DE19637947A1

DE19637947A1 - Nucleic acid construct coding for a protein complex of stat protein and nuclear receptor and its use

Info

Publication number: DE19637947A1
Application number: DE1996137947
Authority: DE
Inventors: Bernd Dr Groner; Elisabeth Dr Stoecklin
Original assignee: BIOMEC TECHNOLOGIE TRANSFER GM
Current assignee: BIOMEC TECHNOLOGIE TRANSFER GM
Priority date: 1996-09-17
Filing date: 1996-09-17
Publication date: 1998-03-19
Also published as: WO1998012320A1; AU4774497A

Abstract

The invention concerns a nucleic acid construct coding for a protein complex containing a) a stat protein or a functional derivative thereof and b) an activated nuclear receptor or a functional derivative thereof, and its use in controlling a gene expression.

Description

Die Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-Konstrukt kodierend für einen Proteinkomplex enthaltend a) ein Stat-Protein oder ein funktionelles Derivat davon und b) einen aktivierten nukleären Rezeptor oder ein funktionelles Derivat davon und seine Verwendung in der Kontrolle der Genexpression.The invention relates to a nucleic acid construct coding for a protein complex containing a) a stat protein or a functional derivative thereof and b) an activated one nuclear receptor or a functional derivative thereof and its use in the control of gene expression.

Für die Mehrzahl der Proteine ist die Regulation der Transkription ihrer Gene der wichtigste Schritt bei der Kontrolle der Genexpression. Insbesondere in höheren eukaryotischen Zellen wird die Transkription der DNA in RNA, die nach einem Prozessierungsschritt als Matrize für die Proteinsynthese dient, durch eine Vielzahl von Proteinen positiv wie auch negativ kontrolliert. Es ist daher nicht verwunderlich, daß extrazelluläre Signalproteine (ESPs) die Transkription von ruhenden Genen in den Zielzellen spezifisch aktivieren können.For the majority of proteins the regulation of Transcription of their genes is the most important step in the process Control of gene expression. Especially in higher ones eukaryotic cells will translate DNA into RNA, which after a processing step as a matrix for the Protein synthesis serves through a variety of proteins controlled positively as well as negatively. It is therefore not surprising that extracellular signaling proteins (ESPs) Specific gene transcription from resting genes can activate.

Zu den ESPs zählen beispielsweise Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytokine und Interleukine. Cytokine sind von Zellen sekretierte Proteine, die beispielsweise das Wachstum, die Differenzierung und die Aktivierung von Zellen regulieren und eine wichtige Rolle bei der Immunantwort spielen. Darunter fallen Interleukine, eine Gruppe von Molekülen, die von Immunzellen sekretiert werden. Die Bindung der Cytokine an Rezeptoren der Zellmembran verursacht im allgemeinen eine Homo- oder Heterodimerisierung des Rezeptors und löst als Folge davon intrazelluläre Signale aus. Eines der ersten Signale ist die Aktivierung von Proteintyrosinkinasen (PTKs), die mit dem Rezeptor physikalisch assoziiert sind. Die aktivierten, rezeptorassoziierten PTKs wiederum phosphorylieren verschiedene Substrate, die das extrazelluläre Signal von der Zelloberfläche zu dem ruhenden Gen im Zellkern weitertragen.The ESPs include, for example, hormones, growth factors, Cytokines and interleukins. Cytokines are from cells secreted proteins, for example the growth, the Regulate differentiation and activation of cells and play an important role in the immune response. Underneath fall interleukins, a group of molecules made by Immune cells are secreted. Binding of the cytokines Cell membrane receptors generally cause one Homo- or heterodimerization of the receptor and dissolves as As a result, intracellular signals. One of the first Signals is the activation of protein tyrosine kinases (PTKs), that are physically associated with the receptor. The activated, receptor-associated PTKs in turn phosphorylate various substrates that make up the extracellular Signal from the cell surface to the resting gene in the cell nucleus carry on.

Vor kurzem wurde ein neuer Signaltransduktionsweg charakterisiert, der die mitogenen Signale verschiedener Zytokine vermittelt. Dieser Signaltransduktionsweg beruht auf der Aktivierung einer Kinase aus der Janus Proteintyrosinkinase-Familie (Jaks) durch Cytokinrezeptoren und durch Wachstumsfaktor-Rezeptoren. Jaks sind cytoplasmatische, nicht-transmembrane Tyrosinkinasen mit einem Molekulargewicht zwischen 125 und 135 kD, die spezifisch mit Rezeptoren assoziiert sind (Heim, M. H., Europ. J. Clinical Invest., 26, 1-12, 1996). Das gemeinsame Merkmal der Mitglieder der Jak-Familie sind zwei Tandem-Tyrosinkinase- Domänen (JH1, Jak Homologie 1 auch PTK genannt, und JH2, auch KRD genannt). Daneben gibt es noch weitere homologe Domänen JH3-JH7, die allen Jaks gemeinsam sind.Recently a new signal transduction path was developed characterized the mitogenic signals of different Cytokines mediated. This signal transduction path is based on the activation of a kinase from the Janus Protein tyrosine kinase family (Jaks) through cytokine receptors and through growth factor receptors. Jaks are cytoplasmic, non-transmembrane tyrosine kinases with one Molecular weight between 125 and 135 kD, specific with Receptors are associated (Heim, M.H., Europ. J. Clinical Invest., 26, 1-12, 1996). The common characteristic of Members of the Jak family are two tandem tyrosine kinases Domains (JH1, Jak Homologie 1 also called PTK, and JH2, too Called KRD). There are also other homologous domains JH3-JH7 that are common to all Jaks.

Die Aktivierung der Jaks resultiert in der Phosphorylierung von Signaltransduktoren und -aktivatoren der Transkription (Stat). Die Stat-Proteine sind Transkriptionsfaktoren, die spezifisch an Promotorsequenzen von Genen binden und die Transkription dieser Gene durch die RNA Polymerase II stimulieren (Heim, M. H., supra). Die Stat-Proteine wandern hierbei zwischen Cytoplasma, Zellmembran und Zellkern hin und her. In unstimulierten Zellen befinden sie sich vornehmlich im Cytoplasma. Die Bindung eines Liganden an den membranständigen Rezeptor, die zur Aktivierung des Rezeptor-Kinase-Komplexes führt, bewirkt die Aktivierung der Stat-Proteine an der Zellmembran. Die aktivierten Stat-Proteine dimerisieren und wandern in den Zellkern, wo sie an spezifische DNA-Sequenzen binden und die Transkription des Gens spezifisch aktivieren.The activation of the Jaks results in the phosphorylation of signal transducers and activators of transcription (Stat). The stat proteins are transcription factors that bind specifically to promoter sequences of genes and the Transcription of these genes by RNA polymerase II stimulate (Heim, M.H., supra). The stat proteins migrate between the cytoplasm, cell membrane and cell nucleus forth. In unstimulated cells, they are mainly in the Cytoplasm. Binding of a ligand to the membrane Receptor, which is used to activate the receptor-kinase complex leads to the activation of the stat proteins on the Cell membrane. The activated stat proteins dimerize and migrate to the cell nucleus, where they attach to specific DNA sequences bind and specifically activate the transcription of the gene.

Die Stat-Proteine bestehen aus ca. 750-850 Aminosäuren und enthalten eine DNA-Bindedomäne, eine sogenannte "src homology 2 domain" (SH2), eine Transaktivierungsdomäne (TAD), einen unmittelbar C-terminal von der SH2-Domäne liegenden Tyrosinrest und einen Serinrest in der Transaktivierungsdomäne (Heim, M. H., supra). Die SH2-Domäne ist ungefähr zwischen den Aminosäuren 600 und 700 lokalisiert. Die Stat-Proteine binden über ihre SH2-Domäne an phosphorylierte Tyrosinreste von Transmembran-Rezeptoren, wobei die rezeptor-assoziierte JAK-Kina se die Stat-Proteine spezifisch an dem einzigen Tyrosinrest phosphorylieren. Dies hat zur Folge, daß zwei Stat-Proteine spezifisch über SH2-Phosphotyrosin-Interaktionen reziprok interagieren und dimerisieren. Das Stat-Protein-Dimer wandert in den Zellkern und bindet spezifisch an Promotorsequenzen im Genom der Zelle. Die DNA-Bindedomäne der Stat-Proteine liegt ungefähr zwischen den Aminosäuren 400 und 500. Nach der Bindung des Stat-Protein-Dimers an die DNA interagiert das Dimere über eine Transaktivierungsdomäne mit dem RNA Polymerase II Transkriptionskomplex, um die Transkription des ruhenden Gens zu aktivieren bzw. zu verstärken. Ein Transkriptionskomplex besteht im allgemeinen aus einer RNA Polymerase und weiteren Transkriptionsfaktoren, wie z. B. TATA-Box-Bindeproteine, die die spezifische Transkription eines Gens kontrollieren. Man hat auch gefunden, das Tyrosin- und Serin-phosphorylierte Stat-Proteine stärkere Transkriptionsaktivatoren sind als Tyrosin-phosphorylierte Stat-Proteine (Wen, Z. et al., Cell, 82, 241-250, 1995). Mit Ausnahme von Stat4, welches hauptsächlich im Thymus und in der Testis exprimiert wird, kommen die bis heute bekannten Proteine Stat1, 2, 3, 5 und 6 ubiquitär vor.The Stat proteins consist of approx. 750-850 amino acids and contain a DNA binding domain, a so-called "src homology 2 domain" (SH2), a transactivation domain (TAD), a tyrosine residue located directly at the C-terminal of the SH2 domain and a serine residue in the transactivation domain (Heim, MH, supra). The SH2 domain is located approximately between amino acids 600 and 700. The Stat proteins bind via their SH2 domain to phosphorylated tyrosine residues from transmembrane receptors, the receptor-associated JAK kinase specifically phosphorylating the Stat proteins at the only tyrosine residue. As a result, two Stat proteins interact reciprocally and dimerize specifically via SH2-phosphotyrosine interactions. The stat protein dimer migrates into the cell nucleus and binds specifically to promoter sequences in the genome of the cell. The DNA binding domain of the Stat proteins is approximately between amino acids 400 and 500. After the binding of the Stat protein dimer to the DNA, the dimer interacts with the RNA polymerase II transcription complex via a transactivation domain in order to activate the transcription of the resting gene or to reinforce. A transcription complex generally consists of an RNA polymerase and other transcription factors, such as. B. TATA box binding proteins that control the specific transcription of a gene. It has also been found that tyrosine and serine phosphorylated Stat proteins are stronger transcription activators than tyrosine phosphorylated Stat proteins (Wen, Z. et al., Cell, 82, 241-250, 1995). With the exception of Stat4, which is mainly expressed in the thymus and in the testis, the proteins Stat1, 2, 3, 5 and 6 known to date are ubiquitous.

Das Promotor-Element, an das die Stat-Proteine spezifisch binden, kann grundsätzlich in zwei Gruppen aufgeteilt werden (Heim, M. H., supra). Die erste Gruppe wird als "interferon stimulated response element" (ISRE) bezeichnet und besitzt die Konsensus-Sequenz AGT TTC NNT TTC NC/T, wobei N jedes beliebige Nukleotid bedeutet. Dieses Element ist beispielsweise die Bindestelle des sogenannten "interferon stimulated gene factor 3" (ISGF 3), der ein Komplex aus einem Stat1-Stat2-Heterodimer und ein 48 kD Protein ist. Die zweite Gruppe wird als "GAS-like response elements" bezeichnet und besitzt die Konsensus-Sequenz TTN NNN NAA. "GAS" steht für "IFN-Y response element" im Promotor des GBP ("guanylate binding protein")-Gens. Dieses Element ist beispielsweise die Bindestelle für Stat1-Homodimere, Stat1-Stat3-Heterodimere, Stat3-Homodimere, Stat4-Homodimere, Stat5-Homodimere und Stat6-Homodimere, wobei die variablen inneren Nukleotide an Art und Zahl die Bindungsaffinität der Stat-Dimere beeinflussen können. So binden beispielsweise das Stat1-Homo dimere an die Sequenz TTC CCA GAA, das im Promotor des FcγR1 Gens vorkommt, und das Stat3-Homodimere an die Sequenz TTC CCG TCA, das im Promotor des c-fos Gens vorkommt. Ein weiteres Beispiel ist das Stat5-Dimere, das an die Konsensussequenz TTC NNN GAA bindet, wobei die spezifische Bindung an die Sequenz AC TTC TTG GAA mit höherer Affinität und die spezifische Bindung an die Sequenz AT TTC TTG GGA mit geringerer Affinität erfolgt (Groner, B. & Gouilleux, F., Current Opinion in Genetics & Development, 5, 587-594, 1995). Diese Sequenzen werden im Promotor des β-Caseingens gefunden. Die folgenden Tabellen aus Heim, M. H. (supra) (Tabelle 1) und Ivashiv, L. B. (Immunity, 3, 1-4, 1995) (Tabelle 2) geben einen beispielhaften Überblick über die verschiedenen Stat- Bindesequenzen: The promoter element to which the stat proteins specifically bind can basically be divided into two groups (Heim, MH, supra). The first group is called the "interferon stimulated response element" (ISRE) and has the consensus sequence AGT TTC NNT TTC NC / T, where N means any nucleotide. This element is, for example, the binding site of the so-called "interferon stimulated gene factor 3" (ISGF 3 ), which is a complex of a Stat1-Stat2 heterodimer and a 48 kD protein. The second group is called "GAS-like response elements" and has the consensus sequence TTN NNN NAA. "GAS" stands for "IFN-Y response element" in the promoter of the GBP ("guanylate binding protein") gene. This element is, for example, the binding site for Stat1 homodimers, Stat1-Stat3 heterodimers, Stat3 homodimers, Stat4 homodimers, Stat5 homodimers and Stat6 homodimers, the type and number of the variable inner nucleotides being able to influence the binding affinity of the stat dimers . For example, the Stat1 homodimers bind to the sequence TTC CCA GAA, which occurs in the promoter of the FcγR1 gene, and the Stat3 homodimers bind to the sequence TTC CCG TCA, which occurs in the promoter of the c-fos gene. Another example is the Stat5 dimer, which binds to the consensus sequence TTC NNN GAA, with specific binding to the sequence AC TTC TTG GAA with higher affinity and specific binding to the sequence AT TTC TTG GGA with lower affinity (Groner, B. & Gouilleux, F., Current Opinion in Genetics & Development, 5, 587-594, 1995). These sequences are found in the promoter of the β-case gene. The following tables from Heim, MH (supra) (Table 1) and Ivashiv, LB (Immunity, 3, 1-4, 1995) (Table 2) provide an exemplary overview of the different Stat binding sequences:

Tabelle 1 Table 1

Tabelle 2 Table 2

Die Spezifität der intrazellulären Signalübertragung kann bei dem Jak-Stat-Übertragungsweg im allgemeinen auf zweierlei Weise geregelt werden. Zum einen wird die Spezifität über die selektive Aktivierung von Stat-Proteinen aufgrund der spezifischen Bindung eines Liganden an seinen Rezeptor bestimmt und zum anderen wird die Spezifität über die spezifische Bindung der Stat-Dimere an die Promotorsequenzen geregelt. Die folgenden Tabellen aus Heim, M. H. (supra) sollen eine Übersicht über die verschiedenen Liganden bzw. Liganden-aktivierten Rezeptoren geben: The specificity of intracellular signaling can be the Jak-Stat transmission path generally in two ways Ways to be regulated. For one, the specificity is about selective activation of stat proteins due to specific binding of a ligand to its receptor on the other hand, the specificity is determined via the specific binding of the stat dimers to the promoter sequences regulated. The following tables from Heim, M. H. (supra) should provide an overview of the different ligands or Ligand-activated receptors give:

Tabelle 3 Table 3

Aktivierung der Stat-Proteine Activation of the stat proteins

Tabelle 4 Table 4

Aktivierung der Jak-Kinasen Activation of the Jak kinases

Ein Beispiel für die Spezifität der intrazellulären Signalübertragung ist die Regulation der Genaktivität von Milchproteingenen. Es ist bekannt, daß nach der Geburt Mamma- Epithelialzellen beginnen, große Mengen an Milchproteinen zu sekretieren. So wurde gefunden, daß Prolaktin, ein Hormon, das in steigender Menge während der Schwangerschaft und der Stillperiode gebildet wird, die Transkription von Milchproteingenen, wie z. B. vom β-Casein- oder β-Lacto globulingen, über den Jak2-Stat-5-Signalübertragungsweg aktiviert (Liu, X. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 8831-8835, 1995). Es wurde auch gefunden, daß für die Induktion der Transkription durch den β-Casein-promotor in einer Mausmamma-Epithelialzellinie (HC11) drei milchbildende Hormone (Insulin, Glucocorticoide (Nebennierenhormone) und Prolactin) notwendig sind, wobei das künstliche Glucocorticoid Dexamethason die Sensitivität der Zellen, auf Prolactin zu antworten, steigert (Groner, B. & Gouilleux, F., supra).An example of the specificity of the intracellular Signaling is the regulation of gene activity from Milk protein genes. It is known that after birth, mom Epithelial cells begin to produce large amounts of milk proteins secrete. So it was found that prolactin, a hormone that in increasing amounts during pregnancy and Breastfeeding period is formed, the transcription of Milk protein genes, such as B. from β-casein or β-lacto globulingen, via the Jak2-Stat-5 signal transmission path activated (Liu, X. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 8831-8835, 1995). It was also found that for the Induction of transcription by the β-casein promoter in a mouse mammary epithelial cell line (HC11) three milk-producing Hormones (insulin, glucocorticoids (adrenal hormones) and Prolactin) are necessary, the artificial glucocorticoid Dexamethasone is the sensitivity of cells to prolactin answer, increases (Groner, B. & Gouilleux, F., supra).

Es ist bekannt, daß Steroidhormon-Rezeptoren, zu denen auch der Glucocorticoid-Rezeptor gehört, und sogenannte Orphan- Rezeptoren latente Transkriptionsfaktoren sind, die im Zytoplasma der Zellen vorliegen und nach der Interaktion mit einem Steroid-Liganden sich allosterisch verändern, gegebenenfalls dimerisieren, in den Zellkern wandern und an spezifische Glucocorticoid-Rezeptor-Bindesequenzen binden, um die Transkription positiv oder negativ zu regulieren (Bamberger, Chr. M. et al. Endocrine Reviews, 17, 245-261, No. 3, 1996; Cato, A. C. B. & Wade, E. BioEssays, 18, 371-378, No. 5, 1996). Sie werden daher auch zu der sogenannten nukleären Rezeptorfamilie zusammengefaßt. Alle Mitglieder (nukleäre Rezeptoren) dieser Familie besitzen eine charakteristische Dreidomänenstruktur (siehe auch Fig. 11). Die N-terminale Domäne enthält vor allem Sequenzen, die für die Genaktivierung ("transcriptional activation function", AF) verantwortlich sind, die mittlere Domäne enthält vor allem Sequenzen, die für die DNA-Bindung verantwortlich sind ("DNA-binding domain", DBD) und die C-terminale Domäne enthält vor allem Sequenzen, die u. a. für die Hormonbindung verantwortlich sind ("ligand- binding domain", LBD). Analog den Stat-Proteinen sind homologe Domänen unter den einzelnen Rezeptoren der Familie ohne wesentlichen Funktionsverlust austauschbar. Beispiele für derartige Rezeptoren sind der Glucocorticoid-Rezeptor, der Mineralocorticoid-Rezeptor, der Androgen-Rezeptor, der Progesteron-Rezeptor, der Östrogen-Rezeptor, der Vitamin D3-Rezep tor, der Thyroidhormon-Rezeptor, der Retinsäure-Rezeptor und sogenannte Orphan-Rezeptoren (Mangelsdorf D. J. et al. Cell, 83, 835-839, 1995). Die Rezeptoren binden im allgemeinen an palindromische DNA-Sequenzen im Promotorbereich der jeweiligen zu regulierenden Gene (Beato, M. et al. Cell, 83, 851-857, 1995). So enthält beispielsweise eine Hälfte des Palindroms die Sequenz AGAACA, an den der Glucocorticoid-, der Mineralocorticoid-, der Progesteron- und der Androgen-Rezeptor über ihre DNA-bindenden Domänen (DBD) spezifisch binden. Für den Glucocorticoid-Rezeptor wird das DNA-Bindeelement auch "glucocorticoid responsive element" (GRE) genannt. Der Östrogen-Rezeptor erkennt beispielsweise spezifisch die Sequenz AGGTCA.It is known that steroid hormone receptors, which also include the glucocorticoid receptor, and so-called orphan receptors are latent transcription factors which are present in the cytoplasm of the cells and which, after interaction with a steroid ligand, allosterically change, possibly dimerize, in migrate the nucleus and bind to specific glucocorticoid receptor binding sequences to positively or negatively regulate transcription (Bamberger, Chr. M. et al. Endocrine Reviews, 17, 245-261, No. 3, 1996; Cato, ACB & Wade, E. BioEssays, 18, 371-378, No. 5, 1996). They are therefore also grouped together in the so-called nuclear receptor family. All members (nuclear receptors) of this family have a characteristic three-domain structure (see also FIG. 11). The N-terminal domain mainly contains sequences which are responsible for the gene activation ("transcriptional activation function", AF), the middle domain mainly contains sequences which are responsible for the DNA binding ("DNA-binding domain", DBD) and the C-terminal domain mainly contains sequences which are responsible, inter alia, for hormone binding ("ligand-binding domain", LBD). Analogous to the stat proteins, homologous domains can be exchanged between the individual receptors in the family without a significant loss of function. Examples of such receptors are the glucocorticoid receptor, the mineralocorticoid receptor, the androgen receptor, the progesterone receptor, the estrogen receptor, the vitamin D3 receptor, the thyroid hormone receptor, the retinoic acid receptor and so-called orphan Receptors (Mangelsdorf DJ et al. Cell, 83, 835-839, 1995). The receptors generally bind to palindromic DNA sequences in the promoter region of the respective genes to be regulated (Beato, M. et al. Cell, 83, 851-857, 1995). For example, half of the palindrome contains the sequence AGAACA, to which the glucocorticoid, mineralocorticoid, progesterone and androgen receptors bind specifically via their DNA-binding domains (DBD). For the glucocorticoid receptor, the DNA binding element is also called "glucocorticoid responsive element" (GRE). For example, the estrogen receptor specifically recognizes the sequence AGGTCA.

Interessanterweise enthält der β-Caseinpromotor zwar zahlreiche Promotorelemente, wie z. B. eine TATA-Bindeprotein- Bindungsstelle, eine OCT1-Protein-Bindestelle, eine YY-1-Pro tein-Bindestelle, eine Einzelstrang-DNA-Bindefactor- Bindestelle und zwei MGF- oder Stat5-Protein-Bindestellen (Groner, B. & Gouilleux, F., supra), jedoch kein bekanntes GRE-Element, an das ein aktivierter Glucocorticoid-Rezeptor binden könnte.Interestingly, the β-casein promoter does contain numerous promoter elements, e.g. B. a TATA binding protein Binding site, an OCT1 protein binding site, a YY-1-Pro tein binding site, a single-stranded DNA binding factor Binding site and two MGF or Stat5 protein binding sites (Groner, B. & Gouilleux, F., supra), but not a known one GRE element to which an activated glucocorticoid receptor could bind.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß der Dexamethason aktivierte Glucocorticoid-Rezeptor direkt mit einem Stat5-Protein-Dimer interagiert und der sich gebildete Stat5-Protein-Glucocorticoid-Rezeptor-Komplex die Transkription eines durch den β-Caseinpromotor kontrollierten Gens um das im Vergleich zum uninduzierten Zustand ca. 40fache stimulieren kann. Es wurde auch gefunden, daß in Anwesenheit von GRE-Elementen die Bildung des Stat5-Protein- Glucocorticoid-Rezeptor-Komplexes die Bindung des aktivierten Glucocorticoid-Rezeptors an das GRE-Element verhindert bzw. unterdrückt, was besonders überraschend war.It has now surprisingly been found that the Dexamethasone activated glucocorticoid receptor directly with interacts with a Stat5 protein dimer and the one that is formed Stat5 protein glucocorticoid receptor complex which Transcription of one controlled by the β-casein promoter Gens by about 40 times compared to the uninduced state can stimulate. It was also found that in the presence of GRE elements the formation of the Stat5 protein Glucocorticoid receptor complex binding the activated Prevents or prevents glucocorticoid receptor on the GRE element suppressed, which was particularly surprising.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Nukleinsäure-Konstrukt, das getrennt oder zusammen Nukleinsäuren enthält, die für einen Proteinkomplex kodieren, der a) ein Stat-Protein oder ein funktionelles Derivat davon und b) einen nukleären Rezeptor oder ein funktionelles Derivat davon enthält.The subject of the present invention is therefore a Nucleic acid construct that is separate or together Contains nucleic acids that code for a protein complex, a) a stat protein or a functional derivative thereof and b) a nuclear receptor or a functional derivative of which contains.

Insbesondere liegt das genannte Stat-Protein im Stat-Protein nukleärer-Rezeptor-Komplex als Dimer vor, da der Komplex dann spezifisch an entsprechende oben beschriebene Nukleinsäuresequenzen binden kann. Das Dimer kann hierbei sowohl ein Homodimer, beispielsweise ein Stat5-Homodimer, aber auch ein Heterodimer, beispielsweise ein Stat1-Stat3-Hetero dimer sein.In particular, the said stat protein is in the stat protein nuclear receptor complex as a dimer because the complex then specifically to corresponding ones described above Can bind nucleic acid sequences. The dimer can do this both a homodimer, for example a Stat5 homodimer, but also a heterodimer, for example a Stat1-Stat3 hetero be dimer.

Für die Bildung des beschriebenen Proteinkomplexes ist es im Prinzip ausreichend, wenn das Stat-Protein lediglich eine Domäne, die den nukleären Rezeptor bindet, und der nukleäre Rezeptor lediglich eine Stat-Protein-bindende Domäne enthält.For the formation of the protein complex described it is in Principle sufficient if the stat protein is only one Domain that binds the nuclear receptor and the nuclear one Receptor contains only a stat protein binding domain.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft daher auch ein Nukleinsäure-Konstrukt, das getrennt oder zusammen Nukleinsäuren enthält, die für einen Proteinkomplex kodieren, der ein funktionelles Derivat eines Stat-Proteins und/oder ein funktionelles Derivat eines nukleären Rezeptors enthält. Der Begriff "funktionell" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß das Derivat eines Stat-Proteins den nukleären Rezeptor binden kann und das Derivat des nukleären Rezeptors das Stat-Protein binden kann. Unter dem Begriff "funktionelles Derivat" versteht man jedoch auch Konstrukte, bei denen zumindest die DNA-bindende Domäne des Stat-Proteins und die Transaktivierungsdomäne des nukleären Rezeptors direkt oder indirekt fusioniert sind. Another object of the present invention relates hence a nucleic acid construct that is separated or together contains nucleic acids necessary for a protein complex encode a functional derivative of a stat protein and / or a functional derivative of a nuclear receptor contains. The term "functional" means in the sense of present invention that the derivative of a stat protein can bind the nuclear receptor and the derivative of nuclear receptor that can bind the stat protein. Under the However, the term “functional derivative” is also understood Constructs in which at least the DNA-binding domain of Stat protein and the transactivation domain of the nuclear Receptor are fused directly or indirectly.

