DE19860543A1

DE19860543A1 - Verwendung substituierter Tyrosinderivate als Protease-Inhibitoren

Info

Publication number: DE19860543A1
Application number: DE1998160543
Authority: DE
Inventors: Albrecht Berg; Karin Reiber; Peter Proksch
Original assignee: Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Current assignee: Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1998-12-23
Publication date: 2000-06-29

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen der Formel I DOLLAR F1 worin R¶1¶ = Br, R¶2¶ = H, Alkyl, Acyl, R¶3¶ = H, Alkyl, R¶4¶ = H, Alkyl, Acyl bedeuten, sowie von deren Salzen als Protease-Inhibitoren, v. a. in der Krebstherapie. Diese Inhibitoren sind von großem Interesse, das Proteinasen, insbesondere Metallo-Proteasen und Collagenase, beim Vorgang der Metastasierung, d. h. beim Auflösen der Extrazellulärmatrix, zum Einwandern von Krebszellen in gesundes Gewebe eine wichtige Rolle spielen (Angiogenese).

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von substituierten Tyrosinderivaten sowie deren Salze als Protease-Inhibitoren, vorzugsweise als Inhibitoren von Metallo-Proteasen und Collagenase. Aufgrund der wertvollen inhibierenden Eigenschaften sind diese Tyrosinderi vate als Protease-Hemmer für die Krebsbekämpfung geeignet.

Bekannte Beispiele für Protease-Inhibitoren aus natürlichen Quellen (Pflanzen, Mikroor ganismen) sind: Betulinsäure aus Doliocarpus verruculosus (Phytother. Res. (1996), 10(3), 194-197); Murrayanolide aus Dendrobeania murrayana (J. Nat. Prod. (1995), 58(12), 1978-82); WS75624 A und B aus Saccharothrix spec. (J. Antibiot. (1995), 48(10), 1066-72); Cinnamsäure (Int. J. Cancer (1995), 62(3), 1995); Pycnidion aus Phoma spec. (Tetrahedron (1993), 49(11), 2139-41); Talopeptin aus Streptomyces monzunensis (Tetrahedron Lett. (1982), 23(22), 2319-22); Propioxatin A aus Actinosynnema spec. (Biochem. (1997), 61(3), 561-562); BE16627B aus Streptomyces spec. (Japan Agents Actions (1993), 39(3-4), 182-86); Actinonin aus Streptomyces roseopullatus (J. Antibiot. (1987), 40, 1757); Phosphoramidon aus Streptomyces tanashiensis (Anticancer Res. (1984), 4, 221).

Synthetisch hergestellte Protease-Hemmer werden durch folgende Strukturtypen doku mentiert: Captopril (J. Immunol. (1994), 153(12), 5750-59); Macrocyclische Peptide (J. Med. Chem. (1998), 41(11), 1745-1748); Thiadiazolylthioharnstoffe (WO 9740031 A1), Piperazinosulfoamide (WO 9719068A1); Sulfonylaminosäuren (EP 757037A2), Mercap toacyl-Dipeptide (J. Med. Chem.(1996), 39(16), 3158-3168); Hydroxamsäure-Derivate (WO 9830541 A1).

Die Erfindung dient der Verwendung von Protease-Inhibitoren als Arzneimittel für die Behandlung von Krebsgeschwüren und Tumoren. Es wurde überraschenderweise gefun den, daß Verbindungen der Strukturklasse des Verongamins und Hydroxyverongamins als Inhibitoren von Proteasen geeignet sind. Die genannten Substanzen sind durch Biosynthese mit Hilfe geeigneter Produktionsorganismen, wie Schwämme der Gattung Verongula, insbesondere der Art Verongula gigantea oder Pseudoceratina crassa (Mierzwa, R.et.al J.Nat.Prod 57, 175, (1994); Ciminiello; P. et.al. J.Nat.Prod. 58, 689 (1995)) zugänglich.

