Kolonne und aus dem Ausgang 26 heraus in die Reaktionskammer gedrückt.Figure 2 illustrates a simple ion exchange column which can be used to practice the present invention. In Fig. 2A, the ion exchange column 14 includes a single ion-exchange resin 21. In Figure 2B contains the lonenaustauscherkolonne 14 a positive ion exchange Erhan 1: 21 and a negative ion exchange resin 27. In both cases the tube is finished 14 by two rubber caps 24 and 25, of which one has an exit point 26. The probe 12, as shown in this arrangement, is a hypodermic needle which can be inserted through the rubber wall 24 to form a sealed connection between the probe and the column. Liquid forced through the probe is forced directly through the column and out of exit 26 into the reaction chamber.
F i g. 3 veranschaulicht eine analytische Testpackung, wobei eine lonenaustauscherkolonne, eine Reaktionskammer und die in die Reaktionskanimer einzuführenden Reagentien allesamt in der gleichen Packung enthalten sind. Die Packung ist in der US-Patentschrift 24 76 515 beschrieben. Sie besteht aus einem festen Oberteil 30, an dem eine Tasche aus transparentem Kunststoffmaterial befestigt ist. Das Oberteil enthält eine lonenaustauscherkolonne 32 mit einer Eintrittsstelle 33 am einen Ende und einem Ausgang 35 am anderen Ende. Die lonenaustauscherkolonne ist durch Kautschukkappen 5! und 52 verschlossen, so daß cine Injektionsnadel in den Eingang 33 eingeführt werden kann, und die Kolonne wird so betrieben, wie es in Verbindung mit Fig.2 beschrieben worden ist. In diesem Falle jedoch geht die Ausgangsöffnung 35 in eine Reaktionskammer 36, die im transparenten Plastikbeutel durch einen Verschluß 53, der sich entlang der Peripherie des Beutels erstreckt, gebildet wird, wie es in der Zeichnung dargestellt ist. Die Reagentien in Form von Festsubstanzen oder Flüssigkeiten befinden sich in den Beuteln, die in der Reaktionskammer von zerbrechbaren Verschlüssen 37 und 42 gebildet werden. Die Reaktion wird eingeleitet, indem man die Reaktionskammer 36 bis zu dem Punkt zusammendrückt, wo die in ihr enthaltene flüssige Probe gegen die zerbrechlichen Verschlüsse gepreßt wird, wobei deren Zerbrechen verursacht wird und sich ihr Inhalt in die Reaktionskammer entleert Indem man einerseits bestimmte zerbrechliche Verschlüsse schützt und andere austauscht, können die richtigen Reagentien zur richtigen Zeit in die Reaktionskammer eingeführt werden. Wenn die Reaktion erst einmal ausgelöstF i g. 3 illustrates an analytical test pack, with an ion exchange column, a reaction chamber and the canisters to be introduced into the reaction chamber Reagents are all contained in the same pack. The packing is in US patent 24 76 515. It consists of a solid upper part 30 on which a bag made of transparent Plastic material is attached. The upper part contains an ion exchange column 32 with an entry point 33 at one end and an exit 35 at the other end. The ion exchange column is covered by rubber caps 5! and 52 locked so that cine Injection needle can be inserted into inlet 33 and the column is operated as in FIG Connection with Fig.2 has been described. In this case, however, the exit port 35 goes into a reaction chamber 36 which is contained in the transparent plastic bag by a closure 53 which extends along it extending the periphery of the bag, as shown in the drawing. The reagents in In the form of solids or liquids are contained in the bags that are in the reaction chamber of frangible seals 37 and 42 are formed. The reaction is initiated by placing the Reaction chamber 36 compresses to the point where the liquid sample contained in it against the fragile closures, causing them to break and their contents into the Reaction chamber emptied By protecting certain fragile closures on the one hand and exchanges others can use the correct reagents be inserted into the reaction chamber at the correct time. Once the reaction is triggered
worden ist, kann der Inhalt der Reaktionskammer nach dem in der DE-OS 19 41 572 beschriebenen Verfahren analysiert werden.has been, the contents of the reaction chamber according to the method described in DE-OS 19 41 572 to be analyzed.
