DE19506887A1 - Verfahren zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und hochreiner Total RNS - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen simultanen Isolierung von genomischer Desoxyribonukleinsäure (DNS) und zellulärer Total Ribonukleinsäure (RNS) aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien.

Es ist für eine Vielzahl von biologisch, molekularbiologisch, medizinisch-analytisch sowie biochemisch arbeitenden Laboratorien von großer Bedeutung. Damit sind Anwendungsgebiete der Erfindung die Molekularbiologie, Biochemie, Gentechnik, Medizin, Veterinärmedizin und alle angrenzenden Gebiete.

Die simultane Isolierung von genomischer DNS wie auch zellulärer Total RNS aus ein und demselben biologischen Ausgangsmaterial ist bis zum heutigem Zeitpunkt an nur einige wenige praktizierbare Methoden gebunden. So beschreiben Raha, S., Merante, F., Proteau, G. und Reed, J.K. (GATA, 1990, 7(7): 173-177) eine Methode zur Trennung genomischer DNS und zellulärer Total RNS über selektive Präzipitationsschritte unter Verwendung von Litiumchlorid. Eine weitere Möglichkeit der simultanen Isolierung von DNS und RNS basiert auf Durchführung einer Ultrazentrifugation durch einen Zäsiumchloridgradienten zur Pelletierung der RNS und anschließender Dialyse der DNS aus der Guanidinium-Phase (Coombs, L.M., Pigott, D., Proctor, A., Eydmann, M., Denner, J. und Knowles, M.A.; Anal. Biochem. (1990); 188; 338-343). Ein solches Verfahren benötigt einen erheblichen zeitlichen (mindestens 48 Stunden) sowie apparativen Aufwand (Ultrazentrifugationsentechnik, spezielle Spezialrotoren).

Ein z.Z. relativ häufig genutztes und auch kommerziell verfügbares Verfahren beruht auf der Verwendung eines Reagenz aus Guanidinthiocyanat und Phenol. Das biologische Material wird in diesem Reagenz homogenisiert, wobei sich die RNS nach Zugabe von Chloroform und durchzuführender Phasentrennung in der wäßrigen Phase befindet und aus dieser präzipitiert wird. Die zurückbleibende Interphase bzw. phenolische Phase enthält sowohl Proteine als auch genomische DNS. Durch Veränderung des pH Wertes und erneuter Phasentrennung soll die genomische DNS ebenfalls in die wäßrige Phase überführt werden und wird aus dieser wiederum präzipitiert. /Chomczynski, P., Biotechniques 1993, 15(3): 532-536/.

Prinzipiell muß nach dem Stand der Technik davon ausgegangen werden, daß die isolierte zelluläre Total RNS in den meisten Fällen mit genomischer DNS kontaminiert ist.

So enthält die mittels der von Chomcynski entwickelten und genutzten Reagenz erhaltene wäßrige Phase neben der RNS auch genomische DNS, welche dann ebenfalls aus dieser Phase präzipitiert wird und sich damit in der finalen RNS-Präparation als kontaminierender Bestandteil befindet. Gerade die Kontamination isolierter zellulärer RNS mit genomischer DNS stellt für eine Vielzahl von weiteren Verwendungen der RNS ein gravierendes Problem dar.

So ist z. B. die Anwendung eines RNAse Protection Assays zwingend an eine DNS freie RNS gebunden. Ferner muß auch für eine Vielzahl von RT-PCR-Reaktionen die verwendete RNS frei von einer Kontamination mit genomischer RNS sein. So besteht z. B. bei Expressionsuntersuchungen von cDNS-Konstrukten in transgenen Organismen als auch bei Nachweisen der Expression intronloser Gene wie auch von noch unbekannten Gensequenzen keine Möglichkeit nachzuweisen, ob das resultierende PCR- Fragment aus der kontaminierenden DNS oder aus der RNS amplifiziert wurde. Sowohl aus der genomischen DNS wie auch aus einer RNS abgeleitete Amplifikate hätten dieselbe Länge.

