DE1805257A1 - Diagnostische Zubereitung und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Description

25. Oktober 1968

Bard-Hamilton Company, Inc.
Unser Zeichen DA-IC393

Ρiagnosti sehe Zubereit\xxiq und Vorfahren au deren Herstellung»

Di© Erfindung bezieht sich auf eine Hauttest-Zubereitung, die eine stabile, wässrige, injizierbare Lösung von Desoxyribonucleinsäure enthält und die sich für die Diagnose von systemischer Lupus erythematosus iZehrrose, Schmetterlingsf!echte) bei noch nicht behandelten Versuchsobjekten, d.h. bei Menschen oder Tieren, die nicht unter körperlicher Behandlung bzw. syetemisoher Medikation stehen, eignet. Systeraische Lupus erythematosus wird oft

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auch als "system!scha Lupus" oder, kurz als ^WSLE^W bezeichnet. Desoxyribonucleinsäure (manchmal auch als Deoxyribonucleineäure bezeichnet) wird gewöhnlich mit DMA abgekürzt. Die erfindungsgemasse Hauttest-Zubereitung soll stabil sein, weil ™ sie, ohne nennenswerten Verlust an Aktivität der DNA in dem wässrigen Lösungsmittal in Gegenwart von anderen darin aufgelösten Zusätzen, eine Lagerbeständigkeit für mehr ale ein Jahr besitzen soll und selbst naah 2 Jahren noch eine wirksame Aktivität aufweisen muss, damit sie wirksam alsDiagnostikura. angewendet werden kann, ohne unerwünscht« Reaktionen in dem zu untersuchenden Versuchsobjekt hervorzurufen .

j Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Me-

thode sur Durchführung des Tests an unbehandelten Versuchsobjekten, welche verdächtige Symptoms zeigen, ua damit ssu bestimmen, ob das Versuchsobjekt von syatemisohem Lmpu» bzw. SLE befallen ist.

■ Man weiss, dass SLE die -Erkrankung" la' ihrer allgemeinen Form, welch® die Hieren sovis'auoh das Hairs usvi andere Organe befällt, zahlreiche Symptom« wi®

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und Gelenkentzündungen, Hautausschläge sowie verschiedene Änderungen im Körpersystera hervorruft, die allzuoft nicht erkannt werden; vielmehr führen die Symptome von SIJS oft zu dem Eindruck, dass irgend eine andere Krankheit vorliegt.

In der Vergangenheit wurde mit einem grossen Zeit- und Geldaufwand der sogenannte Lupus erythematosus Zellentest, kurz als der "LE-Zellentest" bezeichnet, sowie der sogenannte "Anhaltspunkt fur die Diagnose von SLE" entwickelt. Dieser Test ist vollständig von Dr. Edmund L.Duboia in einer von ihm unter dem Titel "Lupus Erythematoeue¹* herausgegebenen Zusammenfassung, erschienen im Verlag The Blakiston Division, McGraw-Hill Book Company, Hew York, M.Y. auf den Seiten 302 - 306 beschrieben worden.

Nach diesen Untersuchungen, die schliesslich zu der diagnostischen Zubereitung und dem. Hautteet geaäss der Erfindung geführt haben, wurde vor 1965 das Präparat für parenterale Verabreichung wie folgt bereitet: Eine 0,1 %-ige Lösung von DNA in wässriger Kochsalzlösung wurde hergestellt durch Auflösen von 100 mg DNA in S ml einer 0,1-n Natriumhydroxydlösung; dann wurde .mit destillier-

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fcem Wasser auf 50 ml aufgefüllt, schliesslich genägend 0,1-n Salzsäure bis zu einem pH von 7,4 zugegeben und schliesslich mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

P Dieses parenteral zu verabreichende Präparat

zeigte unerwünschte Beschränkungen. Neben anderen Nachteilen konnte dieses Präparat nicht in geeignet!! Weise sterilisiert werden, weil dadurch ein Verlust dtt Π i,-Aktivität bei der Filtersterilisierung, ss.B. mit einem Seitz-Filter stattfand. Eb konnte auch wegen Verlust seiner DNA-Aktivität weder mit Hitze noch mit Hilfe der oft verwendeten chemischen Lösungen noch .mit UV-Belichtung sterilisiert

