DE1620548B1

DE1620548B1 - Verfahren zur Herstellung von Inosin-, Adenosin-, Cytidin- und/oder Uridin-5'phosphat

Info

Publication number: DE1620548B1
Application number: DE1966T0031245
Authority: DE
Inventors: Mikio Honjo; Ryuji Marumoto
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1965-05-29
Filing date: 1966-05-26
Publication date: 1970-10-08
Also published as: NL6607407A; GB1150241A; BE681627A; US3346562A; NL130134C

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur von 40 bis 60 Mol Phosphortrichlorid und 2 bis 20 Mol,

Herstellung von Inosin-, Adenosin-, Cytidin- und/oder vorzugsweise 2 bis 4 Mol, Wasser pro Mol Ribonu-

Uridin-5'-phosphat aus den entsprechenden Ribo- cleosid.

nucleosiden. Die gesamte erforderliche Menge an Phosphor-

Ribonucleosid-5'-phosphate sind sehr wertvoll als 5 trichlorid kann dem Reaktionssystem auf einmal Würze für Speisen sowie in der pharmazeutischen zugesetzt werden, jedoch ist es zur Erzielung der besten Industrie. Sie werden hergestellt, indem zunächst die Ausbeute zweckmäßig, das Phosphortrichlorid in Hydroxylgruppen, die in 2'- und 3'-Stellung des zwei Portionen dem Reaktionssystem zuzugeben. Riboseanteils gebunden sind, mit einer Acyl- oder Dies kann so geschehen, daß man zuerst etwa 1 bis Isopropylidengruppe geschützt werden und dann die io 10 Mol (zweckmäßig 1 bis 2 Mol) Phosphortrichlorid 5'-Hydroxylgruppe der so geschützten Verbindung mit pro Mol Ribonucleosid zusammen mit etwa 2 bis fünfwertigen Phosphorverbindungen, wie Phosphor- 20 Mol (zweckmäßig 2 bis 4 Mol) Wasser pro Mol pentachlorid oder Phösphoroxychlorid, phosphoryliert Ribonucleosid zum Reaktionssystem gibt, die Rewird und anschließend die schützenden Gruppen aktion stattfinden läßt, bis das Reaktionsgemisch klar entfernt werden. Zu diesen bekannten Verfahren 15 wird, und dann etwa 10 bis 90 Mol (zweckmäßig gehört die in der französischen Patentschrift 1 369 079 40 bis 60 Mol) Phosphortrichlorid pro Mol Ribobeschriebene Phosphorylierung von Nucleosiden in nucleosid zur weiteren Fortsetzung der Reaktion GegenwartvonKetone^beiderzunächstdieHydroxyl- zum Reaktionsgemisch gibt. In diesem Fall ist für gruppen in 2'- und 3'-Stellung maskiert und danach die erste Reaktionsstufe nicht unbedingt Sauerstoff die Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe unter 20 erforderlich, aber die zweite Reaktionsstufe muß so Verwendung von POCl₃ durchgeführt wird. Das durchgeführt werden, daß das Reaktionssystem der bekannte Verfahren erfordert jedoch eine lange Zeit Atmosphäre ausgesetzt ist oder Sauerstoff oder Luft (etwa 7 bis 30 Stunden) bis zum vollständigen Schutz eingeblasen wird.

und für die Phosphorylierung und ist daher für die Bei der ersten Stufe des Verfahrens gemäß der

technische Herstellung unvorteilhaft. 25 Erfindung werden die Hydroxylgruppen in der 2'- und

Es wurde nun gefunden, daß eine selektive Phos- 3'-Stellung des Riboseanteils durch das aliphatische

phorylierung der 5'-Hydroxylgruppe des Ribonucleo- Keton in Gegenwart von Phosphortrichlorid und

sids leicht in kurzer Zeit erzielt werden kann, wenn Wasser geschützt, und die freie 5'-Hydroxylgruppe

man an Stelle der bekanntermaßen verwendeten wird durch Phosphortrichlorid und Sauerstoff in

fünfwertigen Phosphorverbindungen Phosphortrichlo- 30 Gegenwart des aliphatischen Ketons phosphoryliert.

