DE19917571B4 - Electrode grid for electroporation reaction batches - Google Patents
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Abstract
Elektrodenraster für die parallele Bearbeitung zahlreicher Elektroporationsreaktionsansätze mit suspendierten lebenden Zellen, insbesondere für die Übertragung von Nukleinsäuren, Proteinen oder niedermolekularen Substanzen aus der Suspensionslösung in die Zelle durch reversible Permeabilisierung der Zellmembran mit Hilfe eines oder mehrerer elektrischer Pulse geeigneter Feldstärke und Dauer, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den gegenüberstehenden Elektrodenastenden von Anoden- und Kathodenleiterbahnen des in planarer Anordnung von metallischen elektrischen Leiterbahnen auf der Oberfläche eines elektrischen Isolators gebildeten Elektrodenrasters Elektroporationsreaktionszonen für die Aufnahme von Elektroporationsreaktionsansätzen ausgebildet sind.Electrode grid for the parallel processing of numerous electroporation reaction approaches with suspended living cells, in particular for the transfer of nucleic acids, proteins or low molecular substances from the suspension solution into the cell by reversible permeabilization of the cell membrane with the help of one or more electrical pulses of suitable field strength and duration, characterized in that electroporation reaction zones for receiving electroporation reaction approaches are formed between the opposing electrode branch ends of anode and cathode conductor tracks of the electrode grid formed in a planar arrangement of metallic electrical conductor tracks on the surface of an electrical insulator.
Description
Es ist bekannt, daß die Membran lebender Zellen unter Enfluß eines elektrischen Pulses kurzzeitig für Makromoleküle wie z. B. Nukleinsäuren und Proteine und für niedermolekulare Substanzen durchlässig wird. Dieses Verfahren der Elektroporation hat, besonders wegen der hohen Effizienz, mit der Desoxyribonukleinsäuren (DNA) in die Zelle übertragen werden können, eine weitverbreitete Anwendung zum Transfer wasserlöslicher Moleküle in lebende Zellen erlangt (Handbuch „Cell Biology: A Laboratory Handbook, Academic Press, 1998, Vol. 4, Seiten 57–63). Bei Standard-Elektoporationskammern stehen sich Anode und Kathode in Form von Metallplatten gegenüber. Die durch Elektroporation zu behandelnde Zellsuspension wird in die Elektroporationskammer gefüllt und diese mit dem Spannungsgenerator verbunden. Hierbei können Volumina von 50 μl Zellsuspension kaum unterschritten werden. Weiterhin können verschiedene Elektroporationsreaktionsansätze nur nacheinander ausgeführt werden, wobei die Handhabung schwer zu automatisieren ist.It is known that the membrane of living cells under Enfluß an electrical pulse for a short time for macromolecules such. B. nucleic acids and proteins and is permeable to low molecular weight substances. This method of electroporation, especially because of the high efficiency with which deoxyribonucleic acids (DNA) can be transferred into the cell, has become widely used for the transfer of water-soluble molecules to living cells (Handbook Cell Biology: A Laboratory Handbook, Academic Press, 1998 , Vol. 4, pages 57-63). In standard Elektoporationskammern stand anode and cathode in the form of metal plates. The cell suspension to be treated by electroporation is filled into the electroporation chamber and connected to the voltage generator. In this case, volumes of 50 .mu.l cell suspension can hardly be undershot. Furthermore, various electroporation reaction approaches can only be performed sequentially, and handling is difficult to automate.
