DE1617447C - Verfahren zur Herstellung eines reinen, hochviskosen Hyaluronsaurepraparates - Google Patents

Description

Es sind mehrere Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure bekannt und zum Teil in Patentschriften niedergelegt worden. Da diese Verbindung synthetisch nicht zugänglich ist, kommen ausschließlich Methoden zur Isolierung aus einem Naturprodukt in Frage. Hierzu wurden neben dem Glaskörper menschlicher und tierischer Augen auch andere Organe herangezogen, die relativ reich an Hyaluronsäure sind, z. B. Nabelschnur, Schweinehaut, Synovialflüssigkeit, der Kamm des Hahnes, die Wände von Venen und Arterien. Hyaluronsäure wird in Sarkomen gebildet und von verschiedenen Bakterien in das Kulturmedium ausgeschieden (J. S. B r i m a c ο m b e und J. M.Webber, »Mucopolysaccharides«, Elsevier Publishing Company, Amsterdam, 1964).

In keinem Fall kommt die Hyaluronsäure in reiner Form vor, sondern stets mehr oder minder fest an Proteine gebunden. Neben der Nabelschnur besitzen die leichter zugänglichen Glaskörper tierischer Augen den höchsten Gehalt an Hyaluronsäure, aber auch hier ist die Abtrennung der Proteinkomponente der wesentlichste Schritt des Isolierungsverfahrens.

Im Prinzip bestehen die bekannten Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure aus einem proteolytischen Abbau der Eiweißkomponente, der Entfernung der gebildeten Aminosäuren durch Dialyse oder Austauscher und nachfolgendem mehrfachem Umfallen der Hyaluronsäure zwecks weiterer Reinigung. Allen diesen Verfahren ist der Nachteil gemeinsam, daß der proteolytische Eiweißabbau nicht vollständig ist und stets eine geringe Menge an Resteiweiß zurückbleibt, die dann durch mehr oder minder komplizierte Reaktionen gesondert entfernt werden muß. Diese Nachbehandlungen führen immer zu einem weitergehenden Abbau der Hyaluronsäure, deren Lösungen zwangläufig mit zunehmender Reinheit einen immer stärkeren Abfall der Viskosität zeigen oder — sofern derartige Nachbehandlungen vorzeitig abgebrochen werden —zu Produkten, die noch einen beträchtlichen Proteingehalt aufweisen. Handelsübliche Hyaluronsäurepräparate enthalten bis zu 5% Protein und können daher für viele Zwecke nicht verwendet werden (H. U. Bergmeyer, »Methoden der enzymatischen Analyse«, Verlag Chemie, Weinheim, 1962, S. 1023). '

In der USA.-Patentschrift 2 585 546 vom 12. 2. 1952 wird die Herstellung einer hochviskosen Hyaluronsäure beschrieben, wobei von menschlichen und tierischen Nabelschnüren ausgegangen wird. Nach diesem arbeitsmäßig sehr aufwendigen Verfahren werden Hyaluronsäurelösungen erhalten, die bei einer Konzentration von 1 mg/ml eine relative Viskosität ■ von 8,2 zeigen. Die Reinheit der so erhaltenen Präparation ist zu bezweifeln, da die Autoren Stickstoffgehalte von 2,8 bis 4,3% angeben.

In. einer späteren Erfindung derselben Autoren werden proteolytische Fermente zum Abbau der Proteine herangezogen, wie dies in der USA.-Patentschrift 2 583 096 vom 22. 1. 1952 niedergelegt ist. Auch hierbei werden entsprechend den angegebenen Analysendaten keine reinen und einheitlichen Präparate erhalten. Es ist bekannt, daß ein enzymatischer Abbau des natürlichen Hyaluronsäure-Eiweiß-Komplexcs keine völlig proteinfreie Hyaluronsäure liefert (H. G i b i a η, »Mucopolysaccharide und Mucopolyäaccharidasen«, F. Deut icke, Wien, 1959).