Die Erfindung betrifft dementsprechend die Verwendung von Verongamin-Derivaten der Formel I,

worin R₁ Br ist, R₂ H, Alkyl (C₁-C₆), Acyl (C₁-C₁₀) bedeutet, für R₃ = H, Alkyl (C₁-C₆) und für R₄ = H, Alkyl (C₁-C₆), Acyl (C₁-C₁₀) stehen, und Salzen davon als Protease- Inhibitoren.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter Acyl z. B. der Acylrest einer (C₂-C₇)- Alkansäure, wie Essigsäure oder Propionsäure, der Acylrest eines Kohlensäure-halbesters, wie Kohlensäure-(C₁-C₄)-alkylesters, oder der Acylrest einer gegebenenfalls durch (C₁-C₄)- Alkyl mono-, di- oder tri-substituierten Benzoesäure zu verstehen.

Salze von Verbindungen der Formel I sind insbesondere Alkalimetallsalze, wie Natrium- und Kaliumsalze, ferner Ammoniumsalze, die als Additionsverbindungen mit Halogenwas serstoffsäuren wie Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, ferner (C₁-C₄)-Alkyl halogeniden, wie -chloriden oder -bromiden, vorliegen.

Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen erfolgt durch Extrakti on aus dem Gewebematerial von Verongula spec., vorzugsweise aus Verongula gigantea oder Pseudoceratina crassa, mit Methanol oder mit wasserunlöslichen Lösungsmitteln und nachfolgende Reinigung unter Einsatz üblicher chromatografischer Adsorbentien z. B. Kie selgel oder Dextrangele, sowie gegebenenfalls anschliessender Derivatisierung durch dem Fachmann bekannte Methoden (Evans, D. A et.al. J. Am. Chem. Soc. 112 5290 (1990); Cabre', J. et.al. Synthesis 413 (1984); Brown, L. et.al. J. Org. Chem. 49, 3875 (1984); Barton, D. H. R. et.al. Tetrahedron Lett. 27 3619 (1986)).

Die Verbindungen der Formel I gehören einer neuen Klasse proteaseinhibierender Natur stoffe (bzw. derivatisierter Naturstoffe) an, die sich von anderen Vertretern biologisch herstellbarer Naturstoffe mit proteasehemmenden Eigenschaften strukturell wesentlich unterscheiden. Eine proteaseinhibierende Wirkung von diesen substituierten Tyrosinderiva ten ist bisher noch nicht bekannt. Mit den Vertretern der genannten Strukturklasse wird angestrebt, die Palette von proteasehemmenden Präparaten zu vergrößern und Nachteile der bekannten Strukturen zu beseitigen. Für die Lösung dieser Aufgabe sind die neuen Verbindungen deshalb von Vorteil, weil die bisher bekannten Metalloprotease-Hemmer oft Nachteile, wie ungenügende Wirksamkeit, hohe Toxizität gegenüber Säugern, wie Mensch und Tier, andere unerwünschte Nebenwirkungen und unspezifische Wirksamkeit, aufweisen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung von substituierten Tyrosinde rivaten der Formel I und deren Verwendung bei der Behandlung proteaseabhängiger Krankheitszustände gelöst.

Die Protease-Hemmer können als solche in Substanz oder in Mischung mit geeigneten, dem Fachmann bekannten Hilfsstoffen oder Trägermaterial verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen oral oder parenteral appli ziert, aber auch eine rektale Anwendung ist möglich. Geeignete feste oder flüssige galeni sche Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten oder Dragees.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert, ohne sie jedoch einzuschränken.

Ausführungsbeispiel 1

Die Inhibitionswirkung von Verongamin (R₁ = Br, R₂ = CH₃, R₃, R₄ = H) auf eine Zink- Protease (isoliert aus Bacillus spec.), die aufgrund ihres Permeationsverhaltens, den in Tumorzellen überexpremierten Metalloproteasen ähnelt, wurde in einem in vitro-Assay wie folgt nachgewiesen (Jones, Laurie. J. et.al., Analytical Biochemistry 251 144-152 (1997)). Das Testprinzip beruht auf der Messung freiwerdender Fluoreszenzenergie infol ge proteolytischer Spaltung fluoreszenzmarkierten Caseinsubstrats. Wird die als Target eingesetzte Protease jedoch vorher mit einem Inhibitor inkubiert, so kann keine vollständi ge Aufspaltung des fluoreszenzmarkierten Proteinsubstrats mehr erfolgen, wodurch eine Differenz in freiwerdender, meßbarer Fluoreszenzenergie entsteht. Die Inhibitionswirkung wird anhand eines mitgeführten Standards vergleichbar und einschätzbar.

