DE1617447B1

DE1617447B1 - Verfahren zur Herstellung eines reinen hochviskosen Hyaluronsäurepräparates

Info

Publication number: DE1617447B1
Application number: DE1966E0031253
Authority: DE
Inventors: Gerhard Dr Billek
Original assignee: ETAPHARM CHEM PHARM LAB GES M
Current assignee: ETAPHARM CHEM PHARM LAB GES M
Priority date: 1965-03-17
Filing date: 1966-03-16
Publication date: 1970-09-24
Also published as: US3396081A; GB1088304A; CH485855A; AT252264B; NL6603433A

Description

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Es sind mehrere Verfahren zur Herstellung von saccharides aus der Magenschleimhaut des Schweines

Hyaluronsäure bekannt und zum Teil in Patent- ■; beschrieben, wobei es sich vermutlich um Hyaluron-

schriften niedergelegt worden. Da diese Verbindung säure handelt. In diesem Fall scheint ein reines und

synthetisch nicht zugänglich ist, kommen ausschließ- proteinfreies Präparat erhalten worden zu sein, was

lieh Methoden zur Isolierung aus einem Naturprodukt 5 durch die Anwendung eines 19stufigen Verfahrens

in Frage. Hierzu wurden neben dem Glaskörper erzielt werden konnte, wobei allerdings ein Abbau

menschlicher und tierischer Augen auch andere der Hyaluronsäure eintrat, da die relative Viskosität

Organe herangezogen, die relativ reich an Hyaluron- der Lösung (0,5 °/₀ in 0,9 °/₀ Natriumchlorid bei

säure sind, z. B. Nabelschnur, Schweinehaut, Synovial- 37°C) nur 1,87 betrug.

flüssigkeit, der Kamm des Hahnes, die Wände von io Di_e Herstellung eines Hyaluronsäurepräparates aus

Venen und Arterien. Hyaluronsäure wird in Sarkomen den Glaskörpern tierischer Augen ist ferner in der

gebildet und von verschiedenen Bakterien in das , russischen Patentschrift 130159 vom 2.11.1960

Kulturmedium ausgeschieden (J. S. B r i m a c ό m b e beschrieben. Hierbei werden Ballaststoffe durch Homo-

und J. M. We b b e r, »Mucopolysaceharides«, Elsevier genisieren, Filtration und Behandlung mit Chloroform

Publishing Company, Amsterdam, 1964). 15 sowie anschließendes Ausfällen mit Äthanol entfernt.

In keinem Fall kommt die Hyaluronsäure in reiner Dieses Verfahren liefert offenkundig keine protein-

Form vor, sondern stets mehr oder minder fest an freien Präparate, was auch für den angesprochenen

Proteine gebunden. Neben der Nabelschnur besitzen Verwendungszweck, nämlich zur äußerlichen Behand-

die leichter zugänglichen Glaskörper tierischer Augen lung langsam verheilender Wunden und Geschwülste

den höchsten Gehalt an Hyaluronsäure, aber auch 20 _mit geringfügiger Granulation, nicht notwendig er-

hier ist die Abtrennung der Proteinkomponente der scheint,

wesentlichste Schritt des Isolierungsverfahrens. In der chemischen Literatur sind einige Verfahren

