DE19936992A1

DE19936992A1 - Neuartige Templat-geprägte Materialien, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE19936992A1
Application number: DE19936992A
Authority: DE
Inventors: Mathias Ulbricht; Sergiy Piletski; Uwe Schedler; Heike Matuschewski
Original assignee: Poly-An GmbH
Current assignee: Poly-An GmbH
Priority date: 1998-08-03
Filing date: 1999-08-02
Publication date: 2000-05-25
Also published as: DK1102623T3; ATE499981T1; DE59915253D1

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Templat-geprägte Materialien in Gestalt Templat-geprägter Polymere (TGP) auf beliebigen Oberflächen, wozu auch Membranen gehören (Templat-geprägte Membranen, TGM). Sie entstehen durch Modifizierung der Oberfläche von festen Trägern, die auf dem Wege einer an der Trägeroberfläche initiierten vernetzenden Polymerisation funktioneller Monomere in Gegenwart eines Templates zu stabilen Templatabdrücken führt, die anschließend Templatmoleküle oder Templatderivate spezifisch binden. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung von TGP und ihre Verwendung für die substanzspezifische Stofftrennung.

Description

Die Erfindung betrifft neuartige Templat-geprägte Materialien in Gestalt Templat-geprägter Polymere (TGP) aus wäßrigen Lösungen sowie TGP auf einem festen Träger (z. B. Membra nen), Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung für die substanzspezifische Stoff trennung.

In der Biotechnologie benötigt man für Produkte wie Enzyme, monoklonale Antikörper oder rekombinante Proteine neue effiziente Trenn- und Reinigungsstrategien. Dies gilt auch für synthetische Wirkstoffe, insbesondere wenn sie eine komplexere Struktur oder/und ein höhe res Molekulargewicht bzw. eine eingeschränkte Stabilität aufweisen.

Für alle diese Anwendungsgebiete werden substanzspezifische Hochleistungsmaterialien ge sucht, wobei eine große Flexibilität in Anpassung an die speziellen Targets erforderlich ist. Vorzugsweise werden feste Materialien (Partikel, Filme) eingesetzt, um die Phasentrennung von festen und flüssigen Stoffströmen zu vereinfachen. Im Unterschied zu Trennverfahren, die auf unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften beruhen, ist die chemische Affinität zum Träger die Voraussetzung für substanzspezifische Trennungen. Substanzspezifität kann durch biologische oder biomimetische Rezeptoren erzielt werden. Für Affmitätstrennungen werden bislang entweder spezifische, aber sehr empfindliche biologische Liganden (z. B. An tikörper, Enzyme) oder relativ unspezifische synthetische Liganden (z. B. Farbstoffe, Metall chelate) verwendet; Beispiele sind Chromatographie, Festphasenextraktion, Membrantren nung, Festphasenassays oder Sensoren (D. Sii, A. Sadana, J. Biotechnol. 19 (1991) 83).

Porenfreie Filme bzw. Schichten oder Partikel mit affinen Liganden an der Oberfläche besit zen eine beschränkte Bindungskapazität; bei porösen Materialien mit größerer spezifischer Oberfläche und Bindungskapazität treten typischerweise Einschränkungen der Bindungska pazität durch Diffusionslimitierungen auf. Gerichtet durchströmbare poröse Membranen sind deshalb besonders attraktive alternative Materialien. Etablierte Membranverfahren mit porö sen Membranen wie Mikro- oder Ultrafiltration (MF oder UF) funktionieren nach dem Grö ßenausschlußprinzip (W. Ho, K. Sirkar (Eds.), Membrane Handbook, von Nostrand Reinhold, New York, 1992). Die Trennung von Substanzen ähnlicher Molekülgröße mit porösen Mem branen erfordert zusätzlich spezifische (Affinitäts-) Wechselwirkungen mit der Membran (E. Klein, Affinity Membranes, John Wiley & Sons, New York, 1991).

Die Hauptmotivation für die Anwendung von Affmitätsmembranen besteht in der Möglichkeit der gerichteten Anströmung trennspezifischer Gruppen (Liganden/Rezeptoren), die sich in großer Dichte in den Poren befinden. Damit wird eine drastische Verbesserung der Effektivi tät (geringerer Druckabfall, kürzere Verweilzeiten, höhere Durchsatzgeschwindigkeiten, kaum Diffusionslimitierung in Poren, schnellere Equilibrierung) im Vergleich zu analogen Prozes sen mit Partikeln möglich (D. K. Roper, E. N. Lightfoot, J. Chromatogr. A 702 (1995) 3). Solche Affinitätsmembranen können für Stoffirennungen, vorzugsweise von Proteinen, aber auch vieler anderer Substanzen (z. B. Peptide, Nukleinsäurederivate, Kohlehydrate oder ver schiedene Toxine, Herbizide, Pestizide) bis zu Zellen genutzt werden (US 5766908). Außer dem ergeben sich vielfältige Anwendungsmöglichkeiten in der Analytik, wie z. B. zur hochse lektiven Probenanreicherung oder auch zur Dekontamination von Stoffströmen (DE 196 09 479).

Eine sehr attraktive Alternative zu biologischen oder biomimetischen Affinitäts- Liganden/Rezeptoren, z. B. für Chromatographie oder Analytik, wurde in den letzten Jahren entwickelt. Dies ist die Nutzung von spezifischen, aber sehr robusten funktionellen Kavitäten ("molekularen Abdrücken") in synthetischen Polymeren, hergestellt durch molekular prägende Polymerisation (G. Wulff, Angew. Chem. 107 (1995) 1958; K. Mosbach, O. Ramström, Bio/Technology 14 (1996) 163; A. G. Mayes, K. Mosbach, Trends Anal. Chem. 16 (1997) 321). Dazu realisiert man eine Polymerisation von Monomeren in Gegenwart von Templatmo lekülen (z. B. Protein, Nukleinsäure, niedermolekulare organische Substanz), die mit einem funktionellen Monomer einen während der Polymerisation relativ stabilen Komplex bilden können. Nach dem Auswaschen des Templates können die so hergestellten Materialien Tem platmoleküle wieder spezifisch binden. Die so synthetisierten Polymere heißen Templat geprägte Polymere (TGP)/molekular geprägte Polymere (MIP) oder "Fingerabdruck"- Polymere (s. Fig. 1, Fig. 2).

Auf diese Weise sind z. B. die Herstellung polymerer Sorbentien in Gegenwart kleiner organi scher Moleküle (Patent US 5110833) bzw. makromolekularer Substanzen (US 5372719) oder die Synthese von Acrylamid- bzw. Agarosegelen in Gegenwart von Proteinen beschrieben worden (Patente US 5728296, US 5756717). Auch Peptid- bzw. Proteinspezifische Sorbenti en, hergestellt durch "Oberflächenprägen" von Metallchelatstrukturen auf speziell funktiona lisierte Partikeln, wurden beschrieben (US 5786428). In allen Fällen wurden hohe Affinitäten für die jeweiligen Template erhalten. Die Anwendung von durch molekulares Prägen herge stellten künstlichen Antikörpern und Rezeptoren hat sehr große Vorteile, weil diese Struktu ren viel stabiler als ihre natürlichen Analoga sind. Außerdem können sie für jede Substanz (selbst für solche mit wenig ausgeprägten Antigen-Eigenschaften, wie z. B. kleine Moleküle oder Immunodepressiva) synthetisiert sowie wesentlich einfacher und kostengünstiger als die entsprechenden Biomoleküle hergestellt werden.

