DE1617391C3

DE1617391C3 - Process for the production of an anti-tumor protein

Info

Publication number: DE1617391C3
Application number: DE19661617391
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Vester, Frederic, Dr., 8000 München
Priority date: 1965-12-30
Filing date: 1966-12-29
Publication date: 1976-11-25

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines hochaktiven, von Ballaststoffen und atypisch toxischen Verunreinigungen befreiten tumorhemmenden Proteins aus Misteln. Unter dem Kurzbegriff »Mistel« werden hier Viscum-Arten, speziell Viscum album L. sensu latiore, und Loranthus-Arten, speziell Loranthus europäus L., verstanden.The present invention is a process for the preparation of a highly active, of Dietary fiber and atypical toxic impurities freed tumor-inhibiting protein from mistletoe. Under the short term »mistletoe« are Viscum species, especially Viscum album L. sensu latiore, and Loranthus species, especially Loranthus europäus L., Roger that.

Es ist bekannt, daß durch Reinigung des Preßsaftes von Misteln, z.B. durch Gesamtausfälle mit wäßrigen Salzlösungen, wie Ammoniumsulfatlösungen, und nachfolgender Dialyse, oder mit organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, proteinartige Fraktionen mit tumorhemmenden Eigenschaften angereichert werden können [z.B. Selawry et al., Hoppe-Seyler's Zeitschr. Phys. Chem., 324, 262 bis 281 (1961)].It is known that by cleaning the pressed juice of mistletoe, for example by total failures with aqueous Saline solutions, such as ammonium sulfate solutions, and subsequent dialysis, or with organic solvents, like acetone, proteinaceous fractions are enriched with anti-tumor properties can be [e.g. Selawry et al., Hoppe-Seyler's Zeitschr. Phys. Chem., 324, 262-281 (1961)].

Es wird ferner in der belgischen Patentschrift 646 095 gezeigt, daß man ein gereinigtes und hochaktives Protein erhalten kann, wenn man den von schlammartigen Verunreinigungen befreiten Preßsaft, d.h. den Klarpreßsaft, aus Misteln oder äquivalente Wasserextrakte, Dialysate oder Trockensubstanzen mittels einer wäßrigen Salzlösung, insbesondere Ammoniumsulfatlösung, aussalzt und die bei einer MoIarität von etwa 1 bis 1,9 (berechnet auf Ammoniumsulfat) anfallende Proteinfraktion gegen Wasser dialysiert und, wenn erwünscht, den wasserunlöslichen Anteil des Retentates bis zu einer Molarität von höchstens 0,4 (berechnet auf Ammoniumsulfat) mit einer wäßrigen Salzlösung, insbesondere Ammoniumsulfatlösung, einsalzt und gegebenenfalls die erhaltene Lösung an einem Adsorptionsmittel, wie einem Polydextrangel (z.B. einem Polydextrangel mit Ionenaustauschereigenschaften, insbesondere mit basischen Gruppen, wie Diäthylaminoäthyl-Sephadex, ein mit Kreuzbindungen versehenes Polydextrangel, welches mit Diäthylaminoäthylgruppen verätherte Hydroxygruppen enthält und Molekularsieb- und Ionenaustauschereigenschaften aufweist), wenn erwünscht über 2 Stufen, wie Filtrieren durch einen Adsorptionsmittelblock und/oder Chromatographieren an einer Adsorptionsmittelsäule, reinigt. Das mittels Ausfällen erhaltene Proteinmaterial, genannt Nx, oder dessen Dialyseretentat Nx 1 sowie die daraus nach dem Einsalzen erhaltenen Fraktionen Nx 11₀.₀₄ und Nx 12₀._0/, wie z.B. Nx H₀₁, Nx H₀₃₅, Nx 12₀₁ oder Nx 12₀₃₅, oder weiter, z.B. an Adsorptionsmit-It is also shown in Belgian patent specification 646 095 that a purified and highly active protein can be obtained if the pressed juice freed from sludge-like impurities, ie the clear pressed juice, from mistletoe or equivalent water extracts, dialysates or dry substances, by means of an aqueous salt solution, in particular ammonium sulfate solution , and the protein fraction obtained with a molarity of about 1 to 1.9 (calculated on ammonium sulfate) is dialyzed against water and, if desired, the water-insoluble portion of the retentate up to a molarity of at most 0.4 (calculated on ammonium sulfate) with a aqueous salt solution, in particular ammonium sulfate solution, and optionally the solution obtained on an adsorbent, such as a polydextrangel (e.g. a polydextrangel with ion exchange properties, especially with basic groups, such as diethylaminoethyl Sephadex, a cross-linked polydextrangel with di äthylaminoäthylgruppen contains etherified hydroxyl groups and has molecular sieve and ion exchange properties), if desired in 2 stages, such as filtering through an adsorbent block and / or chromatography on an adsorbent column. The protein material obtained by means of precipitation, called Nx, or its dialysis retentate Nx 1 and the fractions Nx 11 ₀ obtained therefrom after salting. ₀₄ and Nx 12 ₀ . _{0 /} , such as Nx H ₀₁ , Nx H ₀₃₅ , Nx 12 ₀₁ or Nx 12 ₀₃₅ , or further, e.g. on adsorbents