Dies zeigt die Bedeutung der Isolierung von genomischer DNS-freier Total RNS.

Ein weiteres Problem besteht in der Präparationsdauer zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und zellulärer Total RNS sowie in deren arbeitstechnischem Aufwand.

Das einzige z.Z. kommerziell verfügbare Isolierungssystem benötigt für die Realisierung der simultanen Isolierung beider Nukleinsäurefraktionen mindestens 3 Stunden und ist mit einem nicht unerheblichen Aufwand an notwendigen Reaktionsgefäßen und Feinchemikalien belastet. Weiterhin benötigen alle diese Methoden auch eine relativ große Menge an biologischen Ausgangsmaterialien, so daß bei Vorhandensein von nur limitierter Mengen an Untersuchungsmaterialien meistens eine simultane Isolierung beider Nukleinsäuren nicht mehr möglich ist.

Die Erfindung hat das Ziel, eine simultane Isolierung von genomischer DNS und zellulärer Total RNS hoher Reinheit und ohne eine Kontamination mit genomischer DNS auch aus sehr kleinen Mengen (< 10⁵ Zellen; < 1 mg Gewebematerial) unterschiedlicher Ausgangsmaterialien zu erreichen.

Das Verfahren soll sehr einfach handhabbar sein, nur geringe apparative Ausrüstung benötigen und es gestatten, beide Nukleinsäurefraktionen sehr schnell wie auch aus sehr kleinen Mengen an Ausgangsmaterialien zu isolieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird gemäß Anspruch 1 realisiert, die Unteransprüche 2-8 sind Vorzugsvarianten.

Die simultane Isolierung von genomischer DNS und zellulärer Total RNS aus unterschiedlichen biologischen Ausgangsmaterialien ist dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien lysiert und das Lysat mit einem nichtporösen, hochdispersen SiO₂-Träger inkubiert wird. Die an dieses Trägermaterial gebundene DNS wird anschließend pelletiert und der nun nur noch RNS enthaltende Überstand in ein neues Zentrifugengefäß überführt, mit Phenol und Chloroform sowie einer Natriumacetatlösung versetzt und nach erfolgter Phasentrennung die zelluläre Total RNS aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von Isopropanol präzipitiert. Die am Trägermaterial fixierte genomische DNS wird während der Dauer der RNS-Präzipitation mit einem Waschpuffer versetzt und gewaschen und abschließend mittels eines Puffers geringer Salzkonzentration vom Trägermaterial abgetrennt.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Total RNS ist undegradiert und von exzellenter Qualität (OD₂₆₀ : OD₂₈₀ = 1.8-2.0). Von entscheidender Bedeutung ist dabei, daß keine Kontamination genomischer DNS mehr vorliegt. Dies bedeutet einen erheblichen Vorteil gegenüber den meisten bisher Verwendung findenden Präperationsmethoden. Auch die ebenfalls aus ein und derselben biologischen Probe isolierte genomische DNS ist ist von exzellenter Qualität und für eine Vielzahl weiterer Verfahren als Substrat verwendbar. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich weiterhin durch seine Einfachheit aus, benötigt nur geringe Mengen an Feinchemikalien wie auch Zentrifugengefäße und minimiert auch die Menge und notwendige Zeitdauer des Umganges mit toxischen organischen Solventien (benötigt nur einen Phenol/Chloroform Extraktionsschritt). Das Verfahren gestattet es, sowohl genomische DNS als auch zelluläre Total RNS innerhalb von weniger als 1,5 Stunden zu isolieren. Dies bedeutet eine drastische Reduzierung der Präparationsdauer im Vergleich zu dem z.Z. kommerziell angebotenen diesbezüglichen Verfahren. Die Bindung der Desoxyribonukleinsäure erfolgt an der Oberfläche von hochdispersen und nichtporösen Feststoffpartikeln, vorzugsweise mit einem Partikeldurchmesser von 40 nm, bei einer aktiven Oberfläche von ca. 50 m²/g. Die Bindung der Desoxyribonukleinsäure an das verwendete Trägermaterial wird durch chaotrope Salze des Lysepuffers vermittelt. Die Lyse der Ausgangsmaterialien und die Bindung an das Trägermaterial erfolgen im selben Reaktionsgefäß.