Die Auswahl der Komponenten für die Synthese eines TGP erfolgt vor allem aufgrund der Wechselwirkungen zwischen Templat und funktionellem Monomer. Mit dem Ziel, diese Wechselwirkungen möglichst effektiv und für Affinitätswechselwirkungen zugänglich zu "fixieren", werden zusätzlich geeignete Vernetzer und Lösungsmittel gewählt.

Jede Substanz mit definierter dreidimensionaler Gestalt (Form) kann als Templat für die Synthese von TGP genutzt werden. Substanzklassen reichen folglich von kleinen Molekülen mit Molekülmassen unter oder um 100 Da (z. B. Herbizide) bis zu Partikeln wie Viren, Bakte rien oder Zellen. Allerdings sind Verbindungen mit biologischer Funktion wie Proteine, Pep tide, Nukleinsäuren oder Kohlehydrate von besonders großem Interesse. Die Erkennung von Templaten durch TGP basiert auf der Kombination verschiedener Faktoren wie reversibler kovalenter oder nichtkovalenter Bindung, elektrostatischer und hydrophober Wechselwirkun gen sowie der Komplementarität der Gestalt (Form). Welcher dieser Faktoren dominiert, ist von der Polymerstruktur, den Templateigenschaften sowie den Bindungsbedingungen abhän gig. Z. B. sind in hydrophoben Lösungsmitteln oft elektrostatische Wechselwirkungen für die Templaterkennung durch TGP dominierend. Dagegen sind in polaren Lösungsmitteln hydro phobe Wechselwirkung sowie die Gestaltspezifität am wichtigsten für die Templaterkennung. Vorzugsweise sollten TGP unter Bedingungen synthetisiert werden, die starke, aber reversible Wechselwirkungen zwischen dem Polymer und dem Templat favorisieren. Für große Molekü le (100. . .100000 Da) kann dagegen auch eine Kombination von vielen schwächeren Bindun gen unter Einbeziehung von Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen günstig sein. Für kleine Moleküle (50. . .100 Da) sind wenige starke Wechselwirkungen wie z. B. ioni sche Bindungen notwendig, um TGP mit hoher Affinität zu erhalten.

Wasser als Lösungsmittel oder wäßrige Systeme generell sind natürlich im Zusammenhang mit den o. g. Anwendungen von besonderem Interesse. Von der Natur "optimierte" Li gand/Rezeptor-Systeme funktionieren unter diesen Bedingungen optimal. In der Synthese von TGP für Anwendungen in wäßrigen Systemen gibt es dagegen erst in jüngster Zeit erste Fort schritte (L. Andersson, Anal. Chem. 68 (1996) 111; S. Hjerten, J. L. Liao, K. Nakazato, Y. Wang, G. Zamaratskaia, H.X. Zhang, Chromatographia 44 (1997) 227). Besondere Probleme bereiten Synthesen von TGP-Rezeptoren für kleinere Moleküle. Offensichtlich ist es bislang in solchen Versuchen nur unvollkommen gelungen, neben der Wahl geeigneter Wechselwir kungskräfte auch die detailgetreue Anordnung der funktionellen Gruppen zu steuern.

Der Erfindung liegen die Aufgaben zugrunde, den bekannten Stand durch die Entwicklung von Templat-geprägten Materialien zu verbessern. Die Aufgaben wurden dadurch gelöst, daß neuartige Templat-geprägte Polymere (TGP), z. B. auf Oberflächen fester Formkörper als Trä ger synthetisiert werden.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ein allgemeines Polymerisationsverfahren; in prinzipiell bekannter Weise ist unter den speziellen erfindungsgemäßen Bedingungen (s.u.) auch die Synthese von TGP-Partikeln möglich. Da diese Partikel aber aufgrund der bevorzugten was serlöslichen Monomere und wäßrigen Bedingungen (s.u.) mehr oder wenig starken Hydro gelcharakter aufweisen, erfolgt vorzugsweise die Synthese dünner TGP-Schichten auf festen, vorzugsweise polymeren, Trägern. Dieses Oberflächenprägen führt durch eine selektiv an der Trägeroberfläche initiierte, kontrollierte vernetzende Polymerisation in Gegenwart von Tem platmolekülen zu kovalent fixierten, dünnen Schichten mit Templatabdrücken auf der gesam ten Trägeroberfläche, beispielsweise einer Membran (TGM). Aufgrund der Selektivität der Initiierung bleiben Matrix- bzw. Porenstruktur intakt. Somit kann eine unabhängige Optimie rung von Porenstruktur (Kapazität, Permeabilität) und Oberflächenfunktionalität (Spezifität durch Templatabdrücke) durch ein spezielles Herstellungsverfahren erreicht werden. Mögli che Template sind z. B. kleine Moleküle mit Molekülmassen unter oder um 100 Da (u. a. Her bizide), größere Moleküle wie Peptide, Proteine, Nukleinsäuren oder Kohlehydrate, oder auch Partikel wie Viren, Bakterien oder Zellen. Bei der Filtration durch oder der Applikation auf TGP können die Template oder Templatderivate auch aus verdünnten Lösungen in den Tem platabdrücken (funktionellen Kavitäten) mit hoher Spezifität gebunden werden. Dann können die Template oder Templatderivate ggf. gereinigt und anschließend entweder unter Filtrati onsbedingungen (als Konzentrat) eluiert oder direkt auf dem Träger nachgewiesen werden.

Polymere Membranen können durch Verfahren wie Fällungsmittel- oder Temperatur induzierte Phaseninversion in einer Vielzahl von Porenstrukturen sowie mit den gewünschten mechanischen etc. Eigenschaften hergestellt werden. Damit ist eine Auswahl optimaler porö ser Matrixmembranen für die gewünschten Trennprozesse möglich (E. Klein, Affinity Mem branes, John Wiley & Sons, New York, 1991).

Die Auswahl der Komponenten für ein Templat-spezifisches TGP erfolgt vor allem aufgrund der Wechselwirkungen zwischen Templat (T) und funktionellem Monomer (FM). Mit dem Ziel, diese Wechselwirkungen möglichst effektiv und für Affmitätswechselwirkungen zu gänglich zu "fixieren", werden geeignete Vernetzer (V) und Lösungsmittel (LM) gewählt. Die Synthese der TGP-Schichten erfolgt dann in situ durch reaktive Beschichtung der gesamten Trägeroberfläche, z. B. Membran, aus einem Reaktionsgemisch niedriger Viskosität, aber un ter Erhalt des Komplexes aus T und FM. Diese Funktionalisierung der Membran mit TGP erfolgt derart, daß sowohl die Porenstruktur als auch die Stabilität der Matrixmembran nicht beeinträchtigt werden, daß aber auch eine Blockierung der (transmembranen) Poren minimiert wird.

Um diese Anforderungen zu erfüllen, ist eine photochemische Initiierung einer heterogenen Pfropfcopolymerisation (z. B. funktioneller Acrylate) zur TGP-Synthese besonders bevorzugt. Dafür resultiert folgender prinzipieller Ablauf der Funktionalisierung:

1. Beschichtung des Trägers mit Photoinitiator (PhI)
2. Equilibrieren des Trägers mit dem Reaktionsgemisch (T, FM, V, LM, PhI), im Falle von Membranen: Füllen und Equilibrieren des Porenvolumens der Matrix memban mit dem Reaktionsgemisch,
3. UV-Belichtung: selektive Anregung des PhI, Erzeugung von Startradikalen an der Ober fläche des Trägers, Polymerisation (vorzugsweise Temperatur, T ≦ 25°C),
4. Extraktion von unumgesetzten Reaktanden, löslichern Homopolymer und T1.