In der britischen Patentschrift 818 336 vom 21.6. 1957 wird die Isolierung eines neuen sauren Aminopolysaccharides aus der Magenschleimhaut des Schweines beschrieben, wobei es sich vermutlich um Hyaluronsäure handelt. In diesem Fall scheint ein reines und proteinfreies Präparat erhalten worden zu sein, was durch die Anwendung eines 19stufigen Verfahrens erzielt werden konnte, wobei allerdings ein Abbau der Hyaluronsäure eintrat, da die relative Viskosität der Lösung (0,5 °/₀ in 0,9% Natriumchlorid bei 37°C) nur 1,87 betrug.

Die Herstellung eines Hyaluronsäurepräparates aus den Glaskörpern tierischer Augen ist ferner in der russischen Patentschrift 130159 vom 2.11. 1960 beschrieben. Hierbei werden Ballaststoffe durch Homogenisieren, Filtration und Behandlung mit Chloroform sowie anschließendes Ausfällen mit Äthanol entfernt. Dieses Verfahren liefert offenkundig keine proteinfreien Präparate, was auch für den angesprochenen Verwendungszweck, nämlich zur äußerlichen Behandlung langsam verheilender Wunden und Geschwülste mit geringfügiger Granulation, nicht notwendig erscheint.

In der chemischen Literatur sind einige Verfahren beschrieben worden, deren Ziel es war, eine möglichst unveränderte native Hyaluronsäure zu isolieren, vorwiegend zum Zweck von Strukturuntersuchungen und unbeschadet der Aufwendigkeit der herangezogenen Methoden. So erhielt T. C. L a u r e η t (J. Biol. Chem., 216, S. 263 [1955]) eine als weitgehend unverändert angesprochene Hyaluronsäure aus dem Glaskörper tierischer Augen durch Ultrazentrifugation und ohne vorhergehenden enzymatischen Abbau. Das Endprodukt enthielt aber bis zu 5% Protein.

Nach T. C. Laurent, M. Ryan und A. Pietruskiewieg (Biochim. Biophys. Acta, 42, S. 476 [I960]) kann Hyaluronsäure als Cetylpyridiniumsalz gefällt und zentrifugiert werden. Nach weiteren Reinigungsoperationen, die eine mehrfache Dialyse einschließen, enthalten die Endprodukte immer noch über 1% Protein.

D. Hamerman und J. Sandson (Nature, 188, S. 1194 [I960]) isolieren die Hyaluronsäure aus der Synovialflüssigkeit durch Zonenelektrophorese, wobei das Endprodukt nach Umfallen mit Äthanol immer noch 2,5% Eiweiß enthält. Nach Angaben der Autoren stellt dies die mit milden Methoden erhaltene eiweißärmste Hyaluronsäure dar, die bisher beschrieben wurde. ■ -

Die Hyaluronsäure selbst wie auch deren Salze bilden mit Wasser hochviskose Lösungen. Es konnte gezeigt werden, daß unter bestimmten Voraussetzungen derartige Lösungen als Glaskörperersatz in das menschliche Auge injiziert werden können und bei Netzhautablösungen alle bisher bekannten Glaskörperersatzstoffe in ihrer Wirksamkeit und Verträglichkeit bei weitem übertreffen (W. Widder, Graefes Arch f. Ophthalmol., 162, S. 416 [I960]; K. H r u b y, KHn. Monatsblättcr f. Augenheilkunde, 138, S. 484 [1961]). Nach W. Widder (Graefes Arch. f. Ophthalmol., 164, S. 550 [1962]) gilt dies vor allem für die klinisch bedeutsame Verweilzeit derartiger Implantate im Glaskörper. Um den Anforderungen als Glaskörperersatzflüssigkeit zu genügen, muß die Hyaluronsäurelösung eine hohe Viskosität besitzen, muß völlig proteinfrei sein, darf keine Antigene und Pyrogene enthalten. Die Lösung soll sich außerdem sterilisieren lassen, ohne einen besonderen Abfall der Viskosität zu zeigen.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren

zur Herstellung eines reinen, hochviskosen, protein-, antigen- und pyrogenfreien, hitzesterilisierbaren Hyaluronsäurepräparates.