Das sehr einfache und nur wenige experimentelle Schritte umfassende Verfahren ist in idealster Weise für eine breite Anwendung in medizinischen Diagnostik-Laboratorien geeignet und steht in diesem Zusammenhang auch Anwendern zur Verfügung, welche nicht über spezielle molekularbiologisch-biochemische Kenntnisse verfügen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist u. a. die Voraussetzung gegeben, aus limitierten Mengen an Untersuchungsmaterialien sowohl die DNS als auch die RNS zu isolieren. Dies erlaubt Untersuchungen von Genen (DNS-Untersuchung) und deren Expression (RNS-Untersuchung). Vor allem quantitative Abnormitäten von Genen und deren RNS-Expression scheinen eine wesentliche Bedeutung von Vorgängen während der Kanzerogenese und Metastasierung wie auch bei der postoperativen Progression von Tumorpatienten zu spielen. Die Möglichkeit des Findens korrelativer Zusammenhänge bezüglich der Anzahl bestimmter tumorassoziierter DNS-Sequenzen, deren Struktur (Sequenzinformation) und deren Expression (RNS) ist somit von entscheidender Bedeutung für ein besseres Verstehen von Zusammenhängen pathogener Mechanismen.

Ferner erlaubt eine Methode der simultanen Isolierung von DNS und Total RNS auch die Untersuchung unterschiedlicher Spleißing-Mechanismen (z. B. Alternatives Spleißen, Trans-Spleißen). Die Untersuchung von Spleißvorgängen hat sowohl im Bereich der Grundlagenforschung (Untersuchung von Vorgängen der Genregulation) wie auch auf medizinischen Gebiet (Aufklärung immunologischer Phänomene bei parasitären Erkrankungen; z. B. nach Infektion mit Afrikanischen Trypanospomen) ebenfalls eine große Bedeutung.

Die Mehrzahl solcher Studien scheitert am Fehlen eines geeigneten methodischen Instrumentariums zur simultanen Isolierung von DNS und RNS, vor allem bei Vorhandensein nur geringer Mengen an Untersuchungsmaterialien.

Mit den erfindungsgemaßen Verfahren besteht die Möglichkeit der simultanen Isolierung von genomischer DNS und zellulärer Total RNS aus bakteriellen Lysaten, aus Zellkulturen, intakten oder gefrorenen Gewebeproben, Spermien, Körperflüssigkeiten, Pflanzenzellen, Hefezellen sowie Blutserum, Blutplasma und Vollblut.

Die erfindungsgemäßen Verfahrensvarianten erlauben die simultane Isolierung beider Nukleinsäuren (DNS und RNS) mit einem extrem geringen zeitlichen sowie apparativen Aufwand.

Es ist keine zeitaufwendige Proteinase-Verdauung notwendig. Der geringe zeitliche Aufwand der simultanen Isolierung von DNS und RNS aus ein und demselben Ausgangsmaterial stellt für eine Vielzahl von potentiellen Anwendern eine enorm wichtige Größe dar und bedeutet damit einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Verfahren. Die Eigenschaft des verwendeten Lysepuffers, sowohl die zelluläre Integrität zu zerstören wie auch endogene wie exogene DNAsen und vor allem RNAsen hochpotent zu inaktivieren, gestattet es darüber hinaus, DNS und RNS aus Frischpräparaten unter Feldbedingungen (z. B. bei Expeditionen, nach Operationen ) zu isolieren, ohne zusätzliche Kühlbedingungen unter Lysepuffer zu lagern und zu transportieren und die Ribonukleinsäuren ohne Verlust ihrer biologischen Aktivität einer weiteren Verwendung zuzuführen.