Hinzu kam, dass seine allgemeine Verwendung zu stark eingeschränkt war, weil es bei der Injektion nicht nur das unangenehme Gefühl eine» Brennen«, sondern auch Jucken und eine unerträgliche schmerzvolle Reaktion an der Injektionestelle hervorrief» Manchmal war die Reaktion so intensiv, dass im mittleren Bereich der Stelle ein Absterben (Necrosis) stattfand.

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Schliesslich konnten Präparate, bei denen eine pftysiologische Kochsalzlösung verwendet wurde, auch deshalb nicht verwendet werden, weil sie die Reaktionsfähigkeit von PNA ungünstig beeinflussten, beispielsweise indem sie den Umfang der Verhärtung, die sich rings um die Injektionsstella bilden sollte und die sie begleitende Hautrötung zurückdrängten; zwei Symptome, die bei einen bekannten positiven SLE-Test bei der zu untersuchenden Person auftreten sollen.

Alle diese Einschränkungen, Naohteile und ungünstigen Gesichtspunkte, die bei den bekannten Präparaten auftraten, werden mit der vorliegenden Erfindung überwunden und vermieden.

Ein Gesichtspunkt des Präparates und der Methode nach der Erfindung besteht darin, dass ein einfaches und leicht anwendbares Präparat bereitgestellt wird, da· sich zu einer breiten und allgeneinen Anwendung bei einen Hautteet anbietet und bei der Diagnose von unbehandelten systeaisehen Lupus erytheaatosus empfindlicher ist, al« der bisher sur Verfügung stehende, sehr kostspielige und seitraubende LE-Zellen-Test.

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* feetiert.

Ein anderer GesiciitspunJct bei dem erfindungsgeaSssen Präparat ist die Leichtigkeit, mit der es sich herstellen und sterilisieren lässt« sowie seine Stabilität, die sich durch die oben erwähnte Lagerbest&ndigkeit aani»

Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines iüjizierbaresi PrÄparat«, das in weitem Umfang ohne Brem&gciflÜtX, Sehaerz oder andere unerwünschte Reaktion injiziert «mrden kann.

Ein weiterer Geeiclitapinkt der Erfindung besteht darin, dass sie allgemein anwendbar ist, um alle Personen ausscheiden zu können, die aufgrund ihrer Symptome zwar SLE-verdachtig sind, in Wirklichkeit aber ein« andere Krankheit haben, deren Symptorae ctemjenigen Shnlioh sind, die von SLE hervorgerufen werden.

Ganz allgemein enthalt di· diagmoEtissh<»' bereitung g*m&aa der Erfindung «im« diagssoetiich Konzentration von DNA, stabil g*l£«t in βίη·η wlsarige« Lösungsmittel, worin auch ein physiologisch

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Puffer, der mit dem gelösten OHA verträglich ist und den pH bei etwa 6,9 bis etwa 8 hält, sowie etwa 0,2 bis etwa 0,5 % eines physiologisch verträglichen Alkali chloride gelöst sind, wenn ein für einen Hauttest wirksames Volumen des Präparates dem Versuchsobjekt injiziert wird.

Der Gehalt an DNA kann recht niedrig sein; er kann z.B. etwa 0,05 % bis etwa 0,12 % oder mehr betragen und bis zu etwa 0,3 % oder höher ansteigen. Tatsächlich ist jegliche Menge oberhalb von 0_rl % normalerweise bei den üblichen Xnjektionsvolumen von 0,1 ml unnötig, sodass jeder Überschuss einfach verlorengeht.