rid als Phosphorylierungsmittel verwendet und die Auf diese Weise wird das entsprechende geschützte

Phosphorylierung in Gegenwart von Sauerstoff vor- Ribonucleosid-S'-dichlorphosphat erhalten,

nimmt. Die Reaktion wird vorteilhaft so durchgeführt, daß

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Ver- die Temperatur durch Kühlung bei etwa 0 bis 10⁰C

fahren zur Herstellung von Inosin-, Adenosin-, 35 gehalten wird.

Cytidin- und/oder Uridin-5'-phosphat durch Um- In der zweiten Stufe des Verfahrens gemäß der

setzen der entsprechenden Ribonucleoside mit 10 bis Erfindung wird die geschützte Verbindung in bekannter

100 Mol eines Phosphorylierungsmittels, bezogen auf Weise zu Ribonucleosid-5'-phosphat hydrolysiert,

das Ribonucleosid, in Gegenwart von Wasser und Dies kann beispielsweise geschehen, indem man das

aliphatischen Ketonen mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen 40 erhaltene Produkt in Eiswasser gibt, den pH-Wert

und anschließende Hydrolyse des Reaktionsproduktes mit einer Alkaliverbindung (z. B. Natriumhydroxyd,

zum gewünschten 5'-Ribonucleotid, das dadurch Kaliumhydroxyd und Natriumcarbonat) auf 1,0 bis 2,0

gekennzeichnet ist, daß man als Phosphorylierungs- einstellt und das Gemisch auf etwa 40 bis 100° C,

mittel Phosphortrichlorid einsetzt und dabei in Gegen- vorzugsweise auf 50 bis 80° C, erhitzt,

wart von Sauerstoff arbeitet. 45 Das als Endprodukt gebildeteRibonucleosid-5'-phos-

Bei diesem Verfahren werden die entsprechenden phat kann vom Reaktionsgemisch nach beliebigen, Ribonucleosid-5'-phosphate in kurzer Zeit und in bekannten Methoden abgetrennt werden, z. B. unter guter Ausbeute erhalten. Verwendung von Ionenaustauscherharzen oder Aktiv-Ais aliphatische Ketone mit 3 bis 6 Kohlenstoff- kohle oder durch Kristallisation in Form eines Salzes, atomen eignen sich für die Zwecke der Erfindung 50 z. B. des Natriumsalzes. Das erfindungsgemäße Verbeispielsweise Aceton, Methyläthylketon, Methyl- fahren ermöglicht somit die Herstellung des beisobutylketon und Methylisopropylketon. treffenden Ribonucleosid-5'-phosphats in kurzer Zeit

Die Reaktion wird im allgemeinen durchgeführt, und in guter Ausbeute.

indem man zuerst das Ribonucleosid im Keton löst Um die erfindungsgemäß erforderliche kurze Re-

oder suspendiert und dann Phosphortrichlorid und 55 aktionsdauer zu veranschaulichen, wird der folgende

Wasser zur Lösung oder Suspension gibt, wobei man Versuch beschrieben.

das Reaktionssystem in Berührung mit der Atmosphäre Zu einer Suspension von 2 g Inosin in 50 ml Aceton

hält oder Sauerstoff oder ein sauerstoffhaltiges Gas, wurden 3 ml Phosphortrichlorid und dann 1 ml

z. B. Luft, in das Reaktionssystem bläst. Wasser gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde

Da das Keton als Lösungsmittel wirkt, ist für die 60 30 Minuten bei 20°C gerührt. Dann wurden weitere

