DE1924230A1 - Method for isolating orgotein from blood - Google Patents
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Description
1489114891
in Palo Alto (Kalifornien,USA)in Palo Alto (California, USA)
Verfahren zum Isolieren von Orgotein aus Method of isolating orgotein from
Blut .Blood.
Orgotein ist die vom "United States Adopted Name Council" einem reinen wasserlöslichen Protein ziemlich niedrigen Molekulargewichts, vorwiegend ui-helicaler Konfiguration, welches durch zwei bis vier Atome zweiwertiger Metalle, wie Mg, Fe, Cu, chelatisiert ist, zugeordnete freie Kurzbezeichnung. Bei Orgotein handelt es sich um ein physiologisch wirksames und nicht enzymatisch wirkendes Protein- -Metallchelat, welches bei der Behandlung von solchen Krankheiten eingesetzt werden kann, welche, wie beispielsweise Entzündungen, auf ein gestörtes. Immunisierungssystem des erkrankten Individuums zurückzuführen sind-(vgl. Huber et al, Abstracts Seventh Annual Meeting of the Society of Toxicology« Washington D.O., März 1968 Nr. 59» und Belgische Patent- * schrift Nr. 687 828). In der Belgischen'Patentschrift Nr. 687 828 ist die Isolierung des dort noch nicht als Orgotein bezeichneten Proteine aus Rihderleber im.einzelnen beschrieben} die U.S.A. Anmeldung Nr. 657 866 vom 2« August 1967 v betrifft eine Verbesserung dieses Verfahrens zwecks Erzielung höherer Ausbeuten. Die vorliegende Erfindung betrifft nun Orgotein is the free abbreviation assigned by the United States Adopted Name Council to a pure, water-soluble protein of fairly low molecular weight, predominantly of a ui-helical configuration, which is chelated by two to four atoms of divalent metals such as Mg, Fe, Cu. Orgotein is a physiologically active and non-enzymatically active protein- metal chelate, which can be used in the treatment of diseases that, such as inflammation, affect a disturbed. Immunization system of the sick individual can be traced back to - (see. Huber et al, Abstracts Seventh Annual Meeting of the Society of Toxicology "Washington DO, March 1968 No. 59" and Belgian patent * publication No. 687 828). In the Belgischen'Patentschrift no. 687828 the isolation of proteins not there yet called Orgotein described im.einzelnen from Rihderleber} the US application Ser. No. 657,866 from 2 «August 1967 v improvement relates to this process in order to obtain higher yields. The present invention now relates to
0P982 7/19 9 60P982 7/19 9 6
ein einfacher und mit geringeren Kosten durchzuführendes Verfahren zum Isolieren von Orgotein aus leichter zugänglicheren und billigeren Ausgangsstoffen.an easier and less costly one to do Process for isolating orgotein from more accessible and cheaper raw materials.
Orgotein ist ein seiner Struktur nadi helicales Protein u.zw. scheinen zumindest 80 # des Moleküls .\-helicale Konfiguration zu besitzen, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, daß im Molekül des Orgoteins weniger als 15 tf°i wahrscheinlich etwa 13 $, kettenabbrechender Aminosäurereste, wie Reste des Serins, Threonine, Prolins, Isoleucins und Cysteine, von den insgesamt vorliegenden Aminosäiireresten enthalten sind. Die durchschnittliche chemische Analyse des Orgoteins, also des Proteinchelats, ergibt 50,02 $ C, 7,92 jfc H, 25,55 0, 15,26 °ß> IT, 0,43 $> S, 0,00 $ P und weniger als 1 i* Asche« Die Prüfung eines aus Orgotein erhaltenen sauren Hydrolysates mittels typischer Zuckerreagentien spricht für die Anwesenheit von etwa 3 bis 4 # Kohlehydrate, berechnet als Glucose, iia Molekül, wobei das Kohlehydrat wahrscheinlich kovalent an das Protein gebunden ist. Orgotein enthält weniger als 0,01 $ Lipoidphosphor, weniger als 0,1 $ Cholesterin, weniger als 0,05 $> Galactolipoid und höchstens nicht nachweisbare Mengen an wasserlöslichen Glycolipoiden.Orgotein is one of its structure nadi helical protein u.zw. seem at least 80 # of the molecule. \ - to have helical configuration, which is probably due to the fact that in the molecule of Orgoteins less than 15 tf ° i probably about $ 13, chain terminating amino acid residues, such as residues of serine, threonine, proline, isoleucine and Cysteines, are contained by the total amino acid residues present. The average chemical analysis of orgotein, i.e. the protein chelate, gives 50.02 $ C, 7.92 jfc H, 25.55 0, 15.26 ° ß> IT, 0.43 $> S, 0.00 $ P and less than 1 * i ash "the examination of an acidic hydrolyzate obtained from Orgotein means Zuckerreagentien typically speaks for the presence of about 3 to 4 # carbohydrates, calculated as glucose, iia molecule, wherein the carbohydrate is likely covalently bound to the protein. Orgotein contains less than $ 0.01 lipoid phosphorus, less than $ 0.1 cholesterol, less than $ 0.05> galactolipoid and at most undetectable amounts of water-soluble glycolipids.
Entsprechend neuesten Berechnungen besitzt'das im Orgotein enthaltene Protein ein Molekulargewicht von etwa 32,600 + + 10 $> und einschließlich des Kohlehydrats ein Molekularge-■wicht von etwa 34 000. Unter Berücksichtigung dieses Molekulargewichts des Orgoteins und dessen Aschegehalt von etwa 0,3 $> ergibt sich für das Proteinchelat Orgotein im Durchr schnitt ein Gehalt an insgesamt 235 Aminosäureresten und etwa 2 bis 4 Metallatomen (gram atoms of metals) pro Molekül.According to the latest calculations, the protein contained in orgotein has a molecular weight of about 32,600 + + 10 $> and, including the carbohydrate, a molecular weight of about 34,000. Taking into account this molecular weight of orgotein and its ash content of about 0.3 $> the protein chelate orgotein has an average of 235 amino acid residues and about 2 to 4 metal atoms (gram atoms of metals) per molecule.
Der Proteinanteil des Orgoteins enthält alle wesentlichen Aminosäuren, ist im wesentlichen frei von Cystin und enthält andere schwefelhaltige Reste nur in geringen Mengen u.zw. enthält es pro Molekül nur einen Cysteinrest und vier Methioninreete und keine sonstigen schwefelhaltigen Reste. The protein part of orgotein contains all essential amino acids, is essentially free of cystine and contains other sulfur-containing residues only in small amounts u.zw. it contains only one cysteine residue and four methionine reetes per molecule and no other sulfur-containing residues.
0 0 9 8 2 7/1996, * bad original0 0 9 8 2 7/1996, * bad original
Das Protein enthält außergewöhnlich wenig Reste des Serins ■ und Threonine, u.zw. etwa zwei Serinreste und etwa fünf Threoninreste pro Molekül. Im Protein überwiegen die freien basischen Gruppen (55 basische Gruppen, von welchen 11 von Argininresten, 26 von Lysinresten und 18 von Histidinresten zur Verfügung gestellt werden) die freien sauren Gruppen (31 saure Gruppen, welche von Asparaginsäure und Glutaminsäure zur Verfügung gestellt werden; 17 der 48 Reste von Asparaginsäure und Glutaminsäure sind zur Gänze in Form von Amiden im Protein gebunden), so daß sich ein ungewöhnlich niedriges Verhältnis, u.zw. ein Verhältnis von 0,564, von freien sauren Gruppen zu freien basischen Gruppen ergibt. In Tabelle I ist ein typisches Aminosäureprofil des Orgoteins für ein Molekulargewicht von 32 600 angegeben. Dieses Aminosäureprofil, gibt den Durchschnitt aus mehreren Versuchen und unter Einhaltung verschiedener Abbauzeiten an, wobei die von S. Moore et al. in Anal» Chenu 30, 1190, 1958, angegebene Methode und Norleucin als Standard verwendet wurde. . .The protein contains extremely few residues of the serine and threonine, u.zw. about two serine residues and about five threonine residues per molecule. In the protein, the free ones predominate basic groups (55 basic groups, of which 11 are from arginine residues, 26 from lysine residues and 18 from histidine residues available) the free acidic groups (31 acidic groups, those of aspartic acid and glutamic acid to provide; 17 of the 48 residues of aspartic acid and glutamic acid are entirely in the form of Amides bound in the protein), so that an unusually low ratio, u.zw. a ratio of 0.564, of gives free acidic groups to free basic groups. In Table I is a typical amino acid profile of the Orgoteins given for a molecular weight of 32,600. This amino acid profile is the average of several Attempts and in compliance with various degradation times, the by S. Moore et al. in Anal »Chenu 30, 1190, 1958, given method and norleucine was used as the standard. . .
Tabelle I
AminosäureprofilTable I.
Amino acid profile
Aminosäure . Aminosäurereste proAmino acid. Amino acid residues per
• Molekül (gerundet auf• Molecule (rounded to
: ganze Zahlen) : whole numbers)
Alanin 25Alanine 25
' Arginin . 11'Arginine. 11th
Asparaginsäure 25 .-■-■■' Cystin. 1/2 · Ί Aspartic Acid 25 .- ■ - ■■ 'Cystine. 1/2
Glutaminsäure 25Glutamic acid 25
Glycin ' 24Glycine '24
Histidin · 18Histidine 18
Isoleucin ' . 13Isoleucine '. 13th
Leucin 17Leucine 17
Lysin 27 Methionin '4Lysine 27 Methionine 4
Phenylalanin 9Phenylalanine 9
Prolin . 10Proline. 10
Serin 4Serine 4
Threonin 5Threonine 5
-.. Tryptophan . 1- .. tryptophan. 1
009827/1996009827/1996
Tabelle I (Fortsetzung)Table I (continued)
Tyrosin 1-2Tyrosine 1-2
Valin 24'Valine 24 '
-Amid-NHp - (15) . ■ *-Amid-NHp - (15). ■ *
Asche (He -Atome) 2-4Ash (He atoms) 2-4
Die angegebenen Werte beruhen auf dem Abbau mit HCC während 18, 24 und 72 Stunden unter Zugrundelegung eines Molekulargewichts des Proteins von 32 600.The values given are based on degradation with HCC for 18, 24 and 72 hours assuming a protein molecular weight of 32,600.