!5 teln gereinigte Fraktionen, wie Nx 12₀₁I und Nx 12₀₃₅I, zeigen ausgeprägte tumorhemmende Eigenschaften. Diese Proteinmaterialien sind aus der genannten belgischen Patentschrift bekannt.5 times purified fractions, such as Nx 12 ₀₁ I and Nx 12 ₀₃₅ I, show pronounced anti-tumor properties. These protein materials are known from the aforementioned Belgian patent.

Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von hochaktiven und reinen Proteinfraktionen sind in erster Linie ihrer Mehrstufigkeit wegen umständlich; zudem muß auf jeder Stufe zur Vermeidung von Aktivitätsverlusten unter Kühlen, d.h. bei Temperaturen von etwa 0° bis etwa 10° C, gearbeitet werden. Es ist deshalb offensichtlich, daß ein Verfahren, bei welchem auf eine oder mehrere oder langwierigen Reinigungsstufen, insbesondere auf Filtrieren und Chromatographieren sowie Zentrifugieren verzichtet werden könnte, einen erheblichen Vorteil mit sich brächte. Dabei ist eine weitere Reinigung und Anreicherung der vorgereinigten Proteinfraktion wünschenswert. Dies wird durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht.The previously known processes for the production of highly active and pure protein fractions are in first and foremost because of their multi-stage nature, cumbersome; also must be done at every level to avoid loss of activity work with cooling, i.e. at temperatures from about 0 ° to about 10 ° C. It it is therefore obvious that a process in which one or more or lengthy cleaning stages, In particular, filtration, chromatography and centrifugation can be dispensed with could bring a significant advantage. This involves further purification and enrichment the prepurified protein fraction is desirable. This is achieved by the inventive Procedure achieved.

Es hat sich gezeigt, daß man mit diesem Verfahren in einfacher, schneller und insbesondere auch kontinuierlicher Weise zu den erwünschten Proteinfraktionen gelangt. Auch das unerläßliche Kühlen läßt sich bei dieser Methode sehr einfach durchführen. Außer zur Umgehung von konventionellen Reinigungsstufen eignet sich die trägerfreie Ablenkungselektrophorese selbstverständlich auch als Reinigungsstufe in irgendeinem anderen, mehrstufigen Anreicherungsverfahreri. It has been shown that this method can be used in a simpler, faster and, in particular, also more continuously Way to get the desired protein fractions. Even the essential cooling can be done very easy to do with this method. Except for bypassing conventional cleaning levels the carrier-free deflection electrophoresis is of course also suitable as a purification stage in any one other, multi-stage enrichment procedures.

Das Prinzip der trägerfreien Ablenkungselektrophorese ist bekannt (H a η η i η g, Z. Anal. Chem., 181, 244 (1961); Hanning, »Eine Neuentwicklung der trägerfreien Ablenkungselektrophorese und ihre Anwendung auf cytologische Probleme«, Habilitationsschrift [München 1964]).The principle of carrier-free deflection electrophoresis is known (H a η η i η g, Z. Anal. Chem., 181, 244 (1961); Hanning, »A new development in carrier-free deflection electrophoresis and its application on cytological problems «, habilitation thesis [Munich 1964]).

Als Ausgangsmaterial kann man Preßsaft aus Misteln verwenden, den man aus Pflanzenmaterial, insbesondere aus Stengeln und Blättern, von Viscum- oder Loranthus-Arten, insbesondere.von Laubholzmisteln, wie Eichen-, Apfel- oder Pappelmisteln, er-As a starting material you can use pressed juice from mistletoe, which is made from plant material, in particular from stems and leaves, from Viscum or Loranthus species, especially from hardwood mistletoe, like oak, apple or poplar mistletoe,

hält. Üblicherweise wird allerdings der Preßsaft von schlammartigen Verunreinigungen, zweckmäßig durch Zentrifugieren, befreit; aus dem Klarpreßsaft oder einem äquivalenten Wasserextrakt werden, wenn erwünscht, z.B. durch Dialyse, weitere Ballaststoffe entfernt. Es können auch die entsprechenden Trokkensubstanzen verwendet werden (vgl. belgische Patentschrift 646095).holds. Usually, however, the pressed juice of sludge-like impurities is useful by centrifugation, freed; from the clear press juice or an equivalent water extract, if if desired, e.g. by dialysis, further fiber removed. The corresponding dry substances can also be used can be used (see Belgian patent specification 646095).