Insbesondere ist es bevorzugt, wenn das funktionelle Derivat des Stat-Proteins zusätzlich eine Transmembran-Rezeptor- bindende Domäne enthält, vorzugsweise die SH2-Domäne des Stat- Proteins und vor allem eine Domäne, die zwischen den Aminosäuren 600 und 700 liegt. Besonders bevorzugt ist die Transmembran-Rezeptor-bindende Domäne des Stat5-Proteins. Die Aminosäuresequenzen der Stat-Proteine sind in der EMBL Gene Bank unter den Zugangsnummern U06924 (Stat1), M97934 (Stat2), U06922 (Stat3), U06923 (Stat4), U21103 (Maus Stat5a), U21111 (Maus Stat5b) und U16030 (Stat6) veröffentlicht (siehe auch Liu, X. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92, 8831-8835, 1995).In particular, it is preferred if the functional derivative of the stat protein additionally a transmembrane receptor contains binding domain, preferably the SH2 domain of the stat Protein and especially a domain between the Amino acids 600 and 700. The is particularly preferred Transmembrane receptor binding domain of the Stat5 protein. The Amino acid sequences of the Stat proteins are in the EMBL genes Bank under the access numbers U06924 (Stat1), M97934 (Stat2), U06922 (Stat3), U06923 (Stat4), U21103 (mouse Stat5a), U21111 (Mouse Stat5b) and U16030 (Stat6) released (see also Liu, X. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92, 8831-8835, 1995).

Eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es auch, wenn das funktionelle Derivat des Stat-Proteins nicht nur eine Transmembran-Rezeptor-bindende Domäne, sondern auch eine DNA-bindende Domäne enthält, insbesondere eine Domäne, die zwischen den Aminosäuren 400 und 500 des Stat-Proteins liegt. Durch die Verbindung einer Transmembran-Rezeptor- bindenden Domäne mit einer DNA-bindenden Domäne erhält man ein Derivat eines Stat-Proteins, das die wesentlichen Funktionen enthält, um einerseits zur eigenen Aktivierung an den Transmembran-Rezeptor und andererseits an die entsprechende DNA-Sequenz binden zu können.A particular embodiment of the present invention is it also if the functional derivative of the stat protein is not only a transmembrane receptor binding domain, but also contains a DNA-binding domain, in particular a domain, those between amino acids 400 and 500 of the stat protein lies. By connecting a transmembrane receptor binding domain with a DNA binding domain is obtained Derivative of a stat protein that does the essential functions contains, on the one hand, for own activation to the Transmembrane receptor and on the other hand to the corresponding To be able to bind DNA sequence.

Aufgrund der Homologien zwischen den einzelnen Stat-Proteinen können so auch funktionelle Derivate der Stat-Proteine hergestellt werden, die beispielsweise die Transmembran- Rezeptor-bindende Domäne von einem Stat-Protein und die DNA-bin dende Domäne von einem anderen Stat-Protein enthalten. So ist beispielsweise bekannt, daß ein künstliches Stat2-Protein, das die SH2-Domäne von Stat1 anstelle von Stat2 enthielt, durch IFN-γ aktiviert werden konnte (Heim, M. H., supra). Besonders bevorzugt sind auch die homologen Domänen von Stat5 und Stat6, da das Stat6-Protein mit dem Stat5-Protein am nächsten verwandt ist (Liu, X. et al., supra). Dadurch kann beispielsweise ein funktionelles Stat5-Derivat erzeugt werden, das anstelle der SH2-Domäne von Stat5 die SH2-Domäne von Stat6 enthält, wodurch das Stat5-Derivat im Gegensatz zum unveränderten Stat5-Protein durch IL-4 aktivierbar wird (siehe Tabelle 3).Because of the homology between the individual stat proteins can also use functional derivatives of the stat proteins be produced, which, for example, the transmembrane Receptor-binding domain from a stat protein and the DNA bin containing the domain of another stat protein. So it is known, for example, that an artificial Stat2 protein, that contained the SH2 domain of Stat1 instead of Stat2, could be activated by IFN-γ (Heim, M.H., supra). The homologous domains of Stat5 are also particularly preferred and Stat6, since the Stat6 protein coexists with the Stat5 protein is related (Liu, X. et al., supra). This can for example, a functional Stat5 derivative can be generated, instead of the SH2 domain of Stat5, the SH2 domain of Stat6 contains, whereby the Stat5 derivative in contrast to the unchanged Stat5 protein can be activated by IL-4 (see Table 3).

Der nukleäre Rezeptor des beschriebenen Proteinkomplexes ist beispielsweise ein Steroidhormon-Rezeptor oder ein Orphan- Rezeptor, insbesondere ein Glucocorticoid-Rezeptor, ein Mineralocorticoid-Rezeptor, ein Androgen-Rezeptor, ein Progesteron-Rezeptor, ein Östrogen-Rezeptor, ein Vitamin D3-Rezep tor, ein Thyroidhormon-Rezeptor, ein Retinsäure-Rezeptor und/oder ein Orphan-Rezeptor, insbesondere ein Glucocorticoid- Rezeptor. Insbesondere ist der Rezeptor durch seinen natürlichen oder durch einen künstlichen Liganden aktiviert (siehe Mangelsdorf, D. J., 1995, supra). Durch die Aktivierung erfolgt im allgemeinen eine Dimerisierung des Rezeptors und eine spezifische Bindung des Rezeptor-Dimeres an die Stat- Proteine. Beispiele für natürliche Liganden des Glucocorticoid-Rezeptors sind die Nebennierenrindenhormone, z. B. Cortison, und ein Beispiel für einen künstlichen Liganden ist Dexamethason.The nuclear receptor of the protein complex described is for example a steroid hormone receptor or an orphan Receptor, especially a glucocorticoid receptor Mineralocorticoid receptor, an androgen receptor Progesterone receptor, an estrogen receptor, a vitamin D3 receptor tor, a thyroid hormone receptor, a retinoic acid receptor and / or an orphan receptor, in particular a glucocorticoid Receptor. In particular, the receptor is through its activated naturally or by an artificial ligand (see Mangelsdorf, D.J., 1995, supra). By activation there is generally dimerization of the receptor and specific binding of the receptor dimer to the Proteins. Examples of natural ligands of Glucocorticoid receptor are the adrenal cortex hormones, e.g. B. Cortisone, and an example of an artificial ligand is dexamethasone.

Zur Bindung des nukleären Rezeptors ist im Prinzip die Stat- bindende Domäne des Rezeptors ausreichend. Daher erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Nukleinsäure- Konstrukt, das getrennt oder zusammen Nukleinsäuren enthält, die für einen Proteinkomplex kodieren, die die Stat-bindende Domäne eines nukleären Rezeptors als ein funktionelles Derivat des Rezeptors enthält. Vor allem sind funktionelle Derivate des nukleären Rezeptors bevorzugt, die neben der Stat- bindenden Domäne auch noch die Transaktivierungsdomäne enthalten, da insbesondere dadurch eine deutliche Stimulierung der Transkription erreicht wird. So wurde beispielsweise gefunden, daß Glucocorticoid-Rezeptor-Derivate, die die GRE-Ele ment-Bindedomäne nicht enthielten, die Transkription über die Bindung an Stat5 immer noch stimulieren können.In principle, the status for binding the nuclear receptor is binding domain of the receptor sufficient. Therefore stretches the present invention also relates to a nucleic acid Construct that contains nucleic acids separately or together, that code for a protein complex that the stat-binding Domain of a nuclear receptor as a functional derivative of the receptor contains. Above all, are functional derivatives preferred of the nuclear receptor, which in addition to the binding domain also the transactivation domain included, especially because of this a clear stimulation the transcription is achieved. For example found that glucocorticoid receptor derivatives that the GRE-Ele ment binding domain did not contain the transcription can still stimulate binding to Stat5.

Da nukleäre Rezeptoren, vorzugsweise Steroidhormon-Rezeptoren und insbesondere der Glucocorticoid-Rezeptor eine starke Transaktivierungsdomäne besitzen, sind auch funktionelle Derivate möglich, die die DNA-bindende Domäne des Stat- Proteins und die Transaktivierungsdomäne des nukleären Rezeptors enthalten, wobei vorzugsweise beide Domänen fusioniert sind. Derartige Konstrukte sind bereits bei dem Hefe-Gal4-Genaktivatorprotein bekannt, bei dem die Aktivierungsdomäne des Gal4-Proteins an die DNA-bindende Domäne des bakteriellen Genregulationsproteins lexA fusioniert wurde. Dieses Gal4-lexA-Fusionsprotein aktivierte Gene in Hefe, die im Promotor eine bakterielle lexA DNA-Bindestelle enthielten. Die beschriebenen Stat-nukleärer-Rezeptor- Konstrukte können daher auch Gene aktivieren, die im Promotor eine Stat-Bindestelle enthalten. Bevorzugt sind auch Konstrukte, bei denen der Stat-Proteinanteil nicht nur die DNA-bindende Domäne, sondern auch die Transmembran-Rezeptor- bindende Domäne umfaßt.Because nuclear receptors, preferably steroid hormone receptors and especially the glucocorticoid receptor is a strong one Having transactivation domains are also functional Derivatives possible that the DNA-binding domain of the stat Protein and the transactivation domain of the nuclear Contain receptor, preferably both domains are merged. Such constructs are already in the Yeast Gal4 gene activator protein known in which the Activation domain of the Gal4 protein to the DNA binding Domain of the bacterial gene regulation protein lexA fused has been. This Gal4-lexA fusion protein activated genes in Yeast containing a bacterial lexA DNA binding site in the promoter contained. The described Stat nuclear receptor Constructs can therefore also activate genes in the promoter include a stat binding site. Are also preferred Constructs in which the stat protein content is not just that DNA-binding domain, but also the transmembrane receptor binding domain.

Die Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise DNA oder RNA. Zur Transformation bzw. Transfektion und/oder zur Expression der beschriebenen Gene in den jeweiligen Zellen eignen sich vorzugsweise nackte DNA, Plasmide oder virale Vektoren, wie z. B. retrovirale, adenovirale oder adenoassoziierte Vektoren als Transformations- bzw. Transfektions- und/oder Expressionsvektoren. Als Transformations- bzw. Transfektionsmethoden eignen sich beispielsweise die Mikroinjektion von nackter DNA, die Elektroporation oder Ca₃(PO₄)₂-Präzipitation von Plasmiden, die Transfektion von RNA mit Hilfe von retroviralen Vektoren oder die Transfektion von DNA mit Hilfe von adenoviralen oder adenoassoziierten Vektoren.The nucleic acids are in the sense of the present invention preferably DNA or RNA. For transformation or Transfection and / or for expression of the genes described in bare DNA is particularly suitable for the respective cells, Plasmids or viral vectors, such as. B. retroviral, adenoviral or adeno-associated vectors as Transformation or transfection and / or Expression vectors. As a transformation or For example, transfection methods are suitable Microinjection of naked DNA, electroporation or Ca₃ (PO₄) ₂-precipitation of plasmids, the transfection of RNA using retroviral vectors or transfection of DNA using adenoviral or adeno-associated Vectors.

Sollen die Zellen nicht nur den beschriebenen Proteinkomplex, sondern auch den entsprechenden Transmembran-Rezeptor, wie oben näher beschrieben, exprimieren, so erhält man nach der Transformation bzw. Transfektion mit der oder den entsprechenden Nukleinsäuren eine Zelle, mit deren Hilfe man die Transkription gewünschter Gene spezifisch über den beschriebenen Proteinkomplex von außen durch die Zugabe von dem entsprechenden Liganden des klonierten Rezeptors und/oder von dem Hormon, das den nukleären Rezeptor aktiviert, steuern kann.Should the cells not only have the protein complex described, but also the corresponding transmembrane receptor, such as described above, express, so you get after the Transformation or transfection with the or corresponding nucleic acids a cell, with the help of which the transcription of desired genes specifically via the described protein complex from the outside by the addition of the corresponding ligand of the cloned receptor and / or of the hormone that activates the nuclear receptor can.

Ein weiterer Gegenstand ist daher ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure-Konstrukt, das zusätzlich eine oder mehrere Nukleinsäuren enthält, die für einen Rezeptor kodieren, der aus einem Rezeptor der Interferon-Familie, der gp130 Familie, der Il-2 Familie, der gp140 Familie, der GH Familie, der Rezeptor-Tyrosinkinasen Familie und/oder der Familie der G-Protein- gekoppelten Rezeptoren ausgewählt ist.Another subject is therefore an inventive one Nucleic acid construct that additionally one or more Contains nucleic acids that code for a receptor that from a receptor of the interferon family, the gp130 family, the Il-2 family, the gp140 family, the GH family, the Receptor tyrosine kinases family and / or the family of G protein coupled receptors is selected.

Die Transkription des oder der gewünschten endogenen oder exogenen Gene wird durch einen Promotor gesteuert, der neben den notwendigen regulatorischen Sequenzen, wie z. B. eine TATA-Sequenz, gegebenenfalls auch eine oder vorzugsweise mehrere Stat-Protein-DNA-Bindesequenzen und/oder eine oder vorzugsweise mehrere DNA-Bindesequenzen enthält, an denen der nukleäre Rezeptor binden kann. Zur Steuerung endogener Gene wird die Stat-Protein-DNA-Bindesequenz und/oder die DNA-Binde sequenz, an der der nukleäre Rezeptor binden kann, in den Promotor des entsprechenden Gens beispielsweise durch homologe Rekombination integriert.The transcription of the desired endogenous or exogenous genes is controlled by a promoter that is adjacent the necessary regulatory sequences, such as. Legs TATA sequence, optionally also one or preferably multiple stat protein DNA binding sequences and / or one or preferably contains several DNA binding sequences at which the can bind nuclear receptor. To control endogenous genes becomes the stat protein DNA binding sequence and / or the DNA binding sequence to which the nuclear receptor can bind, in the Promoter of the corresponding gene, for example by homologous Recombination integrated.