Diese Funktionalisierungen basieren auf der Wirkung des Trägermaterials als Coinitiator, d. h. alle Polymere, aus denen sich photoinitiiert Radikale generieren lassen, die eine Pfropfcopo lymerisation starten können, lassen sich auf diese Weise modifizieren. Die TGP- Funktionalisierungen sind aus wäßrigen oder organischen Lösungsmitteln möglich. Über Initi ierungs- und Polymerisationsbedingungen lassen sich Funktionalisierungsgrad und damit Oberflächenbedeckung der Matrix steuern. Falls erforderlich, kann so auch eine Blockierung der Matrixmembranporen im Falle von TGM minimiert werden. Damit ist die Anwendung des für die TGP-Synthese etablierten Methodenarsenals auf die Oberflächenfunktionalisierung von Trägermaterialien möglich.

Für die Photofunktionalisierung wurde ein bisher noch nicht bekanntes Zusammenspiel zwi schen Adsorption des PhI und des T an der (Membran)Polymeroberfläche sowie den Polyme risationsbedingungen beobachtet. Von einem hydrophilen Polymer (z. B. Nylon) kann ein ad sorbierter hydrophober PhI (z. B. Benzophenon) durch ein hydrophiles T (z. B. Terbumeton) verdrängt werden; die Photoftmktionalisierung wird dadurch unterdrückt. Ein solches System ist zur TGP-Synthese nicht geeignet. Ein hydrophiler PhI (z. B. Benzophenoncarbonsäure) dagegen coadsorbiert mit dem hydrophilen T am hydrophilen Polymer; die Photofunktionali sierung ist dadurch hinreichend effektiv; das T bindet spezifisch an dem so synthetisierten TGP. Ein hydrophober Phl (z. B. Benzophenon) adsorbiert bevorzugt an einem hydrophoben Polymer (z. B. Polypropylen); die Photofunktionalisierung ist effektiv; für ein hydrophileres T (z. B. Terbumeton) dominieren die Bindungen zu Templatabdrücken im Pfropfcopolymer.

Daraus können unterschiedliche TGP-Strukturtypen abgeleitet werden (s. Fig. 3):

a) Templatabdrücke innerhalb oder/und an der Oberfläche einer vernetzten Pfropfcopoly merschicht, die an der Trägeroberfläche fixiert ist,
b) Templatabdrücke direkt an der Trägeroberfläche unter Beteiligung des Matrixpolymers.

Auch eine chemische Pfropfung von Polymeren bzw. Polymervernetzung (z. B. Synthese von Polyanilinderivaten) auf der Oberfläche einer Matrixmembran ist zur Herstellung von TGP geeignet.

Template. Geeignete Substanzklassen reichen von kleinen Molekülen mit Molekülmassen unter oder um 100 Da (z. B. Herbizide) bis zu Partikeln wie Viren, Bakterien oder Zellen. Die Templatkonzentrationen in der Monomermischung für die TGP-Herstellung betragen zwi schen 0,01 und 50%. Mit der vorliegenden Erfindung können auch in wäßrigen Systemen ionische und elektrostatische Wechselwirkungen sowie Wasserstoffbrückenbindungen zur Synthese von TGP und somit zur molekularen Erkennung genutzt werden. Hydrophobe Wechselwirkungen können einen zusätzlichen Beitrag liefern. Dies ergibt insbesondere für kleine Moleküle signifikante Verbesserungen und ist auch für biologisch relevante Moleküle wie z. B. Aminosäuren, Peptide, Nucleinsäuren, Oligonucleotide, Zucker sowie Oligosacchari de, aber auch für Proteine oder DNA und RNA nutzbar.

Funktionelle Monomere mit positiv oder negativ geladenen funktionellen Gruppen (z. B. Ami noethylacrylat-Derivate oder Acrylsäure bzw. Methacrylsäure) sind für die TGP-Synthese geeignet. Zusätzlich können hydrophobe Einheiten wie z. B. aromatische Ringe, Kryptanden oder Cyclodextrine in TGP eingebaut werden. Auch zur Komplexbildung befähigte Monome re wie Metallchelatkomplexe, Schiff'sche Basen und spezielle Ester können für die Herstel lung von TGP genutzt werden. Auch Anilin und -derivate mit weiteren funktionellen Gruppen können für die TGP-Synthese genutzt werden. Weiterhin sind z. B. auch Derivate der Phenyl boronsäure, die mit Diolen Ester bilden können, als funktionelle Monomere geeignet. Die Konzentration funktioneller Monomere in der Mischung kann zwischen 0 und 100% betragen. Die Lösungsmittel für die Polymerherstellung können das Monomer selbst, Wasser (Puffer), organische Lösungsmittel oder deren Mischungen sein. Generell hängt der optimale Mono mertyp für TGP von der Templatstruktur sowie den Polymerisationsbedingungen ab. In Ab hängigkeit von den Polymerisationsbedingungen sowie der Zusammensetzung können die geprägten Polymere in der gewünschten Dichte, Porosität, Vernetzungsdichte und Konsistenz hergestellt werden. Beispiele für Vernetzer sind Ethylenglycolbismethacrylat für funktionelle Acrylate, o-Phenylendiamin für Polyanilin, N,N-Methylenbisacrylamid oder Piperazin bisacrylamid für Acrylamid oder Bisepoxide für Agarose. Die Vernetzerkonzentrationen in der Monomermischung betragen zwischen 0 und 80%.

Um das Templat wieder aus dem TGP herauszuwaschen, können z. B. eine Säure, die die elektrostatischen Wechselwirkungen stört, eine Salzlösung mit einer zur Dissoziation ausrei chenden Jonenstärke oder ein Lösungsmittel mit anderer Polarität verwendet werden. Dadurch werden in den Poren oder/und an der Oberfläche des Polymers die zur Templatstruktur kom plementären Bindungsstellen wieder freigesetzt. Allerdings sind auch Anwendungen von TGP mit gebundenem Templat möglich.

Durch Wahl der Funktionalisierungsstrategie bzw. -bedingungen können neben einer optima len Spezifität der Templatabdrücke auch die unspezifischen Wechselwirkungen von struktu rell ähnlichen oder verschiedenen Substanzen mit dem TGP minimiert werden. Beispiele da für sind die Optimierung des funktionellen Monomers und/oder des Vernetzers, Zusätze im Reaktionsgemisch (z. B. von hydrophilen Monomeren), Mehrschritt-Modifizierungen oder nachträgliche Derivatisierungen. Damit wird die Selektivität der TGP erhöht.

Die Strukturcharakterisierung der TGP erfolgt in prinzipiell bekannter Weise mit etablierten Verfahren, z. B. durch REM-Untersuchungen (REM - Raster-Elektronen-Mikroskop), FTIR- ATR-Spektroskopie (Fourier Transform Infrared - Attenuation of Total Reflexion; Infra rotspektroskopie mit Abschwächung der Totalreflexion), Funktionalgruppenanalytik mit photometrischen oder fluorimetrischen Methoden, Kontaktwinkelmessungen, Permeabilitäts messungen sowie statische und dynamische Sorptionsexperimente mit dem Templat oder an deren strukturell ähnlichen bzw. verschiedenen Substanzen. Insbesondere die statischen und dynamischen Bindungskapazitäten der TGP für das Templat, in Abhängigkeit von TGP- Struktur und den Testbedingungen (Konzentration, Verweilzeit, applizierte Stoffmengen und Volumen, Spülbedingungen usw.) sind wesentlich im Hinblick auf die vielfältigen Anwen dungen der TGP.

Template oder Templatderivate werden bei der Filtration durch oder der Applikation auf TGP, auch aus hoher Verdünnung, in den Templatabdrücken mit hoher Spezifität gebunden. Dann können die Template oder Templatderivate ggf gereinigt und anschließend entweder unter Filtrationsbedingungen (als Konzentrat) eluiert oder direkt auf dem Träger nachgewiesen werden (s. Fig. 4).