Zweckmäßig verwendet man aber im vorliegenden Verfahren eine aus dem Klarpreßsaft durch Anreicherung vorgereinigte Proteinfraktion. Es sind dies in erster Linie die durch Aussalzen, z.B. mit einer Ammoniumsulfatlösung, bei einer Molarität bis zu 1,9, insbesondere von 1 bis 1,9, bezogen auf Ammoni-However, in the present process one expediently uses one from the clear pressed juice by enrichment pre-purified protein fraction. These are primarily those obtained by salting out, e.g. with a Ammonium sulfate solution, with a molarity up to 1.9, in particular from 1 to 1.9, based on ammonium

umsulfat, erhältlichen Fraktionen Nx oder deren Dialyseretentate Nx 1, ferner auch die durch Einsalzen, z.B. mit einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Molarität bis zu 0,4, bezogen auf Ammoniumsulfat, weiter angereicherten Fraktionen Nx 11_{0 bis 0 4} oder insbesondere Nx 12_{0 bis04}, wie Nx 11₀, oder Nx 1I₀₃₅, oder insbesondereNx 12_{0 x} oder Nx 12₀₃₅, oder daraus z.B. durch Behandeln mit einem geeigneten Adsorptionsmittel, wie einem Polydextrangel, z.B. durch Filtration durch einen Block eines solchen Adsorptionsmittels, weitergereinigte Proteinfraktionen (vgl. belgische Patentschrift 646095). _{umsulphate, available fractions Nx or their dialysis retentates Nx 1, furthermore also the fractions Nx 11 0 to 0 4} or in particular Nx 12 _{0 to 04} which are further enriched by salting, e.g. with an ammonium sulphate solution at a molarity of up to 0.4, based on ammonium sulphate, such as Nx 11 ₀ , or Nx 1I ₀₃₅ , or in particular _{Nx 12 0 x} or Nx 12 ₀₃₅ , or further purified protein fractions (cf. Belgian Patent specification 646095).

Da die wirksamen Proteinfraktionen sehr leicht denaturiert werden, wird die Elektrophorese in der Kälte, zweckmäßig bei Temperaturen, die +10° C ¹S nicht übersteigen, d.h. bei ungefähr 0° bis etwa 10° C, durchgeführt. Der als Ausgangsstoff verwendete Preßsaft und die daraus durch Vorreinigung erhaltenen Proteinfraktionen sind möglichst frisch zu verarbeiten oder müssen durch Gefriertrocknung haltbar gemacht werden.Since the active protein fractions are very easily denatured, electrophoresis in the cold, preferably at temperatures + 10 ° C will not exceed ¹ S, ie, at about 0 ° to about 10 ° C is performed. The pressed juice used as the starting material and the protein fractions obtained from it by pre-cleaning must be processed as freshly as possible or must be preserved by freeze-drying.

Üblicherweise wird das Ausgangsmaterial in einer geeigneten wäßrigen Pufferlösung der trägerfreien Ablenkungselektrophorese unterworfen, wobei man Konzentrationen von etwa 0,1% bis etwa 5%, vorzugsweise von etwa 0,5 % bis etwa 5 %, des Ausgangsstoffes verwendet.Usually, the starting material is subjected to carrier-free deflection electrophoresis in a suitable aqueous buffer solution, using concentrations of from about 0.1% to about 5%, preferably from about 0.5% to about 5%, of the starting material.

Geeignete Puffer für die in der Ablenkungskammer wandernde Lösung (Kammerpuffer) sind in erster Linie nicht denaturierende wäßrige Puffer, wie Phosphatpuffer, Diäthylbarbiturat-Puffer (Veronaipuffer), 2-Amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol-Puffer (Tris-Puffer) oder äquivalente Pufferlösungen, wobei die Konzentration möglichst im Molaritätsbereich von etwa 0,01-m. bis etwa 0,1-m., vorzugsweise bei etwa 0,03-m., liegt. Diese Puffer sind auf einen pH von 4 bis etwa 10,5, vorzugsweise auf einen pH-Wert in Nähe des Neutralpunktes, d.h. von etwa 6 bis etwa 9, eingestellt. Beispielsweise verwendet man als Kammerpuffer einen 0,03-m. wäßrigen 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol-Puffer
(Tris-Puffer), mit Zitronensäure auf pH 8,6 eingestellt. Suitable buffers for the solution migrating in the distraction chamber (chamber buffer) are primarily non-denaturing aqueous buffers, such as phosphate buffer, diethyl barbiturate buffer (Veronai buffer), 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol buffer (Tris buffer ) or equivalent buffer solutions, the concentration being in the molarity range of about 0.01-m. to about 0.1-m., preferably about 0.03-m., is. These buffers are adjusted to a pH of 4 to about 10.5, preferably to a pH value in the vicinity of the neutral point, that is to say from about 6 to about 9. For example, a 0.03 m is used as the chamber buffer. aqueous 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol buffer
(Tris buffer), adjusted to pH 8.6 with citric acid.