Ein Ansatz enthält in 220 µl: Puffer: 100 µl/VT; Substrat: 100 µl/VT; Verongamin bzw. Standardinhibitor: 10 µl/VT. Nach der Vorlage des Puffers werden Testsubstanzen und Standardinhibitor in festgelegten Konzentrationen (siehe Methodenbeschreibung) einge füllt. Mit Zugabe des Enzyms wird eine Vorinkubationszeit von 15 min, dabei 5 min Schütteln bei Raumtemperatur und 10 min Inkubation bei 30°C, wahrgenommen. An schließend erfolgt der Zusatz des in Arbeitskonzentration (10 µg/ml) vorliegenden Casein substrats. Die Testplatte wird dem Fluoreszenzreader FLUOROSCAN ASCENT, Type 374; LABSYSTEMS zugeführt und verweilt die gesamte Inkubationszeit von 1 Std, bei 30°C im Gerät, wobei mehrere Meßpunkte zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen werden. Der Test wird von der Auswerteinheit eigenständig ausgewertet, d. h. die prozen tuale Inhibierung sowie ein Iw-Wert (Verhältnis der prozentualen Inhibierung der Probe zum Standard bei gleicher Konzentration) zur Einschätzung der Testsubstanzen ermittelt. Verongamin zeigt einen IC₅₀-Wert gegenüber der Zink-Protease von 15 µg/ml (0,039 mM) und gegen Collagenase einen IC₅₀-Wert von 21,3 µg/ml (0,055 mM). Als Standard dient der typische Metalloprotease-Inhibitor Phosphoramidon.

Ausführungsbeispiel 2

Die Inhibitionswirkung von Hydroxyverongamin (R₁ = Br, R₂ = H, R₃, R₄ = H) wurde un ter den Bedingungen entsprechend Anwendungsbeispiel 1 gemessen.

Hydroxyverongamin zeigt einen IC₅₀-Wert gegenüber der Zink-Protease von 7,0 µg/ml (0,019 mM) und gegen Collagenase einen IC₅₀-Wert von 17,1 µg/ml (0,046 mM).

Methodenbeschreibung

Chemikalien, Reagenzien und Prüfsubstanzen:
Testkit 1 EnzChek Protease Assay Kit for green fluorescence (E-6638); BODIPY FL [MOBITEC]
Testkit 2 EnzChek Protease Assay Kit for red fluorescence (E-6639); BODIPY TR-X [MOBITEC]
0,1 M Natriumbicarbonat-Lösung; pH 8,3
Enzym; Modell 1: mikrobielle Metalloprotease aus Bacillus spec. (Zn-Protease)
Enzym; Modell 1: Thermolysin [ICN BIOMEDICALS, INC.], Metalloprotease, die als käuflich erworbene Protease zur Kontrolle des Versuchs mitgeführt wird enzymspezifischer Puffer (pH-Optimum des Enzyms beachten); im Modell 1: Digestion- Puffer (Substrat-Puffer) [MOBITEC]
Inhibitor (Standard); Modell 1: Phosphoramidon [ICN BIOMEDICALS, INC.] Aqua dest., Methanol, Ethanol
Prüfsubstanzen (Hersteller oder Lieferer) schwarze CLINIPLATE-Mikrotiterplatten