Das in F i g. 3 veranschaulichte System ist ein in vieler Hinsicht bevorzugtes System, da eine separate lonenaustauscherkolonne mit jeder Testprobe verbunden ist und das ganze System, einschließlich der lonenaustauscherkolonne, nach beendeter Analyse beseitigt werden kann.The in Fig. 3 is one of many Preferred system in terms of its ability to connect to a separate ion exchange column for each test sample and the entire system, including the ion exchange column, can be disposed of after the analysis has ended can.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung. Es betrifft eine analytische Bestimmung, die ohne Beseitigung bestimmter makromolekularer Bestandteile, insbesondere von Proteinmolekülen, undurchführbar wäre.The following example illustrates the invention. It concerns an analytical determination that does not require elimination certain macromolecular constituents, especially protein molecules, would be impracticable.
Bestimmung von SerumphosphatDetermination of serum phosphate
Ein 6,35 mm χ 7,62 cm-Rohr wurde zu 1Ai mit Sulfoäthylcellulose gefüllt, die zuerst mit Wasser äquilibriert worden war und von der die Feinstbestandteile abdekantiert worden waren. Das restliche Viertel des Rohres wurde dann mit Styrol-divinylbenzolsulfonsäure gefüllt, die ebenfalls mit Wasser äquilibriert, von der die Feinstbestandteile entfernt und die mit 10%iger H2SO4 gewaschen worden war. Die saure Wäsche überführt die Styrol-divinylbenzolsulfonsäure aus der Natriuiiisalzform in die Wasserstoffionenform, so daß dieser Teil des Rohres sehr sauer ist und einen pH-Wert von 0,55 besitzt.A 6.35 mm χ 7.62 cm tube was filled to 1 Ai with sulfoethyl cellulose, which had first been equilibrated with water and from which the fines had been decanted off. The remaining quarter of the tube was then filled with styrene-divinylbenzenesulfonic acid, which was also equilibrated with water, from which the fines had been removed and which had been washed with 10% H2SO4. The acidic wash converts the styrene-divinylbenzenesulfonic acid from the sodium salt form into the hydrogen ion form, so that this part of the tube is very acidic and has a pH of 0.55.
Eine 5A-Probe eines handelsüblichen Bezugsseruins, welches eine bekannte Phosphatkonzentration enthielt, wurde durch die Kolonne titriert, wobei man 2,0 ml H2O als Eluiermittel verwendete. Es wurde ein Druck von etwa 1,76 kg/cm2 angewendet und man schickte 2,0 ml Probeflüssigkeit in 0,7 Minuten durch die Kolonne. Die Testreaktion ist eine gut bekannte Analyse, bei der 0,8 ml der Probeflüssigkeit anschließend mit den folgenden Reagentien kombiniert wurden:A 5A sample of a commercial reference seruine containing a known concentration of phosphate was titrated through the column using 2.0 ml of H2O as the eluant. A pressure of about 1.76 kg / cm 2 was applied and 2.0 ml of sample liquid was sent through the column in 0.7 minutes. The test reaction is a well known analysis in which 0.8 ml of the sample liquid was then combined with the following reagents:
0,8 ml 25%ige Trichloressigsäurelösung,0.8 ml of 25% trichloroacetic acid solution,
200 λ Ascorbinsäure,200 λ ascorbic acid,
0,5 ml Ammoniummolybdat und0.5 ml ammonium molybdate and
1,0 ml Arsenitcitrat.1.0 ml arsenite citrate.
Dann wurde die Absorption der Probeflüssigkeit bei 600 Ä gemessen. Wird die Absorption einer Blindprobe (H2O), die durch eine gleiche Kolonne geschickt worden ist, von dem Wert der Probenflüssigkeit subtrahiert, so liegt das Ergebnis dicht bei dem Absorptionswert, der für eine Vergleichsprobe aufgezeichnet wird, die die gleiche Menge an Phosphat enthält, wie es unten gezeigt wird. Die Absorption ist nicht in absolute Konzentrationen umgerechnet worden.Then the absorbance of the sample liquid was measured at 600 Å. If the absorption of a blank sample (H 2 O), which has been sent through the same column, is subtracted from the value of the sample liquid, the result is close to the absorption value recorded for a comparison sample which contains the same amount of phosphate as shown below. The absorption has not been converted into absolute concentrations.
pHpH
Absorption bei 600 ÄAbsorption at 600 Å
Vergleichcomparison
Probesample
BlindprobeBlank sample
638
1,26
UO 638
1.26
UO
0,100.10
0,1130.113
0,0170.017
Ohne die Proteinentfernung konnte der Test nicht durchgeführt werden.Without protein removal, the test could not be performed.
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