Reaktion ein weiteres Lösungsmittel nicht unbedingt 50 ml Phosphortrichlorid dem Reaktionsgemisch bei

erforderlich. Das Keton kann in einer solchen Menge 0 bis 5° C zugesetzt. In geeigneten Zeitabständen wurde

verwendet werden, daß das Ribonucleosid ausreichend jeweils 0,1 ml der Reaktionslösung entnommen, um

gelöst oder suspendiert wird. Vorzugsweise wird das die Bildung von Inosin-5'-monophosphat (nachstehend

Keton im großen Überschuß verwendet. 65 als 5'-IMP bezeichnet) zu überwachen. Das Ergebnis

Das Molverhältnis von Phosphortrichlorid und ist in der folgenden Tabelle genannt. Es zeigt, daß

Wasser zum Nucleosid ist verschieden, je nach dem innerhalb von 60 Minuten nach Beginn der Reaktion

Ausgangsmaterial. Es liegt vorzugsweise im Bereich 94% 5'-IMP gebildet wurden.

Claims

Zeit, MinutenBildung von 5'-IMP, %O035604070508260938093 Weise ergab 3,2 g Dinatriumsalz von 5'-Inosinsäure. Die Ausbeute betrug 80%. Beispiel 5 5 2 g Inosin, 70 ml Aceton, 40 ml Phosphortrichlorid und 1 ml Wasser wurden gleichzeitig gemischt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0 bis 5°C der Reaktion überlassen. Durch Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise ίο wurden 3 g des Dinatriumsalzes von Inosinsäure _ . . , Λerhalten. Die Ausbeute betrug 75%· Beispiel 1 a/o Zu einer Suspension von 2 g Inosin in 50 ml Aceton Beispiel wurden unter Rühren 3 ml Phosphortrichlorid und Ein Gemisch von 2 g Uridin, 50 ml Aceton, 3 ml dann 1 ml Wasser gegeben. Das Reaktionsgemisch 15 Phosphortrichlorid und 1 ml Wasser wurde auf die wurde 30 Minuten bei 100C gerührt. Zum Reaktions- imBeispiell angegebene Weise behandelt. Anschließend gemisch wurden weitere 40 ml Phosphortrichlorid wurden 50 ml Phosphortrichlorid zum Reaktionsgegeben, wobei die Temperatur 2 Stunden bei 0 bis gemisch gegeben. Durch Aufarbeitung des Reaktions-5°C gehalten wurde und die weitere Reaktion bei gemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise offenem Reaktionsgefäß stattfand. Das Reaktions- 20 wurden 2,9 g des Dinatriumsalzes von 5'-Uridinsäure gemisch wurde in 11 Eiswasser gegossen und die er- erhalten. Die Ausbeute betrug 80 %· haltene Lösung mit einer 20%igen wäßrigen Natrium- . . hydroxydlösung auf pH 1,5 eingestellt. Diese Lösung B e 1 s ρ 1 e 1 7 wurde zur Abspaltung der Isopropylidengruppen Zu einer Suspension von 2 g Inosin in 50 ml Methyl- 30 Minuten bei 7O0C gehalten. Die so behandelte 25 äthylketon wurden 3 ml Phosphortrichlorid und dann Lösung wurde an einer Aktivkohlesäule adsorbiert. 1 ml Wasser gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer 30 Minuten bei 1O0C gerührt. Nach Zugabe von 50 ml 0,5%igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung eluiert. Phosphortrichlorid zum Reaktionsgemisch wurde Das Eluat wurde auf pH-Wert 8 eingestellt und ein- dieses 30 Minuten in einem offenen Gefäß gerührt, geengt. Die Analyse des Konzentrats durch Papier- 30 Das Reaktionsgemisch wurde dann in 11 Eiswasser elektrophorese (0,05 Mol Boratpuffer) ergab, daß das gegossen und die erhaltene Lösung mit einer 20%igen Inosin-5'-monophosphat in einer Ausbeute von 88 % wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf pH-Wert 1,5 gebildet worden war. Durch Zugabe von