Der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, zahlreiche Elektroporationsreaktionsansätze parallel mit kleinen Reaktionsvolunina durchzuführen und die Handhabung leicht automatisierbar zu machen.The indicated in
Dieses Problem wird durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale gelöst.This problem is solved by the features listed in
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß durch die Anordnung eines Elektrodenrasters auf einer Oberfläche, zwischen den gegenüberstehenden Verästelungen von Anoden- und Kathodenleiterbahnen Reaktionszonen für Mikroelektroparationsreaktionen entstehen, die eine parallele Bearbeitung zahlreicher Elektroporationsreaktionsansätze ermöglichen. Auf verschiedenen Mikroelektroporationsreaktionszonen plazierte Elektroporationsreaktionsansätze können parallel einem elektrischen Puls ausgesetzt werden, indem die Hauptäste der Anoden- und Kathodenleiterbahnen mit dem Spannungsgenerator verbunden werden. Je nach Abmessung der sich gegenüberstehenden Äste von Anoden- und Kathodenleiterbahnen können zwischen den Elektrodenästen Reaktionsvolumina von unter 100 nl bis über 5 μl aufgetragen werden. Je nach Anordnung und Abmessung der Anoden- und Kathodenleiterbahnen können unterschiedliche Oberflächen mit der gewünschten Zahl und Dichte an Mikroelektroporationsreaktionszonen hergestellt werden. Die Anpassung der Elektroporationsreaktionszonenanordnung an Standardmikrotiterplattenformate erlaubt das Auftragen und Bearbeiten von Elektroporationsreaktionsansätzen mit robotergesteuerten Pipettiersystemen.The advantages achieved by the invention are in particular that arise by the arrangement of an electrode grid on a surface, between the opposing branches of anode and cathode conductive lines reaction zones for microelectroparation reactions that allow parallel processing numerous electroporation reaction approaches. Electroporation reaction batches placed on different microelectrification reaction zones can be exposed in parallel to an electrical pulse by connecting the main branches of the anode and cathode traces to the voltage generator. Depending on the dimensions of the opposing branches of anode and cathode conductor tracks, reaction volumes of less than 100 μl to more than 5 μl can be applied between the electrode branches. Depending on the arrangement and dimensions of the anode and cathode conductor tracks, different surfaces with the desired number and density of microelectroporation reaction zones can be produced. The adaptation of the electroporation reaction zone array to standard microtiter plate formats allows the application and processing of electroporation reaction batches with robotic pipetting systems.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist in Patentanspruch 2 angegeben. Die räumliche Abtrennung der einzelnen Elektroporationsreaktionszonen untereinander durch senkrecht zur Leiterbahnoberfläche stehende Wände verringert das Risiko einer Kontamination zwischen benachbarten Elektroporationsreaktionszonen und ermöglicht es, nach der Durchführung der Elektroporation weitere Inkubationslösungen zu den einzelnen Elektroporationsansätzen zuzufügen, ohne daß es zu einer Vermischung der einzelnen Ansätze untereinander kommt.An advantageous embodiment of the invention is specified in
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben.An embodiment of the invention is illustrated in the drawing and will be described in more detail below.
Es zeigtIt shows
Bei dem Ausführungsbeispiel befindet sich das Elektrodenraster auf einer elektrisch isolierenden Kunststoffoberfläche (e). Die Verästelungen von Anoden- und Kathodenleiterbahnen bilden 96 Reaktionzonen (c) in denen sich je ein Anoden- (d) und ein Kathodenast (d) gegenüber stehen. Die Elektrodenäste können zum Beispiel photolithographisch durch Platinenätztechnik aus Kupfer in 35 μm Schichtdicke abgebildet werden. In der Beispielausführung im 96er Mikrotiterplattenformat sind gegenüberstehende Elektrodenäste (d) durch eine Lücke von 1 mm voneinander getrennt und 3 mm breit. Die Abstände zwischen den Zentren benachbarter Elektroporationsreaktionszonen betragen in der Beispielausführung 9 mm. Auf die 96 Elektroporationsreaktionszonen können verschiedene Elektroporationsreaktionsansätze mit einem Volumen von 5 μl derart aufgetragen werden, daß die Lücke zwischen gegenüberstehenden Elektrodenästen durch die Elektroporationsflüssigkeit überbrückt wird. Auf verschiedenen Mikroelektroporationsreaktionszonen plazierte Tropfen von Elektroporationsreaktionsansätze können parallel einem elektrischen Puls ausgesetzt werden, indem die Hauptäste der Anoden- (a) und Kathodenleiterbahnen (b) mit dem Spannungsgenerator verbunden werden.In the exemplary embodiment, the electrode grid is located on an electrically insulating plastic surface (e). The ramifications of anode and cathode conductor tracks form 96 reaction zones (c) in each of which an anode (d) and a cathode load (d) face each other. The electrodes branches can, for example, be imaged photolithographically by platinum etching from copper in a layer thickness of 35 μm. In the 96-well microtiter plate format example, opposing electrode branches (d) are separated by a gap of 1 mm and 3 mm wide. The distances between the centers of adjacent electroporation reaction zones are 9 mm in the example embodiment. On the 96 electroporation reaction zones various electroporation reaction batches with a volume of 5 ul can be applied so that the gap between opposing electrode branches is bridged by the electroporation liquid. Droplets of electroporation reaction batches placed on different microelectrification reaction zones can be exposed in parallel to an electrical pulse by connecting the main branches of the anode (a) and cathode conductor tracks (b) to the voltage generator.
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R020 | Patent grant now final |
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