Als Alkfilichlorid verwendet man vorteilhaft * Natriumchlorid. Es kann innerhalb des oben angegebenen Bereichs schwanken. Der optimale Gehalt liegt bei etwa 0,3 %·

Soweit bisher beobachtet, kann der Puffer qualitativ und quantitativ ao weit variiert werden, als er noch dazu befähigt ist, den pH innerhalb des oben angegebenen Bereichs, jedoch besser zwischen 6,9 und 7,5 und insbesondere bei etwa 7,3 oder minus 0/1 zu halten. Vorzug·-

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weise kann der Puffer im wesentlichen bestehen ans Kalium» dihydrogenphosphat, WaJPO^) in einer Menge von etwa 0,036 % des wässrigen Bautteet-Praparats, sowie aus Dinatriumhydrogenphosphat-ltodecahvdrat 1Ia₂HFO^l-II₂Ql in einer Menge von etwa 0,143 t und als Alkalichlorid natriumchlorid in einer Menge von etwa 0,3 % enthalten» Zitronensäure oder Hatiiu*ci±rafc sowie latrium- oder IZaliunacetat oder andere physiologisch zuträgliche Puffer können sueasaen mit dem Alkalihälogenid verwandet werden sowie Mischungen dieser Substanzen in geeigneten Mengenverhältnissen* um den gewünschten pH-Wert innerhalb des oben angegebenen Bereichs zu halten. Voraussetzung ist, dass diese anderen Puff er mit der DMA vertraglich sind {d.h. keinen Siederschlag bilden und sie somit inaktiv machen I. Dies liest «ich durch einen einfachen Versuch bestimmen Ist su sehen· ob die W$h ausgefallt wird oder indem man eine Losung einem Intrader» maltest an einem bekanntem, nicht behandelten SLI-Vereucmsobjskt unterwirft. - -

Soweit bisher mitgeteilt wurde, ist MIA von Kalber-iaiymuadrlieen besonders wirksam. Sin« geeignet reine DMA: von anderen Hinder- oder Slugetierquelien kann eben-

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falls verwendet werden sowie auch τοη Hefe,, Fiec&speraa nie Herings* otter Lachs&pema oder τοη anderen geeigneten Quellen hoher Qaali tit.

Gleichgültig, von welcher Quelle dl* DIA staaat, ist es zunlchst vorteilhaft, sie za sterilisieren* indem van sie in Pulverform eines. Athylenoxydgas in einer geeigneten gamer lind genügend lange aussetzt, rtaait die betreffende Blfä-Öharge sterilisiert wird. Kormalerweise können Merf Hr 4 Ms 8 Stunden ausreichend sein. Is 1st jedoch nicht nachteilig, wenn man diese Behandlung llngere Zeit ausdehnt. Bann sollte die Wh belüftet werden, indes ■an sie einer Atmosphäre steriler Luft aussetst, imdea »an derartige Luft genügend lange in die Xaexer einleitet, u» im wesentlichen das gesamte Äthylenoxyd durch des üblichen hierfür Torgeseheneit Auslass zu verdringen· Bies kann im. Verlauf von 8 Ms 12 Stunden erreicht werden, doch ist es nicht nachteilig, diese Behandlung über lacht-14 Stunden

Vort«ilhafterwei*e kann die erforderliche Menge der Puffermischung einachlie«*lich des Alkmlichlorids

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wie Matriiuaeliloxld in einer sutrSglicheR Meiage aa pyrogen- -

freieai*-^;-«t»iiieift,'desi&lli^ ^: *

Wasser oder in einem solchen nicht sterilen Wasser gelöst '

'wobei? iii''I«^ '"■

feit -Qd«E ohne dem Phenol) st er i Ii si art werden fcann,' a»B. durch Sei ta-Filtration, Behandlung im Autoklaven oder *it beiden Methoden* - - · ■-■■

