DE19602662C2 - Verfahren zur bioluminometrischen Bestimmung von Pyrophosphat - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anwendung von L-Luciferin in bioluminometrischen Messungen.

Die Emission von Licht im Verlauf einer chemischen Katalyse wird als Bioluminiszenz bezeichnet. In der Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) katalysiert Luciferase (Firefly luciferase EC.1.13.12.7) die oxydative Decarboxylierung von D-Luciferin zu Oxyluciferin. Diese Reaktion ist mit der Emission von Licht verbunden. Da sich Licht sehr empfindlich messen läßt, wird dieses Verfahren allgemein zur Bestimmung von geringen Mengen ATP benutzt (Gould, S. und Subramani, S. (1988) Analytical Biochemistry, 175, 5-13). Die Hauptanwendung der bioluminometrischen ATP-Messungen ist der Nachweis bakterieller Verunreinigungen (Lebensmittelchemie, Militär) sowie die Analyse biochemischer Reaktionen (biologische und medizinische Forschung) (Kricka, L. (1988) Analytical Biochemistry, 175, 14-21).

Die Katalyse der Luciferase ist stereospezifisch und eine Lichtemission kann daher nur in Gegenwart von D-Luciferin, nicht aber bei Verwendung von L-Luciferin gemessen werden (Seliger, H., McElroy, W., White, E. und Field, G. (1961) Proceedings of the National Academy of Science, 47, 1129-1134; McElroy, W. und Seliger, H. (1962) Federal Proceedings, 21, 1006-1012). Beide Isomere können synthetisiert werden (Bowie, L. (1978), Methods in Enzymology, Vol. LVII, 15-28). Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit wirkt L- Luciferin als kompetitiver Inhibitor von D-Luciferin. Dieser Umstand wird von kommerziellen "ATP momtoring kits" zur Stabilisierung der Luciferaseaktivität ausgenutzt und stellt gleichzeitig die wichtigste praktische Anwendung von L-Luciferin dar (Lundin, A. (1982) Luminescent Assays: Perspectives in Endocrinology and Clinical Chemistry, Hrsg. Serio, M. und Pazzagli, M., Raven Press, New York).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Stereospezifität der bioluminometrischen Reaktion zu umgehen und damit den Anwendungsbereich bioluminometrischer Messungen zu erweitern.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die folgenden Verfahrensschritte gelöst:

• - Luciferase wird mit Adenosintriphosphat, L-Luciferin und Pyrophosphatase präinkubiert,
• - durch Zusatz von Pyrophosphat wird die Reaktion getriggert und ein Lichtblitz emittiert, der eine qualitative und quantitative Pyrophosphat-Messung ermöglicht.

Es hat sich überraschend gezeigt, daß nach dem Zusatz von Pyrophosphat zu den präinkubierten weiteren Komponenten ein starker Lichtblitz emittiert wird, der eine qualitative und quantitative luminometrische Messung ermöglicht.

Im Rahmen der Erfindung liegt auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur bioluminometrischen Bestimmung von Pyrophosphat.

Der Vorteil der Erfindung liegt in der Erweiterung des Meßspektrums bioluminometrischer Messungen. Bei unverändert hoher Empfindlichkeit ist es möglich, eine neue Stoffklasse, Pyrophosphate, zu messen. Analog der bioluminometrischen Adenosintriphosphat-Messung ergibt sich damit die Möglichkeit, durch Kopplung chemischer Reaktionen die Produktion bzw. den Verbrauch von Pyrophosphat zu erfassen. Pyrophosphat entsteht z. B. im Zuge der Aktivierung von Zellen durch Hormone, daneben spielt es eine wichtige Rolle im Prozeß der hormonellen Steuerung der mitochondriellen Aktivität.

Im folgenden wird die Erfindung anhand eines beispielhaften Anwendungsbeispiel beschrieben.

Beispiel:

Bezüglich pH, Temperatur und Pufferzusammensetzung erfolgt die Präinkubation von Luciferase mit Adenosintriphosphat (ATP) und L-Luciferin unter Standardbedingungen (wie z. B. in Lembert, N. und Idahl, L.-Å., (1995) Biochemical J., 305, 929-933 dargestellt). Das kontinuierliche Erfassen der Lichtemission ist mit kommerziell erhältlichen Luminometern möglich.

Fig. 1 zeigt anhand einer Lichtemission-Zeit-Kurve den Effekt einer Pyrophosphat-Zugabe auf die Lichtemission von Luciferase.

Die offenen Kreise bezeichnen den Reaktionsverlauf, gemessen als Lichtemission, von Luciferase (0,1 µM) in der Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) (100 µM) und L- Luciferin (1 µM). Zum Zeitpunkt 6 min wird zu dieser Lösung Pyrophosphat (PPi) (50 µM) zugegeben. Das Ausbleiben einer nennenswerten Lichtemission unter diesen Reaktionsbedingungen entspricht dem Stand der Technik.

Die durchgezogene Linie bezeichnet den Reaktionsverlauf bei der erfindungsgemäßen Vorgehensweise. Hierbei wird Luciferase (0,1 µM) in der Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) (100 µM) und L-Luciferin (1 µM) mit Pyrophosphatase (0,2 U/ml) präinkubiert. Zum Zeitpunkt 6 min wird zu dieser Lösung Pyrophosphat (PPi) (50 µM) zugegeben. Der dabei auftretende Lichtblitz ist deutlich erkennbar.

Eine Blitzinduktion wurde bereits innerhalb folgender Konzentrationsintervalle gemessen:

Luciferase:	5 nM bis 0,1 µM
Adenosintriphosphat:	10 bis 1.000 µM
L-Luciferin:	0,1 bis 2 µM
Pyrophosphatase:	0,2 bis 5 U/ml
Pyrophosphat:	10 bis 100 µM

Sowohl die Pufferzusammensetzung als auch die Konzentrationen der Reaktanden können in weiten Grenzen variiert werden.

Claims (1)

1. Verfahren zur bioluminometrischen Bestimmung von Pyrophosphat, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

• 1. Luciferase wird mit Adenosintriphosphat, L-Luciferin und Pyrophosphatase präinkubiert,
• 2. durch Zusatz von Pyrophosphat wird die Reaktion getriggert und ein Lichtblitz emittiert, der eine qualitative und quantitative Pyrophosphat-Messung ermöglicht.