DE19633731A1

DE19633731A1 - Hybridzellen zur Steigerung der Immunogenität von Tumorzellen

Info

Publication number: DE19633731A1
Application number: DE19633731A
Authority: DE
Inventors: Johann Hinrich Prof Dr Peters
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-08-21
Filing date: 1996-08-21
Publication date: 1998-02-26

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Hybridzellen, die sich zur Steigerung der Immunogenität von Tumorzellen eignen, ein solche Hybridzellen enthaltendes Vakzinierungs-Mittel und die Verwendung beider.

Es ist bekannt, daß bei etwa 0,5% der Krebspatienten, z. B. jener des malignen Melanoms, eine vollständige Rückbildung des Tumors eintritt. Auch kommt es bei vielen Krebspatienten zu einer Kontrolle des Tumors, wodurch dieser über Jahre in einem stabilen Zustand verharrt. Dies weist darauf hin, daß das Immun system einen Einfluß auf den Verlauf einer Krebserkrankung hat.

Viele Versuche wurden unternommen, das Immunsystem zu aktivieren, Tumor zellen zu erkennen und auszuschalten. Bisher haben diese Versuche jedoch keine zufriedenstellenden Ergebnisse gebracht.

Der vorliegenden Erfindung liegt so mit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu stellen, mit dem das Immunsystem gegenüber Tumorzellen stimuliert werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Hybridzellen aus Tumorzellen und Antigen-präsentierenden Zellen.

Der Ausdruck "Hybridzellen" weist auf Zellen hin, die Genome zweier oder mehrerer Zellen enthalten, d. h. Hybridzellen sind das Ergebnis der Verschmel zung mehrerer Zellen.

Der Ausdruck "Tumorzellen" umfaßt Tumorzellen und Prä-Tumorzellen jeglicher Art. Die Tumorzellen können aus Primärtumoren oder Metastasen stammen. Sie können in üblicher Weise, wie durch Operation oder Punktion, aus einem Orga nismus erhalten werden. Auch können die Tumorzellen frisch isoliert oder in Kultur gehalten sein.

Der Ausdruck "Antigen-präsentierende Zellen" umfaßt Zellen jeglicher Art, die Antigene präsentieren. Solche Zellen werden nachstehend mit APCs bezeichnet. Beispiele von APCs sind Monocyten, Makrophagen, dendritische Zellen, z. B. solche der Lymphe, des Knochenmarks, des Bluts und der Haut, wie Langer hans-Zellen, und von Monocyten abgeleitete, dendritische Zellen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung sind B-Lymphocyten keine APCs. APCs können in übli cher Weise aus einem Organismus isoliert werden. Beispielsweise können Monocyten abgeleitete, dendritische Zellen aus Monocyten des Bluts durch Kultivierung unter Bedingungen, die eine Differenzierung der Monocyten zu Makrophagen ausschließen, erhalten werden. Dies kann z. B. bei menschlichen Monocyten dadurch erreicht werden, daß sie in einem serumfreien Medium oder in einem mit foetalem Kälberserum supplementierten, humanserumfreien Medium kultiviert werden. Auch können sie in einem serumhaltigen Medium kultiviert werden, das mit Zytokinen, wie IL-4, GM-CSF, IFN-γ und/oder Tumornekrosefak tor-α, supplementiert ist. Dendritische Zellen können z. B. aus dem Blut, in dem sie mit etwa 0,1% der mononuklearen Zellen vorliegen, durch Immunaffinitäts reinigung mittels eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, der gegen den dritische Zellen gerichtet ist und an eine feste Phase, wie Magnetpartikel, gebunden ist, präparativ gewonnen werden. Dendritische Zellen können auch aus Vorläuferzellen des Knochenmarks, z. B. CD34-positive Stammzellen, gewon nen werden. Diese CD34-positiven Stammzellen kommen auch im Nabelschnur blut und in niedriger Frequenz im Blut nach der Geburt bis zum Erwachsenenalter vor. Ihre Frequenz wird erhöht, indem das Individuum für einige Tage mit Wachstumsfaktoren, wie dem Stammzellfaktor, behandelt wird. Die Stammzellen werden aus dem Knochenmark oder aus dem Blut gewonnen, und in der Kultur durch Zugabe geeigneter Wachstumsfaktoren, wie Stammzellfaktor, der vor genannten Interleukine und/oder z. B. IL1, IL3, IL6, TGF-β-1, nach bekannten Methoden zu dendritischen Zellen differenziert. In den beiden letzteren Fällen der APC-Gewinnung kann eine Leukapherese die Mengenausbeute der gewünsc hten Zelltypen aus dem Blut erhöhen.

In erfindungsgemäßen Hybridzellen liegen Tumorzellen verschmolzen mit APCs vor. Die Verschmelzung kann durch übliche Verfahren, wie Fusion, z. B. über einen inaktivierten Sendai-Virus, durch Polyetyhlenglykol oder durch Elektrofu sion, erreicht werden.