Die Stat-Protein-DNA-Bindesequenz enthält beispielsweise die Konsensussequenz AGT TTC NNT TTC NC/T, an die vorzugsweise ein Stat1-Stat2-Heterodimeres bindet und/oder TTN NNN NAA, an die vorzugsweise Stat1-Homodimere, Stat1-Stat3-Heterodimere, Stat3-Homodimere, Stat4-Homodimere, Stat5-Homodimere und/oder Stat6-Homodimere binden, wobei die variablen inneren Nukleotide an Art und Zahl die Bindungsaffinität der Stat- Dimere, wie oben näher beschrieben, beeinflussen können. Insbesondere sind die in der Tabelle 1 und 2 aufgeführten Sequenzen bevorzugte DNA-Bindesequenzen der jeweiligen Stat- Proteine. Ein weiteres konkretes Beispiel ist das Stat5-Di mere, das an die Konsensussequenz TTC NNN GAA bindet, wobei die spezifische Bindung an die Sequenz TTC TTG GAA und insbesondere an die Sequenz AC TTC TTG GAA mit höherer Affinität und die spezifische Bindung an die Sequenz TTC TTG GGA und insbesondere an die Sequenz AT TTC TTG GGA mit geringerer Affinität erfolgt. Durch die Wahl der geeigneten DNA-Bindesequenz läßt sich hierdurch noch eine weitere vorteilhafte Feinsteuerung der Transkription eines Gens erreichen. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung der genannten Stat5-Protein-DNA-Bindesequenzen zur Steuerung der Transkription.The stat protein DNA binding sequence contains, for example Consensus sequence AGT TTC NNT TTC NC / T, to which preferably one Stat1-Stat2 heterodimer binds and / or TTN NNN NAA to which preferably Stat1 homodimers, Stat1-Stat3 heterodimers, Stat3 homodimers, Stat4 homodimers, Stat5 homodimers and / or Stat6 homodimers bind, the variable inner The type and number of nucleotides the binding affinity of the stat Dimers, as described in more detail above, can influence. In particular, those listed in Tables 1 and 2 Sequences preferred DNA binding sequences of the respective stat Proteins. Another concrete example is the Stat5-Di mere that binds to the consensus sequence TTC NNN GAA, where the specific binding to the sequence TTC TTG GAA and especially to the sequence AC TTC TTG GAA with higher Affinity and specific binding to the sequence TTC TTG GGA and in particular to the sequence AT TTC TTG GGA lower affinity occurs. By choosing the appropriate one DNA binding sequence can thereby be used for yet another advantageous fine control of the transcription of a gene to reach. A particularly preferred embodiment of the The present invention is therefore the use of the above Stat5 protein DNA binding sequences to control Transcription.

Die DNA-Bindesequenz des nukleären Rezeptors umfaßt beispielsweise eine regulatorische Sequenz aus dem "mouse mammary tumour virus long terminal repeat" (MMTV-LTR), die mit Steroidhormon-Rezeptoren interagiert (Payvar, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6628-6632, 1981), vorzugsweise die Sequenzen AGAACA und AGGTCA vor allem in palindromischer Anordnung, insbesondere das GRE-Element. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung einer DNA-Bindesequenz des nukleären Rezeptors, insbesondere des GRE-Elements, in Verbindung mit einer Stat-Protein-DNA-Bindesequenz, insbesondere der Stat5-Protein- Konsensussequenz, weil dadurch die Stärke der Transkription eines Gens von außen sehr leicht geregelt werden kann. Enthält beispielsweise ein Promotor eines endogenen oder exogenen Gens eine oder mehrere Stat-Protein-DNA-Binde sequenzen und ein oder mehrere GRE-Elemente, dann kann die Transkription gemäß Tabelle 5 von außen sehr leicht durch Aktivierung des Stat-Proteins und/oder des Glucocorticoid- Rezeptors wie folgt gesteuert werden: The DNA binding sequence of the nuclear receptor includes for example a regulatory sequence from the "mouse mammary tumor virus long terminal repeat "(MMTV-LTR) Steroid hormone receptors interact (Payvar, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6628-6632, 1981), preferably the Sequences AGAACA and AGGTCA especially in palindromic Arrangement, especially the GRE element. Particularly advantageous is the use of a nuclear DNA binding sequence Receptor, especially the GRE element, in connection with a stat protein DNA binding sequence, in particular the stat5 protein Consensus sequence because it strengthens the Transcription of a gene can be regulated very easily from the outside can. For example, contains a promoter of an endogenous or exogenous gene one or more stat protein DNA binding sequences and one or more GRE elements, then can the transcription according to Table 5 from the outside very easily Activation of the stat protein and / or the glucocorticoid Receptor can be controlled as follows:

Tabelle 5 Table 5

Die DNA-Bindesequenz des nukleären Rezeptors und die Stat- Protein-DNA-Bindesequenz können jedoch auch auf zwei oder mehreren verschiedenen Promotoren liegen, die die Transkription von zwei oder mehreren endogenen und/oder exogenen Genen kontrollieren. Enthält beispielsweise das Gen A eine oder mehrere Stat5-Protein-DNA-Bindesequenz und das Gen B ein oder mehrere GRE-Elemente, dann kann die Transkription gemäß Tabelle 6 von außen durch Aktivierung des Stat-Proteins und/oder des Glucocorticoid-Rezeptors wie folgt gesteuert werden:The DNA binding sequence of the nuclear receptor and the stat However, protein-DNA binding sequence can also be on two or several different promoters that are the Transcription of two or more endogenous and / or control exogenous genes. Contains gene A, for example one or more Stat5 protein DNA binding sequences and gene B one or more GRE elements, then the transcription according to Table 6 from the outside by activating the stat protein and / or the glucocorticoid receptor are controlled as follows will:

Tabelle 6 Table 6

Generell bedeutet das, daß die Aktivierung eines Stat-Proteins in Anwesenheit eines aktivierten nukleären Rezeptors die Aktivität von Promotoren mit DNA-Bindesequenzen, an denen der nukleäre Rezeptor binden kann, unterdrückt und die Aktivität von Promotoren mit Stat-protein-DNA-Bindesequenzen erhöht. Ein mögliches Anwendungsgebiet ist daher beispielsweise die Unterdrückung der Glucocorticoid-induzierten Apoptose (Zelltod) von Lymphozyten.Generally this means that the activation of a stat protein in the presence of an activated nuclear receptor Activity of promoters with DNA binding sequences to which the nuclear receptor can bind and suppress activity of promoters with stat protein DNA binding sequences increased. A possible application is therefore, for example Suppression of glucocorticoid-induced apoptosis (Cell death) of lymphocytes.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Nukleinsäure-Konstrukt, das getrennt oder zusammen Nukleinsäuren enthält, die einen Promotor mit einer oder vorzugsweise mehreren Stat-Protein-DNA-Bindesequenzen enthalten, der die Transkription eines endogenen oder exogenen Gens steuert und die einen Promotor mit einer oder vorzugsweise mehreren nukleären Rezeptor-DNA-Bindesequenzen enthalten, die die Transkription desselben oder eines anderen endogenen oder exogenen Gens steuert, wobei insbesondere die Stat-Protein-DNA-Bindesequenz ausgewählt ist aus AGT TTC NNT TTC NC/T und/oder TTN NNN NAA, und die DNA-Bindesequenz, an die der nukleäre Rezeptor binden kann, die Sequenzen AGAACA und/oder AGGTCA vor allem in palindromischer Anordnung, insbesondere das GRE-Element, enthält.Another object of the present invention is therefore a nucleic acid construct that is separate or together Contains nucleic acids that have a promoter with a preferably several stat protein DNA binding sequences contain the transcription of an endogenous or exogenous Gens controls and a promoter with one or preferably multiple nuclear receptor DNA binding sequences contain the transcription of the same or another controls endogenous or exogenous gene, in particular the Stat protein DNA binding sequence is selected from AGT TTC NNT TTC NC / T and / or TTN NNN NAA, and the DNA binding sequence which the nuclear receptor can bind, the sequences AGAACA and / or AGGTCA especially in a palindromic arrangement, especially the GRE element.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine eukaryotische Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Konstrukt transformiert oder transfiziert worden ist.Another object of the present invention is also a eukaryotic cell with an inventive Nucleic acid construct has been transformed or transfected is.

Eine besonders bevorzugte eukaryotische Zelle ist eine Zelle, die zusätzlich mit einer Desoxyribonukleinsäure transformiert oder transfiziert worden ist, die einen Promotor mit einer oder vorzugsweise mehreren Stat-Protein-DNA-Bindesequenzen enthält, der die Transkription eines endogenen oder exogenen Gens steuert. Hierbei ist eine Stat-Protein-DNA-Bindesequenz bevorzugt, die aus den Konsensussequenzen AGT TTC NNT TTC NC/T und/oder TTN NNN NAA ausgewählt ist. A particularly preferred eukaryotic cell is a cell which is additionally transformed with a deoxyribonucleic acid or has been transfected with a promoter or, preferably, multiple stat protein DNA binding sequences contains the transcription of an endogenous or exogenous Gens controls. Here is a stat protein DNA binding sequence preferred, which from the consensus sequences AGT TTC NNT TTC NC / T and / or TTN NNN NAA is selected.

Eine andere bevorzugte eukaryotische Zelle ist eine Zelle, die zusätzlich mit einer Desoxyribonukleinsäure transformiert oder transfiziert worden ist, die einen Promotor enthält, der die Transkription eines endogenen oder exogenen Gens steuert und der eine oder vorzugsweise mehrere DNA-Bindesequenzen enthält, an denen der nukleäre Rezeptor binden kann, vorzugsweise eine AGAACA und/oder AGGTCA Sequenz vor allem in palindromischer Anordnung, insbesondere ein GRE-Element.Another preferred eukaryotic cell is a cell that additionally transformed with a deoxyribonucleic acid or has been transfected which contains a promoter which contains the Controls transcription of an endogenous or exogenous gene and which contains one or preferably more DNA binding sequences, to which the nuclear receptor can bind, preferably one AGAACA and / or AGGTCA sequence especially in palindromic Arrangement, especially a GRE element.

Die erfindungsgemäße eukaryotische Zelle ist insbesondere eine CHO-, BHK-, C127-, COS-Zelle, Epithelzelle, hämatopoetische Stammzelle oder Immunzelle.The eukaryotic cell according to the invention is in particular one CHO, BHK, C127, COS cell, epithelial cell, hematopoietic Stem cell or immune cell.

Die beschriebenen Proteinkomplexe lassen sich besonders vorteilhaft durch gentechnische Methoden nach dem Fachmann bekannten Verfahren herstellen. Hierbei werden Nukleinsäuren, die für das Stat-Protein oder ein funktionelles Derivat davon kodieren und die für den nukleären Rezeptor oder ein funktionelles Derivat davon kodieren oder die für ein Fusionsprotein, welches beispielsweise die DNA-bindende Domäne des Stat-Proteins und die Transaktivierungsdomäne des nukleären Rezeptors enthält, kodieren, in geeigneten Zellen, beispielsweise eukaryotische Zellen wie CHO-, BHK-, C127-, COS-Zellen, Epithelzellen, hämatopoetische Stammzellen oder Immunzellen, zur Expression gebracht.The protein complexes described can be particularly advantageous by genetic engineering methods according to the expert produce known methods. Here nucleic acids, that for the stat protein or a functional derivative thereof encode and that for the nuclear receptor or a encode functional derivative thereof or that for a Fusion protein, which, for example, is the DNA-binding domain of the stat protein and the transactivation domain of the contains nuclear receptor, encode, in suitable cells, for example eukaryotic cells such as CHO, BHK, C127, COS cells, epithelial cells, hematopoietic stem cells or Immune cells, brought to expression.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Proteinkomplex enthaltendAnother object of the present invention is therefore also containing a protein complex

a) a stat protein or a functional derivative thereof and
b) a nuclear receptor or a functional derivative thereof, which by expression of an inventive Nucleic acid construct can be produced.