Herstellung von Arbeitslösungen Testkit

Digestion-Puffer:	2,5 ml des 20-fach konzentrierten Digestion-Puffer (zum Testkit gehörig) werden mit A. dest. auf ein Endvolumen von 50 ml aufgefüllt
Standardlösung des BODIPY FL bzw. BODIPY TR-X-Caseinsubstrats:	Herstellung einer 1 mg/ml-Lösung durch Zugabe von 0,2 ml A.dest. (BODIPY FL) bzw. Natriumbicarbonat-Puffer (pH 8,3) (BODIPY TR-X) zu dem im Vial vorliegenden Lyophilisat; Herstellung der Arbeitskonzentration von 10 µg/ml durch Verdünnung der Standardlösung (0,2 ml) mit 19,8 ml Digestion-Puffer
AL=L<Herstellung der Enzym- und Inhibitorlösung im Modell 1:
Enzym (Zn-Protease aus Bacillus spec.):	Lösen von 1 mg Lyophilisat in 1 ml Digestion-Puffer
Standard-Inhibitor (Phosphoramidon):	Herstellen einer 5 mg/ml-Stammlösung durch Zugabe von 100 µl DMSO + 900 µl Methanol zu 5 mg Phosphoramidon-Lyophilisat; 1 : 5-Verdünnung mit A. dest. Zur Herstellung der Arbeitskonzentration von 1 mg/ml

Testablauf Mikrotiterplattenbelegung

Gesamtvolumen/Vertiefung (VT):	220 µl
Digestion-Puffer/VT:	100 µl
Substrat-Lösung/VT:	100 ml
Standard-Inhibitor/VT:	10 µl
Testsubstanz/VT:	10 µl
Enzym-Lösung/VT:	10 µl

Meßgerät

FLUOROSCAN ASCENT, Type 374; LABSYSTEMS
Software: Ascent für Windows, Version 2.1 (1996)
Mikrotiterplatten: 96 VT; black Cliniplate

Lösungsmittel-Toleranz

Wie auch bei anderen Enzymtests häufig beobachtet, zeigt sich das Toleranzverhalten der Protease gegenüber Lösungsmitteln variabel (I_w zw. 0 bis 0,2). Testsubstanzen können i.d.R. unverdünnt nur als DMSO/Methanol-Gemisch (1 : 9) verwendet werden. Reines Methanol, Ethanol bzw. DMSO werden von der Protease meist nicht toleriert (I_w Ethanol: bis 0,5). Aufgrund des Inhibitionsverhalten des Standards wird eine 1 : 10 (5 µg/ml) bzw. 1 : 20 (2,5 µg/ml)-Verdünnung der Testsubstanzen mit A.dest. für einen realen Wirkungs vergleich von Testsubstanz und Standard befürwortet.

Auswertung

Der Nachweis einer Protease-Hemmung erfolgt über den gegenüber dem Enzym-0-Wert geringeren Fluoreszenzwert (FL-Wert).

Sollten Testsubstanzen also inhibitorische Eigenschaften besitzen, so wird, infolge der Vorinkubation von Enzym und Testsubstanz, das Enzym gehemmt und somit weniger Substrat gespalten, was mit einem geringeren FL-Wert korelliert.

Der Grad der Inhibierung kann über die Formel:

berechnet werden.

Zur Bewertung der Testsubstanz wird das Verhältnis von I% der Probe zu I% des Stan dards bei gleicher Konzentration von 50 µg/ml bzw. 5 und 2,5 µg/ml ermittelt und ergibt somit den Wert Iw:

Iw = I%_PR/I%_STI

Im Modell 1 wurde Phosphoramidon als Standard-Inhibitor und Vergleichssubstanz für Testproben gewählt, da er als, in der Literatur ausgezeichneter, typischer Inhibitor für Metalloproteasen einen IC₅₀-Wert von 1,18 µg/ml, d. h. 2,17 µM realisiert.

Claims

1. Verwendung von Verbindungen der Formel I,
worin R₁ Br und R₂ H, Alkyl(C₁-C₆), Acyl (C₂-C₁₀) bedeuten, für R₃ = H, Alkyl (C₁-C₆) und R₄ = H, Alkyl (C₁-C₆), Acyl (C₂-C₁₀) stehen, und deren Salze als Protease Inhibitoren.

2. Verwendung von Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch 1 als Inhibito ren der Collagenase.

3. Verwendung von Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch 1 als Inhibito ren von Metallo-Proteasen.

4. Verwendung der Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 1, worin R₁ = Br, R₂ = CH₃ und R₃ und R₄ H (Verongamin) bedeuten, als Protease-Inhibitor.

5. Verwendung der Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 1, worin R₁ = Br, R₂ = H und R₃ und R₄ H (Hydroxyverongamin) bedeuten, als Protease-Inhibitor.