Aus hyaluronsäurehaltigen tierischen Organen, wie Glaskörper des Auges, Nabelschnüren u. a., oder hyaluronsäureproduzierenden Bakterienkulturen wird in üblicher Weise, z. B. durch Fällung mit Aceton, ein Trockenpulver hergestellt. Zur Erleichterung des enzymatischen Abbaues wird die Suspension dieses Trockenpulvers in Wasser kurzzeitig im alkalischen Bereich erhitzt, wobei die Proteinkomponente denaturiert wird. Nach Einstellung des für das herangezogene Enzym optimalen pH- und Temperaturbereiches wird das Protein durch proteolytische Fermente, vorzugsweise durch ein Hydrolasengemisch aus Aspergillus orizae abgebaut. Nach Entfernen der freien Aminosäuren und Mineralsalze durch Behandlung mit Ionenaustauschern wird eine unreine, noch proteinhaltige Hyaluronsäurelösung erhalten. Der wesentliche und neue Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht nun darin, daß die so erhaltene Lösung der unreinen, restproteinhaltigen Hyaluronsäure auf einen sauren pH-Bereich von ungefähr 3 bis 4 eingestellt wird, in welchem die Verunreinigungen mit der Hyaluronsäure einen unlöslichen Komplex bilden, wobei ein Teil der Hyaluronsäure selbst als Fällungsmittel der Verunreinigungen, vorwiegend des restlichen, sonst nur schwierig ohne Depolymerisation der Hyaluronsäure zu entfernenden Proteins fungiert, worauf die so erhaltenen unlöslichen Komplexverbindungen durch hochtouriges Zentrifugieren abgetrennt werden.

Die so erhaltene Hyaluronsäurelösung besitzt nach Bildung des Natriumsalzes durch Zusatz von Natriumkarbonat bzw. Natriumbikarbonat bei einer Konzentration von 0,2 % in Wasser eine relative spezifische Viskosität von 20 und stellt eine wasserklare, protein-, antigen- und pyrogenfreie Lösung dar. Infolge der außergewöhnlichen Reinheit der Hyaluronsäure ist diese Lösung durch Hitze sterilisierbar, wobei der Abfall der Viskosität nicht beträchtlich ist. Dies steht im Gegensatz zur bestehenden Lehrmeinung, wonach neutrale Hyaluronsäurelösungen, also die Salze dieser Verbindung, höhere Temperaturen (auch schon 6O⁰C) nicht vertragen und deshalb nicht hitzesterilisierbar seien (R. W. J e a η 1 ο ζ und E. F ο r c h i e 11 i, J. Biol. Chem., 186, S. 495 [1950]).

Die nach diesem Verfahren hergestellten Hyaluronsäurelösungen lassen sich gefriertrocknen und geben nach neuerlichem Lösen in der entsprechenden Menge Wasser ein Präparat mit den ursprünglichen Eigenschaften.

Die erfindungsgemäß hergestellte hochreine Hyaluronsäurelösung ist ein Heilmittel und kann als Ersatz des Glaskörpers des menschlichen Auges bei Verletzungen oder Netzhautablösungen (Ablatio retinae) verwendet werden.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung eines reinen, hochviskosen, protein-, pyrogen- und antigenfreien, sterilisierbaren Hyaluronsäurepräparates aus einer unreinen Hyaluronsäurelösung, die aus hyaluronsäurehaltigen tierischen Organen, wie Glaskörper des Auges, Nabelschnüren, oder aus hyaluronsäureproduzierenden Bakterienkulturen erhalten und dadurch von Begleitstoffen befreit wird, daß der Proteinanteil eines aus dem Ausgangsmaterial in üblicher Weise z. B. durch Acetonfällung hergestellten Trockenpulvers in wässeriger Suspension im alkalischen Bereich durch Erhitzen denatuiert, durch proteolytische Fermente abgebaut und die freien Aminosäuren und andere ionogene Substanzen durch Behandlung mit Ionenaustauschern entfernt werden, dadurchgekennzeichnet, daß die so erhaltene unreine Hyaluronsäurelösung auf einen sauren pH-Bereich von ungefähr 3 bis 4 eingestellt wird, in welchem die Verunreinigungen mit der Hyaluronsäure einen unlöslichen Komplex bilden, wobei ein Teil der Hyaluronsäure selbst als Fällungsmittel der Verunreinigungen, vorwiegend des restlichen^ sonst nur schwierig ohne Depolymerisation der Hyaluronsäure zu entfernenden Proteins wirkt, worauf die so erhaltenen unlöslichen Komplexverbindungen durch hochtouriges Zentrifugieren abgetrennt werden.