' Der isoelektrische Punkt des Protein-Metallehelats liegt bei einem pH-Wert von etwa 5»5 +_ 0,2 und der isoionische Punkt liegt bei einem pH-Wert von etwa 7,92+0,02. Der isoelektrische Punkt wurde durch Elektrophorese auf Celluloseacetat unter Verwendimg von Citrat-Phosphat- -Puffern verschiedenen pH-Werts ermittelte Der isoionische Punkt wurde nach der von Riddiford et al. in J. Biochem, 239» 1079» 1964f angegebenen Methode bestimmt. Hiebei wurde das Protein gründlich dialysiert und damit von allen Elektrolyten befreit und anschließend, gefriergetrocknet.The isoelectric point of the protein-metal helate is at a pH of about 5 »5 + _ 0.2 and the isoionic point Point is at a pH of about 7.92 + 0.02. The isoelectric point was determined by electrophoresis Cellulose acetate using citrate phosphate -Buffers of different pH-determined the isoionic Point was determined by the method proposed by Riddiford et al. in J. Biochem, 239 »1079» 1964f. Hiebei was the protein is dialyzed thoroughly and thus freed from all electrolytes and then freeze-dried.
Orgotein ergibt bei einem pH-Wert von 7 ein für Proteine typisches Infrarotspektrum.. In der folgenden Tabelle II sind Ultraviplettabsorptionsspektren des Grgoteins angegeben, welche bei einem pH-Wert von 1,5 in 0,05 n-HCl und in 0,05 n-HCl plus 0,10 m-KCljbei einem pH-Wert von 7 in Wasser, _bei einem pH-Wert von 7 in 0",05 m-Phosphatpuffer und bei pH 13 in 0,15 m-KCl (eingestellt auf pH15 mit 1 n-KOH) ermittelt wurden.Orgotein gives a value for proteins at pH 7 typical infrared spectrum .. In the following table II the ultraviplet absorption spectra of the Grgotein are given, which at a pH of 1.5 in 0.05 n-HCl and in 0.05 n-HCl plus 0.10 m-KClj at a pH value of 7 in water, _at a pH of 7 in 0 ", 05 m-phosphate buffer and at pH 13 in 0.15 m-KCl (adjusted to pH15 with 1 n-KOH) were determined.
-■-■■*- ■ - ■■ *
0 09827/19Ö60 09827 / 19Ö6
Ultraviolettabsoprionaspektren des OrgoteinsUltraviolet absorption spectra of orgotein
bzw·
rry.1nm
respectively·
rry.1
O7 560
mg/ mlT = 0.05
O 7 560
mg / ml
.0.434
mg/ mlT = 0.15
.0.434
mg / ml
300
295
290
28δ
284
233
282
281
280
279
278
277
276
27 δ
270
2ΰδ
260
2δδ
250
245
230310
300
295
290
28δ
284
233
282
281
280
279
278
277
276
27 δ
270
2ΰδ
260
2δδ
250
245
230
0.102
0.145
0.236
0.320
0.342
0.355
0,369
0,377
0,384
0,385
θ', 385
Ol 364
0l330
0'284
0,247
0,226
0.263
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0.320
0.342
0.355
0.369
0.377
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0.385
θ ', 385
Ol 364
0l330
0'284
0.247
0.226
0.263
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0,030
0.066
0.129
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Ol 226
0," 227
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Ol 226
0, "227
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1,00
•mg/mlH 2 O
1.00
• mg / ml
0,492
mg/mlBuffer
0.492
mg / ml
0.492
mg/mlKCl-KOIi
0.492
mg / ml
Oy090. ,
0.184
0.372 .
Ο.510
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Ol 560
Ol 570
θ'. 580 ·
θΐ58δ
Ol 590
Ol 592
01590
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Ol 538
0;475
θ'400
0.337
0,315
0,402
Ό-.1000.035
O y 090.,
0.184
0.372.
Ο.510
01540
Ol 560
Ol 570
θ '. 580
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Ol 590
Ol 592
01590
0.588
01580
Ol 538
0; 475
θ'400
0.337
0.315
0.402
Ό-.100
0.03
0.13
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0,22
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0,30
0,27
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0.845
ΐ',ΙδΟ
1J4S
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ΐ ', ΙδΟ
1J4S
1.70
009827/1996 ,009827/1996,
Bei pH 13,0 scheinen alle Tyrosylreste des Proteins unter spontaner Ionisierung dem Lösungsmittel frei zugänglich zu sein, wogegen bei einem pH-Wert von 1,5, selbst bei einer Ionenkonzentration von 0,05, die Tyrosylreste teilweise gegen einen Angriff von der Seite des Lösungsmittels her abgeschirmt sind. Das Proteinmolekül scheint damit im alkalischen Bereich stärker aufgefaltet zu sein*At pH 13.0 all of the tyrosyl residues of the protein appear to be freely accessible to the solvent with spontaneous ionization, whereas at a pH value of 1.5, even at an ion concentration of 0.05, the tyrosyl radicals partially resist attack from the solvent side are shielded. The protein molecule thus seems to be more unfolded in the alkaline range *
Bei einem pH-Wert von weniger als 5,5 erweist sich das Protein zunächst als im wesentlichen unlöslich, jedoch beginnt es sich bei einem pH-Wert von 2 wieder zu lösen und ist bei einem pH-Wert von 1,5 vollständig gelöst. Im Säuredifferenzspektrum sind die bei "292-294 nm auftretenden "_ Scheitel auf Tryptophan und die bei 285-287 nm auftretenden Scheitel der Hauptsache nach auf Tyrosin und zu einem sehr geringen Teil auf Tryptophan zurückzuführen, wobei Phenylalanin im Bereich von 250-265 nm Änderungen in der Feinstruktur des Spektrums bewirkt= Bas Säuredifferenzspektrum bei einer Ionenkonzentratlrm von 0,05 m ist wesentlich ver-v schieden vom Säuredifferensspektrum bei einer Ionenkonzentration von 0,15 m. Bei einer Ionenkonzentration von 0,05 m sind bei 280-296 nm keine definierte Scheitel festzustellen, jedoch zeigt sich bei 294-296 nm.ein Plateau und bei 285-290 nm, hinter einer niedriger liegenden Stufe bei 280-282 nm eine breite Schulter. Bei einer Ionenkoi^en-tration von 0,15 m zeigt sich bei 294-296 nm kein Scheitel und auch kein Plateau, jedoch erstreckt sich über den Bereich von 278-285 nm ein.breites welliges Plateau, wobei bei 286-290 nm eine Schulter feststellbar ist.At a pH of less than 5.5 the protein initially proves to be essentially insoluble, but it begins to dissolve again at a pH of 2 and is completely dissolved at a pH of 1.5. In the acid difference spectrum, the peaks occurring at "292-294 nm" are due to tryptophan and the peaks occurring at 285-287 nm are mainly due to tyrosine and to a very small extent to tryptophan, with phenylalanine changes in the range of 250-265 nm effected in the fine structure of the spectrum = Bas acid difference spectrum at a Ionenkonzentratlrm of 0.05 m is substantially comparable v secreted m from Säuredifferensspektrum at an ionic concentration of 0.15 at an ionic concentration of 0.05 m are. 280-296 nm with no defined The apex can be seen, but at 294-296 nm there is a plateau and at 285-290 nm, behind a lower step at 280-282 nm, a broad shoulder. At an ion concentration of 0.15 m there is no peak and also no plateau at 294-296 nm, but a broad, wavy plateau extends over the range from 278-285 nm, with one at 286-290 nm Shoulder is detectable.
Es scheint, daß das bei einem pH-Wert von 1,5 bei 292-296 nm auftretende Plateau auf eine Umgruppierung der Tryptophanreste im Prbteinmolekül zurückzuführen ist. Die bei 287-290 nm auftretende Schulter ergibt sich wahrscheinlich zum Teil durch die Tyrosinreste des Moleküls. Bei einer Ionenkonzentration von 0,15 ist das Tryptophan, im Gegensatz für den Fall einer Ionenkonzentration von 0,05, anscheinend nahezu abgeschirmt. Bei beiden lonenkon&entratxonenIt appears that the plateau occurring at pH 1.5 at 292-296 nm is due to a regrouping of the tryptophan residues in the sample molecule. The shoulder that appears at 287-290 nm is likely due in part to the tyrosine residues of the molecule. At an ion concentration of 0.15, in contrast to the case of an ion concentration of 0.05, the tryptophan is apparently almost shielded. In both ionic cones & entratxones
- 009827/1996 ßA0 original- 009827/1996 ßA0 original
sind die Spektren hinsichtlich der durch Tyros-in bewirkten Scheitel nahezu als abnormal zu bezeichnen. Der bei anderen Proteinen bei etwa 285 nm aufscheinende Scheitel fehlt bei einer Ionenkonzentration von 0,15 m und entartet bei einer Ionenkonzentration von 0,05 m zu einer nur schwach ausgeprägten Schulter. Das bei 284-288 nm feststellbare Spektrum spricht dafür, daß die Tyrosinreste im<Inneren des Proteinmoleküls eingeschlossen und damit dem Lösungsmittel nicht zugänglich sind. .are the spectra in terms of those caused by tyros-in Parting almost to be described as abnormal. The vertex appearing at around 285 nm in other proteins is missing in an ion concentration of 0.15 m and degenerates into an only weakly pronounced one at an ion concentration of 0.05 m Shoulder. The spectrum that can be determined at 284-288 nm suggests that the tyrosine residues are inside the protein molecule included and thus not accessible to the solvent. .
Bei der Gelscheibenelektrophorese auf Polyacrylamid und bei der Dünnschichtelektrophorese auf Agarose ergibt Orgotein drei schmale und nahe bei einander liegende Banden, die, bezogen auf den Ausgangspunkt, naher der Anode liegen. Diese Banden sind einfach und stets reproduzierbar und besonders geeignet zur Identifizierung des Orgoteins. Die Dünnschichtelektrophorese auf Argarose stellt eine Abänderung der von R.E. Phillips und F^.R. Blevitch in Progress in Clinical Pathology\ 1966, S. 62-153, beschriebenen Methode dar. Die Gelscheibenelektrophorese auf Polyacrylamid beruht auf den Arbeiten von Ornstein und Davis in Ann. N. Y. Acad. Sei. 121, 321 und 404, 1964 und von Williame und Reisfield in Nature, 195, 281, 1962.In gel-disk electrophoresis on polyacrylamide and in thin-layer electrophoresis on agarose, Orgotein produces three narrow and closely spaced bands which, based on the starting point, are closer to the anode. These bands are simple and always reproducible and are particularly suitable for identifying the orgotein. Thin-layer electrophoresis for argarose is a modification of that of RE Phillips and F ^ .R. Blevitch in Progress in Clinical Pathology \ 1966, pp. 62-153. The gel disk electrophoresis on polyacrylamide is based on the work of Ornstein and Davis in Ann. NY Acad. May be. 121, 321 and 404, 1964 and by Williame and Reisfield in Nature, 195, 281, 1962.
