-
Die
Erfindung betrifft Analysenverfahren, deren Genauigkeit und Präzision dadurch
erhöht
wird, daß die
Signale analytisch interessierender Ionen (Analysenionen) auf die
von Referenzionen bezogen oder daß die Verfahrensbedingungen
durch Referenzverfahren überprüft werden.
Diese „vergleichenden" Analysen sollen
in Ionenfallenmassenspektrometern vorgenommen werden.
-
Die
Erfindung besteht darin, die zu vergleichenden Ionensorten oder
Verfahren in getrennten, sich zeitlich schnell abwechselnden Einzelspektren unter
jeweilig optimalen Raumladungsbedingungen aufzunehmen, wobei die
Regelung der Raumladung in der Ionenfalle für die Einzelspektren der jeweiligen Ionensorte
oder des jeweiligen Verfahrens getrennt vorgenommen wird. Die Steuergröße für die Regelung
kann beispielsweise aus den jeweils letzten unter gleichen Bedingungen
aufgenommenen Einzelspektren hergeleitet werden. Dabei kann eine
Isolierung, aber auch eine Fragmentierung der interessierenden Ionensorten
vorgenommen werden. Durch diese Schachtelung von Einzelspektren
kann einerseits eine zeitsparende Steuerung der Raumladung, andererseits
ein großer
dynamischer Bereich für
die Messungen genutzt werden. Zur Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses – und damit
der Präzision
der Messung – können jeweils
mehrere geschachtelt aufeinanderfolgende Einzelspektren gleicher
Ionensorten getrennt zu Summenspektren addiert werden, wobei nur
die Summenspektren quantitativ ausgewertet werden.
-
Vergleichende
Analysen bieten sich immer dann an, wenn die Prozesse der Probenvorbereitung,
der Probenzuführung
oder der Messung nicht völlig
konstant zu halten sind. Der Vergleich einer Analysenmessung mit
den möglichst
zeitgleich gewonnenen Ergebnissen einer Referenzmessung kann lediglich
der Kontrolle des Meßverfahrens
dienen; es kann aber auch der Bezug eines Signals der Analysensubstanz
auf die Signale einer zur Probe zugebenen „internen" Referenzsubstanz Verluste einer Probenaufbereitung
ausgleichen. Es gibt viele Ausformungen solcher Vergleichsanalysen,
das Verfahren der quantitativen, massenspektrometrischen Analyse
mit einer isotopenmarkierten internen Referenzsubstanz, deren Ionen
im gleichen Spektrum mitgemessen werden, ist nur eines davon.
-
Ionenfallen
nach Paul bestehen aus einer hochfrequenzversorgten Ringelektrode
und zwei Endkappenelektroden; im Inneren können Ionen gespeichert werden.
Die Ionenfallen können
als Massenspektrometer verwendet werden, indem die gespeicherten
Ionen massenselektiv ausgeworfen und durch Sekundärelektronenvervielfacher
gemessen werden. Es sind mehrere verschiedene Methoden für den Ionenauswurf
bekannt geworden, auf die hier nicht näher eingegangen werden soll.
-
In
Hochleistungs-Ionenfallenmassenspektrometern, wie sie hier für vergleichende
Analysen eingesetzt werden sollen, dürfen sich nur relativ wenige
Ionen befinden, wenn gut aufgelöste
Spektren mit richtiger Massenzuordnung erhalten werden sollen. Befinden
sich zu viele Ionen in der Ionenfalle, so stört die Raumladung der Ionen
den Ionenauswurf und damit die Spektrenaufnahme. So wurde für ein weitverbreitetes,
kommerzielles Massenspektrometer dieser Art von nur 300 Nutzionen
berichtet, die für die
Messung eines Einzelspektrums zur Verfügung stehen. In Ionenfallen
der antragstellenden Firma stehen für ein Einzelspektrum etwa 2000
Ionen zur Verfügung.
Selbst damit ist aber der dynamische Bereich für vergleichende Analysen innerhalb
eines Spektrums außerordentlich
beschränkt.
-
Die
Raumladungsgrenze kann aus der Drift oder der Breitenzunahme der
Ionensignale bestimmt werden. Eine übliche Definition bezieht sich
auf eine Drift von 0,1 atomaren Masseneinheiten, das heißt, als
Raumladungsgrenze wird diejenige Ionenmenge in der Ionenfalle definiert,
die eine Zeitverzögerung des
Auswerfens der Ionen um eine solche Zeitdifferenz bewirkt, die umgerechnet
einer Massendrift von 0,1 atomaren Masseneinheiten gegenüber Normalbedingungen
entspricht.
-
Der
Einsatz der Raumladungswirkung ist relativ scharf. Eine Zunahme
der Füllmenge
an der Raumladungsgrenze von nur 10 % bewirkt bereits eine weitere
Drift um etwa 0,1 atomare Masseneinheiten, bleibt man dagegen um
eta 20 % unter der Raumladungsgrenze, so ist die Massendrift nicht mehr
meßbar.