"-■ Me DNA/ beispielsweise 1,0 g_f wird in eine» genügendert Voltiaen bekannter' KTonzentration,' «.«Β· in 25 al' ' 0,1-R KatriiiiKfeyclroxyd erlöst, wobei die entstaiKieii· LSsung auf ein geeignetes Volumen, ζ „B. 250 ml gebracht und dann «it de» - erforderlichen. ~ Volumen "einer - bekannten Kbnzeßtration, noraalerveise axt 0,1-n Salzeftur®, auf «inen pH τοπ etwa 7_#4 elageetelit wird. Zu dieser Löeoitg iaxm dasra der Paffer in einer solchen Menge zugegeben werden« dass sidi die «rforderliche Konzentration in dea endgffiltigen i*rlf«- rat ergibt. Bar pH kann dann geprüft und, felle, notwendig, auf 7,4 eiageetelit werden·- ■ ■ . " ■

Bann kann da· Phenol (s.B. 4 werden oder die Lösung kann' weiter ait der gleichen Menge

am ■. - ©ad öriginai.

Wasser bis nahe an das erforderliche Volumen verdQnnt, dann erst mit dem Phenol ¹VeTeBtSt werden, worauf schliessllch das Volumen auf 1 Itr. aufgerollt wird. Das Phenol mos* nur bis zu der minimalem Menge anwesend sein alt der die fertige Lösung bakterizid bleibt, z.B. o,4 % pro Itr. der fertigen Zubereitung,

Das erfiarliiijwjert sse Verfahren erstreckt sich auch auf die 3nt«x*aclmag eine« Patienten, um davit festzustellen, ob er vaa SUS lief allen ist, indem aan (1| intrakutan an einer aaitberen, afialitdi leicht beobaehtba Flache des Körpers, sJB· im die (zunächst in geeigneter Weise aseptisch gereinigt»! Baut der ventralen Oberfläche des Unterarms 0,1 ml dea injizierbar« DMA-Haut test-Präparat es injiziert aod dann (ü) die Test stelle nach β, 12 und 24 Stunden beobachtet, wt den negativen oder positiven Ausfall des Versucne zu erkennen und das Ergebnis in eimer von drei Beurteilungen (Werten) angibt.

Wenn im Verlamf von bis zn 24 Stunden Oberhaupt keine Reaktion oder smr eine cohwaohe Rötung mm der Stelle der urspruagUcmen Injektion stattfindet, iet der

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Test negativ verlaufen. Eine positive Reaktion zeigt- sich an der Injektionsstelle durch eine verhärtete Flache an, die so gross oder grosser ist, als die ursprüngliche Quaddel bzw. Schwiele nach dem Herausziehen der Nadel, uageben von einem Hof von Hautrötung. Die positive Reaktion wird als 14- bezeichnet, wenn die Breite des von der Quaddel radial gemessenen Hofs 1 bis 10 Bim betragt. Die Reaktion wird als 2+ bezeichnet, wenn die Hofbreite 10 mm überschreitet und bis zu 20 mm betragt. Die Reaktion wird als 3+ bezeichnet, wenn die Breite des Hofs 20 mm Oberst«igt«

Das DKA-Kautteet-Priparat far SLS geoAes dar Erfindung wird durch das folgend· Beispiel n&her erläutert, das jedoch nicht beschrankend ausgelegt werden soll:

Desoxyribonucleinslure 1,0 g. Kaliuwühydrogenphosphat 0,36 · Dinatriunhydrogenphosphat |·12Η«0) l_r4S " Natriumchlorid 5,0 " und

Phenol (D.S.P.) 4,0

Die nit Äthylenoxyd sterilisierte DKA wurde gelöst, wie dies oben beschrieb·]! 1st. Das Kaliumhydrogeii-

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phosphat, Diaatritiefeyclrogenpitospiiat tsiiuI Matritmohlorid wircleit in» pfyrogenfreie»«, sterilen, destillierten Wasser gelöst, litre Lösxmg dama, in eine« Autoklaven Cöder nach, einer anderen itetlißde) sterilisiert und. ait der verdünntem IMRrLIBfsting versetzt ι daran warde das Piienol ztig^|iebert_r wie dies oben bösiskxiefaeit ist usd die Löstmg imrde achliesslich. bis zu dem endcplItig^Et ¥oltuaeit tor 1 Itr. vardÜDiit. Jkts so entstandene fertige, sterile, wässrige Hsnittest-Prlparat enthielt:

BeaoxyriboRicecleiiislttre * 0_#l %

Natriumchlorid ~ 0,3 *

fyFt J T IMMi r nynTTKMTBpwOPpiiWtL Ο·03θ

r>inatri\iHihydrogeiipliosphat ί*12Η₂0> 0,14$ "

Fitenol 0.4 *«

Dieses fertige Hauttestpraparat wurde dann in sterile, mit Guastikapeeln versehene ÄafKillen ron. % r«rechiedenen GrSseen, nfiialicii τοπ 2 imd 5 el, eingefüllt. Im dieser Fora «ar das Präparat verkauf «fertig und für den Httuttest anwendungefcereit. Dieser wurde durchgfefilhxt duzen aseptisdbes Aufsiehen des allgeaein fUr Injektionen r«r- «endeten Volueens von 0,1 al Teetl5«ung mir intr*kutaaen Injektion, wie dies oben besdhrieben wird··

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Pie -WerscMedeneit Bestandteile dep Beieplelee: qudr.titativ no lange geändert werden,, ala DNA im einer «ϋαςροαϋβοίχ Wlrksaiaem Kb©santratlart anwesend ist und dar Pteffffer zusammen mit dsm tFAtriiauicMoXid im einer Menge vorhanden ist«, dass der angegebene Bereich 'fix den Gehalt Ca| Älkalichlorid und (b) fix die festen EbatenltdLltt, die i.n. dem Priparat dnxck die Ptifferziibeireitungr,, zaaeiamim mit. dam üikali, chLorid vorgaselieni »ind^. im Bareio& ^om »twa Ο bis etwa 0,7 Clew. % liegt,. ■ \

im einizalEen, ^«rwendate kann" ekrdi eine seiner ander en

^ wie einer Form, die nur ssnei od«r aieben Moleküle Kristall Wasser emtifc&It. Jedes der beiden

Im.dem. Puffer kaum dtsrcfi ein» entefpreelieEd· Talente Heftige eines anderen Üinlio&eii pfeyeiologieoii \mbedenkliclien, wasBerlöallchen einwtrttgen Älkallkation-dihydrogen- oder einaa

ersetzt «erden.

Phenol ist nicht a&m einKige Temendbcxo Bak t«risid_# denn ·· kann c^anx oder teilweise-dmrc^ eine ent*

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sprechende bakterizid genügende Konzentration eines anderen Bakterizide ersetzt werden, das bei injizierbaren PrÄparaten üblich ist und mit der DKA. in den entsprechend angewendeten Konzentrationen rertr&glich ist.

Mit dem Ausdruck "diagnostisch wirksame Konzentration" wird die Mindestkonzentration verstanden, die bei Verabreichung durch intradermale Injektion in einen geeigneten Injektionsvolumen beispielsweise dem allgemein Üblichen Volumen von 0,1 mm, wenigstens den oben definierten Wert 1+ bei einem positiven Test an einem bekannten Versuchsobjekt hervorrufen kann, von dem man weiss, dass es systemische Lupus erythematosus hat. Es ist natürlich auch möglich, 0,05 bis etwa 0,3 ml des diagnostischen Pr&parats nach der Erfindung zu injizieren,obwohl das allgemein sum Injizieren verwendete Volumen von 0,1 ml gewöhnlich ausreicht.

Alle hier angegebenen Prosentangaben sind Gewichtsprozente, falls nichts anderes vermerkt ist· Der Ausdruck "injizierbar", der für das erfindungsgemftsse diagnostische Pr&parat verwendet wird, setzt fest, dass das gesamte Präparat pyrogenfrei und steril 1st, sodass es sich -für die Injektion eignet.

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Diese diagnostischen Präparate können hauptsächlich an Menschen verabreicht werden.