Aus Rinderblut isoliertes Orgotein scheint praktisch wenn nicht vollständig identisch zu sein mit &us Rinderleber isoliertem Orgotein, da die Molekulargewichte und der Metallgehalt gleich sind und schließlich auch die gleiche Wirkung feststellbar ist beim Rheumatoidfaktor-Agglutiniertest und beim Bioversuch nach Ungar die gleiche antiinflammatorische Wirkung feststellbar ist.Orgotein isolated from bovine blood seems useful if not to be completely identical to & us beef liver isolated orgotein, since the molecular weights and the metal content are the same and ultimately also the same The same anti-inflammatory effect can be determined in the rheumatoid factor agglutination test and in the Hungarian bio-test Effect can be determined.
Es war überraschend, daß Orgotein aus Blut im wesentlichen frei von Enzymen isoliert werden kann, da gerade Blut eine große Anzahl von Enzymen enthält und allein in den roten/Blutkörperchen menschlichen Blutes zumindest 82 Verschiedene Enzyme aufgefunden wurden. Sie Anwesenheit dieser - It was surprising that orgotein can be isolated from blood essentially free of enzymes, since just now Blood contains a large number of enzymes and alone in the red / human blood cells at least 82 different enzymes were found. You presence of this -
009 8 27/1996009 8 27/1996
Enzyme, des Chromoproteins Hämoglobin, von Phosphorlipoiden .und Cholesterin und schließlich· auch von anorganischen Salzen im Blut erschwert jedoch das Isolieren reinen Orgoteins aus Blut keinesfalls wenn in erfindungsgemäßer Weise vorgegangen wird.Enzymes, of the chromoprotein hemoglobin, of phospholipoids and cholesterol and finally also of inorganic salts In the blood, however, the isolation of pure orgotein from blood in no way complicates when proceeding in the manner according to the invention will.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann Orgotein frei von Enzymen aus h'ämolysierten, von Blutplasma befreiten Erythrocyten gewonnen werden, wenn das Hämoglobin vom Hämolysat abgetrennt, das von Hämoglobin befreite Hämolysat in Gegenwart eines Puffers und eines zweiwertigen Metallions, vorzugsweise eines Metallions eines Metalls mitIn the context of the method according to the invention, Orgotein can be free of enzymes from hemolyzed plasma freed erythrocytes are obtained when the hemoglobin is separated from the hemolysate, the hemolysate freed from hemoglobin in the presence of a buffer and a divalent metal ion, preferably a metal ion of a metal with
ο
einem Atomradius von 0,69-0,80 A, bis zur Inaktivierung der
COp-Anhydrase erhitzt und aus der erhaltenen Lösung das
Orgotein abgetrennt wird. Auf diese Weise können unter Verwendung billigerer Ausgangsstoffe und unter Verwendung einfacher,
weniger Zeit raubender und weniger kostspieliger Arbeitsmethoden Ausbeuten an Orgotein erhalten werden, die
vergleichbar sind mit den unter Verwendung von Rinderleber erzielbaren Ausbeuten an Orgotein.ο
an atomic radius of 0.69-0.80 Å, heated until the COp anhydrase is inactivated and the orgotein is separated from the resulting solution. In this way, using cheaper starting materials and using simple, less time-consuming and less expensive working methods, yields of orgotein can be obtained which are comparable to the yields of orgotein which can be achieved using beef liver.
Da Orgotein seiner Natur nach ein Protein ist, ist es auch wärmeempfindlich, weshalb mit Ausnahme des später noch zu beschreibenden Erhitzens alle Arbeitsschritte bei einer unterhalb Raumtemperatur, insbesondere bei einer unterhalb 5 C liegenden Temperatur vorgenommen werden. Da, wie bekannt, Orgotein in Anwesenheit einer zweiwertige Metallionen, insbesondere Metallionen mit einem AtomradiusSince orgotein is a protein by its nature, it is also sensitive to heat, which is why with the exception of later all work steps are included in the heating to be described one below room temperature, especially at one temperature below 5 C. Because, as is known, orgotein in the presence of a divalent one Metal ions, especially metal ions with an atomic radius
ο
von 0,69-0,80 A, enthaltenden Pufferlösungen wesentlich stabiler ist, werden nach dem Freisetzen des Orgoteins aus
den roten Blutkörperchen durch Hämolyse vorzugsweise alle Arbeitsschritte (ausgenommen das Isolieren des Orgoteins
in trockener Form) in Anwesenheit eines solchen Püffers
vorgenommen (vgl. Belgische Patentschrift Nr. 68? 828), ο
of 0.69-0.80 A, containing buffer solutions is much more stable, after the release of the orgotein from the red blood cells by hemolysis, preferably all work steps (with the exception of isolating the orgotein in dry form) are carried out in the presence of such a buffer (cf. Belgian patent specification No. 68? 828),
Als Ausgangsstoffe für das erfindungsgeroäße Verfahren werden Erythrocyten,' also rote Blutkörperchen, vorzugsweise , von Säugetieren staminende Erythrocyten, verwendet· !tote The starting materials used for the process according to the invention are erythrocytes, that is to say red blood cells, preferably erythrocytes originating from mammals
009827/1996009827/1996
Blutkörperchen aus Rinderblut. werden vor allem deshalb bevorzugt, weil Rinderblut, welches in Schlächtereien in großen · Mengen anfällt, billig ist und relativ große Mengen an Orgotein enthält. Vorzugsweise wird frisches Rinderblut oder stabilisiertes Rinderblut, beispielsweise mittels Äthylendiamintetraegsigsäure (Xl)TE) kurz nach der Schlachtung stabilisiertes Rinderblut, als Ausgangsstoff verwendet, da bei lagerung von Blut im nicht eingefrorenen Zustand und/oder im nicht konservierten Zustand die Menge des aus dem Blutisolierbaren Orgoteins ziemlich rasch abnimmt. Blood cells from bovine blood. are preferred above all because cattle blood, which in slaughterhouses in large In quantities, is cheap and contains relatively large amounts of orgotein. Fresh bovine blood or stabilized bovine blood, for example by means of ethylenediaminetetracetic acid (Xl) TE) Bovine blood stabilized shortly after slaughter, used as starting material, since storage of blood in the non-frozen state and / or in the non-preserved state, the amount of orgotein that can be isolated from the blood decreases fairly rapidly.
In ihrer Struktur naturgemäß im gewissen Maße von aus Rinderblut gewonnenem Orgotein abweichende Orgoteine können auch aus den roten Blutkörperchen anderer Säugetiere, beispielsweise Pferden, Ziegen, Schafen usw., gewonnen werden, und es zeigte sich, daß in Einzelfällen bestimmte solcher: Orgoteine pharmakοlogisch Wirksamer waren als andere. Aus Rinderblut gewonnenes °rgotein erweist sich jedoch als besonders wirksam, weshalb von hindern stammende rote Blutkörperchen vorzugsweise als Ausgangsstoff verwendet werden.Naturally, in their structure, orgotein differing to a certain extent from orgotein obtained from bovine blood can also be obtained from the red blood cells of other mammals, e.g. horses, goats, sheep, etc., and it turned out that in individual cases certain of these: Orgoteins were pharmacologically more effective than others. the end However, rgotein obtained from bovine blood proves to be particularly effective, which is why red blood cells originating from hindrances are preferably used as a starting material.
a) Gewinnung· roter Blutkörperchena) Obtaining red blood cells
Rote Blutkörperchen, welche etwa 35 - 45 VoI.-^ bzw. etwa 39 - 50 Gew.-$ des gesamten Blutes ausmachen, werden vom Blutplasma zweckmäßig abzentrifugiert oder auch lediglich sedimentieren gelassen. Beim erneuten Aufschlämmen der so abgetrennten roten Blutkörperchen und beim nochmaligen Zentrifugieren wird von den roten Blutkörperchen restliches Blutplasma entfernt. Zum Aufschlämmen kann hiebei Wasser» physiologische Kochsalzlösung oder eine Pufferlösung verwendet werden, wobei"letztere bevorzugt verwendet wird, da so eine vorzeitige Hämolyse vermieden werden kann.Red blood cells, which are about 35-45% by volume or make up about 39-50% by weight of the total blood, are expediently centrifuged off from the blood plasma or else only allowed to sediment. When the red blood cells separated in this way are re-slurried and when again Centrifugation removes residual blood plasma from the red blood cells. Water can be used for slurrying » physiological saline solution or a buffer solution can be used, the latter being preferred because so premature hemolysis can be avoided.
b) Hämolyseb) hemolysis
Das Chromoprotein Hämoglobin wird von den vom Blutplasma abgetrennten roten Blutkörperchen durch Hämolyse ab getrennt, wobei in an eich bekannter Weiae, beispielsweise gemäß M. Moßkowitz und M. Calvin, Exp. Cell Rea., 3, 33, 1952, The chromoprotein hemoglobin is removed from the separated blood plasma from red blood cells by hemolysis from separated, wherein in a calibration Weiae known, for example according Moßkowitz M. and M. Calvin, Exp. Cell Rea., 3, 33, 1952
*■ %* ■%
1996 '. 0*0 original1996 '. 0 * 0 original
oder gemäß S.S. Bernstein et al., J. Biöl· Chem., 122, 507, 1938, vorgegangen werden kann. Vorzugsweise wird die Hämolyse mittels entsalzten Wassers bei 0 bis 5 C vorgenommen, wobei das Wasser Netzmittel und/oder oberflächenaktive Stoffe enthalten kann. Puffersubstanzen und andere Salze, soferne vorhanden, sollen nur in geringen Konzentrationen .or according to S.S. Bernstein et al., J. Biöl · Chem., 122, 507, 1938, action can be taken. Preference is given to hemolysis carried out by means of desalinated water at 0 to 5 C, the water being wetting agents and / or surface-active agents May contain substances. Buffer substances and other salts, if present, should only be used in low concentrations.
vorliegen, damit die Hämolyse nicht gestört wird; beispiels-present so that hemolysis is not disturbed; exemplary
++ —"5++ - "5
weise kann die Konzentration von Mg etwa 10 m, jdie Konzentration von Cu++ etwa 10 m und/oder die KonzentrationThe concentration of Mg can be about 10 m, the concentration of Cu ++ about 10 m and / or the concentration
++ —5
von Zn 10 m betragen, wobei zusätzlich tris-Puffer oder Boratpuffer in einer Konzentration von weniger als 5.10 m
vorliegen kann.++ -5
of Zn be 10 m, with tris buffer or borate buffer also being present in a concentration of less than 5.10 m.