Folgende Anwendungen ergeben sich aus der erfindungsgemäßen Lösung, ohne daß damit die Anwendungsmöglichkeiten auf die konkreten Fälle beschränkt werden soll:

1. Filtration (Perfusion) von Lösungen, aber auch gasförmige Gemischen, durch TGP,
2. Diffusion (Dialyse) oder Elektrodiffusion (-dialyse) durch TGP,
3. Anwendung von TGP in Festphasenextraktion, (Membran-)Chromatographie oder Elek trophorese,
4. Anwendung von TGP in Sensoren,
5. Anwendung von TGP als Katalysator,
6. Applikation von Lösungen, aber auch gasförmigen Gemischen, auf TGP; Beispiele Test streifen, Blottingmembranen, Assays, Drugscreening.

Mit den synthetisierten TGP ist z. B. die effiziente und spezifische Aufkonzentrierung von Schadstoffen (Herbiziden) aus verdünnten Lösungen möglich (vgl. 1.). Das kann einerseits dazu genutzt werden, solche Substanzen quantitativ zu eliminieren (Detoxifikation); anderer seits ist aber auch eine definierte Anreicherung (analog zur Festphasenextraktion; vgl. 3.) für die folgende Spurenanalytik möglich. Z. B. die effiziente Hochreinigung von Proteinen, ein Prozeß von höchster Relevanz für die Biotechnologie, ist mit TGP ebenfalls möglich (vgl. 1). Auch dabei sind, in Abhängigkeit von Protein und Prozeß, sowohl die Analytik, eine Herstel lung in reiner Form, als auch eine Dekontamination möglich.

Der bekannte Stand läßt sich erfindungsgemäß durch neuartige TGP verbessern, die aus wäß rigen Reaktionsmischungen synthetisiert werden und unter wäßrigen Bedingungen, insbeson dere in Gegenwart von Puffersalzen, auch hohe Spezifitäten aufweisen.

Ein Komplex zwischen Templat und funktionellem Monomer, der im wesentlichen auf ioni schen Bindungen basiert, kann leicht durch erhöhte Salzkonzentration gespalten werden. Die ser Effekt kann zum einen für die Elution des Templates aus dem TGP genutzt werden, schränkt aber zum anderen die Anwendbarkeit für Affinitätstrennungen, mit Ausnahme von wäßrigen Lösungen niedriger Jonenstärke, sehr stark ein.

Überraschenderweise führt nun der Zusatz von Salz (z. B. Puffer) während der Polymerisation zu TGP, die eine hohe Affinität für Templatmoleküle bei ähnlich hoher Salzkonzentration (z. B. des Puffers unter den bevorzugten Anwendungsbedingungen) haben. Dieser Effekt kann phänomenologisch derart beschrieben werden, daß die Salzkonzentration in der Reaktionsmi schung den Abstand der Funktionalgruppen, die an der Ionenaustauschwechselwirkung betei ligt sind, "einstellt". Im Verlauf der Synthese gelingt es offensichtlich, diese vorteilhafte Konstellation zu fixieren (synthetischer Rezeptor mit ionischen Funktionalgruppen im richti gen Abstand). Besonders effektiv läßt sich diese Verfahrensweise bei Oberflächenfunktiona lisierungen fester Träger realisieren, die im folgenden beschrieben wird.

Die erfindungsgemäßen neuartigen Templat-geprägten Materialien bestehen aus Templat geprägten Polymeren (TGP), die durch Modifizierung der Oberfläche von festen Trägern in wäßrigen oder organischen Reaktionslösungen erhalten werden und die auf dem Wege einer an der Trägeroberfläche initiierten vernetzenden Polymerisation funktioneller Monomere in Gegenwart eines Templates zu stabilen Templatabdrücken führt. Anschließend können die Templatabdrücke Templatmoleküle oder Templatderivate auch aus wäßrigen, salzhaltigen Lösungen spezifisch binden.

Die erfindungsgemäßen Templat-geprägten Membranen (TGM) werden durch Modifizierung der Oberfläche von Membranen erhalten, die auf dem Wege einer an der Membranoberfläche initiierten vernetzenden Polymerisation funktioneller Monomere in Gegenwart eines Templa tes zu stabilen Rezeptorstrukturen in Form von Templatabdrücken führt, die anschließend Templatmoleküle oder Templatderivate spezifisch binden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung Templat-geprägter Materialien besteht dar in, daß ausgehend von einer porösen Membran unter Erhalt der makropösen Struktur und spezifischen Oberfläche synthetisiert wird und sowohl eine große Templat-Bindungskapazität als auch eine hohe Permeabilität der Templat-geprägten Membran erzielt werden. Die Synthe se der Templatabdrücke erfolgt durch eine heterogene photoinitiierte vernetzende Pfropfcopo lymerisation funktioneller Monomere auf der Trägeroberfläche.

Bei der erfindungsgemäßen Herstellung Templat-geprägter Materialien werden eine Substanz vom H-Abstraktionstyp (Anlagerung eines Wasserstoffatoms aus der Umgebung) als Photo initiator und das Trägerpolymer als Coinitiator eingesetzt, wobei die Initiierung durch Licht anregung des Photoinitiators erfolgt.

Die Synthese der Templatabdrücke beruht auf einer chemisch initiierten vernetzenden Poly merisation funktioneller Monomere auf der Trägeroberfläche. Als Initiator wird eine Substanz eingesetzt, die nach physikalischer oder chemischer Anregung Radikale oder andere Starter spezies für eine Polymerisation erzeugt.

Als Trägermaterialien dienen organische Polymere wie z. B. Polypropylen, Polyethylen, Poly styren, Polysulfon, Polyamide, Polyester, Polycarbonat, Polyacrylnitril, Polyvinylidenfluorid, Polytetrafluoroethylen, Polyacrylate, Polyacrylamide, Cellulose, Amylose, Agarose sowie deren jeweilige Derivate, Copolymere oder Blends der Polymeren.

Als Trägermaterialien werden ferner poröse Festkörper wie z. B. Gläser, Silikate, Keramiken oder Metalle bzw. deren Komposite, auch mit organischen Polymeren, eingesetzt.

Die Membranen weisen vorzugsweise symmetrische, aber auch asymmetrische Porenstruktu ren und Porengrößen zwischen wenigen nm und 10 µm, bevorzugt 100 nm bis 5 µm auf.

Als Template dienen kleine Moleküle mit Molekülmassen unter oder um 100 Da, wie z. B. Herbizide, Wirkstoffe oder Aminosäuren, größere Moleküle wie Peptide, Proteine, Nuklein säuren oder Kohlehydrate, oder auch Partikel wie Viren, Bakterien oder Zellen und als funk tionelle Monomere polymerisationsfähige Verbindungen mit zur Wechselwirkung mit Tem platen befähigten Gruppen, insbesondere Carboxyl-, Sulfonyl-, Sulfat-, Phosphat-, Amino- oder quartären Ammonium-Gruppen sowie jeweils deren Derivate, auch im Gemisch.

Durch eine nachträgliche oder vorherige zusätzliche Funktionalisierung oder Beschichtung wird die unspezifische Bindung von mit Templat konkurrierenden Substanzen und Nicht- Templaten verringert.

In einer besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im Gemisch mit den funktionellen Monomeren auch Vernetzermonomere sowie Lösungsmittel für alle Komponenten des Reaktionsgemisches eingesetzt.