Die Erfindung soll nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden Simultane Isolierung genomischer DNS und zellulärer Total RNS aus einer eukaryontischen Monolayer-Zellkultur (25 cm² Flasche; ca. 5 × 10⁶ Zellen)

Lyse der Zellen durch Zugabe von Lysepuffer (Guanidinthiocyanat; N-Lauryl-Sarcosyl; DTT; Natriumcitrat) und Überführung der Zell-Lyse-Suspension in ein 1.5 ml Eppendorf-Zentrifugengefäß. Zugabe des Trägermaterials zur Zell-Lyse-Suspension, kurzes Vortexen, Inkubation für 5 Minuten in einem Eisbad und anschließende Pelletierung des Trägermaterials durch kurze Zentrifugation in einer Tischzentrifuge (30 Sekunden).

Überführung des Überstandes in ein neues Eppendorf-Zentrifugengefäß und Zugabe von Phenol (wassergesättigt oder Tris-gepuffert), Chloroform und Natriumacetat und 5 minütige Inkubation auf Eis. Nach erfolgter Phasentrennung durch Zentrifugation wird die obere wäßrige Phase in ein neues Eppendorf-Zentrifugengefäß überführt, mit einem gleichem Volumen Isopropanol versetzt und zur Präzipitation der RNS für 20-30 Minuten bei -20°C inkubiert. Die am Trägerpellet gebunden genomische DNS wird während der Isopropanolfällung der RNS mit Waschpuffer (50 mM NaCl; 10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; 70% v/v Ethanol) versetzt und gewaschen und anschließend die genomischen DNS durch Zugabe eines Elutionspuffers (Tris; EDTA) bei 52°C vom Trägermaterial abgelöst, der Träger durch kurze Zentrifugation von der eluierten genomische DNS abgetrennt und diese in ein neues Reaktionsgefäß überführt.

Das nach Inkubation bei -20°C und anschließender Zentrifugation erhaltene RNS-Pellet wird zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen und nach erfolgter vollständiger Entfernung des Ethanols das Pellet in RNase freiem TE Puffer oder DEPC-behandeltem Aqua Bidest aufgenommen.

Claims (8)

1. Verfahren zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und zellulärer Total RNS, gekennzeichnet durch Lyse von diese Nukleinsäuren enthaltenden Materialien, Inkubation des Lysates mit einem nichtporösen, hochdispersen SiO₂-Träger, sowie a) Abtrennung des Trägers vom Lysat durch Zentrifugation, Zugabe definierter Anteile von Phenol, Chloroform und Natriumacetat zum Lysat und Präzipitation der Total RNS nach Phasentrennung aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von Isopropanol und b) Waschen des Trägers mit einem Waschpuffer und Ablösung der trägerfixierten genomischen DNS vom Trägermaterial mit einem Puffer geringer Salzkonzentration.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Lyse des Ausgangsmaterials chaotrope Salze wie Guanidinthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Litiumchlorid oder Litiumchlorid/Harnstoff-Gemische mit Ionenstärken < 4 M eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterialien zur Bindung der genomischen DNS hochdisperse, nichtporöse SiO₂-Partikeln mit einer Korngröße von 7-40 nm, vorzugsweise 40 nm, bei einer spezifischen Oberfläche von 50-300 m²/g, vorzugsweise 50 m²/g, eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, das der Träger mit der fixierten genomische DNS vom Lysat durch einen kurzen Zentrifugationsschritt abgetrennt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die am Träger gebundene genomische DNS mit einem Waschpuffer, vorzugsweise bestehend aus 50 mM NaCl, 10 mM Tris HCl und 1 mM EDTA sowie 70%v/v Ethanol, gewaschen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die trägerfixierte genomische DNS vorzugsweise mit einem Puffer niedriger Salzkonzentration (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA) bei einer Temperatur von 48-56°C, vorzugsweise 52°C, eluiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß es als batch- Verfahren durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß es als chromatographisches Verfahren durchgeführt wird.