Erfindungsgemäße Hybridzellen eignen sich, an einen Organismus verabreicht zu werden. Damit kann die Immunogenität der in den Hybridzellen enthaltenen Tumorzellen und solcher, die diesen gleichen, gesteigert werden. Die Bestand teile der Hybridzellen, d. h. die Tumorzellen und die APCs, können von dem zu behandelnden Organismus stammen. Solche Zellen werden als autologe Zellen bezeichnet. Auch können sie hinsichtlich des Organismus allogen sein. Hierbei ist es günstig, wenn die Zellen einem dem Organismus entsprechenden HLA-Typ angehören. Der Fachmann kennt Verfahren, Zellen einen bestimmten HLA-Typ zu verleihen. Hierbei ist es günstig, wenn entweder die Tumorzellen oder die APC aus einem anderen Organismus der selben Spezies stammen und durch die unterschiedlich HLA-Moleküle die Immunogenität weiter verstärkt wird. Weiter hin ist es günstig, wenn die Tumorzellen oder die Hybridzellen inaktiviert sind. Hierfür können übliche Verfahren, wie Bestrahlung, durchgeführt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Vakzinierungs-Mittel, das vorstehende Hybridzellen und übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Verdünnungs mittel, Trägermittel, etc. umfaßt. Günstig kann es sein, wenn das Vakzinierungs- Mittel weitere, die Immunogenität von Zellen steigernde Substanzen umfaßt. Solche Substanzen sind z. B. Moleküle, die Tumorzellen fehlen, wie MHC-I- Moleküle, kostimulatorische Moleküle, wie B7, sekretorische Immunstimulatoren, wie Zytokine, insbesondere II-2, Interferone und GM-CSF, tumorassoziierte Antigene, wie MAGE1, Tyrosinasen und virale Proteine, wie EBNA3 von Epstein- Barr-Virus. Die Substanzen können in verschiedener Form, z. B. als Polypeptide, insbesondere synthetische Polypeptide, vorliegen. Auch können sie in Form von sie kodierenden Expressionsplasmiden vorliegen, die ferner für HLA-Moleküle kodieren können. Ferner sind solche Substanzen alle gängigen Adjuvantien.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Immunogenität von Tumorzel len zu steigern. In vitro kann dies z. B. dadurch gezeigt werden, daß Tumorzellen, die mit APCs fusioniert sind, zugegebene Lymphozyten aktivieren und zur Proliferation stimulieren. Dies ist darstellbar:

1. in der Zellvermehrung der Lymphozyten, gemessen durch Einbau von tritiiertem Thymidin,
2. in der starken Verschiebung der Lymphozytenpopulation zugunsten zyto toxischer CD8-positiver T-Lymphozyten, und
3. in der Aktivierung der Killeraktivität der Lymphozyten gegenüber den vorstehenden Tumorzellen.

Die vorliegende Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß die Tumorantigene der Tumorzellen nicht identifiziert sein müssen. Ferner nutzt die Erfindung das gesamte Tumorantigen-Potential der Tumorzellen, was ein späteres Erkennen einzelner, gegebenenfalls veränderter Tumorzellen durch den Organismus erleich tert. Die vorliegende Erfindung eignet sich daher bestens zur Therapie von Krebs erkrankungen, wie malignes Melanom.

Die Erfindung wird durch das Beispiel erläutert.

Beispiel Herstellung erfindungsgemäßer Hybridzellen

Einem Tumorpatienten werden Nierenkarcinom-Zellen und APCs, d. h. Monocy ten, entnommen. Letztere werden mit IL-4, GM-SCF und IFN-γ behandelt, wodurch Monocyten abgeleitete, dendritische Zellen erhalten werden. Diese werden zusammen mit den Nierenkarzinomzellen einer Elektrofusion unterzogen. Die einzelnen Bedingungen der Elektrofusion sind in Tabelle I angegeben. Es werden erfindungsgemäße Hybridzellen erhalten. Ihr Nachweis wird durch mikroskopische Untersuchen geführt.

Tabelle 1

Bedingungen der Fusion von Nierenkarzinomzellen mit Monocyten abgeleiteten, dendritischen Zellen

Claims

1. Hybridzellen aus Tumorzellen und Antigen-präsentierenden Zellen.

2. Hybridzellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigen präsentierenden Zellen dendritische Zellen sind.

3. Hybridzellen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die dendriti schen Zellen Monocyten-abgeleitete, dendritische Zellen, von CD34-positi ven Stammzellen des Knochenmarks abgeleitete dendritische Zellen oder dendritische Zellen des Blutes sind.

4. Hybridzellen nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen und die Antigen-präsentierenden Zellen vom gleichen Orga nismus stammen.

5. Hybridzellen nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen oder Hybridzellen inaktiviert sind.

6. Vakzinierungs-Mittel, enthaltend die Hybridzellen nach einem der Ansprüche 1-5 und übliche Hilfsstoffe.

7. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß weite re die Immunogenität von Zellen steigernde Substanzen vorliegen.

8. Vakzinierungs-Mittel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanzen MHC-I-Moleküle, kostimulatorische Moleküle, sekretorische Immunstimulatoren, tumorassoziierte Antigene, Tyrosinasen, virale Proteine und/oder Adjuvantien sind.

9. Verwendung der Hybridzellen nach einem der Ansprüche 1-5 und des Vakzinierungs-Mittels nach einem der Ansprüche 6-8 zur Steigerung der Immunogenität von Tumorzellen.