Bei der Herstellung Templat-geprägter Polymere (TGP) läßt sich durch den Zusatz von Salz die Bindungsspezifität und -kapazität des Templat-geprägten Polymers für das Templat sowie Templat-ähnliche Substanzen erhöhen, wobei als Träger Filme, Membranen, Fasern, Hohlfa sern, Gewebe, Vliese oder Partikel, jeweils nichtporös oder porös, verwendet werden, jedoch das Templat-geprägte Polymer auch trägerfrei in beliebiger Gestalt und Größe hergestellt ist. Die erfindungsgemäße Verwendung der neuartigen Templat-geprägten Materialien liegt in der Stofftrennung und/oder Analytik von flüssigen oder gasförmigen Stoffgemischen, die auf der spezifischen Bindung der Template oder Templatderivate bei der Perfusion oder Diffusion durch Templat-geprägte Polymere oder der Applikation auf Templat-geprägten Polymeren basieren, ferner in der substanzspezifischen Stofftrennung mittels

- Affmitätsfiltration durch eine Anordnung mit Templat-geprägtem Polymer zur Aufkonzen trierung, Reinigung, Abtrennung oder analytischen Bestimmung von Substanzen,
- Dialyse oder Elektrodialyse durch ein Templat-geprägtes Material zur Aufkonzentrierung, Reinigung, Abtrennung oder analytischen Bestimmung von Substanzen,
- Festphasenextraktion, Chromatographie, Membranchromatographie oder Elektrophorese mit einem Templat-geprägten Polymer zur Aufkonzentrierung, Reinigung, Abtrennung oder ana lytischen Bestimmung von Substanzen,
- eines Templat-geprägten Polymers als Sensor oder Katalysator zur Reinigung, Abtrennung oder analytischen Bestimmung von Substanzen sowie
- eines Templat-geprägten Polymers als Blottingmembran oder Teststreifen oder Material für Assays oder zum Wirkstoff = Screening.

Die Merkmale der Erfindung gehen außer aus den Ansprüchen auch aus der Beschreibung hervor, wobei die einzelnen Merkmale jeweils für sich allein oder zu mehreren in Form von Kombinationen vorteilhafte schutzfähige Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die Kombination besteht aus bekannten (Membranen, Polymere) und neuen Elementen (Modifizierung der gesamten Oberfläche von Membranen mit Templat geprägten Polymerschichten, Synthese dünner TGP-Schichten auf festen Trägern), die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, daß nunmehr mit den synthetisierten TGP z. B. die spezifische Aufkonzentrierung von Schadstoffen aus verdünnten Lösungen (Bereicherung der Spurenanalytik) sowie z. B. die effiziente Hochreinigung von Proteinen - ein Prozeß von höchster Relevanz für die Biotechnologie - möglich ist und die TGP-Synthese in wäßrigen Systemen mit hoher Templat-Spezifität sowie die Anwendbarkeit der TGP-Synthese auf Oberflächen fester Formkörper als Träger gelingt.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Für das Herbizid Terbumeton (2-t-Butylamino-4-ethyl-6-methoxy-1,3,5-triazin) molekular geprägte Polypropylenmembran

Eine Probe (6 cm²) einer PP-MF-Membran (2E HF, Akzo Nobel, Wuppertal) wird mit Chlo rofom extrahiert, getrocknet und gewogen; anschließend wird die Membran in einer Petrischa le (d = 10 cm) mit 10 ml Reaktionslösung bestehend aus 5 mM Terbumeton (Templat), 25 mM Acrylsäure (funktionelles Monomer), 600 mM Ethylenglycolbismethacrylat (Vernetzer) und 5 mlvi Benzophenon (Photoinitiator) in Chloroform getränkt und überschich tet. Die Petrischale wird mit einer Glasplatte (Tief-UV-Filter, 1 ≧ 310 nm) abgedeckt. Nach 30 min erfolgt die Belichtung bei Halblast an einem UV-Trockner (Beltron GmbH) für insge samt 9 min (9 Passagen durch Belichtungszone). Anschließend wird die Membran dreimal mit Chloroform/Essigsäure (98/2, v/v) sowie dreimal mit Chloroform extrahiert. Danach wird getrocknet und gravimetrisch der Modifizierungsgrad, TGP pro äußere Membranfläche, be stimmt: DG = 3, 3 µg/cm².

Eine nicht molekular geprägte Kontrollprobe wird nach analoger Vorschrift, aber ohne Tem plat, präpariert; der Modifizierungsgrad (Polymer pro äußere Membranfläche) beträgt: DG = 2,0 µg/cm².

Beispiel 2 Für das Herbizid Terbumeton (2-t-Butylamino-4-ethyl-6-methoxy-1,3,5-triazin) molekular geprägte Nylonmembran

Eine Probe (6 cm²) einer Ny-MF-Membran (2D, Akzo Nobel, Wuppertal) wird mit Chloro form extrahiert, getrocknet und gewogen; anschließend wird die Membran in einer Petrischale (d = 10 cm) mit 10 ml Reaktionslösung bestehend aus 1 mM Terbumeton (Templat), 5 mM Acrylsäure (funktionelles Monomer), 120 mlvi Ethylenglycolbismethacrylat (Vernetzer) und 1 mlvi Benzophenon-4-carbonsäure (Photoinitiator) in Chloroform getränkt und überschichtet. Die Petrischale wird mit einer Glasplatte (Tief-UV-Filter, 1 ≧ 310 nm) abgedeckt. Nach 30 min erfolgt die Belichtung bei Halblast an einem UV-Trockner (Beltron GmbH) für insge samt 9 min (9 Passagen durch Belichtungszone). Anschließend wird die Membran dreimal mit Chloroform/Essigsäure (98/2, v/v) sowie dreimal mit Chloroform extrahiert. Danach wird getrocknet und gravimetrisch der Modifizierungsgrad (TGP pro äußere Membranfläche) be stimmt: DG = 24,2 µg/cm².

Eine nicht molekular geprägte Kontrollprobe wird nach analoger Vorschrift, aber ohne Tem plat, präpariert, der Modifizierungsgrad (Polymer pro äußere Membranfläche) beträgt: DG = 30,0 µg/cm².

Weitere Ergebnisse für variierte Präparationsbedingungen zeigt Tabelle 1.

Tabelle 1

Präparationsbedingungen und Ergebnisse für das Herbizid Terbumeton geprägte Polypropylenmembranen (PP) und Nylonmembranen (PA) Initiator: 1 mM Benzophenon; *1 mM Benzophenon-4-carbonsäure

Beispiel 3 Anwendung einer für Terbumeton molekular geprägten Polypropylenmembran zur Anreicherung von Herbiziden (Festphasenextraktion)

Eine Probe (4,9 cm²) einer entsprechend Beispiel 1 modifizierten Membran wird in einen Fil terhalter aus Stahl mit Luer-Lock-Anschluß (Schleicher & Schuell, Dassel) montiert. 10 ml einer Lösung des Herbizids (Terbumeton, Terbutryn, Desmetryn oder Terbutylazin) mit einer Konzentration im Bereich von 10^-7 bis 10^-5 M in Wasser werden aus einer Spritze mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min quantitativ durch die Membran filtriert. Anschließend wer den das Filtrat sowie 10 ml der Rohlösung mit jeweils 10 ml Chloroform extrahiert; die Her bizidkonzentrationen werden dann mit Hilfe der Gaschromatographie (Trennsäule HP5MS; Hewlet Packard GC System HP 6890 mit Masse-selektivem Detektor HP 5973) quantitativ bestimmt und auf diese Weise die in der Membran gebundene Menge ermittelt.

Repräsentative Ergebnisse für PP-MIP, PP-Kontrolle und PP-unmod. sowie 5.10^-7 M Herbi zid in Wasser zeigen Fig. 5 und Tabelle 2.