Vorzugsweise ist das Stat-Protein durch eine Proteinkinase, insbesondere eine Tyrosinkinase, vor allem eine Jak-Kinase phosphoryliert, da durch die Phosphorylierung das Stat-Protein dimerisiert und die entsprechende oben beschriebene Nukleinsäuresequenz erkennen kann. Besonders bevorzugt ist es, wenn das Stat-Protein sowohl durch eine Tyrosinkinase als auch durch eine Serinkinase phosphoryliert ist, da dadurch nicht nur eine spezifische Bindung an die entsprechende Nukleinsäuresequenz, sondern auch eine Erhöhung der Stimulierung der Transkription erzielt wird. Im allgemeinen enthalten eukaryotische Zellen entsprechende Proteinkinasen entweder in freier oder in gebundener, beispielsweise rezeptorgebundener Form. Tabelle 4 gibt eine Übersicht über die Aktivierung der Jak-Kinasen durch die mit ihnen assoziierten Rezeptoren nach entsprechender Ligandenaktivierung. So aktiviert beispielsweise der Ligand Prolactin die Jak2-Kinase durch spezifische Bindung an den Prolactin-Rezeptor. Die Ligandenbindung verursacht hierbei im allgemeinen eine Assoziierung einzelner transmembraner Ketten des Rezeptors, was dazu führt, daß im allgemeinen zwei oder mehr Jak2-Kinasen entweder mit dem Rezeptor assoziieren und in die räumliche Nähe gebracht werden oder falls sie mit dem Rezeptor bereits assoziiert sind, durch die Assoziierung der transmembranen Rezeptorketten in die räumliche Nähe gebracht werden. Anschließend erfolgt die gegenseitige Phosphorylierung und Aktivierung der Kinasen, die wiederum den Rezeptor phosphorylieren und/oder andere beispielsweise im Cytoplasma der Zelle vorkommende Proteine, wie z. B. die Stat-Proteine. Für die anderen in der Tabelle 4 aufgeführten Tyrosinkinasen und den entsprechenden Liganden bzw. deren Rezeptoren gilt Entsprechendes. Hierdurch wird auch erreicht, daß die Stat- Proteine spezifisch und gezielt phosphoryliert und somit aktiviert werden können, wobei der Ligand mittelbar als ein spezifischer Auslöser der Aktivierung dient. Tabelle 3 gibt eine Übersicht über die spezifische Aktivierung von Stat- Proteinen durch die entsprechenden Liganden. So wird beispielsweise Stat5 spezifisch durch Rezeptoren der IL-2 Familie, insbesondere durch den IL-2-, den IL-7- oder den IL-15-Re zeptor, der gp140 Familie, insbesondere durch den IL-3-, den IL-5- oder den GM-CSF-Rezeptor, der GH Familie, insbesondere durch den Erythropoietin-, den Wachstumshormon-, den Prolactin- oder den Thrombopoietin-Rezeptor, und der Rezeptor-Tyrosinkinasen Familie, insbesondere durch den EGF-Re zeptor, direkt oder über die entsprechenden Tyrosinkinasen gemäß Tabelle 4 aktiviert. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Aktivierung von Stat5 durch die Jak2-Kinase insbesondere nach Aktivierung des entsprechenden Rezeptors durch einen Liganden aus der gp140 Familie, der GH Familie und/oder der Rezeptor- Tyrosinkinase-Familie, insbesondere durch IL-3, IL-5, GM-CSF, Erythropoietin, Wachstumshormon, Prolactin, Thrombopoietin und/oder EGF, vor allem Prolactin.The stat protein is preferably by a protein kinase, especially a tyrosine kinase, especially a Jak kinase phosphorylated, because the stat protein by phosphorylation dimerized and the corresponding described above Can recognize nucleic acid sequence. It is particularly preferred when the stat protein is both by a tyrosine kinase as well is phosphorylated by a serine kinase because it does not only a specific link to the corresponding one Nucleic acid sequence, but also an increase in Stimulation of transcription is achieved. In general contain protein kinases corresponding to eukaryotic cells either in free or in bound, for example receptor-bound form. Table 4 gives an overview of the activation of the yak kinases by using them associated receptors according to Ligand activation. For example, the ligand activates Prolactin the Jak2 kinase by specific binding to the Prolactin receptor. The ligand binding causes in generally an association of individual transmembrane chains of the receptor, which generally results in two or more Jak2 kinases either associate with the receptor and in the spatial proximity or if they are brought with the Are already associated by associating the receptor Transmembrane receptor chains brought into close proximity will. The mutual phosphorylation then takes place and activation of the kinases, which in turn activate the receptor phosphorylate and / or others, for example in the cytoplasm proteins occurring in the cell, such as e.g. B. the Stat proteins. For the other tyrosine kinases listed in Table 4 and the corresponding ligands or their receptors applies Corresponding. This also ensures that the status Proteins specifically and specifically phosphorylated and thus can be activated, the ligand indirectly as a specific activation trigger. Table 3 gives an overview of the specific activation of stat Proteins by the corresponding ligands. So will for example, Stat5 specifically through IL-2 receptors Family, especially through the IL-2, IL-7 or IL-15-Re zeptor, the gp140 family, especially through the IL-3, the IL-5 or the GM-CSF receptor, the GH family, especially through erythropoietin, growth hormone, the prolactin or thrombopoietin receptor, and the Receptor tyrosine kinases family, especially through the EGF-Re zeptor, directly or via the corresponding tyrosine kinases activated according to Table 4. A particularly preferred one One embodiment of the present invention is activation of Stat5 by the Jak2 kinase especially after activation of the corresponding receptor by a ligand from the gp140 family, the GH family and / or the receptor Tyrosine kinase family, especially by IL-3, IL-5, GM-CSF, Erythropoietin, growth hormone, prolactin, thrombopoietin and / or EGF, especially prolactin.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Proteinkomplexes, bei dem ein erfindungsgemäßes Nukleinsäure- Konstrukt, wie oben näher ausgeführt, zur Expression gebracht wird.Another object of the present invention is a Process for producing an inventive Protein complex in which a nucleic acid Construct, as detailed above, brought to expression becomes.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Verfahren zur Regulierung der Transkription von mindestens zwei endogenen und/oder exogenen Genen, wobei die Promotorregion des einen Gens eine oder vorzugsweise mehrere Stat-Protein-DNA-Bindesequenzen enthält, insbesondere die Sequenz TTC NNN GAA, und die Promotorregion des anderen Gens eine oder vorzugsweise mehrere DNA-Bindesequenzen enthält, an denen der nukleäre Rezeptor binden kann, vorzugsweise die Sequenz AGAACA und/oder AGGTCA vor allem in palindromischer Anordnung insbesondere ein GRE-Element, wobeiAnother object of the present invention is also a procedure to regulate transcription of at least two endogenous and / or exogenous genes, the Promoter region of the one gene, or preferably several Stat protein DNA binding sequences contains, especially the Sequence TTC NNN GAA, and the promoter region of the other gene contains one or preferably more DNA binding sequences to which the nuclear receptor can bind, preferably that Sequence AGAACA and / or AGGTCA especially in palindromic Arrangement in particular a GRE element, wherein

(a) in the absence of the stat protein dimer or one functional derivative thereof and in the absence of the activated nuclear receptor or a functional one Derivatives thereof essentially neither the one gene nor the other gene is transcribed;
(b) in the presence of the stat protein dimer or one functional derivatives and in the absence of the activated nuclear receptor or a functional derivative thereof one gene transcribes and the other gene essentially is not transcribed;
(c) in the absence of the stat protein dimer or one functional derivative thereof and in the presence of the activated nuclear receptor or a functional one Derivatives of which one gene is essentially not and that other gene is transcribed; and
(d) in the presence of the stat protein dimer or one functional derivative thereof and in the presence of the activated nuclear receptor or a functional one Derivatives of which one gene transcribes and the other gene is essentially not transcribed.

Liegen die Stat-Protein-Bindesequenz(en) und die nukleäre Rezeptor-Bindesequenz(en) auf ein und demselben Promotor, der die Transkription eines endogenen oder exogenen Gens kontrolliert, dann ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Regulierung der Transkription des Gens durch folgende Schritte charakterisiert:The stat protein binding sequence (s) and the nuclear are Receptor binding sequence (s) on the same promoter that the transcription of an endogenous or exogenous gene controlled, then the inventive method for Regulation of gene transcription through the following steps characterized:

(a) in the absence of the stat protein dimer or one functional derivative thereof and in the absence of the activated nuclear receptor or a functional one The gene essentially does not become a derivative thereof transcribed;
(b) in the presence of the stat protein dimer or one functional derivative thereof and in the absence of the activated nuclear receptor or a functional one Derivatives of this are the transcription of the gene via the stat Protein binding sequence induced or enhanced;
(c) in the absence of the stat protein dimer or one functional derivative thereof and in the presence of the activated nuclear receptor or a functional one Derivatives of this are the transcription of the gene via the DNA binding sequence induced or amplified to which the activated nuclear receptor binds; and
(d) in the presence of the stat protein dimer or one functional derivative thereof and in the presence of the activated nuclear receptor or a functional one Derivatives of this are the transcription of the gene via the stat Protein binding sequence induced or enhanced.

Die Interaktion zwischen den Stat-Proteinen und den nukleären Rezeptoren als Koaktivatoren stellt auch ein neues sogenanntes "drug target" dar.The interaction between the stat proteins and the nuclear ones Receptors as coactivators also represents a new so-called represents "drug target".

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung der erfindungsgemäßen eukaryotischen Zelle bzw. des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes zum Auffinden pharmakologisch wirksamer Verbindungen, die insbesondere auf einer positiven oder negativen Interferenz der Interaktion zwischen Stat-Proteinen und nukleären Rezeptoren als Coaktivatoren beruhen, wodurch beispielsweise ein therapeutischer Effekt durch eine Verstärkung oder Blockierung der Interaktion zwischen Stat-Proteinen und Coaktivatoren erzielt werden kann.Another object of the present invention is therefore the use of the eukaryotic cell according to the invention or of the protein complex according to the invention to be found pharmacologically active compounds, in particular on a positive or negative interference of the interaction between stat proteins and nuclear receptors as Coactivators are based on, for example, a therapeutic effect through reinforcement or blocking the interaction between stat proteins and coactivators can be achieved.

Pharmakologisch wirksame Verbindungen können beispielsweise dadurch gefunden werden, daß der erfindungsgemäße Proteinkomplex mit verschiedenen chemischen Verbindungen inkubiert und anschließend beispielsweise in einem nicht denaturierenden Polyacrylamidgel untersucht wird, ob die chemische Verbindung eine Veränderung beispielsweise eine Dissoziation des erfindungsgemäßen Proteinkomplexes bewirken konnte oder nicht.For example, pharmacologically active compounds can be found in that the invention Protein complex with various chemical compounds incubated and then not in one, for example denaturing polyacrylamide gel is examined whether the chemical compound a change for example a Cause dissociation of the protein complex according to the invention could or not.

Pharmakologisch wirksame Verbindungen können beispielsweise auch dadurch gefunden werden, daß man eine erfindungsgemäße eukaryotische Zelle, die einen ausgewählten membranständigen Rezeptor, beispielsweise einen Cytokinrezeptor wie den IL-3-Re zeptor, ein dazugehöriges Stat-Protein, beispielsweise das Stat5-Protein, und einen nukleären Rezeptor, beispielsweise den Glucocorticoid-Rezeptor, exprimiert, mit einem exogenen Gen, beispielsweise ein Indikatorgen kodierend für die β-Galak tosidase und/oder Luciferase, transformiert oder transfiziert, das im Promotorbereich eine oder mehrere Stat- DNA-Bindesequenzen, beispielsweise die Stat5-Bindesequenz TTC TTG GAA, enthält und/oder eine oder mehrere DNA-Binde sequenzen, an denen der nukleäre Rezeptor binden kann, beispielsweise das GRE-Element. Durch Zugabe des Liganden, beispielsweise IL-3, und/oder des Hormons, beispielsweise Dexamethason, kann die Aktivität des Indikatorgens über die Aktivität beispielsweise der β-Galaktosidase und/oder Luciferase in An- und in Abwesenheit der auf die pharmakologisch Wirkung zu testenden Verbindung bestimmt werden. Eine Änderung der Enzymaktivität in Anwesenheit der zu testenden Verbindung weist auf eine mögliche Wechselwirkung der Verbindung mit dem Stat-Protein-Signaltransduktionsweg hin. Auf diese Art und Weise lassen sich leicht pharmakologisch aktive Verbindungen für weitere Untersuchungen auf eine mögliche medizinische Anwendung aus einer Vielzahl von Verbindungen auffinden. So können beispielsweise Agonisten der Stat-nukleärer-Rezeptor-Interaktion gefunden werden, die beispielsweise die hämatopoietische Proliferation stimulieren können. Es können aber auch Antagonisten der Interaktion gefunden werden, die beispielsweise die Wirkung von Wachstumssignalen inhibieren können. Auch ist es denkbar, durch geeignete Verbindungen, die mit diesem Testsystem gefunden wurden, immunsuppressive und anti-inflammatorische Effekte zu modulieren. So wurde beispielsweise gefunden, daß synoviale Flüssigkeiten von Patienten mit entzündeter Arthritis, die Aktivierung von Stat3, jedoch nicht von Stat1 in Monocyten aktivierten (Sengupta, T. K., J. Exp. Med., 181, 1015-1025, 1995). Auch ist bekannt, daß die genetischen Krankheiten "X-linked combined immunodeficiency" (XCID) und "X-linked severe combined immunodeficiency" (XSCID) durch eine defekte Signaltransduktion im Jak-Stat-Signalübertragungsweg verursacht ist (Heim, M. H., supra).For example, pharmacologically active compounds can also be found in that one according to the invention eukaryotic cell that has a selected membrane-bound Receptor, for example a cytokine receptor such as the IL-3-Re zeptor, an associated stat protein, for example that Stat5 protein, and a nuclear receptor, for example the glucocorticoid receptor, expressed with an exogenous Gene, for example an indicator gene coding for the β-Galak tosidase and / or luciferase, transformed or transfected that one or more stat- DNA binding sequences, for example the Stat5 binding sequence TTC TTG GAA, contains and / or one or more DNA binders sequences to which the nuclear receptor can bind, for example the GRE element. By adding the ligand, for example IL-3, and / or the hormone, for example Dexamethasone, the activity of the indicator gene can affect the Activity of, for example, β-galactosidase and / or Luciferase in the presence and absence of those on the Compound to be tested pharmacologically effect will. A change in enzyme activity in the presence of the testing compound indicates a possible interaction the connection with the stat protein signaling pathway there. This way you can easily pharmacologically active compounds for further investigation on a possible medical application from a variety find connections. For example, agonists of the stat-nuclear receptor interaction can be found for example stimulate hematopoietic proliferation can. But they can also be antagonists of the interaction can be found, for example, the effect of Can inhibit growth signals. It is also conceivable through suitable connections with this test system were found to be immunosuppressive and anti-inflammatory Modulate effects. For example, it was found that synovial fluids from patients with inflamed Arthritis, activation of Stat3, but not of Stat1 activated in monocytes (Sengupta, T.K., J. Exp. Med., 181, 1015-1025, 1995). It is also known that the genetic Diseases "X-linked combined immunodeficiency" (XCID) and "X-linked severe combined immunodeficiency" (XSCID) by one defective signal transduction in the Jak-Stat signal transmission path is caused (Heim, M.H., supra).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Testkit, der eine erfindungsgemäße Zelle oder einen erfindungsgemäßen Proteinkomplex und gegebenenfalls geeignete Hilfs- oder Zusatzstoffe, wie z. B. Zellkulturmedium, Stabilisatoren oder Proteaseinhibitoren enthält.Another object of the present invention is therefore also a test kit containing a cell according to the invention or a protein complex according to the invention and, if appropriate, suitable Auxiliaries or additives, such as. B. cell culture medium, Contains stabilizers or protease inhibitors.