Isolieren des OrgoteinsIsolating the orgotein
a) Entfernen des Hämoglobinsa) Removal of the hemoglobin
Es sind zahlreiche Verfahren zum Abtrennen des aus roten Blutkörperchen durch Hämolyse freigesetzten Hämoglobins bekannt. (Vgl. EiR. Waygoodp Methods in Enzymology, Bd. 2, 836, 1955, Academic Press). Einige dieser bekannten Verfahren, beispielsweise das Filtrieren über Diäthylaminocellulose, übt einen nachträglichen Einfluß auf das Orgotein aus, weshalb vprzugsweise eine Fällung mittels Lösungsmitteln vorgenommen wird, jedoch auch eine Fällung mittels Arnmoniumsulfat oder Lösungen anderer organischer Salze vorgenommen werden kann.There are numerous methods of separating the red from Blood cells are known as hemoglobin released by hemolysis. (See EiR. Waygoodp Methods in Enzymology, Vol. 2, 836, 1955, Academic Press). Some of these known processes, for example filtering through diethylaminocellulose, exerts a subsequent influence on the orgotein, which is why precipitation by means of solvents is preferred is, however, also a precipitation with ammonium sulfate or solutions of other organic salts can be made.
Hämoglobin ist vom Hämolysat nicht ohne weiteres auszufällen, jedoch zeigte.sich, daß mit Wasser nicht mischbare und eine größere dichte als Wasser besitzende organische . Lösungsmittel, vorzugsweise halogenierte aliphatisehe Kohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Äthylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff od.dgl., die Ausfällung des Hämoglobins, wahrscheinlich wegen Komplexbildung mit dem Hämoglobin, erleichtern. Um eine solche Komplexbildung wirksam zu fördern, muß ein solches organisches Lösungsmittel mit dem Hämoglobin in innige Berührung gebracht werden, was wegen der Unlöslich· keit solcher organischer Lösungsmittel in Wasser zweckmäßigHemoglobin cannot easily be precipitated from the hemolysate, but it has been shown that organic substances are immiscible with water and have a greater density than water. Solvents, preferably halogenated aliphatic hydrocarbons such as methylene chloride, ethylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride or the like, facilitate the precipitation of the hemoglobin, probably because of complex formation with the hemoglobin. In order to promote such a complex formation effectively, such an organic solvent must be brought with the hemoglobin in intimate contact, which because of Insoluble · ness of such organic solvents useful in water
- 10 00 982.7/1996 - 10 00 982.7 / 1996
BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
AlAl
dadurch bewerkstelligt wird, daß .zusammen mit dem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel eine gewisse Menge eines mit· Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, beispielsweise ein niederes Alkanol wie Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopro panol oder tert.-Butanol, oder ein anderes mit Wasser mischbares Lösungsmittel wie Dioxan, Tetrahydrofuran, Aceton, Methyläthylketon usw., verwendet wird, welches eine geringe Menge des mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels in die wässerige Phase überführt. 'is achieved in that .together with that with water immiscible solvent a certain amount of a Water-miscible organic solvent, for example a lower alkanol such as methanol, ethanol, n-propanol, isopro panol or tert-butanol, or another one with water Miscible solvent such as dioxane, tetrahydrofuran, acetone, methyl ethyl ketone, etc. is used, which has a low Amount of the water-immiscible solvent transferred into the aqueous phase. '
Ks ist wesentlich das Hämoglobin vollständig abzutrennen, weshalb mittels des als Fällungsmittel verwendeten Lösungsmittels .Fällungen so oft vorgenommen werden sollen, bis die überstehende Flüssigkeit nicht mehr von Hämoglobin gefärbt ist.Ks is essential to completely separate the hemoglobin, which is why by means of the solvent used as a precipitating agent Precipitations should be carried out until the supernatant fluid is no longer colored by hemoglobin is.
Es erscheint zweckjnäiSig das ausgefällte Hämoglobin einmal oder mehrere Male auszuwaschen um die Ausbeute an Orgotein zu erhöhen.-Beispielsweise wurden aus 425 ml eines Kuchens von röten Blutkörperchen aus der nach Fällung von Hämoglobin verbleibenden überstehenden Flüssigkeit 640 mg einer Orgotein enthaltenden Proteinfraktion erhalten und durch einmaliges Auswaschen des abgetrennten Hämoglobins mittels entsalzten Wassers weitere 325 mg einer solchen Proteinfraktion gewonnen.The precipitated hemoglobin appears useful once or washed several times to increase the yield of orgotein. For example, 425 ml of one Cake of red blood cells from the supernatant liquid remaining after precipitation of hemoglobin 640 mg a protein fraction containing orgotein and obtained by washing out the separated hemoglobin once using desalinated water another 325 mg of such a protein fraction won.
Um einen Abbau des Orgoteins zu vermeiden, soll das Hämoglobin bei niedrigen Temperaturen, vorzugsweise bei Temperaturen unter 5 0C, insbesondere bei Temperaturen unter 0 0C, beispielsweise bei einer Temperatur von - 10 * C vorgenommen werden.Be made 10 * C - in order to avoid degradation of the Orgoteins, the hemoglobin at low temperatures, preferably at temperatures below 5 0 C, especially at temperatures below 0 0 C, for example at a temperature of to.
In dieser Stufe ist es gelegentlich erwünscht die nach Fällung des Hämoglobins erhaltene überstehende Flüssigkeit , zu dialysieren und gefrierzutrocknen um entweder die Menge an zu erwartendem Orgotein bestimmen zu können oder mehrere Chargen für die weitere Reinigung miteinander zu vereinigen. In diesem Falle können an sich·bekannte Methoden eingesetztAt this stage it is sometimes desirable to have the supernatant obtained after the hemoglobin has precipitated to dialyze and freeze-dry to either the amount to be able to determine the expected orgotein or to combine several batches for further purification. In this case, methods known per se can be used
~ 11 -~ 11 -
009 82 7/1996009 82 7/1996
werden. Das durch Gefriertrocknen erhaltene Produkt ist
ziemlich stabil, jedoch ist es zu empfehlen dieses Produkt kühl,
gern.will. The product obtained by freeze drying is quite stable, however it is recommended to keep this product cool,
gladly.
kühl, vorzugsweise bei einer Temperatur unter .5 0C, zu Ia-cool, preferably at a temperature below .5 0 C, to Ia-
b) Zerstörung der Enzymeb) Destruction of the enzymes
übzwar das als Ausgangsstoff verwendete Blut' zahlreiche Enzyme enthält, ist im in der oben angegebenen Weise erhaltenen Produkt im wesentlichen nurnehr COo-Anhydraseenthalten, die zusammen.mit den .in wesentlich geringeren Mengen vorliegenden Enzymen durch Wärmebehandlung zerstört wird. (Die Empfindlichkeit der COp-Anhydrase gegenüber Wärme ist beispielsweise von K.P. Davis-in ."'The Enzymes" Bd. 5,„ 545» 1961» Academic Press, beschrieben.)The blood used as the starting material is numerous Contains enzymes, the product obtained in the manner indicated above essentially only contains more COo-anhydrase, which are present together with the in significantly smaller quantities Enzymes are destroyed by heat treatment. (The Sensitivity of COp anhydrase to heat is for example by K.P. Davis-in. "'The Enzymes" Vol. 5, "545" 1961 " Academic Press, described.)
Beim Erhitzen der von Hämoglobin befreiten überstehenden Flüssigkeit wird die•COp-Anhydräse vollständig inaktiviert, wobei gleichzeitig alle übrigen wärmelabilen Enzyme inaktiviert werden. Bei 60 °C muß in der Regel langer als 10 Minuten erhitzt werden um die C02-Anhydrase und die übrigen Enzyme zur Gänze zu zerstören. Bei 65 C genügt es in der Regel 10 bis 15 Minuten zu erhitzen, wobei selbst während einer Erhitzungsdauer von 20 Minuten oder mehr die erzielbare Ausbeute an reinem Orgotein kaum beeinträchtigt wird. Beim Erhitzen auf j?O 0C während einer Stunde wird zumindest die Hälfte des Orgoteins zerstört. Wenn das Erhitzen bei 65 0C während 10 bis 20 Minuten vorgenommen wird, bleibt das Orgotein in Anwesenheit einer ein zweiwertiges Metallion mit einem Atomradius von 0,69 - 0,80 A enthaltenden Pufferlösung im wesentlichen unangegriffen, was sich beispielsweise daran zeigt, daß eine Lösung des Orgoteins in solch einer Pufferlösung beim Erhitzen auf 65 0C während 20 Minuten nicht durch Zersetzungsprodukte wolkig getrübtΛ wird. Bei 80 0C zeigt sich eine solche wolkige trübung innerhalb 10 Minuten und bei 100 0C innerhalb 2 Hinufren, Bei 37 0C zeigt sich eine !Trübung erst nach mehreren Stunden»When the supernatant liquid freed from hemoglobin is heated, the • COp anhydrase is completely inactivated, with all other heat-labile enzymes being inactivated at the same time. At 60 ° C, heating usually takes longer than 10 minutes in order to completely destroy the CO 2 anhydrase and the other enzymes. At 65 C it is usually sufficient to heat for 10 to 15 minutes, the achievable yield of pure orgotein being hardly impaired even during heating for 20 minutes or more. At least half of the orgotein is destroyed when heated to 0 ° C. for one hour. If the heating is carried out at 65 0 C for 10 to 20 minutes, the orgotein remains essentially unaffected in the presence of a divalent metal ion with an atomic radius of 0.69-0.80 A containing buffer solution, which is shown, for example, by the fact that a Solution of the orgotein in such a buffer solution when heated to 65 0 C for 20 minutes is not cloudy by decomposition products. At 80 0 C, such a cloudy haze is within 10 minutes and at 100 0 C within 2 Hinufren, at 37 0 C., a! Turbidity shows only after several hours'
0 0 98 2.7 / 1 θ06 bad original0 0 98 2.7 / 1 θ06 bad original
Nachdem die gesamte CC^-Anhydrase durch Erhitzen inaktiviert worden ist, wird das Gemisch sofort ausreichend weit unter Raumtemperatur gekühlt, worauf die ausgefällten Proteine abfiltriert oder abzentrifugiert werden. Die hiebei erhaltene klare Flüssigkeit enthält vorwiegend Orgotein von den insgesamt vorhandenen Proteinen. Aus der so erhaltenen Lösung kann unreines Orgotein in Pulverform durch Dialyse, womit Puffersalze und nicht chelatierte Metallionen entfernt werden, und anschließendes Gefriertrocknen'der proteinhaltigen Lösung isoliert werden.After all of the CC ^ anhydrase is inactivated by heating has been, the mixture is immediately cooled sufficiently below room temperature, whereupon the precipitated Proteins are filtered off or centrifuged off. The clear liquid obtained in this way contains mainly orgotein of the total proteins present. Impure orgotein in powder form can be extracted from the solution obtained in this way by dialysis, with which buffer salts and non-chelated metal ions are removed, and subsequent freeze-drying of the protein-containing ones Solution to be isolated.