-
Die
optimale Füllmenge
maß sich
stets um einen Sicherheitsabstand unterhalb der Füllmenge an
der Raumladungsgrenze befinden. Es hängt von der Güte der Raumladungsregelung
ab, wie groß dieser
Sicherheitsabstand gewählt
werden muß.
Eine sehr gute Regelung erlaubt es, bei einer optimalen Füllung zu
arbeiten, die sich lediglich 20 % unterhalb der Raumladungsgrenze
befindet; eine weniger gute Regelung kann dazu zwingen, bei der
halben oder sogar bei einem Drittel der Raumladungsgrenze zu arbeiten.
Die Güte
der Regelung ist also von starkem Einfluß auf die Meßdynamik
im Spektrum.
-
Ionenfallenmassenspektrometer
haben andererseits Eigenschaften, die ihren Einsatz für viele Arten
von Analysen interessant macht. So können ausgewählte Ionensorten in der Ionenfalle
isoliert und fragmentiert werden. Die Spektren dieser Fragmentionen
werden Tochterionenspektren der betreffenden Elternionen genannt.
Auch Enkelionenspektren können
gemessen werden. Durch die Zugabe von Reaktantgasen können Ionen-Molekül-Reaktionen
studiert werden, beispielsweise die Abhängigkeit deren Reaktionsgeschwindigkeiten
von den Konzentrationen der Reaktionspartner.
-
Die
Anpassung der Ionenfalle an wechselnde Konzentrationen der zugeführten Substanzen, oder
beispielsweise auch an wechselnde Ionisierungs-, Reaktions- oder
Zerfallsbedingungen, kann bei der Ionenfalle aus oben genannten
Gründen
nicht über
die Dynamik der Messung eines Massenspektrums unter Normalbedingungen
vorgenommen werden, wie es bei magnetischen Sektorfeld- oder Quadrupolfilter-Massenspektrometern
möglich
ist. Diese haben eine Meßdynamik
von sechs bis neun Zehnerpotenzen für die Messung der Ionenströme eines Spektrums.
-
In
der Ionenfalle muß daher
die Meßdynamik über die
Bedingungen bei der Regelung zur optimalen Füllung der Ionenfalle hergestellt
werden. Ist beispielsweise die Konzentration einer Substanz in der Probe
groß,
so ist bei konstanter Ionisierungsstärke die Füllzeit für die Ionenfalle bis zum Erreichen
der optimalen Befüllung
nur kurz. Ist die Konzentration dagegen sehr klein, so braucht es
eine lange Zeit, um die Ionenfalle optimal zu füllen. Das gilt in ähnlicher Weise
auch für
die Füllung
der Ionenfalle mit Reaktionsprodukten oder Tochterionen.
-
Die
Füllzeiten
können
in der Praxis zwischen 10 Mikrosekunden und 1000 Millisekunden,
also über 5
Zehnerpotenzen hinweg, variiert werden. Wird dieses Verfahren auf
die quantitative Analyse angewandt, so berechnet sich die Konzentration
dann aus einem Wert, der sich – bei
konstanter Erzeugung der Ionen – als
Signalhöhe
im Spektrum geteilt durch die Füllzeit
berechnet. Dieser Wert ist dem Ionenstrom dieser Ionensorte, der
während
der Ionisierung generiert wird, proportional. Somit wird bei der
Anwendung dieses berechneten Wertes für den Ionenstrom die Bestimmung
der Konzentration vergleichbar mit der durch andere Arten von Massenspektrometern. Die
Meßdynamik
der Ionenfallenmassenspektrometer erhöht sich damit von drei auf
acht Zehnerpotenzen; allerdings nur, wenn sich keine störenden Ionen im Überschuß in der
Ionenfalle befinden.
-
Die
Regelung zur Füllung
der Ionenfalle muß auf
einer Messung der Ionenanzahl in der Ionenfalle beruhen, aus dem
sich dann ein Steuerwert für
die Füllung
berechnen läßt. Da sich
die die Ionen in der Ionenfalle bisher nicht genügend einfach zerstörungsfrei
messen lassen, haben sich zwei verschiedenartige Verfahren herausgebildet:
- (1) Das Verfahren des „Prescan", bei dem ein kurzer Füllprozeß mit konstanter
Füllzeit
der eigentlichen Spektrennahme vorgeschaltet wird. Die dabei gebildeten
Ionen werden aus der Falle ausgetrieben d gemessen. Aus diesem Meßwert wird die
optimale Füllzeit
bestimmt ( US 5 107 109
A ). – Eine
Verbesserung besteht darin, die Füllzeit des Prescan nicht konstant
zu halten, sondern die Füllzeit
des Prescan aus rangegangenen Messungen auf optimale Meßbedingungen
hin zu steuern ( US 5
448 061 A ) der Patentanmeldung EP 0 630 042 A2 wird ebenfalls
die Information aus einem Prescan verwendet, um die optimale Füllzeit einer
nachfolgenden Spektrenaufnahme zu steuern. Allerdings wird hier
weiterhin eine interne Kalibrierung durch Referenzsubstanzen durchgeführt, deren
Ionen gleichzeitig (durch eine zusätzliche Dipolspannung) mit
den zu analysierenden Ionen aus der Ionenfalle ausgeworfen werden.– Diese
beiden Verfahren brauchen zusätzliche
Meßzeit
für den
Prescan, die der eigentlichen Spektrennahme verlorengeht.