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern: The following figures and examples are intended to illustrate the invention explain:

Description of the figures

Fig. 1 zeigt die schematische Darstellung von DNA-Konstrukten mit verschiedenen Promotoren mit Stat5-Protein-Bindesequenzen für die Expression von Luciferase, Fig. 1 shows the schematic representation of DNA constructs with different promoters with Stat5-protein binding sequences for the expression of luciferase

Fig. 2 zeigt die Verstärkung der Stat5-vermittelten Induktion des β-Caseinpromotors durch Aktivierung des Glucocorticoid- Rezeptors (siehe Beispiel 1, 1.1), Fig. 2, the gain of the Stat5-mediated shows induction of the β-casein promoter by activation of the glucocorticoid receptor (see example 1, 1.1)

Fig. 3 zeigt die Verstärkung der Stat5-vermittelten Induktion durch multimere Stat5-Protein-Bindesequenzen im Promotor (siehe Beispiel 1, 1.2), Fig. 3 shows the gain of the Stat5-mediated induction by Stat5 multimeric protein binding sequences in the promoter (see example 1, 1.2),

Fig. 4A und 4B zeigen Immunpräzipitationen des Stat5-Gluco corticoid-Rezeptorkomplexes (siehe Beispiel 2), FIGS. 4A and 4B show immunoprecipitations of Stat5-gluco corticoid receptor complex (see Example 2),

Fig. 5 zeigt die schematische Darstellung von DNA-Konstrukten mit verschiedenen Promotoren mit Glucocorticoid-Rezeptor- Bindesequenzen für die Luciferase-Expression, Fig. 5 shows the schematic representation of DNA constructs with different promoters with glucocorticoid receptor binding sequences for the luciferase expression,

Fig. 6 zeigt die Unterdrückung der Glucocorticoid-Induktion des MMTV-LTR Promotors durch Bildung des Stat5-Glucocorticoid- Rezeptor-Komplexes (siehe Beispiel 3, 3.1), Fig. 6 shows the repression of glucocorticoid-induction of the MMTV-LTR promoter by formation of the Stat5-glucocorticoid receptor complex (see Example 3, 3.1),

Fig. 7 zeigt die Verringerung der Glucocorticoid-Induktion des (GRE)₄-Thymidinkinase-Promotors mit steigender Konzentration des Stat5-Proteins in der Zelle (siehe Beispiel 3, 3.2), Fig. 7 shows the reduction in glucocorticoid-induction of the (GRE) ₄-thymidine kinase promoter with increasing concentration of STAT5 protein in the cell (see Example 3, 3.2),

Fig. 8 zeigt die Verhinderung der Coaktivierung durch den Glucocorticoid-Rezeptor durch eine Mutation der Stat5-Protein- Bindesequenz (siehe Beispiel 4), Fig. 8 shows the prevention of co-activation by the glucocorticoid receptor by a mutation of the Stat5-protein binding sequence (see Example 4),

Fig. 9 zeigt die schematisch Darstellung verschiedener Stat5-Pro teine, Fig. 9 shows the schematic representation of various Stat5 proteins,

Fig. 10 zeigt die Verhinderung der Stat5-vermittelten Induktion durch eine Variante des Stat5-Proteins (siehe Beispiel 5), Fig. 10, the prevention of the Stat5-mediated shows induction by a variant of the Stat5 protein (see Example 5),

Fig. 11 zeigt die schematische Darstellung verschiedener Glucocorticoid-Rezeptoren Fig. 11 is a schematic representation showing different glucocorticoid receptors

Fig. 12-14 zeigen den Einfluß von Mutationen im Glucocorticoid-Rezeptor auf die Induktion der Luciferaseexpression, Figs. 12-14 show the effect of mutations in the glucocorticoid receptor in the induction of luciferase expression,

Fig. 15 zeigt die schematisch Darstellung der intrazellulären Signalübertragung. Fig. 15 shows the schematic representation of the intracellular signal transmission.

Nach Bindung eines Cytokins an den Cytokin-Rezeptor, Aktivierung der JAK-Kinase, Phosphorylierung des Stat5-Pro teins, Dimerisierung und Bindung an die Stat5-DNA-Binde region erfolgt in Abwesenheit von Dexamethason eine schwache Aktivierung der Transkription (A). In Anwesenheit von Dexamethason erfolgt die Aktivierung/Dimerisierung des Glucocorticoid-Rezeptors, die Bildung des Stat5-Gluco corticoid-Rezeptor-Komplexes und die Bindung dieses Komplexes an die Stat5-DNA-Binderegion, was eine starke Transkription des Gens zur Folge hat (B). Zugleich verhindert der Stat5-Glucocorticoid-Rezeptor-Komplex die Bindung des aktivierten Glucocorticoid-Rezeptors an die GRE-Sequenz (C), was zur Folge hat, daß die GRE-kontrollierte Transkription verhindert wird. In Anwesenheit von Dexamethason und in Abwesenheit von Cytokinen kann der aktivierte Glucocorticoid- Rezeptor an die GRE-Sequenz binden, was die Transkription des GRE-kontrollierten Gens zur Folge hat (D).After binding a cytokine to the cytokine receptor, Activation of the JAK kinase, phosphorylation of the Stat5-Pro teins, dimerization and binding to the Stat5 DNA binding region takes place in the absence of dexamethasone weak activation of transcription (A). In the presence of Dexamethasone activates / dimerizes the Glucocorticoid receptor, the formation of the Stat5-Gluco corticoid-receptor complex and the binding of this Complex to the Stat5 DNA binding region, which is a strong one Results in transcription of the gene (B). At the same time prevented the Stat5-glucocorticoid receptor complex binds the activated glucocorticoid receptor on the GRE sequence (C), which has the consequence that the GRE-controlled transcription is prevented. In the presence of dexamethasone and in In the absence of cytokines, the activated glucocorticoid Bind receptor to the GRE sequence, which affects the transcription of the GRE-controlled gene results (D).

Examples 1. Enhance Stat5-mediated induction of β-casein promotors by activating the glucocorticoid Receptor Cell culture

COS7-Zellen wurden in DMEM mit 10%igem fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM Glutamin und 50 µg/ml Gentamycin kultiviert. Die Zellen wurden durch 5 µg/ml bovines Prolactin induziert.COS7 cells were cultured in DMEM with 10% fetal calf serum (FCS), 2 mM glutamine and 50 µg / ml gentamycin. The cells were induced by 5 µg / ml bovine prolactin.

Plasmids and DNA transfection

Die Expressionsvektoren pXM-Stat5 kodierend für das Stat5-Pro tein und pZZ1 kodierend für ein β-Caseingen-Promotor- Luciferasekonstrukt, bei dem der β-Caseingen-Promotor von -344 bis -1 vor das Luciferasegen aus dem pLucDSS Vektor (Gouilleux et al., Nucleic Acids Res., 19, 1563-1569, 1991) kloniert wurde (ßc(-344/-1)-luc; Fig. 1), sind in Gouilleux et al. (EMBO J., 13, 4361-4369, No. 18, 1994) beschrieben. Der Expressionsvektor pcDNAI kodierend für den murinen Prolactin- Rezeptor ist in Wakao, H. et al. (EMBO J., 13, 2182-2191, No. 9, 1994) und Buck, K. et al. (Endocrinology, 130, 1108-1114, No. 3, 1992) beschrieben.The expression vectors pXM-Stat5 coding for the Stat5 protein and pZZ1 coding for a β-caseingen promoter-luciferase construct, in which the β-caseingen promoter from -344 to -1 before the luciferase gene from the pLucDSS vector (Gouilleux et al ., Nucleic Acids Res., 19, 1563-1569, 1991) (βc (-344 / -1) -luc; Fig. 1) are described in Gouilleux et al. (EMBO J., 13, 4361-4369, No. 18, 1994). The expression vector pcDNAI coding for the murine prolactin receptor is described in Wakao, H. et al. (EMBO J., 13, 2182-2191, No. 9, 1994) and Buck, K. et al. (Endocrinology, 130, 1108-1114, No. 3, 1992).

1.1 Die Transfektionsexperimente wurden nach der Calciumphosphat-Präzipitationsmethode durchgeführt. Hierbei wurden halb-konfluente COS7 Zellen in 10 cm Platten mit 2 µg des β-Caseingen-Promotor-Luciferasekonstrukts, 2 µg des Prolactin-Rezeptor-Expressionsvektors, 2 µg des Glucocorticoid-Rezeptor-Expressionsvektors (Hoeck, W. & Groner, B., J. Biol. Chem., 265, 5403-5408, No. 10, 1990), 2,5 µg des Stat5-Expressionsvektors und zusätzlich 2 µg des Plasmids pcH110, das das β-Galactosidasegen unter der Kontrolle des SV40 Promotors als interne Kontrolle für die Transfektionseffizienz enthält, transfiziert. Fallweise wurden die transfizierten Zellen mit 10^-7 M Dexamethason und/oder 5 µg/ml bovines Prolactin 16 Stunden lang vor dem Ernten behandelt.1.1 The transfection experiments were carried out according to the calcium phosphate precipitation method. Here, semi-confluent COS7 cells were placed in 10 cm plates with 2 µg of the β-caseingen promoter-luciferase construct, 2 µg of the prolactin receptor expression vector, 2 µg of the glucocorticoid receptor expression vector (Hoeck, W. & Groner, B. , J. Biol. Chem., 265, 5403-5408, No. 10, 1990), 2.5 ug of the Stat5 expression vector and additionally 2 ug of the plasmid pcH110, which the β-galactosidase gene under the control of the SV40 promoter as internal Contains control for transfection efficiency, transfected. Occasionally, the transfected cells were treated with 10 ^-7 M dexamethasone and / or 5 µg / ml bovine prolactin for 16 hours before harvesting.

Der Luciferasetest wurde wie bei Gouilleux, F. et al. (supra) beschrieben durchgeführt.The luciferase test was carried out as in Gouilleux, F. et al. (supra) described.

Result

Das Ergebnis von drei unabhängigen Experimenten ist in Fig. 2 dargestellt. Fig. 2 zeigt die Luciferaseaktivität nach Behandlung der Zellen ohne Dexamethason (DEX) und ohne Prolactin (PRL) (Spur 1), mit Prolactin und ohne Dexamethason (Spur 2), mit Dexamethason und ohne Prolactin (Spur 3) oder mit Dexamethason und mit Prolactin (Spur 4). Als Kontrollen dienten Zellen, die nicht mit dem Glucocorticoid-Rezeptor- Expressionsvektor (GR) transfiziert wurden und die mit Prolactin und ohne Dexamethason (Spur 5) oder ohne Prolactin und ohne Dexamethason (Spur 6) behandelt wurden. β-casein-luc steht für das β-Caseingen-Promotor-Luciferasekonstrukt, STAT5 für den Stat5-Expressionsvektor und Prl R für den Prolactin- Rezeptor-Expressionsvektor. "+" bedeutet Transfektion mit dem entsprechenden Expressionsvektor bzw. Zugabe des entsprechenden Hormons und "-" keine Transfektion mit dem entsprechenden Expressionsvektor bzw. keine Zugabe des entsprechenden Hormons.The result of three independent experiments is shown in Fig. 2. Fig. 2 shows the luciferase activity is after treatment of the cells without dexamethasone (DEX) and without prolactin (PRL) (lane 1), prolactin, and without dexamethasone (lane 2), with dexamethasone and without Prolactin (lane 3) or with dexamethasone and Prolactin (lane 4 ). Cells which were not transfected with the glucocorticoid receptor expression vector (GR) and which were treated with prolactin and without dexamethasone (lane 5 ) or without prolactin and without dexamethasone (lane 6 ) served as controls. β-casein-luc stands for the β-caseingen promoter luciferase construct, STAT5 for the Stat5 expression vector and PrRI for the prolactin receptor expression vector. "+" means transfection with the corresponding expression vector or addition of the corresponding hormone and "-" means no transfection with the corresponding expression vector or no addition of the corresponding hormone.

Das Experiment zeigt, daß die Zellen, die mit dem β-Caseingen- Promotor-Luciferasekonstrukt, dem Stat5-Expressionsvektor, dem Prolactin-Rezeptor-Expressionsvektor und dem Glucocorticoid- Rezeptor-Expressionsvektor transfiziert wurden, nach Induktion mit Dexamethason und Prolactin eine im Vergleich zum uninduzierten Zustand (Spur 1) eine ca. 40fache und im Vergleich zur Induktion mit Prolactin allein (Spur 2) eine ca. 4fach höhere Luciferaseaktivität zeigen (Spur 4).The experiment shows that the cells that were transfected with the β-caseingen promoter luciferase, the Stat5 expression vector, the prolactin receptor expression vector and the glucocorticoid receptor expression vector after induction with dexamethasone and prolactin were compared to uninduced state (lane 1 ) shows about 40 times and in comparison to induction with prolactin alone (lane 2 ) about 4 times higher luciferase activity (lane 4 ).

1.2 Zusätzlich wurde ein analoges Experiment durchgeführt, bei dem die Zellen anstelle mit dem β-Caseingen-Promotor- Luciferasekonstrukt (ßc(-344/-1)-luc) mit einem Thymidinkinasepromotor-Luciferasekonstrukt transfiziert wurden, das im Promotor sechs Stat5-Protein-Bindesequenzen enthält ((S5RE)₆tk-luc; Fig. 1).1.2 In addition, an analogous experiment was carried out in which the cells were transfected with a thymidine kinase promoter-luciferase construct instead of the β-caseingen promoter-luciferase construct (βc (-344 / -1) -luc), which contained six Stat5 protein in the promoter. Binding sequences contains ((S5RE) ₆tk-luc; Fig. 1).

Das Experiment zeigt eine gesteigerte Induktion der Luziferaseexpression durch Dexamethason und Prolaktin am (S5RE)₆tk-Promotor, der sechs Stat5-Protein-Bindesequenzen enthält, (Fig. 3, Spur 3) im Vergleich zum ßc(-344/-1)- Promotor, der nur zwei Stat5-Protein-Bindesequenzen enthält, (Fig. 2, Spur 4).The experiment shows an increased induction of luciferase expression by dexamethasone and prolactin on the (S5RE) ₆tk promoter, which contains six Stat5 protein binding sequences ( FIG. 3, lane 3 ) compared to the ßc (-344 / -1) promoter containing only two Stat5 protein binding sequences ( Fig. 2, lane 4 ).