Reinigung des OrgoteinsPurification of the orgotein
Nach dem Abtrennen des beim Erhitzen entstandenen Niederschlages kann das in der hiemit erhaltenen Lösung enthaltene bzw. das aus dieser Lösung durch Dialyse und . Gefriertrocknen erhaltene Orgotein ohne Schwierigkeiten durch Filtrieren über ein Gemisch von Kunstharzen (mixed bed resin filtration), durch Elektrophorese und/oder Filtrieren über ein als Molekularsieb wirkendes Polymer, beispielsweise in der in der Belgischen Patentschrift Nr. 68? 828 angegebenen Weise, weiter gereinigt werden. Der größte Teil der das Orgotein begleitenden organischen Verunreinigungen besitzt ein wesentlich niedrigeres Molekulargewicht als Orgotein, so daß diese Verunreinigungen in einfacher Weise und rasch durch Gelfiltration entfernt werden können.After the precipitate formed on heating has been separated off, this can be done in the solution thus obtained contained or that from this solution by dialysis and. Orgotein obtained by freeze-drying without difficulty by filtering through a mixture of synthetic resins (mixed bed resin filtration), by electrophoresis and / or filtering a polymer acting as a molecular sieve, for example in the Belgian patent no. 68? 828 specified Way to be further purified. Most of the organic impurities accompanying orgotein have a much lower molecular weight than orgotein, so that these impurities in a simple manner and can be removed quickly by gel filtration.
Die Erfindung wird im folgenden durch Ausführungsbeispiele näher erläutert..
Beispiel 1: Isolierung von Orgotein aus Rinderblut.The invention is explained in more detail below by means of exemplary embodiments.
Example 1: Isolation of orgotein from bovine blood.
Frisches Rinderblut wurde bei O 0C während ,1.0 Minuten bei 260OXg (das 2600-fache der Erdbeschleunigung) zentrifugiert, worauf das Plasma abdekantiert und die roten Blutkörperchen mit dem 2- bis 3-fachen Volumen einer 0,9-gewichtsprozentigen Kochsalzlösung gewaschen wurden. Die gewaschenen roten Blutkörperchen wurden 'durch Vermischen mit dem 1,1-fachen ihres Volumens an kaltem entsalztem Wasser, welches als Netzmittel 0,02 Gew.-?S Saponin enthielt» hämolysiert.Fresh bovine blood was measured at 0 ° C while 1.0 minutes at 260OXg (the gravitational acceleration 2600 times) centrifuged and the plasma decanted and the red blood cells to the 2- to 3-fold volume of a 0.9 weight percent saline solution were washed. The washed red blood cells were hemolyzed by mixing with 1.1 times their volume of cold deionized water which contained 0.02% by weight of saponin as a wetting agent.
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Nach einer Hämolysedauer von mindestens 30 Minuten bei 4 0C würde das Hämolysat bei - 15 0C langsam und unter Rühren mit dem 0,25-fachen seines Volumens an Äthylalkohol und dann ebenfalls bei -15 C mit dem 0,31-fachen seines Volumens an Chloroform versetzt, worauf das erhaltene Gemisch bei einer Temperatur von höchstens -5 °C 15 Minuten gerührt wurde. Es wurde so ein die Form einer dicken Paste aufweisendes Gemisch erhalten. Aus dieser Paste wurde das Hämoglobin dadurch ausgefällt, daß sie zunächst einige Zeit bei einer Temperatur von -10 0C verwahrt, dann 15 Minuten bei 4 C stehen gelassen'und dann mit den 0,2-fachen ihres Volumens an kalter 0,15 m NaCl-Lösung versetzt wurde, womit sich eine gut fließfähige Suspension ergab. Aus dieser Suspension wurde der Niederschlag und überschüssiges Chloroform durch Abzentrifugieren bei -10 0C während 10 Minuten (beim 20000- -fachen der Erdbeschleunigung) abgetrennt. Die hiebei erhaltene klare Flüssigkeit wurde filtriert und gegen kaltes entsalztes Wasser dialysierts v/orauf die erhaltene dialysierte Lösung gefriergetrocknet wurde.After a Hämolysedauer of at least 30 minutes at 4 0 C, the hemolysate was at - 15 0 C slowly and with stirring with 0.25 times its volume of ethyl alcohol and then also at -15 C with 0.31 times its volume added to chloroform, whereupon the resulting mixture was stirred at a temperature of at most -5 ° C for 15 minutes. A mixture in the form of a thick paste was thus obtained. From this paste, the hemoglobin was precipitated by the fact that they initially held for some time at a temperature of -10 0 C, then 15 minutes at 4 C are gelassen'und then with 0.2 times its volume of cold 0.15 m NaCl solution was added, resulting in a readily flowable suspension. From this suspension, the precipitate and the excess chloroform was by centrifugation at -10 0 C for 10 minutes (when the acceleration of gravity 20000- -fold) separated. The clear liquid was filtered and hiebei s dialyzed v / against cold deionized water was freeze-dried orauf the resultant dialyzed solution.
Der Alkohol und Chloroform enthaltende Niederschlag wurde durch Vermischen mit möglichst wenig entsalztem Wasser in einem Mischer extrahiert, worauf die Flüssigkeit abzentrifugiert wurde. Für dieses Extrahieren des erwähnten Niederschlages ist in der Regel die gleiche Volumsmenge ε·ι Wasser erforderlich als das Volumen der als Ausgangsstoff verwendeten roten Blutkörperchen betrug. Auch die durch diese Extraktion erhaltene Lösung wurde dialysiert und gefriergetrocknet,. Durch diese Rückextraktion des ausgefällten Hämoglobins . werden 40 bis 50 $ der ursprünglich in der klaren Flüssigkeit enthaltenen Proteine gewonnen. Durch nochmaliges Rückextra- · hieren dieses Niederschlages werden weitere 10 bis 15 $ erhalten.The precipitate containing alcohol and chloroform was obtained by mixing with as little deionized water as possible extracted in a mixer, whereupon the liquid was centrifuged off. For this extraction of the mentioned precipitate is usually the same volume ε · ι water required than the volume of raw red blood cells. Even those through this extraction resulting solution was dialyzed and freeze-dried. Through this back extraction of the precipitated hemoglobin. 40 to 50 $ of the proteins originally contained in the clear liquid are recovered. By repeated back extra- Here this rainfall will be another $ 10 to $ 15 obtain.
Das durch Gefriertrocknen erhaltene Material wurde in 0,025 m Tris-Glycin-Puffer gelöst, welcher an Mn++ 0,001 molar war, einen pH-Wert von 7,5 besaß und etwa 20 mg gefrier«*·The material obtained by freeze-drying was dissolved in 0.025 M Tris-glycine buffer, which was 0.001 molar in Mn ++ , had a pH of 7.5 and about 20 mg freeze.
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getrocknetes Material, pro ml enthielt. Die erhaltene Lösung wurde 15 Minuten auf 65 0C erhitzt, womit die COp-Anhydrase (carbonic anhydrase) und die sonstigen wärmelabilen Enzyme ausgefällt wurden. Anschließend wurde die erhaltene Lösung 'sofort in einem Eisbad auf 5 °C gekühlt und dann bei 0 0C 10 Minuten zentrifugiert (beim 20000-fachen der Erdbeschleunigung) um den Niederschlag abzutrennen. Die erhaltene Flüssigkeit wurde gegen entsalztes Wasser dialysiert, worauf die durch Dialyse von überschüssigen Metallionen und Puffersubstanzen befreite Lösung gefriergetrocknet, wurde. Der so erhaltene Feststoff bestand vorwiegend aus Orgotein.dried material, per ml. The resulting solution was heated for 15 minutes 65 0 C, whereby the COP anhydrase (carbonic anhydrase) and other heat-labile enzymes were precipitated. Subsequently, the resulting solution 'was immediately cooled in an ice bath to 5 ° C and then at 0 0 C for 10 minutes centrifuged to separate the precipitate (at 20,000 times the acceleration of gravity). The liquid obtained was dialyzed against deionized water, whereupon the solution, freed from excess metal ions and buffer substances by dialysis, was freeze-dried. The solid obtained in this way consisted predominantly of orgotein.
a) Gelfiltration , -a) gel filtration, -
Sephadex G-75 (ein Ionenaustauschharz) wurde unter dauerndem Rühren langsam auf etwa 60 C erhitztem und entsalztem Wasser zugesetzt, worauf das erhaltene Gemisch mitsamt dem Behälter 5»75 Stunden in ein auf 60 0C erhitztes Wasserbad gestellt und dann eine Stunde bei Raumtemperatur ■ stehen gelassen wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde samt den aufgeschlämmten Stoffen abgesaugt. Dem so erhaltenen Sephadex-Gel wurde das 4- bis 5-fache seines Volumens an V/asser zugesetzt, worauf erneut gerührt, absitzen gelassen und Überstehendes abgesaugt wurde« Anschließend wurde erneut frische Pufferlösung dem Gel zugesetzt und die oben angegebene Arbeitsweise viermal wiederholt. Die schließlich erhaltene Suspension wurde auf 4 °C gekühlt und vor ihrer Verwen- ( dung unter vermindertem Druck entlüftet.Sephadex G-75 (an ion exchange resin) was slowly added to demineralized water heated to about 60 ° C. with constant stirring, whereupon the resulting mixture together with the container was placed in a water bath heated to 60 ° C. for 5-75 hours and then at room temperature for one hour was left standing. The supernatant liquid was sucked off together with the suspended matter. 4 to 5 times its volume of water was added to the Sephadex gel obtained in this way, whereupon the mixture was stirred again, allowed to settle and the excess was sucked off. Fresh buffer solution was then again added to the gel and the above procedure repeated four times. The suspension finally obtained was cooled to 4 ° C. and deaerated under reduced pressure before use.