Tabelle 2

Adsorptionskapazität einer molekular geprägten PP-Membran (10 ml Herbizid-Lösung; Konzentration 10^-5 M; Membranfläche 5 cm²)

Beispiel 4 Für Peroxidase geprägte Polypropylenmembran

Auf einer Membran aus Polypropylen wird Anilin nach folgender exemplarischer Vorschrift zu einem fest haftenden, homogenen, optisch transparenten Film polymerisiert (vgl. Fig. 1, Fig. 2): Zu 30 µl einer Lösung von Anilinhydrochlorid (720 mM) und Meerrettichperoxidase (1,67 mg/ml) in Wasser werden 20 µl Ammoniumperoxodisulfat (250 mM in Wasser) pipet tiert, gründlich vermischt und bei Raumtemperatur unter Schütteln für 2 h zur Reaktion ge bracht. Danach wird gründlich mit Wasser und anschließend mit 10 mM Natriumphosphatpuf fer (pH = 7,5) gewaschen.

Beispiel 5 Ersatz von biologischen Rezeptoren in Assexys durch molekular geprägte Poly mermembranen

Membranen wurden wie in Beispiel 4 durch Peroxidase-TGP modifiziert. Die dabei erhalte nen modifizierten Oberflächen zeigen das Verhalten von künstlichen Antikörpern für Peroxi dase. Um die Affinität der TGP-Oberflächen für das Templat Peroxidase zu demonstrieren, wird Meerrettichperoxidase aus Lösungen unterschiedlicher Konzentration adsorbiert und dann mit Hilfe von Wasserstoffperoxidzugabe sowie der Vis-Detektion, basierend auf der Empfindlichkeit des PAni-Films bestimmt. Die signifikant höheren Werte für die Peroxidase- TGP-Oberfläche im Vergleich zum sehr geringen Signal bei der nicht geprägten Kontrollpro be zeigen die höhere Bindung von Meerrettichperoxidase an den synthetischen Rezeptorstruk turen unter Sättigung der Sorptionskapazität im untersuchten Konzentrationsbereich.

Beispiel 6 Für das Herbizid Desmetryn (2-Isopropylamino-4-methylamino-6-methylthio- 1,3,5-triazin) molekular geprägte Polypropylenmembranen

Eine runde Probe (46 cm²) einer PF-MF-Membran (nominale Porengröße, d = 0.2 µm; 2E HF, Akzo Nobel, oder d = 0.6 µm; AN 06, Millipore) wird mit Chloroform und Methanol extra hiert, getrocknet und gewogen. Danach wird die Membran für 30 min in eine 100 mM Lösung von BP (Photoinitiator) in Methanol getaucht. Anschließend wird die Membran, deren Poren noch mit der BP-Lösung gefüllt sind, in einer Petrischale (d = 10 cm) mit 20 ml Reaktionslö sung, bestehend aus 10 mM Desmetryn (Templat), 50 mM AMPS (funktionelles Monomer), 100 mM MBAA (Vernetzer) und 0.1 mM BP in Wasser, überschichtet. Die Petrischale wird mit einer Glasplatte (Tief-UV-Filter, 1 < 310 nm) abgedeckt. Nach 30 min erfolgt die Belich tung an einem UV-Trockner (Beltron GmbH) bei Halblast für insgesamt 10 min (10 Passagen durch die Belichtungszone). Anschließend wird die Membran intensiv mit Methanol, Wasser, 50 mM Salzsäure, Wasser und wieder Methanol gewaschen. Danach wird getrocknet und gravimetrisch der Modifizierungsgrad (DG, bezogen auf die äußere Membranoberfläche) be stimmt. Eine nicht molekular geprägte Kontrollprobe wird nach analoger Vorschrift, aber oh ne Templat, präpariert. Ergebnisse für variierte Präparationsbedingungen (pH-Wert, Salzkon zentration) zeigt Tabelle 3.

Beispiel 7 Anwendung von Desmetryn-geprägten Polypropylenmembranen zur Anreicherung von Herbiziden (Festphasenextraktion)

Eine Probe (4.9 cm²) einer entsprechend Beispiel 6 funktionalisierten Membran (vgl. Tabel le 3) wird in einen Filterhalter aus Stahl mit Luer-Lock-Anschluß (Schleicher & Schuell, Das sel) montiert. 10 ml einer Lösung von Desmetryn mit einer Konzentration im Bereich von 10^-7 bis 10^-5 M in Wasser werden aus einer Spritze mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min quantitativ durch die Membran filtriert. Anschließend werden das Filtrat sowie 10 ml der Rohlösung mit jeweils 10 ml Chloroform extrahiert; die Herbizidkonzentrationen werden dann mit Hilfe der Gaschromatographie (Trennsäule HP5MS; Hewlet Packard GC System HP 6890 mit Masse-selektivem Detektor HP 5973) quantitativ bestimmt und auf diese Weise die in der Membran gebundene Menge ermittelt.

Repräsentative Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Für beide Matrixmembran porengrößen weisen die TGP-Membranen deutlich (TGP 1) bzw. siginifikant (TGP 2) höhere Affinitäten für das Herbizd auf, während die mit einem chemisch ähnlichen, aber nicht ge prägten Polymer modifizierten Membranen verglichen mit unmodifiziertem PP leicht erhöhte (K 1) oder sogar geringere (K 2) Werte aufweisen.

Das TGP-gebundene Herbizid kann durch pH-Wechsel oder erhöhte Salzkonzentration wieder aus der Membran eluiert werden; ein Beispiel zeigt Fig. 6.

In prinzipiell analoger Weise konnte das Herbizid aus einer 2.10^-9 M Lösung bei einer Wie derfindung von 90% 1000fach angereichert werden; d. h. eine substanzspezifische Festpha senextraktion kann sowohl zur Aufreinigung als auch zur Aufkonzentrierung genutzt werden. Die TGP-Membranen sind ohne Verlust an Spezifität und Kapazität nach einer einfachen Re generation wiederholt einsetzbar, d. h. eine Anwendung zur Dekontamination ist so möglich (s. Fig. 7).

Beispiel 8. Substanz- bzw. Gruppenspezifität von Desmetryn-geprägten Polypropylen membranen

Eine Probe (4.9 cm²) einer entsprechend Beispiel 6 funktionalisierten Membran (TGP 1, s. Tabelle 3) wird wie in Beispiel 7 beschrieben getestet: 10 ml einer Lösung des jeweiligen Herbizids (Desmetryn, Terbumeton, Terbutryn oder Terbutylazin) mit einer Konzentration von 10^-5 M in Wasser werden aus einer Spritze mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min quantitativ durch die Membran filtriert. Anschließend erfolgt wie in Beispiel 7 beschrieben die quantitative Analytik.

Aussagen zu der Spezifität des Prägens und der Gruppenspezifität der TGP-Membranen kön nen aus den in Fig. 8 dargestellten Ergebnissen abgeleitet werden.

Für das Templat Desmetryn sowie Terbutryn und Terbumeton (jeweils Methoxy- bzw. Me thylthio-substituierte s-Triazine) ist die Affmität von TGP größer als die von K. Für Terbuty lazin (Chlorsubstituiertes s-Triazin) sowie das 1,2,4-Triazin Metribuzin ist dagegen keine Spezifität zu beobachten. D. h., die Spezifität wird durch das Prägen erzeugt; auch Substanzen mit identischer Hydrophilie/phobie-Balance (Terbumeton und Terbutylazin, jeweils lg k_ow = 3.04) werden aufgrund eines unterschiedlichen molekularen Details (Methoxy- vs. Chlor-Substituent) unterschiedlich durch den synthetischen Rezeptor gebunden ("Fit"). Es resultiert eine Gruppenspezifität für s-Triazine mit ähnlicher Substitution ("Polyklonalität", in Analogie zu Antikörpern).