- (2) Ein besseres Verfahren verwendet eine Füllsteuerung, die auf die bekannt
Füllrate
eines oder sogar mehrerer vorhergehender Spektren zurückgreift
( DE 4 326 549 C1 ).
Aus diesen Füllraten vorhergehender
Spektren wird auf einen Erwartungswert für die aktuelle Füllrate extrapoliert.
Die Extrapolation kann je nach den Bedingungen linear, quadratisch,
kubisch, exponentiell oder nach einer anderen bekannten Funktion
erfolgen. Aus dem prognostizierten Erwartungswert wird die aktuelle
Füllzeit
für die
optimale Füllmenge
berechnet. Die Füllrate
ist dabei als Füllmenge
geteilt durch die bekannte Füllzeit
definiert, die Füllmenge
wird als integrierter Ionenstrom über ein Spektrum bestimmt.
Da dabei auf die vorhergehend gemessenen Spektren zurückgegriffen
wird, wird keine zusätzliche
Zeit für
einen Prescan verbraucht. Besonders bei starken Änderungen in der Konzentration
der zugeführten
Substanzen, wie sie beispielsweise in der Kopplung mit chromatographischen
Trennverfahren vorliegen, ist diese Art der Raumladungsregelung
der Prescan-Methode
weit überlegen.
-
Das
Verfahren der sogenannten „internen Referenz" ist in allen Ausformungen
der quantitativen Analyse wohlbekannt. Es besteht darin, einer genau bekannten
Menge des Analysenguts (möglichst
vor jeglicher Probenaufbereitung) eine genau bekannte Menge einer
Referenzsubstanz zuzusetzen, und bei der letztendlichen Auswertung
der Analysenresultate die unbekannte Menge oder Konzentration der
Analytsubstanz auf die bekannte Menge oder Konzentration der Referenzsubstanz
zu beziehen. Sind sich die beiden Substanzen einander so ähnlich,
daß sie
für alle
Schritte der Aufbereitung und Analyse gleiches Verhalten zeigen,
so werden alle Verluste oder Veränderungen
oder Empfindlichkeitsunterschiede relativiert und durch den Bezug
aufeinander ausgemerzt.
-
Es
wird hier im Folgenden das Verfahren der internen Referenz beispielhaft
für eine
vergleichende Analyse behandelt, obwohl es viele verschiedene Arten
dieser vergleichenden Analysen mit verschiedenen Zielsetzungen gibt.
-
In
der Massenspektrometrie bietet es sich an, isotopisch veränderte Referenzsubstanzen
zu benutzen, die chemisch genau den Analytsubstanzen entsprechen.
Beispielsweise kann man Benzol (Molekulargewicht 78 atomare Masseneinheiten) hervorragend
analysieren, indem man voll deuteriertes Benzol (Molekulargewicht
86 atomare Masseneinheiten) als Referenz zusetzt. Verluste durch
Verdampfung, verschiedenartige Ionisierungswahrscheinlichkeiten
für Substanzen
und viele andere Effekte der Verfälschung von Analysenresultaten
entfallen damit weitestgehend.
-
Aber
auch chemisch den Analytsubstanzen sehr ähnliche Referenzsubstanzen
anderer Art lassen sich als Referenzsubstanzen benutzen, beispielsweise
Isomere, wenn sie ein verschiedenartiges Massenspektrum ergeben.
-
Für die Analyse
von Gemischen muß man die
Gemische in der Regel zunächst
durch ein Separationsverfahren auftrennen. Es bieten sich hier die wohlbekannten
chromatographischen oder elektrophoretischen Verfahren an. Man wählt dann
für das Verfahren
der internen Referenz in der Regel koeluierende Referenzsubstanzen,
um für
die quantitative Bestimmung möglichst
gleiche Verhältnisse
zu haben. Isotopenmarkiete Substanzen haben gewöhnlich (fast) gleiche Retentionszeiten.