Methanol eingestellt. Diese Lösung wurde 30 Minuten auf 700C zum Konzentrat wurden 3,3 g des Dinatriumsalzes erhitzt, um die Isopropylidengruppen zu entfernen, von Inosin-5'-monophosphat (8H2O) erhalten. Aus- 35 Sie wurde dann an einer Aktivkohlesäule adsorbiert, beute 81 %· Diese Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit Beispiel 2 einer 0,5%igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung eluiert. Das Eluat wurde auf pH-Wert 8 eingestellt Ein Gemisch von 2 g Adenosin in 50 ml Aceton, und eingeengt. Die Analyse der geringen Konzentrat-4 ml Phosphortrichlorid und 2 ml Wasser wurden auf 40 menge durch Papierelektrophorese (0,05 Mol Boratdie im Beispiel 1 angegebene Weise umgesetzt, worauf puffer) ergab, daß Inosin-5'-monophosphat in einer weitere 45 ml Phosphortrichlorid zum Reaktions- Ausbeute von 81 % gebildet worden war. Durch gemisch gegeben wurden. Durch Aufarbeitung des Zugabe von Methanol zum Konzentrat wurden 3,0 g hierbei erhaltenen Reaktionsgemisches auf die im des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat Beispiel 1 angegebene Weise wurden 2,3 g des 45 (8H2O) erhalten. Die Ausbeute betrug 74%· Dinatriumsalzes von 5'-Adenylsäure erhalten. Die Ausbeute betrug 77 %. B e 1 s ρ 1 e 1 8 _ . -ίο Ein Gemisch von 2 g Inosin, 4 ml Phosphortri- ΰ e 1 s ρ 1 e 1 5 chlorid, 20 ml Methylisobutylketon und 2 ml Wasser Ein Gemisch von 2 g Cytidin als Lösung in 100 ml 50 wurde auf die im Beispiel 7 angegebene Weise be-Aceton, 3 ml Phosphortrichlorid und 1 ml Wasser handelt. Nach Zugabe von 40 ml Phosphortrichlorid wurden auf die im Beispiel 1 angegebene Weise um- zum Reaktionsgemisch wurde dieses auf die im gesetzt, worauf weitere 50 ml Phosphortrichlorid zum Beispiel 7 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 2,9 g Reaktionsgemisch gegeben wurden. Durch Auf- des Dinatriumsalzes von 5'-Inosinsäure erhaltenwurden, arbeitung des hierbei erhaltenen Reaktionsgemisches 55 Die Ausbeute betrug 71 %· auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 2,8 g des Dinatriumsalzes von 5'-Cytidylsäure erhalten. Patentansprüche· Die Ausbeute betrug 75 %.

1. Verfahren zur Herstellung von Inosin-,

Beispiel4 ^6o Adenosin-, Cytidin- und/oder Uridin-5'-phosphat

durch Umsetzung der entsprechenden Ribonucleo-

Zu einer Suspension von 2 g Inosin in 50 ml Aceton side mit 10 bis 100 Mol eines Phosphorylierungs-

wurden 3 ml Phosphortrichlorid und dann 1 ml Wasser mittels, bezogen auf das Ribonucleosid, in Gegengegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 10⁰C wart von Wasser und aliphatischen Ketonen mit

gerührt und dann mit 50 ml Phosphortrichlorid bei 65 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und anschließende 0 bis 5°C versetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten Hydrolyse des Reaktionsproduktes zum gewünsch-

der Reaktion überlassen. Die Aufarbeitung des ten 5'-Ribonucleotid, dadurch gekenn-

Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene zeichnet, daß man als Phosphorylierungsmittel

Phosphortrichlorid einsetzt und dabei in Gegenwart von Sauerstoff arbeitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Gegenwart von 2 bis 20 Mol Wasser, bezogen auf das Ribonucleosid, durchgeführt wird.