Als Elektroden-Puffer kommt in erster Linie der gleiche Puffer wie der Kammerpuffer in Frage, vorzugsweise aber mit einer höheren, z.B. einer dreifachen, Molarität, vorzugsweise also einer etwa 0,1-m. entsprechenden, Konzentration.The same buffer as the chamber buffer is primarily used as the electrode buffer, preferably but with a higher, e.g. three times, molarity, preferably about 0.1 m. appropriate, concentration.

Das Ausgangsmaterial wird vorzugsweise im gleichen Puffer oder mindestens in einer vergleichbare pH- und Molaritätswerte aufweisenden wäßrigen Pufferlösung verwendet. Dabei kann die zur Ablenkungselektrophorese verwendete Proteinlösung, z.B. durch Einsalzen der Proteinfraktion und Abzentrifugieren von nicht gelösten Bestandteilen, wenn erwünscht, durch nachfolgendes Umdialysieren gegen eine geeignete Pufferlösung, und/oder Behandeln mit einem Adsorptionsmittel, wie Filtration durch einen Polydextranblock, gegebenenfalls mit anschließendem Umdialysieren oder Dialysieren gegen Wasser und Lyophilisieren hergestellt werden.The starting material is preferably in the same buffer or at least in a comparable one Aqueous buffer solution having pH and molarity values is used. This can be used for deflection electrophoresis Protein solution used, e.g. by salting in the protein fraction and centrifuging it off of undissolved constituents, if desired, by subsequent re-dialysis against a suitable buffer solution, and / or treating with an adsorbent, such as filtration through a Polydextran block, optionally with subsequent re-dialyzing or dialyzing against water and lyophilization.

Die Ablenkungselektrophorese wird üblicherweise so durchgeführt, daß das Ausgangsmaterial vorzugsweise auf der Seite aufgetragen wird, die der Kathode benachbart ist, wobei man einen gieicnmäßigen Zuiluß, auch des Pufferstromes, unterhält. Das Spannungsfeld wird konstant gehalten und liegt zwischen etwa 1200 Volt und etwa 2500 Volt, z.B. um etwaThe deflection electrophoresis is usually carried out so that the starting material is preferred is applied on the side which is adjacent to the cathode, with a uniform addition, also of the buffer stream. The field of tension is kept constant and lies between about 1200 volts and about 2500 volts, e.g. by about

1800 Volt (z.B. für eine Kammerbreite von 50 cm etwa 36 V/cm).1800 volts (e.g. for a chamber width of 50 cm approx. 36 V / cm).

Die Stromstärke liegt entsprechend bei etwa 12OmA bis etwa 380 mA, vorzugsweise bei etwa 120 mA bis etwa 250 mA, und ist bei konstanter Voltzahl von Temperatur, Schichtdicke des Puffers, seiner Zusammensetzung und Ionenstärke abhängig.The current intensity is accordingly around 120 mA to around 380 mA, preferably around 120 mA to about 250 mA, and is at a constant voltage of temperature, layer thickness of the buffer, its Composition and ionic strength dependent.

Die Fließgeschwindigkeit des etwa 0,5 mm dicken Pufferfilms liegt zwischen etwa 40 ml/Stunde und etwa 200 ml/Stunde, vorzugsweise jedoch bei etwa 100 ml/Stunde. Das entspricht einer Wanderungsgeschwindigkeit der Pufferfront von etwa 15 cm/Stunde bis etwa 75 cm/Stunde, vorzugsweise jedoch von etwa 35 cm/Stunde bei einer Frontbreite von 50 cm.The flow rate of the approximately 0.5 mm thick buffer film is between approximately 40 ml / hour and approximately 200 ml / hour, but preferably at about 100 ml / hour. This corresponds to a migration speed the buffer front from about 15 cm / hour to about 75 cm / hour, but preferably from about 35 cm / hour with a front width of 50 cm.

Die Zufließgeschwindigkeit der Substanzlösung kann bis etwa 5 ml/Stunde betragen, liegt jedoch zur besseren Trennung zwischen etwa 1 ml/Stunde bis etwa 2 ml/Stunde.The flow rate of the substance solution can be up to about 5 ml / hour, but is available better separation between about 1 ml / hour to about 2 ml / hour.