Es wurde eine aus Polymethacrylat gefertigte Kolonne mit Umwälzeinrichtung verwendet. Die Länge der Kolonne betrug 1050 mm und der Durchmesser der Kolonne betrug 32 mm* Beim Füllen der Kolonne mit entgastem Puffer wurde besondere Sorgfalt darauf verwendet, daß nahe dem an der Seite der Kolonne befindlichen Filter keine Luftblasen eingeschlossen wurden. Die mit Puffer gefüllte Kolonne wurde sodann in einen kalten Raum gebracht und dort mit Hilfe einer Wasserwage in vertikaler Lage justiert. Nach Temperaturangleich im kalten Raum wurde die Gelaufschlämmung unter dauerndem Rühren in einenA column made of polymethacrylate with a circulation device was used. The length of the column was 1050 mm and the diameter of the column was 32 mm * Special care was taken when filling the column with degassed buffer used to be close to the one on the side of the column no air bubbles have been trapped in the filter. The column filled with buffer was then transferred to a cold one Brought space and there with the help of a level in a vertical position Adjusted position. After adjusting the temperature in the cold room became the gel slurry with constant stirring into a
eAD0R.G.NAu eAD0 RG N Au
an Kopf der Kolonne befestigten Trichter gegossen. Sobald sich am Boden der Kolonne eine einige Zentimeter starke Schicht von Sephadex ausgebildet hatte, wurde der Auslaß am Boden der Kolonne so weit geöffnet, daß sich eine gleichmäßige Ausflußgeschwindigkeit ergab. Es zeigt sich durch das Hochsteigen einer horizontal liegenden Gelfläche im Rohr ob die Kolonne gleichmäßig gefüllt wird. Nachdem sich in der Kolonne eine etwa 95 cm hohe Gelschicht abgesetzt hatte, wurde aus der Kolonne überschüssiges Gel und Puffer entfernt. Nachdem sich die oberste Gelschicht vollständig abgesetzt-hatte, wurde die Kolonne durch einen mit einem Filter ausgestatteten Verschluß geschlossen, Anschließend wurde durch die Kolonne zwei Tage Pufferlösung umgewälzt • um das in der Kolonne befindliche Bett zu stabilisieren; hiebei wurde eine Umwälzgeschwindigkeit von 10 ml/min aufrecht erhalten. Das schließliche Bettvolumen betrug 775*7 cm wegen V = 'Hr2Ii - 3,14.(1,6 cm) .96,5 cm.poured funnel attached to the top of the column. As soon as a layer of Sephadex a few centimeters thick had formed at the bottom of the column, the outlet at the bottom of the column was opened so wide that there was a uniform outflow rate. The rising of a horizontally lying gel surface in the tube shows whether the column is filled evenly. After a gel layer about 95 cm high had settled in the column, excess gel and buffer were removed from the column. After the uppermost gel layer had completely settled, the column was closed by a seal equipped with a filter. Buffer solution was then circulated through the column for two days • to stabilize the bed in the column; a circulation rate of 10 ml / min was maintained. The final bed volume was 775 * 7 cm because of V = 'Hr 2 Ii - 3.14. (1.6 cm) .96.5 cm.
Das nach dem Abtrennen der Enzyme erhaltene gefriergetrocknete Material wurde mit einer Konzentration von 20 mg/ml in Pufferlösung gelost, worauf gegebenenfalls vorhandene unlösliche Feststoffe abzentrifugiert wurden. Die erhaltene klare Lösung wurde auf die Kolonne unter Verwendung eines Dosierventiles (LKB selector valve, Model No. 4911B) aufgegeben. ·The freeze-dried material obtained after separating the enzymes was with a concentration of 20 mg / ml dissolved in buffer solution, whereupon any insoluble solids present were centrifuged off. the clear solution obtained was on the column using of a dosing valve (LKB selector valve, Model No. 4911B) given up. ·
Beim Betrieb der Kolonne wurde stets eine Temperatur von 4 0C eingehalten. Der verwendete Puffer war ein 0,05 molarer Tris-HCl-Puffer, welcher einen pH-Wert Von 7»5 besaß, an KGl 0,15 molar und an Glycin 0,005 molar war und im übrigen an Mg++ 10; molar, an Cu++ 10 molar und an 2n++ A temperature of 4 ° C. was always maintained during operation of the column. The buffer used was a 0.05 molar Tris-HCl buffer, which had a pH of 7-5, was 0.15 molar in KGl and 0.005 molar in glycine and otherwise was Mg ++ 10; molar, on Cu ++ 10 molar and on 2n ++
—5
10 molar war.-5
Was 10 molar.
Der Kolonne wurde die Proteinlösung vom Boden her augeführt, wobei eine Zufuhrgeschwindigkeit von 10 ml/h eingestellt wurde. Der Proteingehalt der einzelnen Fraktionen wurde durch deren Absorption bei 280 mn bestimmt« Die für die einzelnen Proteine aufgefangenen Fraktionen wurdenThe protein solution was fed into the column from the bottom, a feed rate of 10 ml / h was set. The protein content of the individual fractions was determined by their absorption at 280 mn «The for the individual proteins collected fractions were
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• gewogen und-es wurde auch deren Volumen bestimmt. Die das erste Absorptionsmaximum zeigende fraktion, welche der , Kolonne entströmte, enthielt Orgotein, welches in der Regel in 300 bis 400 ml des Eluats enthalten ist. Diese Fraktionen wurden zwecks weiterer Aufarbeitung miteinander vereinigt. Auf diese Fraktionen, welche ein wohldefiniertes Absorptions-. maximum zeigen, folgen Fraktionen«, »sclcne im Absorptionsmaximum eine Schulter zeigen, mutmaßlich ein Analog des Orgoteins enthalten und nicht unbedingt isoliert werden müssen. Es erscheint jedoch angezeigt diese Fraktionen dann zu isolieren wenn deren Proteingehalt von einer maximalen Konzentration rasch absinkt. Beim weiteren Eluieren'der Kolonne folgen beträchtlich"später, Verunreinigungen darstellende Proteine niedrigeren Molekulargewichts enthaltende Fraktionen, die aus der Kolonne entfernt werden um sie für die Aufarbeitung weiterer Chargen vorzubereiten.• Weighed and-their volume was also determined. The the The first fraction showing the maximum absorption, which flowed out of the column, contained orgotein, which as a rule is contained in 300 to 400 ml of the eluate. These factions were combined with one another for further work-up. On these fractions, which have a well-defined absorption. show maximum, fractions follow, "" sclcne show a shoulder in the absorption maximum, presumably an analogue of the Contain orgoteins and do not necessarily have to be isolated. It then appears, however, to indicate these factions to isolate when their protein content drops rapidly from a maximum concentration. When further eluting Columns follow considerably later, showing impurities Fractions containing proteins of lower molecular weight which are removed from the column in order to save them for to prepare the processing of further batches.
b) Abtrennen von Puffersubstanzen und überschüssigen Metallionen.b) Separation of buffer substances and excess metal ions.
Die durch Gelfiltration erhaltene Lösung des Orgoteins wird über eine mit Amberlite MB-1 (ein Kationen- und Anionenaustauschharz von Rohm & Haas, u.zw. ein sowohl stark saure SO,H-Gruppen als auch stark basische -Ν(0Η)(0Η,)ρ0Η20Η-οΓυρ-pen aufweisendes Styrol-Divinylbenzol-Copolymer) gefüllte Kolonne filtriert, womit der Gehalt der Lösung an Puffersubstanzen verringert und der Gehalt der Lösung an Mg+ -, Cu++- und Zn++-Ionen auf weniger als 10 .molar gebracht wird. Alternativ kann der gleiche Zweck auch durch Dialyse erreicht werden.The orgotein solution obtained by gel filtration is poured over an amberlite MB-1 (a cation and anion exchange resin from Rohm & Haas, including a strongly acidic SO, H group as well as a strongly basic -Ν (0Η) (0Η ,) ρ 0Η 2 0Η-οΓυρ-pen containing styrene-divinylbenzene copolymer) filtered column filled, which reduces the content of the solution of buffer substances and the content of the solution of Mg + , Cu ++ and Zn ++ ions less than 10 mol is brought. Alternatively, the same purpose can also be achieved by dialysis.
Eine Kolonne von 3»7 cm Durchmesser und 114 cm Länge wurde mit entsalztem und entgastem Wasser zur Hälfte gefüllt, worauf eine Aufschlämmung des Ionenaustauschharzes in entlüftetem und entsalztem Wasser langsam in die Kolonne gegossen wurde und das Austauschharz absetzen gelassen wurde. Die Kolonne wurde sodann mehrmals mittels entsalzten Wassers gewaschen bis sich ein konstanter pH-Wert von etwa 7,0 ergabA column 3 »7 cm in diameter and 114 cm in length was half filled with desalinated and degassed water, followed by a slurry of the ion exchange resin in the deaerated and deionized water was slowly poured into the column and the exchange resin was allowed to settle. The column was then several times using desalinated water washed until a constant pH of about 7.0 resulted
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und die Ionenkonzentration des Ablaufs aus der Kolonne einerLeitfähigkeit von etwa 1,OS entsprach. Es ergab sich hienit eine Füllhöhe der Kolonne von 84 cm und ein Bettvolumen von 957 mt; dies entspricht einer gesamten Ionenaustauschkapazität von 440 Milliäquivalenten wenn man den vom Hersteller des Austauschharzes angegebenen Paktor von 0,46 berücksichtigt.and the ion concentration of the effluent from the column corresponded to a conductivity of about 1.0 OS. It happened hienit a filling height of the column of 84 cm and a bed volume of 957 mt; this corresponds to a total ion exchange capacity of 440 milliequivalents if one considers the factor of 0.46 taken into account.