2. Immunoprecipitation of the Stat5 glucocorticoid Receptor complex

Sub-konfluente COS7 Zellen wurden in 10 cm Platten wie in Beispiel 1 beschrieben transfiziert und wie in Fig. 4 angegeben eine Stunde lang vor dem Ernten induziert. Die Kernextrakte wurden wie in Gouilleux, F. et al. (supra) beschrieben hergestellt. Vor der Immunpräzipitation wurden die klaren Überstände auf 100 mM NaCl eingestellt. Die Immunpräzipitation wurde mit polyklonalen anti-Stat5a Antikörper (Liu, X. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 8831-8835, 1995) oder mit Glucocorticoid-Rezeptor-spezifischem Antiserum (Höck, W. & Groner, B., J. Biol. Chem., 265, 5403-5408, 1990) durchgeführt. Die Immunpräzipitate wurden mit Protein A-Sepharose isoliert. Die an die Protein A-Sepharose gebundenen Proteine wurden durch eine SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese aufgetrennt und anhand eines Immunblots (Western Blot) mit polyklonalem Antiserum gegen den Glucocorticoidrezeptor (Fig. 4A) oder gegen Stat5 (Fig. 4B) analysiert.Sub-confluent COS7 cells were transfected into 10 cm plates as described in Example 1 and induced as indicated in Figure 4 for one hour before harvesting. The core extracts were as described in Gouilleux, F. et al. (supra) described. Before the immunoprecipitation, the clear supernatants were adjusted to 100 mM NaCl. Immunoprecipitation was carried out with polyclonal anti-Stat5a antibodies (Liu, X. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 8831-8835, 1995) or with glucocorticoid receptor-specific antiserum (Höck, W. & Groner, B., J. Biol. Chem., 265, 5403-5408, 1990). The immunoprecipitates were isolated with Protein A-Sepharose. The proteins bound to the protein A-Sepharose were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and analyzed using an immunoblot (Western blot) with polyclonal antiserum against the glucocorticoid receptor ( FIG. 4A) or against Stat5 ( FIG. 4B).

Result

Fig. 4A und 4B zeigen die Western Blots der Immunpräzipitate von Kernextrakten transfizierter COS7 Zellen, wobei die Zellen ohne Dexamethason und ohne Prolactin (Spur 1), mit Dexamethason und ohne Prolactin (Spur 2), mit Prolactin und ohne Dexamethason (Spur 3) oder mit Dexamethason und mit Prolactin (Spur 4) induziert wurden. Als Kontrollen dienten Zellen, die nicht mit dem Glucocorticoid-Rezeptor- Expressionsvektor (GR) (Spuren 5 und 6 in Fig. 4A) oder die nicht mit dem Stat5-Expressionsvektor (Spuren 7 und 8 in Fig. 4A) transfiziert wurden. Als weitere Kontrollen in dem Westernblot dienten Extrakte von Zellen, die mit dem Glucocorticoid-Expressionsvektor (Spur C in Fig. 4A) oder mit dem Stat5-Expressionsvektor (Spur C in Fig. 4B) transfiziert wurden. FIG. 4A and 4B, Western show blots of immunoprecipitates of nuclear extracts of transfected COS 7 cells, the cells without dexamethasone and without Prolactin (lane 1), with dexamethasone and without prolactin (lane 2), prolactin, and without dexamethasone (Lane 3), or with dexamethasone and with prolactin (lane 4 ). Controls were cells that were not transfected with the glucocorticoid receptor expression vector (GR) (lanes 5 and 6 in FIG. 4A) or that were not transfected with the Stat5 expression vector (lanes 7 and 8 in FIG. 4A). Extracts from cells transfected with the glucocorticoid expression vector (lane C in FIG. 4A) or with the Stat5 expression vector (lane C in FIG. 4B) served as further controls in the Western blot.

Das Experiment zeigt, daß die Zellen, die mit dem Stat5-Ex pressionsvektor, dem Prolactin-Rezeptor-Expressionsvektor und dem Glucocorticoid-Rezeptor-Expressionsvektor transfiziert wurden, nach Induktion mit Dexamethason und Prolactin einen Stat5-Glucocorticoid-Rezeptor-Komplex bilden, der co immunpräzipitiert werden kann (siehe Pfeil zu Spur 4 in Fig. 4A und Spur 4 in Fig. 4B).The experiment shows that the cells transfected with the Stat5 expression vector, the prolactin receptor expression vector and the glucocorticoid receptor expression vector, after induction with dexamethasone and prolactin, form a Stat5-glucocorticoid receptor complex which co can be immunoprecipitated (see arrow to lane 4 in FIG. 4A and lane 4 in FIG. 4B).

3. Suppression of the glucocorticoid induction of the MMTV-LTR Promoter by formation of the Stat5-glucocorticoid Receptor complex

3.1 Die Experimente wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, außer daß die Zellen anstelle mit dem β-Casein gen-Promotor-Luciferase-Konstrukt mit einem MMTV-LTR-Luci ferase-Konstrukt (MMTV LTR-luc, Fig. 5) oder einem Thymidinkinase-Luciferase-Konstrukt ((GRE)₄tk-luc, Fig. 5) transfiziert wurden. Die mit dem MMTV LTR-luc-Konstrukt transfizierten Zellen wurden mit Prolactin und ohne Dexamethason (Fig. 6, Spur 1), mit Dexamethason und ohne Prolactin (Spur 4) oder mit Dexamethason und mit Prolactin (Spur 3) induziert. Als Kontrolle dienten Zellen, die nicht mit dem Prolactin-Rezeptor-Expressionsvektor transfiziert wurden und die entweder mit Dexamethason und ohne Prolactin (Spur 2) oder mit Dexamethason und mit Prolactin (Spur 5) induziert wurden. 3.1 The experiments were carried out as described in Example 1, except that the cells instead of the β-casein gene promoter-luciferase construct with an MMTV-LTR-Luciferase construct (MMTV LTR-luc, Fig. 5) or one Thymidine kinase-luciferase construct ((GRE) ₄tk-luc, Fig. 5) were transfected. The cells transfected with the MMTV LTR-luc construct were induced with prolactin and without dexamethasone ( FIG. 6, lane 1 ), with dexamethasone and without prolactin (lane 4 ) or with dexamethasone and with prolactin (lane 3 ). Cells which were not transfected with the prolactin receptor expression vector and which were induced either with dexamethasone and without prolactin (lane 2 ) or with dexamethasone and with prolactin (lane 5 ) served as control.

Das Experiment zeigt, daß Zellen, die mit dem MMTV LTR-Pro motor-Luciferase-Expressionsvektor, dem Prolactin-Rezeptor- Expressionsvektor, dem Glucocorticoid-Rezeptor- Expressionsvektor und dem Stat5-Expressionsvektor transfiziert und mit Dexamethason und Prolactin induziert wurden, eine um das ca. 5fach verringerte Luciferaseaktivität zeigen (Spur 3) als die Zellen, die mit Dexamethason allein (Spur 4) induziert wurden.The experiment shows that cells transfected with the MMTV LTR promoter luciferase expression vector, the prolactin receptor expression vector, the glucocorticoid receptor expression vector and the Stat5 expression vector and induced with dexamethasone and prolactin, one by one show approximately 5-fold reduced luciferase activity (lane 3 ) than the cells induced with dexamethasone alone (lane 4 ).

3.2 In einem weiteren analogen Experiment wurden die Zellen mit 5 µg des (GRE)₄tk-Luciferasekonstrukts und mit steigender Konzentration des Stat5-Expressionsvektors (0,5 bis 5 µg) transfiziert (Fig. 7). Das Kontrollexperiment wurde mit 2,5 µg des Stat5-Expressionsvektors transfiziert. Anschließend wurden die Zellen mit Dexamethason und mit Prolactin (Spur 1-4) oder als Kontrolle ohne Dexamethason und ohne Prolactin (Spur 5) behandelt.3.2 In a further analog experiment, the cells were transfected with 5 µg of the (GRE) ₄tk-luciferase construct and with increasing concentration of the Stat5 expression vector ( 0.5 to 5 µg) ( Fig. 7). The control experiment was transfected with 2.5 µg of the Stat5 expression vector. The cells were then treated with dexamethasone and with prolactin (lane 1-4 ) or as a control without dexamethasone and without prolactin (lane 5 ).

Das Ergebnis zeigt, daß aufgrund steigender Expression des Stat5-Gens mit steigender Konzentration an Stat5 in der Zelle die Induktion der Expression des Luciferasegens durch den Glucocorticoid-Rezeptor zunehmend verringert wird (Fig. 7).The result shows that due to increasing expression of the Stat5 gene with increasing concentration of Stat5 in the cell, the induction of the expression of the luciferase gene by the glucocorticoid receptor is increasingly reduced ( FIG. 7).

4. Prevention of Coactivation by the Glucocorticoid Receptor due to mutations in the β-casein promoter

Die Experimente wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, wobei zusätzlich ein Experiment durchgeführt wurde, bei dem die Zellen anstelle mit dem β-Caseingen- Promotor-Luciferase-Konstrukt (ßc(-344/-1)-luc; Fig. 1) mit einer nicht aktiven Mutante in der Stat5-Protein-Bindesequenz (mßc(-344/-1)-luc; Fig. 1) transfiziert wurden.The experiments were carried out as described in Example 1, with an additional experiment being carried out in which the cells were used instead of with the β-caseingen promoter-luciferase construct (βc (-344 / -1) -luc; FIG. 1) a non-active mutant in the Stat5 protein binding sequence (mßc (-344 / -1) -luc; Fig. 1).

Fig. 8 zeigt in den Spuren 1-3 die Luciferaseaktivitäten nach Behandlung der mit dem nicht-mutierten Promotor-Konstrukt transfizierten Zellen ohne Dexamethason und ohne Prolactin (Spur 1), mit Prolactin und ohne Dexamethason (Spur 2) und mit Prolactin und mit Dexamethason (Spur 3). Die Spuren 4-6 zeigen die Luciferaseaktivitäten nach Behandlung der mit dem mutierten Promotor-Konstrukt transfizierten Zellen ohne Dexamethason und ohne Prolactin (Spur 4), mit Prolactin und ohne Dexamethason (Spur 5) und mit Prolactin und mit Dexamethason (Spur 6). Fig. 8 shows in Lanes 1-3, the luciferase activities after treatment with the non-mutated promoter construct transfected cells without dexamethasone and prolactin without (lane 1), prolactin, and without dexamethasone (lane 2) and with prolactin and dexamethasone (Lane 3 ). Lanes 4-6 show the luciferase activities after treatment of the cells transfected with the mutant promoter construct without dexamethasone and without prolactin (lane 4 ), with prolactin and without dexamethasone (lane 5 ) and with prolactin and with dexamethasone (lane 6 ).

Ein Vergleich der Spuren 3 und 4 zeigt, daß die Mutation in der Stat5-Protein-Bindesequenz die Induktion der Luciferaseexpression verhindert.A comparison of lanes 3 and 4 shows that the mutation in the Stat5 protein binding sequence prevents the induction of luciferase expression.

5. Prevention of Stat5-mediated induction by Variant of the Stat5 protein

Die Experimente wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, wobei zusätzlich ein Experiment durchgeführt wurde, bei dem die Zellen anstelle mit dem Stat5-Ex pressionsvektor mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der für ein Stat5-Protein kodiert, das an der Aminosäureposition 694 eine Substitution von Tyrosin (Y) zu Phenylalanin (F) besitzt (Fig. 9).The experiments were carried out as described in Example 1, in addition to which an experiment was carried out in which the cells instead of the Stat5 expression vector were transfected with an expression vector which codes for a Stat5 protein which is substituted at amino acid position 694 by Tyrosine (Y) to phenylalanine (F) ( Fig. 9).

Fig. 10 zeigt in den Spuren 1-4 die Luciferaseaktivitäten nach Behandlung der mit dem nicht-mutierten Stat5-Expressionsvektor transfizierten Zellen ohne Dexamethason und ohne Prolactin (Spur 1), mit Prolactin und ohne Dexamethason (Spur 2), mit Dexamethason und ohne Prolactin (Spur 3) und mit Prolactin und mit Dexamethason (Spur 4). Die Spuren 5-8 zeigen die Luciferaseaktivitäten nach Behandlung der mit dem für die Stat5-Variante kodierenden Expressionsvektor behandelten Zellen ohne Dexamethason und ohne Prolactin (Spur 5), mit Prolactin und ohne Dexamethason (Spur 6), mit Dexamethason und ohne Prolactin (Spur 7) und mit Prolactin und mit Dexamethason (Spur 8). Fig. 10 shows in Lanes 1-4, the luciferase activities after treatment of the transfected with the non-mutated Stat5 expression vector cells without dexamethasone and prolactin without (lane 1), prolactin, and without dexamethasone (lane 2), with and without dexamethasone Prolactin (Lane 3 ) and with prolactin and with dexamethasone (lane 4 ). Lanes 5-8 show the luciferase activities after treatment of the cells treated with the expression vector coding for the Stat5 variant without dexamethasone and without prolactin (lane 5 ), with prolactin and without dexamethasone (lane 6 ), with dexamethasone and without prolactin (lane 7 ) and with prolactin and with dexamethasone (lane 8 ).

Ein Vergleich der Spuren 4 und 8 zeigt, daß die Stat5-Variante Y 694 F keine Induktion der Luciferaseexpression bewirken kann.A comparison of lanes 4 and 8 shows that the Stat5 variant Y 694 F cannot induce luciferase expression.

6. Influence of mutations in the glucocorticoid receptor induction of luciferase expression

Die Experimente wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, wobei zusätzlich Experimente durchgeführt wurden, bei denen die Zellen anstelle mit dem Glucocorticoid- Rezeptor-Expressionsvektor mit Expressionsvektoren transfiziert wurden, die für verschiedene Varianten des Glucocorticoid-Rezeptors kodieren (Fig. 11).The experiments were carried out as described in Example 1, with additional experiments being carried out in which the cells instead of the glucocorticoid receptor expression vector were transfected with expression vectors which code for different variants of the glucocorticoid receptor ( FIG. 11).