-
Auf
diese Weise können
durch koeluierende Substanzen viele Schwierigkeiten der quantitativen Analyse
ausgeräumt
werden: So kann beipielsweise ein Sekundärelektronenvervielfacher, der
als Ionendetektor benutzt wird, durch vorausgehende Überladungen
mit Ionen aus demselben Chromatogramm ermüdet sein. Dadurch wird die
Empfindlichkeit zeitabhängig,
sie steigt durch Erholungseffekte nachfolgend wieder langsam an.
Diese sich zeitlich verändernde
Empfindlichkeit kann jedoch durch koeluierende Analyt- und Referenzsubstanzen
wieder relativiert und damit berücksichtigt
werden.
-
Bei
einem Ionenpeak, der aus 100 Ionen besteht, muß sich auch bei konstantem
Angebot an Substanz eine Schwankung der Ergebnisse wiederholter
Spektrennahmen zeigen, die aufgrund der Ionenstatistik durch eine
relative Standardabweichung von 10 % gekennzeichnet ist. Selbst
bei 1000 Ionen ergibt sich eine Schwankung mit einer relativen,
einfachen Standardabweichung von 3 %. Erst bei 10000 Ionen reduziert
sich die einfache Standardabweichung auf 1 %.
-
Je
nach geforderter Präzision
(Wiederholgenauigkeit) für
das Analysenverfahren müssen
also mindestens 100, 1000 oder gar 10000 Ionen gemessen werden.
Es ist damit ersichtlich, daß sich
eine höhere
Präzision
gar nicht durch die Ionen eines einzigen Spektrums erzielen läßt, sondern
daß mehrere Spektren
herangezogen werden müssen.
Es werden bei Ionenfallen aus diesem Grunde sehr häufig mehrere
aufeinanderfolgende „Einzelspektren" zu einem „Summenspektrum" addiert, bevor überhaupt
eine Auswertung des Spektrums erfolgt.
-
Die
mangelnde Meßdynamik,
die selbst in Summenspektren noch herrscht, wirkt sich besonders
dramatisch auf die Präzision
einer Messung des Verhältnisses
von Konzentrationen aus. Sollen Referenz- und Analysensubstanz in
einem einzigen, überlagerten
Spektrum gemessen werden, mit Ionen, die sich gemeinsam in der Ionenfalle
befinden, so müssen
genau gleiche Konzentrationen vorliegen, wenn optimale Präzision erreicht
werden soll. Bereits durch den Vergleich (Fehlerfortpflanzung bei
Quotientenbildung) wird die Präzision
um einen Faktor √2 ≈ 1,4 schlechter.
Ist die Konzentration einer der beiden Substanzen auch nur um einen
Faktor 10 geringer, so vermindert sich die Präzision der Analyse nochmals
um einen Faktor √(10) ≈ 3.
-
In
der Praxis kennt man aber die Konzentration der Analytsubstanz in
einer unbekannten Proben nicht. Es ist also die gleichzeitige Messung
von Analyt- und Referenzsubstanz in einer Ionenfalle wegen der dramatischen
Verluste an Präzision
praktisch nicht möglich.
-
Aufgabe der
Erfindung
-
Es
ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren für die vergleichende Messung
in einer Ionenfalle zu finden, die auch dann mit zufriedenstellender
Präzision
arbeitet, wenn die Ionen der miteinander zu vergleichenden Signale
im Ionisierungs-, Einspeicherungs, Isolierungs- oder Fragmentierungsprozeß mit sehr
verschiedenen Erzeugungsraten hergestellt werden, wie es beispielsweise
bei quantitativen Analysen mit Analysen- und Referenzsubstanzen
unterschiedlicher Konzentration der Fall ist.
-
Beschreibung
der Erfindung
-
Die
Ionen der miteinander zu vergleichenden Signale sollen im Folgenden
mit „Analysenionen" und „Referenzionen" bezeichnet werden,
auch wenn es sich dabei um gleichartige Ionen handelt, wie sie beispielsweise
beim Studium von Ionen-Molekül-Reaktionen
unter Verwendung von Referenzprozessen vorliegen.
-
Es
ist eine Grundidee der Erfindung, die Analysen- und Referenzionen
nicht in einem Spektrum, sondern in getrennten Spektren mit jeweils
optimaler Füllung
abwechselnd zu messen, und dabei die Regelung der Füllung der
Ionenfalle auf die letzten Spektren der gleichen Ionenart zu beziehen.
Es laufen also zwei Regelungsstränge
parallel, einer für
die „Analysenspektren" mit den Analysenionen
und einer für
die „Referenzspektren". Es wird für die Regelung kein
zeitraubender Prescan ausgeführt,
es wird aber auch aus naheliegenden Gründen nicht das zeitlich direkt
vorangehende Spektrum für
die Regelung herangezogen.