Das bei der Gelfiltration anfallende und Orgotein enthaltende Eluat wird erforderlichenfalls auf einen Protein-, gehalt von 8 - 10 i» eingeengt, worauf die erhaltene Lösung mit der erforderlichen Sorgfalt auf den Kopf der mit Ionenaustauschharz gefüllten Kolonne aufgebracht und die Fraktionen mittels entsalztem Wasser auseinander gezogen werden. Die Durchflußgeschwindigkeit wird auf etwa 20 ml/min eingestellt, wobei die erhaltenen Fraktionen durch Bestimmung der Ultraviolettabsorption bei 280 nm auf einen Gehalt an Orgotein überprüft werden,, Es werden Fraktionen in Mengen von 25 bis 50 ml aufgefangen,. Das erwünschte Protein scheint in der Regel in den Fraktionen 4 bis 12 auf. Die Konzentration dieser Fraktionen an Puffersubstanz und zweiwertigen Metallionen wird hiebei beträchtlich unter 10 molar gesenkt, was sich durch den Abfall der Leitfähigkeit der Lösung vor der Filtration über die Kolonne (die Leitfähigkeit zu diesem Zeitpunkt betrug etwa 4000 bis 500C S) auf einen Wert von 1,5 bis 2*5 S anzeigte.The obtained in the gel filtration and the eluate containing Orgotein is necessary, to a protein, content of 8 - concentrated 10 i », whereupon is applied the resulting solution with the necessary care on the top of the filled ion exchange resin column and pulled apart the fractions by demineralized water will. The flow rate is adjusted to about 20 ml / min, the fractions obtained being checked for an orgotein content by determining the ultraviolet absorption at 280 nm. Fractions in amounts of 25 to 50 ml are collected. The desired protein usually appears in fractions 4 to 12. The concentration of these fractions of buffer substance and divalent metal ions is reduced considerably below 10 molar, which is reduced to a value of 1 due to the drop in conductivity of the solution before filtration through the column (the conductivity at this point in time was about 4000 to 500C S) , 5 to 2 * 5 S displayed.
Um eine für Injektionszwecke geeignete sterile Lösung des Proteins herzustellen, wird der erhaltenen Lösung Fructose, Sucrose oder ein anderes Saccharid in einer solchen Menge zugesetzt, daß zumindest 2 Gew.-tie„ des Saccharids auf 1 Gew.-ti. des Proteins kommen, worauf die erhaltene Lösung durch Ultrafiltration sterilisiert und gleichzeitig unter sterilen Bedingungen in sterilisierte Ampullen oder Fläschchen eingefüllt wird. Um ein stabileres Produkt zu erhalten, kann die Füllung der Phiolen bzw6 Fläschchen vor dem Verschließen gefriergetrocknet werden.In order to prepare a sterile solution of the protein suitable for injection purposes, fructose, sucrose or another saccharide is added to the resulting solution in such an amount that at least 2% by weight of the saccharide per 1% by weight. of the protein come, whereupon the solution obtained is sterilized by ultrafiltration and at the same time filled into sterilized ampoules or vials under sterile conditions. In order to obtain a more stable product, the filling of the vials or 6 bottles can be freeze-dried before sealing.
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Beim Arbeiten gemäß Beispiel 1 können folgende Abänderungen einzeln oder zu mehreren gemacht werden ohne die Ergebnisse nennenswert zu verändern.When working according to Example 1, the following changes can be made individually or in groups without change the results significantly.
a) Das Gefriertrocknen vor dem Zerstören der Enzyme durch Erhitzen kann entfallen.a) Freeze-drying before the enzymes are destroyed by heating can be omitted.
b) Vor dem Erhitzen kann das dialysierte Material in einer Pufferlösung, beispielsweise 0,025 m -Puffer, pH 7,8, enthaltend 10""5 m Mg++, 10"^ m Zn++,b) Before heating, the dialyzed material can be in a buffer solution, for example 0.025 m buffer, pH 7.8, containing 10 "" 5 m Mg ++ , 10 "^ m Zn ++ ,
10~4 m Cu++ und10 ~ 4 m Cu ++ and
erhitzt werden.be heated.
c) Die Gelfiltration kann in der unter to) angegebenen Pufferlösung oder in einer anderen einen pH-Wert von 7,8 aufweisenden Pufferlösung, beispielsweise in einem Boratpuffer, vorgenommen werden.c) The gel filtration can be carried out in the buffer solution specified under to) or in another with a pH of 7.8 having buffer solution, for example in a borate buffer, are made.
d) Die Verunreinigungen niedrigen Molekulargewichts können durch Filtrieren der überstehenden klaren Flüssigkeit über ein Filtermedium entfernt werden, welches für Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 30000 keine Adsorptionsfähigkeit besitzt.d) The low molecular weight impurities can be removed by filtering the supernatant clear liquid be removed via a filter medium, which for compounds with a molecular weight of more than 30,000 none Has adsorptive capacity.
e) 1 #-ige Ammonsulfatlösung kann dazu verwendet werden das Hämoglobin vom Hämolysat abzutrennen und ,e) 1 # ammonium sulfate solution can be used for this to separate the hemoglobin from the hemolysate and,
f.) Orgotein und seine Analoga können auch aus den roten Blutkörperchen von Kaninchen, Hühnern, Menschen und den in der folgenden Tabelle angegebenen weiteren Tieren erhalten werden.f.) Orgotein and its analogues can also be obtained from the red Obtained blood cells from rabbits, chickens, humans and the other animals listed in the table below will.
Ausbeute '
in $> - 1 2
Yield '
in $> -
des Äthanol und
Chloroform ent
haltenden Nieder
SchlagsBack extractions
of ethanol and
Chloroform ent
holding down
Blow
. zweimal3
. twice
an roten Blutkörperchen schwankt je nach Rasse und Alter.red blood cell count varies according to race and age.
2 : 2 :
Nach dem Filtrieren über Sphadex G 75. ^Durchschnitt aus 5 Chargen«,
Vollständige Reinigung.After filtering through Sphadex G 75. ^ Average of 5 batches «,
Complete cleaning.
Beispiel 2: Isolierung von Orgotein aus Rinderblut.Example 2: Isolation of orgotein from bovine blood.
- 105Og Rinderblut, welches von Schlächtereien angeliefert und in Alsevers-Lösung oder mit ÄDTE stabilisiert worden war, wurden beim 4000-fachen der Erdbeschleunigung bei O0C 20 Minuten zentrifugiert um die roten Blutkörperchen vom Plasma zu trennen. Das erhaltene Plasma wurde verworfen. Die Alsevers-Lösung wurde durch Auflösen von 24,6g Glucose, 9,6g Natriumcitrat.Dihydrat, 5»04g Natriumchlorid105Og cattle blood, which had been delivered from butcheries and stabilized in Alsevers solution or with ADT, was centrifuged at 4000 times the acceleration due to gravity at 0 ° C for 20 minutes in order to separate the red blood cells from the plasma. The resulting plasma was discarded. The Alsevers solution was made by dissolving 24.6 g of glucose, 9.6 g of sodium citrate. Dihydrate, and 5 »04 g of sodium chloride
P in 1200 ml kaltem destilliertem Wasser, Einstellen des pH- -Wertes der erhaltenen Lösung auf 6,1 mittels Zitronensäure und Sterilisieren der Lösung durch Filtrieren über ein Millipore-Filter und damit sterilisieren hergestellt. Die roten Blutkörperchen wurden durch Vermischen.mit dem 1- bis • 2-fachen ihres Volumens mit 0,9 öew.-#iger Natriumchloridlösung gewaschen, worauf dieses Waschen noch zweimal in der gleichen Weise wiederholt wurde und schließlich bei 0 0G während 20 Minuten bei 4000 χ g zentrifugiert wurde.P in 1200 ml of cold distilled water, adjusting the pH of the resulting solution to 6.1 using citric acid and sterilizing the solution by filtering it through a Millipore filter and sterilizing it. The red blood cells were washed by mixing 1 to 2 times their volume with 0.9% by weight sodium chloride solution, whereupon this washing was repeated twice in the same way and finally at 0 0 G for 20 minutes was centrifuged at 4000 χ g.
Die roten Blutkörperchen wurden durch Vermischen mit dem 1,1-fachen ihres Volumens an kaltem entsalztem Wasser und anschließendes Stehenlassen der erhaltenen Mischung beiThe red blood cells were made by mixing with 1.1 times its volume of cold deionized water and then allowing the mixture obtained to stand
t 4 0C während einer Stunde hämolysiert. Dem erhaltenen Hämolysat wurde das 0,25-fache seines Volumens an Äthylalkohol bei -15 0C unter Rühren langsam zugesetzt, worauf noch das 0,31-fache des Volumens des Hämolysats an Chloroform bei -15 0C zugesetzt wurde um das Hämoglobin auszufällen. Nachdem das erhaltene Gemisch bei -15 0C noch etwa 15 Minuten gerührt worden war, hatte das Gemisch die Form einer dicken Paste angenommen, die bei 4 C noch 15 Minuten stehengelassen wurde und dann mit dem 0,2-fachen ihres Volumens an kaltem entsalztem Wasser versetzt wurde um eine leicht fließfähige Suspension zu erhalten. Von dieser Suspension wurde der " t 4 0 C hemolyzed for one hour. The hemolysate obtained was 0.25 times its volume of ethyl alcohol at -15 0 C under stirring slowly added, followed by the even 0.31 times the volume of the hemolysate was added to chloroform at -15 0 C to precipitate the hemoglobin. After the resultant mixture at -15 0 C. for about 15 minutes being stirred, the mixture had adopted the form of a thick paste, which was allowed to stand still for 15 minutes at 4 C and then by 0.2 times its volume of cold demineralized Water was added in order to obtain an easily flowable suspension. From this suspension the "
?0? 0
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Niederschlag und überschüssiges Chloroform bei 0 0C und 20000 χ g innerhalb 20 Minuten abzentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde noch durch ein Versapor- -lipoxyfilter (0,9) filtriert, womit ein klares Fiitrat erhalten wurde.Precipitate and excess chloroform at 0 0 C and 20,000 χ g centrifuged off within 20 minutes. The supernatant liquid obtained was filtered through a Versapor lipoxy filter (0.9), whereby a clear filtrate was obtained.