Die Mutanten mit den Bezeichnungen hGR C476W/R479Q und hGR(D4X) tragen verschiedene Substitutionen, die die DNA-Bin dung des aktivierten Rezeptors verhindern. C476W steht für die Substitution an der Aminosäureposition 476 des menschlichen Glucocorticoid-Rezeptors von Cytosin (C) nach Tryptophan (W). R479Q steht für die Substitution an der Position 479 von Arginin (R) nach Glutamin (Q). N454D steht für die Substitution an der Position 454 von Asparagin (N) nach Asparaginsäure (D). A458T steht für die Substitution an der Position 458 von Alanin (A) nach Threonin (T). R460D steht für die Substitution an der Position 460 von Arginin (R) nach Asparaginsäure (D). D462C steht für die Substitution an der Stelle 462 von Asparaginsäure (D) zu Cytosin (C).The mutants named hGR C476W / R479Q and hGR (D4X) carry various substitutions that make up the DNA bin prevent the activated receptor from becoming damaged. C476W stands for the substitution at amino acid position 476 of the human glucocorticoid receptor from cytosine (C) Tryptophan (W). R479Q stands for the substitution on the Position 479 from arginine (R) to glutamine (Q). N454D stands for substitution at position 454 of asparagine (N) after aspartic acid (D). A458T is pending substitution position 458 from alanine (A) to threonine (T). R460D stands for the substitution at position 460 of arginine (R) Aspartic acid (D). D462C stands for the substitution on the Site 462 from aspartic acid (D) to cytosine (C).

Die Mutante mit der Bezeichnung hGR-ERcas enthält anstelle der DNA-bindenden Domäne des Glucocorticoid-Rezeptors die DNA-bin dende Domäne des Östrogenrezeptors.The mutant called hGR-ERcas contains instead of DNA-binding domain of the glucocorticoid receptor is the DNA bin ending domain of the estrogen receptor.

rGR-CVC 3-556 steht für eine Deletion im N-terminalen (Aminosäuren 1-2) und C-terminalen Bereich (Aminosäuren 557-795) des Ratten-Glucocorticoid-Rezeptors, die die Liganden unabhängige Transaktivierung bewirken. rGR-CVC 3-556 stands for a deletion in the N-terminal (Amino acids 1-2) and C-terminal region (amino acids 557-795) of the rat glucocorticoid receptor containing the ligands effect independent transactivation.

rGR-CVN 407-795 steht für eine Deletion im N-terminalen Bereich (Aminosäuren 1-406) des Ratten-Glucocorticoid- Rezeptors, die eine schwache Liganden-abhängige Transaktivierung bewirkt.rGR-CVN 407-795 stands for a deletion in the N-terminal Region (amino acids 1-406) of the rat glucocorticoid Receptor, which is a weak ligand-dependent Transactivation causes.

Fig. 12 zeigt die Luciferaseaktivitäten der mit den für die einzelnen Glucocorticoid-Rezeptoren kodierenden Expressionsvektoren transfizierten Zellen hGR (Spuren 1-3), hGR-ERcas (Spuren 4-6), hGR-C476/R479Q (Spuren 7-9) und GR(D4X), (Spuren 10-12) nach Behandlung der Zellen ohne Dexamethason und ohne Prolactin (Spuren 1, 4, 7 und 10), mit Prolactin und ohne Dexamethason (Spuren 2, 5, 8 und 11) und mit Prolactin und mit Dexamethason (Spuren 3, 6, 9 und 12). Fig. 12 shows the luciferase activities of the transfected with the coding for each glucocorticoid receptors expression vectors cells hGR hGR ercas (lanes 4-6), hGR-C476 / R479Q shows (lanes 1-3), (lanes 7-9) and GR (D4X), (lanes 10-12 ) after treatment of the cells without dexamethasone and without prolactin (lanes 1 , 4 , 7 and 10 ), with prolactin and without dexamethasone (lanes 2 , 5 , 8 and 11 ) and with prolactin and with Dexamethasone (lanes 3 , 6 , 9 and 12 ).

Die Experimente zeigen, daß eine funktionelle DNA-bindende Domäne des Glucocorticoid-Rezeptors für die Verstärkung der Stat5-Induktion der Luciferaseexpression nicht nötig ist.The experiments show that a functional DNA-binding Domain of the glucocorticoid receptor for the enhancement of Stat5 induction of luciferase expression is not necessary.

Fig. 13 zeigt die Luciferaseaktivitäten der mit den für die einzelnen Glucocorticoid-Rezeptoren kodierenden Expressionsvektoren transfizierten Zellen hGR (Spuren 1-3) und rGR-CVC 3-556 (Spuren 4-6) nach Behandlung der Zellen ohne Dexamethason und ohne Prolactin (Spuren 1 und 4), mit Prolactin und ohne Dexamethason (Spuren 2 und 5) und mit Prolactin und mit Dexamethason (Spuren 3 und 6). Fig. 13 shows the luciferase activities of the transfected with the coding for each glucocorticoid receptors expression vectors hGR cells (lanes 1-3) and rGR-CVC 3-556 (lanes 4-6) after treatment of the cells without dexamethasone and without prolactin (lanes 1 and 4 ), with prolactin and without dexamethasone (lanes 2 and 5 ) and with prolactin and with dexamethasone (lanes 3 and 6 ).

Das Experiment zeigt, daß eine vorwiegend C-terminale Deletion des Glucocorticoid-Rezeptors die Verstärkung der Stat5-In duktion der Luciferaseexpression unabhängig von Dexamethason bewirkt.The experiment shows that a predominantly C-terminal deletion of the glucocorticoid receptor enhancing the Stat5-In reduction of luciferase expression independent of dexamethasone causes.

Fig. 14 zeigt die Luciferaseaktivitäten der mit den für die einzelnen Glucocorticoid-Rezeptoren kodierenden Expressionsvektoren transfizierten Zellen hGR (Spuren 1-3) und rGR-CVN 407-795 (Spuren 4-6) nach Behandlung der Zellen ohne Dexamethason und ohne Prolactin (Spuren 1 und 4), mit Prolactin und ohne Dexamethason (Spuren 2 und 5) und mit Prolactin und mit Dexamethason (Spuren 3 und 6). Fig. 14 shows the luciferase activities of the transfected with the coding for each glucocorticoid receptors expression vectors hGR cells (lanes 1-3) and rGR-CVN 407-795 (lanes 4-6) after treatment of the cells without dexamethasone and without prolactin (lanes 1 and 4 ), with prolactin and without dexamethasone (lanes 2 and 5 ) and with prolactin and with dexamethasone (lanes 3 and 6 ).

Das Experiment zeigt, daß eine N-terminale Deletion des Glucocorticoid-Rezeptors, bei der die AF-1 Domäne verloren geht, die Stat5-vermittelte Induktion der Luciferaseexpression in Anwesenheit von Dexamethason nicht verstärkt.The experiment shows that an N-terminal deletion of the Glucocorticoid receptor in which the AF-1 domain is lost goes, the Stat5-mediated induction of luciferase expression not enhanced in the presence of dexamethasone.

Claims

1. Nucleic acid construct, characterized in that it contains separately or together nucleic acids which code for a protein complex which

a) a stat protein or a functional derivative thereof and
b) contains a nuclear receptor or a functional derivative thereof.

2. Nucleic acid construct according to claim 1, characterized characterized in that the protein complex is a stat protein contains that from Stat1, Stat2, Stat3, Stat4, Stat5 and / or Stat6 is selected.

3. Nucleic acid construct according to claim 1 or 2, characterized characterized in that the protein complex is a functional Derivative of Stat that contains a transmembrane receptor contains binding domain.

4. Nucleic acid construct according to claim 3, characterized characterized in that said transmembrane receptor binding domain is the SH2 domain.

5. Nucleic acid construct according to claim 3 or 4, characterized characterized in that said transmembrane receptor binding domain between amino acids 600 and 700 of the stat Protein.

6. nucleic acid construct according to any one of claims 3-5, characterized in that the protein complex functional derivative of Stat, which also contains a Contains DNA binding domain.

7. Nucleic acid construct according to claim 6, characterized characterized in that said DNA-binding domain between amino acids 400 and 500 of the stat protein.

8. Nucleic acid construct according to claim 6 or 7, characterized characterized in that the transmembrane receptor binding domain from a stat protein and the DNA binding domain from one other stat protein.

9. nucleic acid construct according to any one of claims 1-8, characterized in that the protein complex has a nuclear Contains receptor made from a steroid hormone receptor or Orphan receptor, especially from the glucocorticoid receptor, the mineralocorticoid receptor, the androgen receptor, the Progesterone receptor, the estrogen receptor, the vitamin D3-Re receptor, the thyroid hormone receptor and / or the retinoic acid Receptor is selected.

10. Nucleic acid construct according to one of claims 1-9, characterized in that the protein complex functional derivative of a member of the nuclear Receptor family that contains a transactivation domain contains.

11. Nucleic acid construct according to one of claims 1-10, characterized in that it additionally has one or more Contains nucleic acids necessary for a transmembrane receptor encode that from a receptor of the interferon family that gp130 family, the Il-2 family, the gp140 family, the GH Family, the receptor tyrosine kinase family and / or the Family of G protein-coupled receptors is selected.

12. Nucleic acid construct, characterized in that it contains separately or together nucleic acids that a Promoter with one or more stat protein DNA bindings contain sequences of the transcription of a control endogenous or exogenous gene, and which a promoter containing one or more DNA binding sequences at which the nuclear receptor can bind and the transcription the same or another endogenous or exogenous gene Taxes.

13. Nucleic acid construct according to claim 12, characterized characterized in that the stat protein DNA binding sequence is selected from AGT TTC NNT TTC NC / T and / or TTN NNN NAA and the nuclear receptor binding sequence is the AGAACA sequence and / or AGGTCA contains.

14. Eukaryotic cell, characterized in that it has a nucleic acid construct according to any one of claims 1-13 has been transformed or transfected.

15. Eukaryotic cell according to claim 14, characterized characterized in that they additionally with a Deoxyribonucleic acid has been transformed or transfected which is a promoter with one or more stat protein DNA binding sequences containing the transcription of a controls endogenous or exogenous gene.

16. Eukaryotic cell according to claim 15, characterized characterized in that the stat protein binding sequence is selected is from AGT TTC NNT TTC NC / T and / or TTN NNN NAA.

17. Eukaryotic cell according to one of claims 14-16, characterized in that it additionally with a Deoxyribonucleic acid has been transformed or transfected which is a promoter with one or more DNA binders sequences to which a nuclear receptor can bind contains the transcription of an endogenous or exogenous Gens controls.

18. Eukaryotic cell according to claim 17, characterized characterized in that the nuclear receptor binding sequence Sequences AGAACA and / or AGGTCA especially in palindromic Arrangement, in particular a GRE element contains.

19. Eukaryotic cell according to any one of claims 14-18 thereby characterized in that the cell a CHO, BHK, C127, COS cell le, epithelial cell, hematopoietic stem cell or Immune cell is.

20. Containing protein complex

a) a stat protein or a functional derivative thereof and
b) an activated nuclear receptor or a functional derivative thereof, characterized in that it can be produced by expression of a nucleic acid construct according to any one of claims 1-13.

21. Process for the preparation of a protein complex containing

a) a stat protein or a functional derivative thereof and
b) an activated nuclear receptor or a functional derivative thereof, characterized in that a nucleic acid construct according to one of claims 1-13 is brought to expression.

22. A method for regulating the transcription of at least two endogenous and / or exogenous genes, characterized in that the promoter region of the one gene contains one or more stat protein DNA binding sequences and the promoter region of the other gene contains one or more DNA binding sequences to which the nuclear receptor can bind, where

(a) in the absence of the stat protein dimer or a functional derivative thereof and in the absence of the activated nuclear receptor or a functional derivative thereof, substantially neither the one gene nor the other gene is transcribed;
(b) in the presence of the stat protein dimer or a functional derivative thereof and in the absence of the activated nuclear receptor or a functional derivative thereof, one gene is transcribed and the other gene is essentially not transcribed;
(c) in the absence of the stat-protein dimer or a functional derivative thereof and in the presence of the activated nuclear receptor or a functional derivative thereof, one gene is essentially not and the other gene is transcribed; and
(d) in the presence of the stat protein dimer or a functional derivative thereof and in the presence of the activated nuclear receptor or a functional derivative thereof, one gene is transcribed and the other gene is essentially not transcribed.

23. A method for regulating the transcription of an endogenous or exogenous gene, characterized in that the promoter region contains one or more stat protein DNA binding sequences and one or more DNA binding sequences to which the nuclear receptor can bind, wherein

(a) in the absence of the stat protein dimer or a functional derivative thereof and in the absence of the activated nuclear receptor or a functional derivative thereof, essentially the gene is not transcribed;
(b) in the presence of the stat protein dimer or a functional derivative thereof and in the absence of the activated nuclear receptor or a functional derivative thereof, the transcription of the gene is induced or enhanced via the stat protein binding sequence;
(c) in the absence of the stat protein dimer or a functional derivative thereof and in the presence of the activated nuclear receptor or a functional derivative thereof, the transcription of the gene via the DNA binding sequence to which the activated nuclear receptor binds ; and
(d) in the presence of the stat protein dimer or a functional derivative thereof and in the presence of the activated nuclear receptor or a functional derivative thereof, the transcription of the gene is induced or enhanced via the stat protein binding sequence.

24. Use of a eukaryotic cell according to one of the Claims 14-19 or a protein complex according to claim 20 to find pharmacologically active compounds.

25. Use according to claim 24, characterized in that the exogenous gene or genes for the β-galactosidase and / or Encode luciferase.

26. Test kit containing a eukaryotic cell according to one of claims 14-19 or a protein complex according to claim 20th