-
Werden,
wie bei quantitativer Analyse mit koeluierender interner Referenz,
beide Substanzen in einer Probe gemeinsam der Ionisierung zugeführt, so füllen sie
auch gemeinsam die Ionenfalle und führen zu einem gemeinsamen Massenspektrum.
Es ist daher eine weitere Grundidee der Erfindung, die Ionen der
beiden Substanzen in der Ionenfalle zu isolieren und dann in getrennten
Spektren mit jeweils optimal geregelter Füllung zu messen. Die Isolierung
kann in bekannter Weise bereits während der Ionisierung durch
Resonanzauswurf unerwünschter
Ionen durch die Anwendung von anregenden Frequenzgemischen mit Lücken vorgenommen
werden. Es können aber
auch, wie ebenfalls bekannt, Isolierungsverfahren nach einer gesteuerten Überfüllung der
Ionenfalle angewandt werden, da die Isolierungsverfahren auch mit
mehr als hundertfacher Überfüllung der
Ionenfalle noch arbeiten können.
Es bleibt somit auch bei nachträglicher Isolierung
die erwünschte
Meßdynamik
im Spektrum erhalten. In beiden Fällen besteht das „Spektrum" allerdings nur aus
den isolierten Ionen.
-
Auch
im Falle der Isolierung von Analyt- und Referenzionen muß die Füllung optimal
gesteuert werden. Es ist nun eine weitere Idee der Erfindung, den
Prozeß der
Isolierung mit in die Füllrate
und ihre Bestimmung aus früheren
Spektren einzuschließen. Die
Integration des Ionenstroms über
ein Spektrum dieser Art ergibt ja schon die Füllmenge, die durch Ionisierung,
Einspeicherung und Isolierung erzeugt wurde. In
DE 4 326 549 C1 bezieht
sich die Füllrate nur
auf die primäre
Ionenerzeugung und Einspeicherung, hier wird nun der Begriff der
Füllrate
auf den Isolierungsprozeß erweitert.
-
Es
ist nun eine weitere Idee der Erfindung, nach einer Fragmentierung
der isolierten Elternionen deren Tochter- oder Enkelionenspektren
für die quantitative
Analyse heranzuziehen, und hier auch die Fragmentierung in die Füllrate einzuschließen. Für die Regelung
braucht auch hier nur jeweils auf die früheren Tochter- oder Enkelionenspektren
gleicher Art zurückgegriffen
werden. – Hier
bietet sich der besondere Vorteil, daß diese Verfahren auch dann
noch arbeiten, wenn die Elternionen durch andere Ionen gleichen
Masse-zu-Ladungsverältnisses, aber
unbekannter Konzentration, überlagert
sind, solange sich nur die Tochterionenspektren unterscheiden.
-
Es
wird hier der besondere Vorteil der Regelung durch Rückgriff
auf früher
aufgenommene Spektren deutlich. Bei der Prescan-Methode, die ja
auch Isolierung und Fragmentierung der Ionen für den Prescan einschließen muß, wird
die zusätzlich
benötigte
Zeit exzessiv groß.
-
Für die vergleichende
Reaktionsanalytik, bei der auf Standardparameter für eine Referenzreaktion zurückbezogen
wird, braucht eine solche Isolierung der Ionen nicht unbedingt zu
erfolgen.
-
Bei
einem Vergleich von mehr als zwei Ionensorten oder mehr als zwei
Reaktionsbedingungen können
auch drei oder mehr Spektren abwechselnd gemessen werden, wobei
dann drei oder mehr Steuerungsstränge parallel laufen müssen.
-
Da
die Messungen der für
die Regelung notwendigen Integrationswerte bei der Schachtelung der
Einzelspektren bereits zwei oder mehr Einzelspektrenaufnahmezeiten
zurückliegen,
ist es wichtig, eine vorausschauende Regelung zu implementieren, wie
in
DE 4 326 549 C1 vorgeschlagen.
Der Wert für die
voraussichtliche Füllrate,
der die Füllzeit
bestimmt, wird dabei nicht als konstant vom letzten Spektrum übernommen,
sondern es findet eine vorausschauende Extrapolation aus zwei, drei
oder sogar vier letztaufgenommen Spektren der gleichen Ionensorte
statt, beispielsweise durch eine lineare, quadratische oder kubische
Extrapolation. Es kann für
den Beginn von chromatographischen Peaks (im Fußbereich der Glockenkurve des
Peaks) auch mit sehr gutem Erfolg eine exponentielle Extrapolation aus
nur zwei Spektren vorgenommen werden, die einfach auf dem „Wachstumsfaktor" des dort exponentiell
ansteigenden Ionenstromsignals beruht.
-
Durch
diese Schachtelung von Spektren mit getrennter Füllungsregelung für die einzelnen
Ionensorten wird nun die Dynamik der Messung ganz erheblich erhöht. Beispielsweise
können
die Konzentrationen von Analysenionen und Referenzionen einer quantitativen
Messung in beiden Richtungen um bis zu einem Faktor 100 und mehr
auseinanderliegen, ohne daß die
Präzision
der Analyse beeinträchtigt wird.