Beispiel 9 Affinität von unterschiedlichen Desmetryn-geprägten Polypropylenmembran für Herbizide aus wäßrigen Pufferlösungen

Eine Probe (4.9 cm²) einer entsprechend Beispiel 6 funktionalisierten Membran (s. Tabelle 3) wird wie in Beispiel 7 beschrieben getestet: 10 ml einer Lösung von Desmetryn mit einer Konzentration von 10^-5 M in Pufferlösungen mit unterschiedlichem pH-Wert werden aus ei ner Spritze mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min quantitativ durch die Membran filtriert. Anschließend erfolgt wie in Beispiel 7 beschrieben die quantitative Analytik (s. Fig. 9).

Es ist zu sehen, daß bei den aus salzfreien Lösungen polymerisierten TGP-Membranen (vgl. Tabelle 3) die Affinität für die Herbizidbindung aus Pufferlösungen gering ist. Auch eine Synthese bei pH = 5.5, d. h. mit dem Natriumsalz des funktionellen Monomers AMPS, ergibt ähnlich geringe Affinitäten. Dagegen weisen die bei niedrigem pH unter Salzzusatz syntheti sierten TGP bemerkenswert hohe Affinitäten für die Herbizidbindung aus 50 mM Pufferlö sungen auf. Bei höheren pH-Werten sinkt die Affinität der TGP, offensichtlich, da die Salz bildung immer stärker mit der Bindung des Herbizids im synthetischen Rezeptor konkurriert.

Beispiel 10 Ersatz von biologischen Rezeptoren (hier Anti-Atrazin-Antikörper) in Assays durch TGP-Oberflächen

Wells von 96er Mikrotiterplatten aus Polystyren wurden unter analogen Bedingungen wie in Beispiel 6 beschrieben, aber mit Atrazin als Templat, modifiziert:
Zunächst werden pro Well 250 µl einer 100 mM Lösung von BP (Photoinitiator) in Methanol pipettiert, und die Mikrotiterplatte wird für 60 min geschüttelt. Die Lösung wird entfernt und anschließend werden pro Well 250 µl der Reaktionslösung, bestehend aus 10 mM Atrazin (Templat), 50 mM AMPS (funktionelles Monomer). 100 mM MBAA (Vernetzer) und 0.1 mM BP in Wasser pipettiert. Die Mikrotiterplatte wird mit einer Glasplatte (Tief-UV- Filter, 1 < 310 nm) abgedeckt. Nach 60 min erfolgt die Belichtung an einem UV-Trockner (Beltron GmbH) bei Halblast für insgesamt 10 min (10 Passagen durch die Belichtungszone). Anschließend wird die Mikrotiterplatte intensiv mit Methanol, Wasser, 50 mM Salzsäure, Wasser und wieder Methanol gewaschen sowie anschließend getrocknet.

Die auf diese Weise erhaltenen modifizierten Oberflächen der Wells zeigen das Verhalten von künstlichen Antikörpern für Atrazin, was sich in einem kompetitiven Triazin-Assay nutzen läßt:
In unterschiedlichen modifizierten Wells werden jeweils 50 µl einer Lösung von Herbizid (Atrazin oder Metribuzin) in Konzentrationen von 10^-7 bis 10^-4 M in Wasser sowie 50 µl Atrazin-Peroxidase-Konjugate-Lösung (aus dem Pestanal Atrazin ELISA Kit; Riedel de Haen) pipettiert und unter Schütteln bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Anschließend er folgen Waschen, Entwickeln sowie Stoppen entsprechend der Vorschrift des kommerziellen Assays (vgl. o.). Die Extinktionen bei 450 nm werden in einem Mikrotiterplattenlesegerät gemessen. Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt. Mit unmodifizierten Mikrotiterplatten wer den keine siginifikanten Extinktionsänderungen erhalten.

Tabelle 3

Präparation von Desmetryn-geprägten PP-Membranen (Beschichtung mit BP; Lö sungen in Wasser; 10 min UV-Belichtung bei Raumtemperatur)

Tabelle 4

Desmetrynsorption aus 10^-5 M Lösungen des Herbizids in Wasser in Desmetryn geprägten Polypropylenmembranen sowie Kontrollproben (Filtrationsgeschwindigkeit 10 ml/min)

Abkürzungsverzeichnis

AA Acrylsäure,
AMPS 2-Acyloylamino-propan-2-sulfonsäure
BP Benzophenon
DG Funktionalisierungsgrad
EDMA Ethylenglycolbismethacrylat,
FM Funktionelles Monomer
FTIR-ATR-Spektroskopie - Fourier Transform Infrared - Attenuation of Total Reflexion; Infrarotspektroskopie mit Abschwächung der Totalreflexion
K Kontrolle, synthetisiert ohne Templat
lg k_OW

Verteilungskoeffizient 1-Octanol/Wasser
LM Lösungsmittel
MBAA N,N'-Methylenbisacrylamid
MF Mikrofiltration
MIP Molekular geprägte Polymere
PhI Photoinitiator
PP Polypropylen
REM Raster-Elektronen-Mikroskop
T Templat
TGM Templat-geprägte Membranen
TGP Templat-geprägte Polymere
UF Ultrafiltration
V Vernetzer

Legende zu den Figuren Fig. 1

Schematische Darstellung der Synthese von Templat-geprägten Polymeren (TGP):
Templat-spezifische Bindungsstellen ("Templatabdrücke") werden durch vernetzte Polymeri sation funktioneller Monomere oder Vernetzung funktioneller Polymere in Gegenwart eines Templats und anschließendes Auswaschen des Templats erzeugt.

Fig. 2

Schematische Darstellung der Modifizierung der Oberfläche vom Membranen mit Templat geprägten Polymeren - Herstellung von Templat-geprägten Membranen (TGM): Templat spezifische Bindungsstellen ("Templatabdrücke") werden durch photoinitiierte vernetzte Pfropfcopolymerisation oder chemische Pfropfung bzw. Polymervernetzung funktioneller Monomere in Gegenwart eines Templats und anschließendes Auswaschen des Templats er zeugt.

Fig. 3

Strukturtypen von TGM:

a) Templatabdrücke innerhalb oder/und an der Oberfläche einer vernetzten Pfropfcopolymer schicht, die an der Membranoberfläche fixiert ist
b) Templatabdrücke direkt an der Membranoberfläche unter Beteiligung des Matrixpolymers.

Fig. 4

Anwendungen von TGM:

a) Perfusion einer Lösung oder gasförmigen Mischung mit Templat durch die Membran
b) Applikation einer Lösung oder gasförmigen Mischung mit Templat auf die Membran.

In beiden Fällen kann anschließend zunächst Waschen und danach Elution bzw. direkte Ana lytik des Templats erfolgen.

Fig. 5

Adsorptionskapazität einer molekular geprägten PP-Membran als Funktion der applizierten Stoffmenge eines ausgewählten Herbizids (Terbumeton).
PP-unmod: unmodifizierte PP-Membran
PP-K3: ohne Anwesenheit von Templat modifizierte Membran (Kontrolle)
PP-MIP3: molekular geprägte PP-Membran.

Fig. 6

Freisetung von in Desmetryn-geprägten PP-Membranen (TGP 1) gebundenem Desmetryn (nach Sorption aus 10^-5M Lösungen des Herbizids in Wasser) durch Filtration/Elution von/ mit 10 ml Salzlösung.