Der Verlauf der trägerfreien Ablenkungselektrophorese kann auf verschiedene Weise, vorteilhaft mittels Ultraviolettabsorption, verfolgt werden. Bei letzterer wird bei einer charakteristischen Wellenlänge, z.B. bei 280 ναμ, die Absorption der einzelnen, aus der Ablenkungselektrophorese erhaltenen Fraktionen festgestellt, wobei das Ansteigen und Absinken der UV-Absorption über die erhaltenen Fraktionen hinweg die Lage der einzelnen Protein-, bzw. absorbierenden Begleitkomponenten anzeigt, unter denen die erwünschte hochaktive Proteinfraktion aus ihrer Lage erkannt und isoliert werden kann. Fig. 1 zeigt z.B. ein bei einer Wellenlänge von 280 ΐημ über alle isolierten Fraktionen der Ablenkungselektrophorese aufgenommenes Ultra violettabsorptionsdiagramm; die Abszissenwerte beziehen sich auf die Fraktionen, die Ordinatenwerte auf die UV-Absorption.The course of the carrier-free deflection electrophoresis can be followed in various ways, advantageously by means of ultraviolet absorption. With the latter, the absorption of the individual fractions obtained from the deflection electrophoresis is determined at a characteristic wavelength, e.g. at 280 ναμ, the rise and fall of the UV absorption across the obtained fractions, the position of the individual protein or absorbing accompanying components indicates, among which the desired highly active protein fraction can be recognized from its location and isolated. 1 shows, for example, an ultraviolet absorption diagram recorded at a wavelength of 280 ΐημ over all isolated fractions of the deflection electrophoresis; the abscissa values relate to the fractions, the ordinate values relate to the UV absorption.

Die Zusammensetzung der einzelnen isolierten Fraktionen kann nach den üblichen Methoden, z.B. mittels Acetylcellulosefolien-Elektrophorese, festgestellt werden.The composition of the individual isolated fractions can be determined by the usual methods, e.g. by acetyl cellulose sheet electrophoresis.

Zur Sichtbarmachung der verschiedenen Proteinbanden wird mit Amidoschwarz nach bekannter Vorschrift angefärbt. To make the various protein bands visible, amido black is stained according to known regulations.

So zeigen z.B. die auf Grund der Ultraviolettabsorption der aus der Ablenkungselektrophorese eines bestimmten Proteingemisches erhaltenen Einzelfraktionen Ibis 48 (Fig. 1) vereinigten Sammelfraktionen I bis VIII in der Acetylcellulosefolien-Elektrophorese die in Fig. 2 wiedergegebenen Zusammensetzungen, wobei mit A die Auftragestelle und mit P die Lage der biologisch wirksamen Proteinkomponenten bezeichnet und auf der Ordinate die Extinktion aufgetragen werden; es erweist sich, daß in diesem Beispiel die tumorhemmenden Proteinfraktionen in der Sammelfraktion V, sowie in der Sammelfraktion IV vereinigt sind.Thus, for example, show that due to the ultraviolet absorbance of individual fractions Ibis obtained from the deflection electrophoresis of a particular protein mixture 48 (Fig. 1) combined collecting fractions I to VIII in the Acetylcellulosefolien electrophoresis reproduced in Fig. 2 compositions, with A the Auftragestelle and P the position of the biologically active protein components is designated and the absorbance is plotted on the ordinate; it turns out that in this example the tumor-inhibiting protein fractions are combined in the collection fraction V and in the collection fraction IV.

Die erwünschte tumorhemmende Fraktion kann entweder direkt oder nach zusätzlicher Reinigung verwendet werden. Die erhaltene hochgereinigte Proteinfraktion kann in lyophilisierter Form aufbewahrt werden; sie wird aber zweckmäßig vor der Lyophilisierungsoperation durch Dialyse gegen Wasser von anorganischen Bestandteilen, besonders von Puffersalzen befreit.The desired anti-tumor fraction can either directly or after additional purification be used. The highly purified protein fraction obtained can be stored in lyophilized form will; but it is expedient before the lyophilization operation by dialysis against water from inorganic components, especially free of buffer salts.

example 1

Das im Beispiel 1, Abschnitt 4 der beigischen Patentschrift 646095 mit Nx 1 bezeichnete Dialysenretentat wird mit Hilfe eines 0,03-m. wäßrigen 2-That in Example 1, Section 4 of the accompanying patent specification 646095 with Nx 1 designated dialysis retentate is done with the help of a 0.03-m. aqueous 2-

Amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol-Puffers wie im oben angegebenen Beispiel 1, Abschnitt 5 eingesalzen; die abzentrifugierte Lösung wird durch Hinzufügen der gleichen Pufferlösung auf eine Substanzkonzentration von 1 % gebracht, 20 ml dieser Lösung, enthaltend 0,2 g der Substanz, werden in einer Entfernung von 12,5 cm neben der Kathode dem 0,5 mm dicken, in einer Breite von 50 cm quer zum Spannungsfeld wandernden Pufferfilm der Ablenkungselektrophorese-Trennapparatur [H a η η i η g, Z. Anal. ίο Chem., 181, 244 (1961)] in einer Zuflußrate von 1 ml/Stunde zugefügt. Der Pufferstrom beträgt 80 ml/Stunde, was einer Wanderungsgeschwindigkeit der Pufferfront von etwa 30 cm/Stunde entspricht. Das Spannungsfeld wird konstant bei 1900 Volt gehalten; die Stromstärke bewegt sich um 180 mA. Nach Verbrauch der 20 ml der Substanzlösung kann weiter nachgefüllt und die Trennung beliebig lange fortgesetzt werden.Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol buffer salted in as in Example 1, Section 5 given above; the centrifuged solution is adjusted to a substance concentration by adding the same buffer solution Bred by 1%, 20 ml of this solution, containing 0.2 g of the substance, are at a distance 12.5 cm next to the cathode, the 0.5 mm thick, 50 cm wide across the voltage field migrating buffer film of the deflection electrophoresis separation apparatus [H a η η i η g, Z. Anal. ίο Chem., 181, 244 (1961)] at a flow rate of 1 ml / hour. The buffer current is 80 ml / hour, which corresponds to a migration speed of the buffer front of about 30 cm / hour. The Voltage field is kept constant at 1900 volts; the current is around 180 mA. According to consumption The 20 ml of the substance solution can be refilled and the separation can be continued for as long as desired will.

Die am unteren Ende der Trennapparatur austretende Pufferfront wird in 48 nebeneinanderliegenden Fraktionen aufgefangen, welche auf Grund ihrer Ultraviolettabsorption bei 280 ΐημ (2 Stunden nach Beginn der Elektrophorese, d.h. wenn die Substanz auszulaufen beginnt) laufend zu Sammelfraktionen vereinigt werden (Fig. 1).The buffer front emerging at the lower end of the separating apparatus is located next to one another in 48 Fractions collected, which due to their ultraviolet absorption at 280 ΐημ (2 hours after the beginning electrophoresis, i.e. when the substance begins to leak) continuously to collection fractions are combined (Fig. 1).

Die erhaltenen Fraktionen können z. B. durch Hinzufügen von wäßrigem Ammoniumsulf at bis zu einer Molarität von 3 ausgesalzen und als Niederschlag abzentrifugiert und, wenn erwünscht, verflüssigt, dialysiert und sodann vorsichtig lyophilisiert werden, können aber auch so, wie aus der Ablenkungselektrophorese erhalten, verwendet werden.The fractions obtained can, for. B. by adding aqueous ammonium sulfate up to one Molarity of 3 salted out and centrifuged off as a precipitate and, if desired, liquefied, dialyzed and then carefully lyophilized, but can also be as from deflection electrophoresis obtained, can be used.

Wie aus der Fig. 2 hervorgeht, befindet sich das hochaktiv tumorhemmende Protein in der. aus den Einzelfraktionen 25 bis 30 (Fig. 1) gebildeten Sammelfraktion V mit einem Maximum in Fraktion 27, sowie in der aus den Einzelfraktionen 19 bis 24 (Fig. 1) gebildeten Sammelfraktion IV.As can be seen from FIG. 2, the highly active tumor-inhibiting protein is located in the. from the Individual fractions 25 to 30 (Fig. 1) formed collective fraction V with a maximum in fraction 27, as well as in the collective fraction IV formed from the individual fractions 19 to 24 (Fig. 1).

40 Beispiel 2 40 Example 2

Zum Vergleich wird eine dem Beispiel 1 analoge trägerfreie Ablenkungselektrophorese mit der nach den Verfahren der Beispiele 1 oder 6 der belgischen Patentschrift 646095 erhaltenen, weitgehend gereinigten Proteinfraktion durchgeführt; deren Zusammensetzung wird, jeweils vor ihrem Einsatz im erfindungsgemäßen Verfahren, mit Hilfe der Acetylcellulosefolien-Elektrophorese und entsprechender Anfärbung festgestellt (siehe Fig. 3; A = Auftrag, P = Lage der biologisch aktiven Proteinkomponenten; Ordinate: Extinktion). Die Auftrennung der beiden Ausgangssubstanzen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ergab, daß die Hauptmenge des aktiven „ Proteins in den Fraktionen 25 bis 30 angereichert wird (Fig. 4). Diese Fraktionen 25 bis 30 weisen die in Fig. 5 wiedergegebene Verteilung auf (A — Auftragstelle, P = biologisch wirksame Proteinkomponente). Die Kurve, welche sich hinsichtlich der aktiven Kornponente weitgehend mit Fig. 3 deckt, zeigt, daß in den aus der trägerfreien Ablenkungselektrophorese resultierenden und zusammengenommenen Fraktionen 25 bis 30 in erster Linie die tumorhemmenden Proteinkomponenten angereichert werden.For comparison, a carrier-free deflection electrophoresis analogous to Example 1 is carried out with the largely purified protein fraction obtained by the process of Examples 1 or 6 of Belgian patent specification 646095; their composition is determined, in each case prior to their use in the method according to the invention, with the aid of acetylcellulose film electrophoresis and corresponding staining (see FIG. 3; A = order, P = position of the biologically active protein components; ordinate: extinction). The separation of the two starting substances according to the process according to the invention showed that the main amount of the active "protein" is enriched in fractions 25 to 30 (FIG. 4). These fractions 25 to 30 have the distribution shown in FIG. 5 (A - application site, P = biologically active protein component). The curve, which largely coincides with FIG. 3 with regard to the active components, shows that in the fractions 25 to 30 resulting from the carrier-free deflection electrophoresis and taken together, primarily the tumor-inhibiting protein components are concentrated.