Es ist also eine quantitative Analyse mit gleichbleibender Präzision über mehr
als vier Zehnerpotenzen in der Variation der Analytkonzentration
möglich.
-
Da
ein Einzelspektrum, wie oben dargelegt, häufig nicht den Präzisionsansprüchen an
die Analyse entspricht, müssen
meist mehrere Spektren aufaddiert werden. Dabei müssen die
Rohspektren vor irgendeiner weiteren Auswertung addiert werden, weil
nur dadurch das Signal-zu-Rausch-Verhältnis entsprechend
steigt. Meist werden etwa 3 bis 20 Einzelspektren zu einem „Summenspektrum" durch Addition aller
korrespondierenden Einzelmeßwerte längs der
Spektrenaufnahme zusammengefaßt.
Diese Addition muß nun
zweckmäßigerweise
auch für die
einzelenen Ionensorten getrennt vorgenommen werden.
-
Für eine optimale
Steuerung nach dieser Erfindung ist es dabei nicht zweckmäßig, die
Einzelspektren für
ein Summenspektrum hintereinander aufzunehmen, da sonst die optimale
Regelungskette zu lange unterbrochen wird. Es müssen vielmehr ausdrücklich die
Einzelspektren alternierend aufgenommen werden, um die Füllsteuerung
optimal vornehmen zu können.
Es findet dabei eine Addition der Einzelspektren zu zwei (oder mehr)
Summenspektren zeitparallel statt.
-
Weitere Vorteile
der Erfindung
-
Diese
Methode hat weitere Vorteile. So können beispielsweise Tochterionenspektren
des Analyten mit Enkelionenspektren der Referenz (oder umgekehrt)
verglichen werden. Es können
für die
beiden Substanzen verschiedene Fragmentierungsbedingungen, optimal
jeweils für
die Substanz, eingestellt werden.
-
Inbesondere
aber lassen sich störende Überlagerungen
von Signalen vermeiden: beispielsweise können Tochterionenspektren von
Analyt und Referenz miteinander verglichen werden, die gleich aussehen.
Beispiel: Wird als Referenz eine Substanz verwendet, die eine mit
dem Isotop 37 u des Chlors markierte 12C37Cl3-Gruppe enthält, so ist
das Molekülion
dieser Referenz sehr gut gegenüber
dem Molekülion
des Analyten mit Normalchlor zu isolieren. Geht aber bei der Tochterionenbildung
diese Gruppe verloren, so haben die Tochterionen von Analyt und Referenz
die gleichen Massen. In den beiden getrennt aufgenommenen Spektren
sind sie aber gut getrennt zu messen.
-
Beschreibung
der Abbildung
-
1 zeigt
das einfache und schnelle Berechnungsschema für die lineare, quadratische
und kubische Extrapolation der Füllraten
f0 aus den gemessenen Füllraten f1 bis
f4 der vorausgehenden Spektren, wenn diese – wie gewöhnlich – gleiche
Aufnahmenzeitabstände
haben.
-
Beschreibung
günstiger
Ausführungsformen
-
Eine
erste Ausführungsform
der vergleichenden Analyse bezieht sich auf die Messung der Reaktionskinetik
von Ionen-Molekül-Reaktionen.
Dabei werden im Prinzip in einer Ionenfalle Ionen einer Sorte eingespeichert
und durch Stöße mit den
Molekülen eines
Reaktantgases zur Reaktion gebracht. Verbrauch der Originalionen
und Zunahme der Produktionen werden als Funktion der Reaktionszeit
(der Wartezeit bis zur Aufnahme der Spektren) und der Reaktantgaskonzentration
gemessen. Aus den Messungen werden Reaktionszeitkonstanten und Reaktionstypus
bestimmt.
-
Dabei
können
die Originalionen in einer Ionenquelle außerhalb der Ionenfalle erzeugt
und in bekannter Weise in die Ionenfalle eingebracht werden. Das
Reaktantgas kann sich durch kontinuierliche Einleitung fortwährend in
der Ionenfalle befinden. Für
die Bestimmung der Zeitkonstanten werden Analysenspektren mit jeweils
verlängerter
Wartezeit bis zur Spektrenaufnahme aufgenommen.
-
Die
Vergleichsanalyse hat in diesem Fall den Sinn, die gesamten Verfahrensbedingungen
einschließlich
der Konstanz der Konzentration des zugeführten Reaktantgases überprüfen zu können. Es wird
dazu ein Referenzverfahren mit einer Standardwartezeit definiert,
und es werden Analysen- und Referenzspektren jeweils nach dieser
Erfindung geschachtelt mit jeweils eigenständiger Regelung der Füllung aufgenommen.