Im Prinzip bestehen die bekannten Verfahren zur beschrieben worden, deren Ziel es war, eine möglichst Herstellung von Hyaluronsäure aus einem proteoly- unveränderte native Hyaluronsäure zu isolieren, vortischen Abbau der Eiweißkomponente, der Entfernung 25 wiegend zum Zweck von Strukturuntersuchungen und der gebildeten Aminosäuren durch Dialyse oder unbeschadet der Aufwendigkeit der herangezogenen Austauscher und nachfolgendem mehrfachem Um- Methoden. So erhielt T. C. L a u r e η t (J. Biol. Chem., fällen der Hyaluronsäure zwecks weiterer Reinigung. 216, S. 263 [1955]) eine als weitgehend unverändert Allen diesen Verfahren ist der Nachteil gemeinsam, angesprochene Hyaluronsäure aus dem Glaskörper daß der proteolytische Eiweißabbau nicht vollständig 30 tierischer Augen durch Ultrazentrifugation und ohne ist und stets eine geringe Menge an Resteiweiß zurück- vorhergehenden enzymatischen Abbau. Das Endprobleibt, die dann durch mehr oder minder komplizierte dukt enthielt aber bis zu 5 % Protein.
Reaktionen gesondert entfernt werden muß. Diese Nach T. C. Laurent, M. Ryan und A. Nachbehandlungen führen immer zu einem weiter- Pietruskiewieg (Biochim. Biophys. Acta, 42, gehenden Abbau der Hyaluronsäure, deren Lösungen 35 S. 476 [I960]) kann Hyaluronsäure als Cetylpyridizwangläufig mit zunehmender Reinheit einen immer niumsalz gefällt und zentrifugiert werden. Nach stärkeren Abfall der Viskosität zeigen oder — sofern weiteren Reinigungsoperationen, die eine mehrfache derartige Nachbehandlungen vorzeitig abgebrochen Dialyse einschließen, enthalten die Endprodukte werden — zu Produkten, die noch einen beträchtlichen immer noch über 1 °/₀ Protein.
Proteingehalt aufweisen. Handelsübliche Hyaluron- 40 D. Hamerman und J. Sandson (Nature, säurepräparate enthalten bis zu 5 % Protein und 188, S. 1194 [I960]) isolieren die Hyaluronsäure aus der können daher für viele Zwecke nicht verwendet werden Synovialflüssigkeit durch Zonenelektrophorese, wobei (H. U. Bergmeyer, »Methoden der enzyma- das Endprodukt nach Umfallen mit Äthanol immer tischen Analyse«, Verlag Chemie, Weinheim, 1962, noch 2,5 % Eiweiß enthält. Nach Angaben der S. 1023). . 45 Autoren stellt dies die mit milden Methoden erhaltene

In der USA.-Patentschrift 2 585 546 vom 12. 2.1952 eiweißärmste Hyaluronsäure dar, die bisher beschrie-

wird die Herstellung einer hochviskosen Hyaluron- ben wurde.

säure beschrieben, wobei von menschlichen und Die Hyaluronsäure selbst wie auch deren Salze

tierischen Nabelschnüren ausgegangen wird. Nach bilden mit Wasser hochviskose Lösungen. Es konnte

diesem arbeitsmäßig sehr aufwendigen Verfahren 50 gezeigt werden, daß unter bestimmten Voraussetzungen

werden Hyaluronsäurelösungen erhalten, die bei einer derartige Lösungen als Glaskörperersatz in das

Konzentration von 1 mg/ml eine relative Viskosität menschliche Auge injiziert werden können und bei

von 8,2 zeigen. Die Reinheit der so erhaltenen Präpara- Netzhautablösungen alle bisher bekannten Glaskörper-

tion ist zu bezweifeln, da die Autoren StickstofFgehalte ersatzstoffe in ihrer Wirksamkeit und Verträglichkeit

von 2,8 bis 4,3% angeben. 55 bei weitem übertreffen (W. Widder, Graefes

In einer späteren Erfindung derselben Autoren Arch f. Ophthahnol., 162, S. 416 [I960]; K. Hruby,

werden proteolytische Fermente zum Abbau der Klin. Monatsblätter f. Augenheilkunde, 138, S. 484

Proteine herangezogen, wie dies in der USA.-Patent- [1961]). Nach W. Widder (Graefes Arch. f.

schrift 2 583 096 vom 22.1.1952 niedergelegt ist. Ophthahnol., 164, S. 550 [1962]) gilt dies vor allem

Auch hierbei werden entsprechend den angegebenen 60 für die klinisch bedeutsame Verweilzeit derartiger

Analysendaten keine reinen und einheitlichen Präpa- Implantate im Glaskörper. Um den Anforderungen

rate erhalten. Es ist bekannt, daß ein enzymatischer als Glaskörperersatzflüssigkeit zu genügen, muß die

Abbau des natürlichen Hyaluronsäure-Eiweiß-Kom- Hyaluronsäurelösung eine hohe Viskosität besitzen,

plexes keine völlig proteinfreie Hyaluronsäure liefert muß völlig proteinfrei sein, darf keine Antigene und

(H. Gibian, »Mucopolysaccharide und Mucopoly- 65 Pyrogene enthalten. Die Lösung soll sich außerdem

saccharidasen«, F. Deuticke, Wien, 1959). sterilisieren lassen, ohne einen besonderen Abfall

In der britischen Patentschrift 818 336 vom 21. 6. der Viskosität zu zeigen.

1957 wird die Isolierung eines neuen sauren Aminopoly- Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren

zur Herstellung eines reinen, hochviskosen, protein-, antigen- und pyrogenfreien, hitzesterilisierbaren Hyaluronsäurepräparates.