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Beispiel 3
a) Eine Proteinlösung (176 ml) in einer 0,1-m.Example 3
a) A protein solution (176 ml) in a 0.1 m.

wäßrigen Ammoniumsulfatlösung, enthaltend 3 g der Proteinsubstanz Nx 12 (belgische Patentschrift 646095), d.h. eine ungefähr l,7%ige Lösung, wird bei +2° durch einen Block (Durchmesser: 65 mm; Höhe: 120 mm) eines Polydextrangels filtriert; der Block wird durch Einschlämmen des Gels mit einem 0,1-m. Natriumacetatpuffer von pH 5,5 hergestellt. Das Gesamteluat wird unter Rühren in der Kälte mit festem Ammoniumsulfat bis zu einer Molarität von 3, bezogen auf das Ammoniumsulfat, versetzt und während 30 Stunden bei +2° stehengelassen. Die so ausgesalzene Proteinfraktion wird abzentrif ugiert, gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert (vgl. belgische Patentschrift 646095).aqueous ammonium sulfate solution containing 3 g of the protein substance Nx 12 (Belgian patent specification 646095), i.e. an approximately 1.7% solution, is filled with a block at + 2 ° (diameter: 65 mm; Height: 120 mm) of a polydextrangle filtered; the block is made by slurrying the gel with a 0.1-m. Sodium acetate buffer of pH 5.5 produced. The total eluate is stirred in the cold with solid ammonium sulfate to a molarity of 3, based on the ammonium sulfate, added and left to stand for 30 hours at + 2 °. The protein fraction salted out in this way is centrifuged off, dialyzed against water and lyophilized (see Belgian patent 646095).

b) Zu einem vergleichbaren Ausgangsmaterial kann man ebenfalls gelangen, wenn man 20 ml der oben beschriebenen Proteinlösung, enthaltend die Substanz Nx 12, bei +2° gegen 0,05-m. wäßrigen 2-Amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol-Puffer (mit Zitronensäure auf pH 5,5 eingestellt) während 36 Stunden umdialysiert und sodann wie im Beispiel 1 beschrieben, der Ablenkungselektrophorese unterwirft. Dabei wird die Lösung wegen der durch den etwas sauren pH-Wert bewirkten Verschiebung zur Anode in der Mitte zwischen Anode und Kathode aufgetragen; die Zuflußrate beträgt 2 ml/ Stunde; der Pufferstrom 120 ml/Stunde. Das Spannungsfeld wird bei 1500 Volt gehalten, wobei die Stromstärke 240 mA beträgt, und die Temperatur liegt zwischen +5 und +9°. Bei dieser Vorreinigung werden in erster Linie die der Proteinfraktion anhaftenden braungefärbten und stark Ultraviolett-absorbierenden-Begleitstoffe abgetrennt (Fig. 6) und als Fraktionen 1 bis 19 verworfen. Die in den Fraktionen 20 bis 27 angereicherte Proteinfraktion wird zusammengefaßt, dialysiert und lyophilisiert; sie ist mit der nach dem Vorreinigungsverfahren (a) erhältlichen Proteinfraktion vergleichbar. b) A comparable starting material can also be obtained if you add 20 ml of the protein solution described above, containing the substance Nx 12, at + 2 ° against 0.05-m. aqueous 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol buffer (adjusted to pH 5.5 with citric acid) redialyzed for 36 hours and then as described in Example 1, the Subject to deflection electrophoresis. The solution is slightly acidic because of the pH-value caused a shift towards the anode in the middle between anode and cathode applied; the flow rate is 2 ml / hour; the buffer flow 120 ml / hour. The Voltage field is kept at 1500 volts, the current strength is 240 mA, and the The temperature is between +5 and + 9 °. During this pre-cleaning process, the the brown-colored and strongly ultraviolet-absorbing accompanying substances adhering to the protein fraction separated (Fig. 6) and discarded as fractions 1 to 19. Those in the political groups 20 to 27 enriched protein fractions are pooled, dialyzed and lyophilized; it is comparable to the protein fraction obtainable by the pre-purification process (a).