Wenn auch die Erfindung anhand der obigen Beschreibung und bestimmter AuefUhrungsformen naher erläutert worden ist, so ist doch darauf hinzuweisen, dass verschiedene Modifikationen und Änderungen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen«

Patwfttangprflohe

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SAU ORiGJWAL

Claims (10)

Patentansprüche .

1. Wässriges, fUr einen Hauttest intradermal injizierbares Präparat zum Erkennen von systemischer Lupus erythematosus in einem nicht behandelten Versuchsobjekt, dadurch gekennzei chnet , dass es stabil dispergierte Desoxyribonucleinsäure in einem Lösungsmittel enthält, das 0,2 bis 0,5 % Alkalichlorid und einen Puffer enthalt, der den pH des Präparats bei etwa 6,9 bis etwa 8 hält, wobei der Feststoffgehalt von Alkalichlorid und Puffer in dem Präparat etwa 0,36 bis etwa 0,7 % betragt,

2. injizierbares Präparat nach Anspruch 1, dadurch g β kennzeichnet, dass es als Puffer Kaliuadihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat «nthält«

3. Injizierbares Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es als Alkaliohlorid Natriumchlorid enthält.

4« Injizierbares Präparat nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzei chnet, dass es etwa 0,1 Sew. % Desoxyribonucleinsäuren etwa 0,3 t Natriumchlorid, etwa 0,036 Gev.t Kaiiumdihydrogenphosphat und etwa 0,143 G«w.% Dinatriuahydrogenphosphat {»^HgOjenthalt.

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5, Verfahren zum Herstellen eines wässrigen, imjiaierbaren diagnostischen Präparats nae?h Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man di© fein verteilt« DesoxyribonucleinsSurö in einer Äthylenoxyd-Ataosphär« * vollständig sterilisiert, worauf man die sterilisierte Desoxyribonucleinsäure in einer genügenden Menge einer wässrigen Lösung von etwa 0,2 big etwa 0,5 % ©ines physiologisch verträglichen Alkalihydroxyds löst, di© entstandene Lösung des Alkaliehlorids mit einem Puffer vermischt, damit das Präparat bei einem pH von etwa 6,9 bis ©iwa 8 gehalten wird, wobei solch® Anteile an Puffer und Alkali« chlorid zugegeben warden, dass sich ®twa 0,36 bis etwa 0,7 % Feststoffe in dem Präparat befinden.

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6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch g e k β η η « a e i c h η © t __f dass man als Puffer phosphat υ.ηά Dinatriuisihydrogenphosphat

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch g β k e η η % e ich η et ,das» man al»,Alkalichlorid Ha triumchlorid verwendet·

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8. Verfahren nach Anspruch 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Präparat herstellt, das etwa 0,1 Gew. % Desoxyribonukleinsäure, etwa 0,3 Gew. % Natriumchlorid, etwa 0,36 Gew. % Kaliumdihydrogenphosphat und etwa 0,143 Gew. % Dinatriumhydrogenphosphat (-12HgO) enthalt.

9. Verfahren zum Erkennen von systemisehen Lupus erythema to sue in einem unbehandelten Versuchsobjekt, dadurch gekennzeichnet , dass man in das Versuchsobjekt unter aseptischen Bedingungen intradermal an einer geeigneten Stelle eine für einen Hauttest diagnostisch wirksame Menge eines wässrigen Präparats nach Anspruch 1 bis 4 injiziert, dann wenigstens genügend lange, bis zur Einwirkung des Präparats wartet und sohlieselich die Fläche rings um die Injektionsstelle beobachtet, ob sich bei eine« positiven Test eine Verhärtung bildet, die von einer Rötung umgeben ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , dass man ein Versuchsobjekt verwendet, das von system!echea Lupus erythematobus befallen war, dann aber vorübergehend die Krankheitssymptoa· nachlieeeen, worauf sieh bei dem Versuchsobjekt Symptome ein·teilen, die diejenigen von eysteaiecher Lupus erytheaatoeus oder einer anderen Ir krankung sein können.

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