Fig. 7

Wiederholte Anwendung von Desmetryn-geprägten PP-Membranen (TGP 1) zur Sorption von Desmetryn aus 10^-5 M Lösungen des Herbizids in Wasser (Regeneration durch Waschen mit 50 ml Salzsäure und Wasser).

Fig. 8

Sorption verschiedener Herbizide aus 10^-5 M Lösungen in Wasser in Desmetryn-geprägten PP-Membranen (TGP 1; Filtrationsgeschwindigkeit 10 ml/min).

Fig. 9

Einfluß des pH-Wertes auf die Sorption von Desmetryn aus 10^-5 M Lösungen in 50 mM Phosphatpuffer in Desmetryn-geprägten PP-Membranen (Filtrationsgeschwindigkeit 10 ml/min).

Fig. 10

Kalibrieren für die quantitative Bestimmung von Atrazin mit Atrazin-TGP-funktionalisierten Mikrotiterplatten ohne Anti-Atrazin-Antikörper (Metribuzin als Kontrolle).

Claims

1. Neuartige Templat-geprägte Materialien, bestehend aus Templat-geprägten Polymeren (TGP) auf beliebigen Oberflächen, wozu Membranen gehören, erhalten durch Modifizie rung der Oberfläche von festen Trägern sowohl in organischen als auch in wäßrigen oder wäßrig-salzhaltigen Reaktionslösungen, die auf dem Wege einer an der Trägeroberfläche initiierten vernetzenden Polymerisation funktioneller Monomere in Gegenwart eines Templates zu stabilen Templatabdrücken führt, die anschließend Templatmoleküle oder Templatderivate aus organischen oder auch aus wäßrigen, salzhaltigen Lösungen spezi fisch binden.

2. Verfahren zur Herstellung Templat-geprägter Materialien nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß

1. 2.1. ausgehend von einer porösen Membran unter Erhalt der makropösen Struktur und spezifischen Oberfläche Templat-geprägte Membranen (TGM) synthetisiert und damit sowohl eine große Templat-Bindungskapazität als auch eine hohe Permeabilität der TGM erhalten werden.
2. 2.2. die Synthese der Templatabdrücke durch eine heterogene photoinitiierte vernetzende Pfropfcopolymerisation funktioneller Monomere auf der Trägeroberfläche erfolgt,
3. 2.3. eine Substanz vom H-Abstraktionstyp als Photoinitiator und das Membranpolymer als Coinitiator eingesetzt werden und die Initiierung durch Lichtanregung des Photoinitia tors erfolgt,
4. 2.4. die Synthese der Templatabdrücke durch eine chemisch initiierte vernetzende Poly merisation funktioneller Monomere auf der Trägeroberfläche erfolgt,
5. 2.5. als Initiator eine Substanz eingesetzt wird, die nach physikalischer oder chemischer Anregung Radikale oder andere Starterspezies für eine Polymerisation erzeugt,
6. 2.6. als Trägermaterialien oder als Membranmaterialien organische Polymere wie z. B. Po lypropylen, Polyethylen, Polystyren, Polysulfon, Polyamide, Polyester, Polycarbonat, Polyacrylnitril, Polyvinylidenfluorid, Polytetrafluoroethylen, Polyacrylate, Polyacryl amide, Cellulose, Amylose, Agarose sowie deren jeweilige Derivate, Copolymere oder Blends der Polymeren eingesetzt werden,
7. 2.7. als Trägermaterialien oder als Membranmaterialien poröse Festkörper wie z. B. Gläser, Silikate, Keramiken oder Metalle bzw. deren Komposite, auch mit organischen Poly meren, eingesetzt werden,
8. 2.8. Membranen mit vorzugsweise symmetrischer, aber auch asymmetrischer Porenstruktur und Porengrößen zwischen wenigen nm und 10 µm, bevorzugt 100 nm bis 5 µm, ein gesetzt werden,
9. 2.9. als Template kleine Moleküle mit Molekülmassen unter oder um 100 Da, wie z. B. Herbizide, Wirkstoffe oder Aminosäuren, größere Moleküle wie Peptide, Proteine, Nukleinsäuren oder Kohlehydrate, oder auch Partikel wie Viren, Bakterien oder Zellen dienen,
10. 2.10. als funktionelle Monomere polymerisationsfähige Verbindungen mit zur Wechsel wirkung mit Templaten befähigten Gruppen, inbesondere Carboxyl-, Sulfonyl-, Sulfat- Phosphat-, Amino- oder quartären Ammonium-Gruppen sowie jeweils deren Deriva te, auch im Gemisch, eingesetzt werden,
11. 2.11. durch eine nachträgliche oder vorherige zusätzliche Funktionalisierung oder Be schichtung die unspezifische Bindung von mit Templat konkurrierenden Substanzen und Nicht-Templaten verringert wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Gemisch mit den funktionellen Monomeren auch Vernetzermonomere sowie Lösungsmittel für alle Komponenten des Reaktionsgemisches eingesetzt werden.

4. Verfahren zur Herstellung Templat-geprägter Polymere (TGP) nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß

1. 4.1. durch den Zusatz von Salz die Bindungsspezifität und -kapazität des Templat geprägten Polymers für das Templat sowie Templat-ähnliche Substanzen erhöht wird,
2. 4.2. als Träger Filme, Membranen, Fasern, Hohlfasern, Gewebe, Vliese oder Partikel, je weils nichtporös oder porös, verwendet werden,
3. 4.3. das Templat-geprägte Polymer trägerfrei in beliebiger Gestalt und Größe hergestellt wird.
4. 4.4. das Templat nach der Synthese nicht aus den Templatabdrücken entfernt wird.

5. Verwendung der neuartigen Templat-geprägten Materialien nach den Ansprüchen 1 bis 4 zur Stofftrennung und/oder Analytik von flüssigen oder gasförmigen Stoffgemischen, die auf der spezifischen Bindung der Template oder Templatderivate bei der Perfusion oder Diffusion durch Templat-geprägte Polymere oder der Applikation auf Templat-geprägten Polymeren basieren.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine substanzspezifische Stofftrennung mittels Affinitätsfiltration durch eine Anordnung mit Templat-geprägtem Polymer zur Aufkonzentrierung, Reinigung, Abtrennung oder analytischen Bestimmung von Substanzen erfolgt.

7. Verwendung nach den Ansprüchen 5 und 6 zur substanzspezifischen Stofftrennung mit tels Dialyse oder Elektrodialyse durch ein Templat-geprägtes Material zur Aufkonzentrie rung, Reinigung, Abtrennung oder analytischen Bestimmung von Substanzen.

8. Verwendung nach den Ansprüchen 5 bis 7 zur substanzspezifischen Stofftrennung mittels Festphasenextraktion, Chromatographie, Membranchromatographie oder Elektrophorese mit einem Templat-geprägten Polymer nach den Ansprüchen 1 bis 4 zur Aufkonzentrie rung, Reinigung, Abtrennung oder analytischen Bestimmung von Substanzen.

9. Verwendung nach den Ansprüchen 5 bis 8 zur substanzspezifischen Stofftrennung oder/und Bindung oder/und chemischen Umwandlung durch ein Templat-geprägtes Po lymer nach den Ansprüchen 1 bis 4 als Sensor oder Katalysator zur Reinigung, Abtren nung oder analytischen Bestimmung von Substanzen.

10. Verwendung nach den Ansprüchen 5 bis 9 zur substanzspezifischen Stofftrennung oder/und Bindung oder/und chemischen Umwandlung durch ein Templat-geprägtes Po lymer nach den Ansprüchen 1 bis 4 als Blottingmembran oder Teststreifen oder Material für Assays oder zum Wirkstoff-Screening.