Eine Lösung von 0,04 g der nach (a) oder (b) vorgereinigten Proteinfraktion in 2 ml Kammerpuffer (0,03-m. wäßrige 2-Amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol-Lösung, mit Zitronensäure auf pH 8,6 eingestellt) wird 12,5 cm von der Kathodenseite entfernt, der Ablenkungselektrophorese-Trennapparatur zugeführt; es handelt sich dabei um die von Hanning, loc. cit. beschriebene senkrecht stehende Ausführung der VaP-Apparatur, welche die austretende Pufferfront in 95 nebeneinanderliegende Fraktionen trennt. Der Substanzzufluß beträgt 0,5 ml/Stunde, der Pufferzufluß 80 ml/Stunde; die Spannung wird bei 2400 Volt gehalten, wobei die Stromstärke etwa 110 mA beträgt und die Temperatur konstant +4° ist. Nach durchgeführter Elution werden die UV-Absorptionen der einzelnen Fraktionen bei 280 ιτιμ gemessen und diese an Hand des Ultraviolettabsorptionsdiagramms(Fig. 7)zu8Sammelfraktionen (I bis VIII) vereinigt. Diese-werden anschließend sofort dialysiert und lyophilisiert. Die Auswertung der Acetylcellulosefolien-Elektrophorese dieser Sammelfraktionen zeigt eine weitgehende Auftrennung der Komponenten (Fig. 8), wobei dieA solution of 0.04 g of the protein fraction pre-purified according to (a) or (b) in 2 ml chamber buffer (0.03 m. Aqueous 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol solution, with citric acid adjusted to pH 8.6) is removed 12.5 cm from the cathode side, the deflection electrophoresis separation apparatus fed; it is that of Hanning, loc. cit. described vertical version of the VaP apparatus, which the exiting Buffer front separates into 95 adjacent fractions. The substance inflow is 0.5 ml / hour, the buffer flow 80 ml / hour; the voltage is maintained at 2400 volts, whereby the current is about 110 mA and the temperature is constant + 4 °. After carried out Elution will be the UV absorptions of the individual fractions measured at 280 ιτιμ and this using the ultraviolet absorption diagram (Fig. 7) combined into 8 collection fractions (I to VIII). This will be done immediately afterwards dialyzed and lyophilized. The evaluation of the acetyl cellulose sheet electrophoresis of this Collection fractions shows an extensive separation of the components (FIG. 8), with the

Sammelfraktionen IV (Einzelfraktionen 40 bis 48) und V (Einzelfraktionen 49 bis 56) die hochaktiven tumorhemmenden Proteinfraktionen P, und P₂ enthalten; die Sammelfraktionen I (Einzelfraktionen 1 bis 17), II + III (Einzelfraktio-Collection fractions IV (individual fractions 40 to 48) and V (individual fractions 49 to 56) contain the highly active tumor-inhibiting protein fractions P and P _2; the collective fractions I (individual fractions 1 to 17), II + III (individual fraction

nen 18 bis 39), VI (Einzelfraktionen 57 bis 64), VII (Einzelfraktionen 65 bis 75) und VIII (Einzelfraktionen 76 bis 95) enthalten Ballaststoffe und atypisch toxische Verunreinigungen. nen 18 to 39), VI (individual fractions 57 to 64), VII (individual fractions 65 to 75) and VIII (individual fractions 76 to 95) contain fiber and atypically toxic impurities.

Hierzu 8 Blatt ZeichnungenIn addition 8 sheets of drawings

609 516/469609 516/469

Claims

Patent claims:

1. Process for the production of a highly active, from fiber and atypically toxic impurities freed tumor-inhibiting protein from mistletoe, characterized in that pressed juice from mistletoe or one obtained from it purified protein fraction, which contains fiber and atypical toxic impurities contained, using carrier-free deflection electrophoresis and separates the tumor-inhibiting Protein isolated from the eluate.

2. The method according to claim 1, characterized in that the starting material in an aqueous buffer solution, which the starting material in a concentration of about 0.1% to about 5%, preferably from about 0.5% to about 5%, is used.

3. The method according to claim 2, characterized in that there is a buffer solution with a Concentration in the molar range of about 0.01-m. to about 0.1-m., preferably from about 0.03-m., Used.

4. The method according to any one of claims 2 or 3, characterized in that the buffer solution to a pH of about 4 to about 10.5, preferably from about 6 to 9, adjusts.