-
Für die Messung
der Abhängigkeit
von der Konzentration des Reaktantgases kann man in ähnlicher
Weise Referenzverfahren definieren, mit denen sich beispielsweise
die Konzentration des Referenzgases überprüfen und notfalls sogar regeln
läßt.
-
Werden
die Originalionen für
die Ionen-Molekül-Reaktionen
durch einen Elektronenstrahl innerhalb der Ionenfalle gebildet,
so kann es notwendig sein, die Ausgangsionen für die Reaktion zunächst zu
isolieren, um Nebenreaktionen gleichzeitig gebildeter, aber unerwünschter
Ionen auszuschalten. Die Isolierung kann beispielsweise in an sich
bekannter Weise durch ein Frequenzgemisch mit Frequenzlücken erzeugt
werden, das an die beiden Endkappen der Ionenfalle angelegt wird
und so ein dipolares Feld mit gemischten Anregungsfrequenzen in
der Ionenfalle erzeugt. Die Anregungsfrequenzen bringen die unerwünschten
Ionen zu Schwingungen zwischen den Endkappen, deren Amplituden sich
vergrößern und
die Ionen schließlich
aus der Ionenfalle entfernen. Die Frequenzlücke bestimmt somit die erwünschten
Ionen, die in der Ionenfalle verbleiben, weil ihre Fundamentalfrequenzen
nicht angeregt werden.
-
Da
die Regelung der Füllung
sich auf die gemessenen Ionen der letzten Spektren gleicher Art
bezieht, bezieht die Regelung der optimalen Füllmenge die Isolierung mit
ein.
-
Es
ist aber nicht notwendig, die Isolierung während der Ionenerzeugung und
-einspeicherung vorzunehmen. Es kann die Ionenfalle während der
Ionenerzeugung bis weit über
die optimale Füllmenge hinaus
mit Ionen gefüllt
und erst dann die Isolierung angewandt werden. Da die Isolierung
auch dann gut arbeitet, wenn eine mehr als hundertfache Überladung
vorliegt, kann in diesem Fall die zeitweilige Überladung der erfindungsgemäßen Regelung
der Füllzeit
willentlich so gesteuert werden, daß erst nach der Isolierung
der erwünschten
Ionensorte die optimale Füllmenge
der Ionenfalle vorliegt. Die „Füllrate" schließt also
in diesem Fall den Prozeß der
anfänglichen Überladung
und der anschließenden
Isolierung mit ein. Da sich die Regelung der Füllmenge nach der Erfindung
auf die integralen Ionenmengen der vorausgehenden Spektren gleicher
Erzeugungsart beziehen, muß nicht
einmal bekannt sein, wie hoch die Überladung im speziellen Fall
eigentlich ist.
-
Eine
zweite Ausführungsform
des Verfahrens nach dieser Erfindung bezieht sich auf die quantitative
Analyse mit interner Referenz. Dabei wird der Analysenprobe, in
der die Analysensubstanz („Analyt") befindet, eine
Referenzsubstanz bekannter Menge zugegeben. Die Referenzsubstanz
soll dem Analyt möglichst ähnlich sein,
beispielsweise kann als Referenz eine isotopenmarkierte Verbindung
genommen werden, die chemisch mit dem Analyten identisch ist. Bei
nachfolgenden Probenaufbereitungsschritten, wie beispielsweise einer
Anreicherung des Analyten in der Probe durch Extraktion, verhalten sich
dann Analyt und Referenz völlig
gleich.
-
In
vergleichenden Analysen mit interner Referenz, die in magnetischen
Sektorfeldgeräten
oder auch in Quadrupolfilter-Massensgektrometern durch geführt werden,
werden nun die Signale der Analytionen und der Referenzionen im
selben Massenspektrum gemessen und dann aufeinander bezogen, da die
Meßdynamik
im Spektrum genügend
groß ist. Das
ist in Ionenfallenmassenspektrometern wegen der geringeren Meßdynamik
nicht möglich.
-
Nach
der vorliegenden Erfindung werden daher die Analytionen und die
Referenzionen in getrennten Einzelspektren gemessen, wobei die Füllrate getrennt
geregelt wird. Diese Einzelspektren können aber, da ja beide Ionensorten
gemeinsam mit der Probe ionisiert werden, nur durch Isolierung der
entsprechenden Ionensorten getrennt gemessen werden.
-
Wenn
die Möglichkeit
besteht, daß die
Analyt- oder Referenzionen auch noch durch andere Ionen der gleichen
Masse (besser: des gleichen Masse-zu-Ladungsverhältnisses) überlagert werden, so können die
beiden Ionensorten auch noch zu Tochterionen fragmentiert werden,
bevor die Spektren gemessen werden. Solange die überlagernden Ionen nicht zu
intensiv sind und andere Tochterionen erzeugen, können die
beiden Tochterionensorten getrennt in reiner Form gemessen und entsprechend
aufeinander bezogen werden.