Der erhaltene Niederschlag wurde durch Vermischen mit kaltem entsalztem Wasser (in einem Osteriser blender) rückextrahiert, wobei zumindest 0,5 VoI,-tie. kalten entsalzten Wassers, bezogen auf das Volumen des ursprünglich vorliegenden Hämolysats, verwendet wurden um eine leicht fließfähige Suspension zu erhalten. Diese Suspension wurde bei 20000 χ g und bei 0 C während 20 Minuten' zentrifugiert, worauf die erhaltene Flüssigkeit über ein Versapore-Filter filtriert wurde. Das klare Filtrat wurde mit der Hauptfraktion vereinigt (Rückextraktion I). Der nunmehr erhaltene Niederschlag wurde erneut in der oben angegebenen Weise rückextrahiert, zentrifugiert und filtriert. Das erhaltene klare. Filtrat wurde mit dem vorher erhaltenen Gemisch aus Hauptfraktion und erster Waschflüssigkeit vereinigt (Rückextraktion II).The obtained precipitate was mixed with back-extracted cold desalinated water (in an Osteriser blender), where at least 0.5 VoI, -tie. cold desalinate Water, based on the volume of the originally present hemolysate, was used to ensure that it was easily flowable To obtain suspension. This suspension was centrifuged at 20,000 χ g and at 0 C for 20 minutes, whereupon the obtained liquid was filtered through a Versapore filter. The clear filtrate was combined with the main fraction (Back extraction I). The now received precipitate was again back-extracted, centrifuged and filtered in the manner indicated above. The obtained clear. Filtrate was combined with the previously obtained mixture of main fraction and first washing liquid (back extraction II).
Das so erhaltene Gemisch aus den verschiedenen Filtraten wurde ohne Dialyse gefriergetrocknet, womit 2,1g eines Produktes erhalten wurden, die Ausbeute bezogen auf die gesamte Blutmenge also 0,2 °J> betrug. Das gefriergetrocknete Material wurde mit einer Konzentration von 20 mg/ml in 0,025 m Tr is- -Glycin-Puffer gelöst, welcher einen.pH-Wert von 7,5 besaßThe mixture obtained in this way from the various filtrates was freeze-dried without dialysis, with which 2.1 g of a product were obtained, the yield based on the total amount of blood was therefore 0.2 ° J> . The freeze-dried material was dissolved at a concentration of 20 mg / ml in 0.025 M Tr is -glycine buffer, which had a pH value of 7.5
und an Mn 10 molar war. Die Lösung wurde in einem Wasserbad unter gelegentlichem Rühren 15 Minuten auf 65 0C erwärmt, worauf der entstandene Niederschlag durch Filtrieren über ein Versapor-Filter abfiltriert wurde. Das erhaltene klare Filtrat wurde gegen entsalztes Wasser dialysiert, dann über ein Versapor-Filter filtriert und schließlich gefriergetrocknet. In dieser Arbeitastufe wurden 300 mg eines Produktes erhalten, also eine Ausbeute von 0,029 $> bezogen auf die eingesetzte Blutmenge erzielt. Dieses Produkt bestand vorwiegend aus Orgotein, und wurde mit einer Konzentration von etwa 50 mg/mland at Mn was 10 molar. The solution was heated in a water bath with occasional stirring for 15 minutes 65 0 C, whereupon the precipitate formed by filtration through a Versapor filter was filtered off. The clear filtrate obtained was dialyzed against deionized water, then filtered through a Versapor filter and finally freeze-dried. In this work stage, 300 mg of a product were obtained, i.e. a yield of $ 0.029> based on the amount of blood used. This product consisted primarily of orgotein, and was used at a concentration of approximately 50 mg / ml
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in einem Puffer gelöst, welcher an Tris 0,03 molar, andissolved in a buffer containing 0.03 molar Tris
Glycin 5.10~^ molar, an Mg++ 10 molar, an Cu++ 10 molar -Glycine 5.10 ~ ^ molar, on Mg ++ 10 molar, on Cu ++ 10 molar -
++ —5 '++ -5 '
und an Zn 10 molar war und einen pH-Wert von 7,1 besaß.and Zn was 10 molar and had a pH of 7.1.
Die so erhaltene Lösung wurde auf eine mit Sephadex G 75 gefüllte Kolonne von einem Durchmesser von 3,2 cm und einer , Länge von 95 cm aufgegeben, deren Inhalt mit der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die.Durchflußgeschwindigkeit wurdi? mit 10 ml/h gewählt, wobei Fraktionen zu je 100 Tropfen (etwa 3,2 ml) aufgefangen wurden. The solution obtained in this way was applied to a Sephadex G 75 filled column with a diameter of 3.2 cm and a length of 95 cm abandoned the content of the same Buffer solution had been equilibrated. The flow rate was? with 10 ml / h selected, with fractions of 100 drops (about 3.2 ml) were collected.
Das aus der Kolonne gewonnene Eluat wurde in Fraktion A · (Auffangrohre 81-100),' B (Auffangrohre 101-107), C (Auffang- ' rohre 108-122), D (Auffangrohre 123-135), E (Auffangrohre 136-158), F (Auffangrohre 159-180) und G (Auffangrohre 181- -235) geteilt. Die Fraktion C enthielt das Orgotein. Die Fraktion C wurde sehr scharf herausgeschnitten um sicherzugehen, daß sie nur reines Orgotein enthält. Die weniger reines Orgotein enthaltenden Fraktionen B und D wurden zwecks nochmalier Aufarbeitung beiseite gestellt. Jede der erhaltenen Fraktionen wurde gegen entsalztes Wasser dialysiert, über ein Millipore-Filter filtriert und dann gefriergetrocknet.The eluate obtained from the column was divided into fraction A (Collecting tubes 81-100), 'B (collecting tubes 101-107), C (collecting-' tubes 108-122), D (collecting tubes 123-135), E (collecting tubes 136-158), F (collecting tubes 159-180) and G (collecting tubes 181- -235) shared. Fraction C contained the orgotein. the Fraction C was cut very sharply to make sure it only contains pure orgotein. The less pure Fractions B and D containing orgotein were set aside for further work-up. Each of the received Fractions were dialyzed against deionized water, over filtered through a Millipore filter and then freeze-dried.
Der Gehalt der einzelnen Fraktionen an gelösten Stoffen und die maximale Ultraviolettabsorption dieser Fraktionen bei 280 nm zeigt die folgende Tabelle.The solute content of each fraction and the maximum ultraviolet absorption of these fractions at 280 nm is shown in the following table.
Fraktionfraction
B .B.
F .F.
Die Gesamtausbeute an Orgotein, eirischlieiSlich der in den Fraktionen B und D enthaltenen 3 ,mg# betrug 38 mg9 was einerThe total yield of orgotein, including the 3 mg # contained in fractions B and D, was 38 mg 9 which is one
- 22 -Q Qi 8 a 7 / 1 9 9 S .' BAD ORIGINAL·- 22 -Q Qi 8 a 7/1 9 9 p. ' BATH ORIGINAL
Ausbeute von 0,0058 $ bezogen auf die eingesetzte Menge an Blut entspricht.Yield of $ 0.0058 based on the amount of blood used.
Beispiel 3* Die Arbeitsweise gemäß Beispiel 2.wurde wiederholt, wobei jedoch das Hämoglobin aus dem.Hämolysat dadurch entfernt wurde, daß der pH-Wert des Hämalysats zunächst auf 6,8 bis 7,0 eingestellt wurde und dann dem Hämolys_at bei 25 0C (iiH^pSO, in einer Menge zugese-tzt wurde, daß die erhaltene Lösung 47 - 50 $> der Sättigungskonzentration des Ammonsulfats an Ammonsulfat enthielt\ anschließend wurde 20 bis 30 Minuten bei 8000 U/min zentrifugiert.Example 3 * The procedure is repeated according to Example 2.wurde except that the hemoglobin from dem.Hämolysat was removed characterized in that the pH of the Hämalysats was first adjusted to 6.8 to 7.0, and then the Hämolys_at at 25 0 C (IIh ^ PSO was estimated zugese-in an amount such that the resulting solution is 47-50 $> contained the saturation concentration of ammonium sulfate to ammonium sulphate \ followed by centrifugation at 8000 U / min 20 to 30 minutes.
. ' Patentansprüche:. 'Patent claims:
. - 23 -. - 23 -
00 0827/199600 0827/1996
Claims (4)
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|---|---|
| US72877768A | 1968-05-13 | 1968-05-13 | |
| US72877768 | 1968-05-13 | ||
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Publications (2)
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| DE1924230A1 true DE1924230A1 (en) | 1970-07-02 |
| DE1924230C DE1924230C (en) | 1973-07-26 |
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ID=
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT390067B (en) * | 1982-03-02 | 1990-03-12 | Italfarmaco Spa | METHOD FOR PRODUCING SUCCINYLATED PROTEINS |
| DE4019490A1 (en) * | 1990-06-19 | 1992-01-02 | Rudolf Schad Gmbh & Co Kg | Pressing and smoking appts. for meats - comprises pressing plates with upper grid to support meat, lower grid to press meat and connected by scissor jack |
| US5362492A (en) * | 1990-12-04 | 1994-11-08 | Gruenenthal Gmbh | Method of inhibiting multiple organ failure in trauma patients by administration of superoxide dismutase |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE375693B (en) | 1975-04-28 |
| NL6906952A (en) | 1969-11-17 |
| DK132864B (en) | 1976-02-23 |
| AT294315B (en) | 1971-11-25 |
| CH527227A (en) | 1972-08-31 |
| GB1244277A (en) | 1971-08-25 |
| IL32097A (en) | 1973-08-29 |
| IL32097A0 (en) | 1969-06-25 |
| FR2008361A1 (en) | 1970-01-23 |
| DK132864C (en) | 1976-07-19 |
| BE732537A (en) | 1969-11-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 |