Aus hyaluronsäurehaltigen tierischen Organen, wie Glaskörper des Auges, Nabelschnüren u. a., oder hyaluronsäureproduzierenden Bakterienkulturen wird in üblicher Weise, z. B. durch Fällung mit Aceton, ein Trockenpulver hergestellt. Zur Erleichterung des enzymatischen Abbaues wird die Suspension dieses Trockenpulvers in Wasser kurzzeitig im alkalischen Bereich erhitzt, wobei die Proteinkomponente denaturiert wird. Nach Einstellung des für das herangezogene Enzym optimalen pH- und Temperaturbereiches wird das Protein durch proteolytische Fermente, vorzugsweise durch ein Hydrolasengemisch aus Aspergillus orizae abgebaut. Nach Entfernen der freien Aminosäuren und Mineralsalze durch Behandlung mit Ionenaustauschern wird eine unreine, noch proteinhaltige Hyaluronsäurelösung erhalten. Der wesentliche und neue Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht nun darin, daß die so erhaltene Lösung der unreinen, restproteinhaltigen Hyaluronsäure auf einen sauren pH-Bereich von ungefähr 3 bis 4 eingestellt wird, in welchem die Verunreinigungen mit der Hyaluronsäure einen unlöslichen Komplex bilden, wobei ein Teil der Hyaluronsäure selbst als Fällungsmittel der Verunreinigungen, vorwiegend des restlichen, sonst nur schwierig ohne Depolymerisation der Hyaluronsäure zu entfernenden Proteins fungiert, worauf die so erhaltenen unlöslichen Komplexverbindungen durch hochtouriges Zentrifugieren abgetrennt werden.

Die so erhaltene Hyaluronsäurelösung besitzt nach Bildung des Natriumsalzes durch Zusatz von Natriumkarbonat bzw. Natriumbikarbonat bei einer Konzentration von 0,2% in Wasser eine relative spezifische Viskosität von 20 und stellt eine wasserklare, protein-, antigen- und pyrogenfreie Lösung dar. Infolge der außergewöhnlichen Reinheit der Hyaluronsäure ist diese Lösung durch Hitze sterilisierbar, wobei der Abfall der Viskosität nicht beträchtlich ist. Dies steht im Gegensatz zur bestehenden Lehrmeinung, wonach neutrale Hyaluronsäurelösungen, also die Salze dieser Verbindung, höhere Temperaturen (auch schon 6O⁰C) nicht vertragen und deshalb nicht hitzesterilisierbar seien (R. W. Jeanloz und E. Forchielli, J. Biol. Chem., 186, S. 495 [1950]).

Die nach diesem Verfahren hergestellten Hyaluronsäurelösungen lassen sich gefriertrocknen und geben nach neuerlichem Lösen in der entsprechenden Menge Wasser ein Präparat mit den ursprünglichen Eigenschaften.

Die erfindungsgemäß hergestellte hochreine Hyaluronsäurelösung ist ein Heilmittel und kann als Ersatz des Glaskörpers des menschlichen Auges bei Verletzungen oder Netzhautablösungen (Ablatio retinae) verwendet werden.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines reinen, hochviskosen, protein-, pyrogen- und antigenfreien, sterilisierbaren Hyaluronsäurepräparates aus einer unreinen Hyaluronsäurelösung, die aus hyaluronsäurehaltigen tierischen Organen, wie Glaskörper des Auges, Nabelschnüren, oder aus hyaluronsäureproduzierenden Bakterienkulturen erhalten und dadurch von Begleitstoffen befreit wird, daß der Proteinanteil eines aus dem Ausgangsmaterial in üblicher Weise z. B. durch Acetonfällung hergestellten Trockenpulvers in wässeriger Suspension im alkalischen Bereich durch Erhitzen denatuiert, durch proteolytische Fermente abgebaut und die freien Aminosäuren und andere ionogene Substanzen durch Behandlung mit Ionenaustauschern entfernt werden, dadurch gekennzeichnet, daß die so erhaltene unreine Hyaluronsäurelösung auf einen sauren pH-Bereich von ungefähr 3 bis 4 eingestellt wird, in welchem die Verunreinigungen mit der Hyaluronsäure einen unlöslichen Komplex bilden, wobei ein Teil der Hyaluronsäure selbst als Fällungsmittel der Verunreinigungen, vorwiegend des restlichen, sonst nur schwierig ohne Depolymerisation der Hyaluronsäure zu entfernenden Proteins wirkt, worauf die so erhaltenen unlöslichen Komplexverbindungen durch hochtouriges Zentrifugieren abgetrennt werden.