-
In
dieser Weise kann man häufig
die Konzentration von Analytsubstanzen messen, ohne daß überhaupt
eine Gemischseparation durch chromatographische oder elektrophoretische
Trennverfahren durchgeführt
werden muß.
-
Von
besonderer Wichtigkeit sind beipielsweise Messungen des Metabolismus
von pharmakologisch genutzten Substanzen. Für die Zulassung eines neuen
Medikaments ist es notwendig, den Metabolismus solcher Substanzen
mit allen Abbaustufen aufzuklären,
die Aufenthaltszeiten aller Zwischenprodukte im menschlichen Körper zu
bestimmen, und die Streubreiten aller Werte in verschiedenen Menschen
genauestens zu messen. Dazu sind Zehntausende von Ana lysen vonnöten. – Für diese
Messungen werden Analysenverfahren gesucht, die in kürzester
Zeit genügend
sicher auszuführen
sind.
-
Da
die meisten Metaboliten schwerflüchtig, aber
gut in Wasser und anderen Lösemitteln
löslich sind,
hat sich für
diese Messungen insbesondere die Flüssigkeitschromatographie in
Verbindung mit einer Ionisierung durch Elektrospray durchgesetzt.
Um die Analysenzeit abzukürzen,
wird die Flüssigkeitschromatographie
so weit wie möglich
durch die Wahl der Bedingungen abgekürzt. Dabei findet keine vollständige Trennung
aller Gemischkomponenten mehr statt. Durch die Aufnahme von Tochterionenspektren erreicht
man aber genügend
substanzspezifische Analysen. Die erforderliche Präzision liegt
je nach Toxizität
der Metaboliten zwischen 1 % und 10 % einfacher Standardabweichung;
interne Referenzverfahren sind notwendig, um die Richtigkeit zu
gewährleisten.
-
Soll
dieses Verfahren in Ionenfallen ausgeführt werden, so ist in der Regel
eine Addition mehrerer Spektren notwendig. Das Analysenverfahren sieht
dabei wie folgt aus: In die Eingabestation eines Kurzsäulen-Flüssigkeitchromatographen
wird die aufbereitete Probe, der vor Aufbereitung eine isotopenmarkierte
Referenz mittlerer Konzentration zugegeben wurde, in Abstanden von
etwa drei Minuten eingespritzt. Über
den Peak des Metaboliten hinweg, der etwa 10 Sekunden Breite hat,
werden erfindungsgemäß zeitgeschachtelte
Tochterionenspektren von Metabolit und Referenz aufgenommen, wobei
zwei Regelungsstränge
die jeweils optimale Füllmenge
erzeugen. Jeweils fünf
Tochterionenspektren jeder Substanz werden addiert. Da insgesamt
die Aufnahme eines einzelnen Tochterionenspektrums 200 Millisekunden
dauert, können
fünf solcher
Einzelspektren pro Sekunde aufgenommen werden. Da der chromatographische
Peak etwa 10 Sekunden Breite hat, werden insgesamt fünf Summenspektren
des Metaboliten und fünf
Summenspektren der Referenz aufgenommen. Von diesen lassen sich
mittleren drei Summenspektren hervorragend auswerten; die Einzelspektren
für das
erste Summenspektrum dienen dazu, die Regelung gut einzuschwingen
zu lassen. Mit dieser Aufnahmetechnik läßt sich das Analysenproblem
lösen,
und die geforderte Präzision
läßt sich erreichen,
auch wenn das Einzelspektrum die Präzision keineswegs erreicht.
-
Die
Regelung greift in diesem Fall am besten auf eine kubische Extrapolation
zurück,
da sich das Signal im chromatographischen Peak sehr rasch ändert. Das
Schema einer kubischen Extrapolation ist in 1 dargestellt.
Aus den vier Füllraten
f1 (jüngstes Tochterionenspektrum)
bis f4 werden die Differenzen a1 bis
a3 gebildet, daraus die Differenzen b1 und b2, daraus
die Differenz c1. Die kubische Extrapolation für den Erwartungswert
fkub ergibt sich sehr einfach zu fkub = f1 + a1 + b1 + c1. Diese sehr einfache Berechnung setzt voraus,
daß die
zeitlichen Abstände
der Spektrennahmen gleich sind. – Die lineare Extrapolation
ergibt sich übrigens
zu flin = f1 + a1; die quadratische Extrapolation zu fqu = f1 + a1 + b1.
-
Für den Fachmann
ist es leicht, für
andere Arten von Vergleichsanalysen nach den hier gegebenen Beschreibungen
die speziell auf diese Analysen zugeschnittenen Verfahren zu entwickeln.