DE1642678A1

DE1642678A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Ornithin und gegebenenfalls L-Isoleucin auf biologischem Wege

Info

Publication number: DE1642678A1
Application number: DE19671642678
Authority: DE
Inventors: Noboru Katsuya; Shinji Okumura; Masao Shibuya; Fumihiro Yoshinaga
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1966-02-19
Filing date: 1967-02-17
Publication date: 1971-06-03
Also published as: US3532600A; GB1178005A

Description

MÖNCHEN HAMBURG

telefon: 555476 8000 MÜNCHEN 15, 1 ?. Februar 1967

TELEGRAMME: KARPATENT NUSSBAUMSTRASSE 10

W. 12996/67 7/Pi

Ajinomoto Co., Ine Tokyo (Japan)

Verfahren zur Herstellung von L-Ornithin und gegebenenfalls L-Isoleucin auf biologischem Wege

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Aminosäuren, wie L-Ornithin und L-Isoleucin, auf biologischem Wege. Die genannten Aminosäuren können z.B. in der Forschung auf dem medizinischen Gebiet, auf dem pharmazeutischen Gebiet und als Zusatzstoffe für Lebensmittel Anwendung finden.

Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von L-Ornithin bekannt, z.B. durch auf chemischem oder biologischem Wege erfolgende Hydrolyse von L-Arginin, das durch Extrahieren und Isolieren von natürlichen Proteinen her-

109823/029S

gestellt wird (Journal of Agricultural Chemical Society, Bd. 77, 1260 (1955) D.E. Rivard & H.E. Carter).

Bs ist nun gefunden worden, daß L-Ornithin in verhältnismäßig hohen Konzentrationen durch gewisse auxotrophe Mutantenstämme von Arthrobacter citreus, die ein Citrullin oder ein Arginin für das Wachstum "benötigen, eraeugt werden kann« Wenn solche Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in Citrullin oder Arginin enthaltendem ITährmedium gezüchtet werden, das sonst in üblicher Weise ausgebildet ist, kann L-Ornithin in dem Medium durch Gärung (fermentation) in hoher Konzentration, wie z.B. 3 bis 4 g/dl gewonnen werden.

Es ist ferner gefunden worden, daß L-Isoleucin zusammen mit L-Ornithin erzeugt werden kann, indem man die gleichen auxotrophen Mutantenstämme in einem Medium züchtet, das oc -Aminobuttersäure enthält, wobei die bevorzugte Konzentration 0,5 bis 3 g/dloc.-Aminobutt er säure im Medium beträgt.

Demgemäß wird bei dem Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung von Aminosäuren, wie L-Ornithin und gegebenenfalls L-Isoleucin, ein Citrullin oder ein Arginin benötigender auxotropher Mutantenstamm von Arthrobacter citreus in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Be-

109823/0295

dingungen gezüchtet, wobei das Medium eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle, einen organischen Nährstoff, essentielle anorganische Ionen und Citrullin oder Arginin sowie gegebenenfalls°C-Aminobuttersäure enthält.

Obwohl möglicherweise die bei dem Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzten Mutantenstämme von Arthrobacter citreus in der Natur gefunden werden können, werden sie zweckmäßig durch Wahl von Mikroorganismen erhalten, deren vegetative Zellen oder Sporen ultraviolettem Licht, Eöntgen strahlen, Gammstrahlen oder ähnlicher elektromagnetischer Strahlung ausgesetzt waren. Die Mutantenstämme von Arthrobacter citreus, die bei dem Verfahren gemäß der Erfindung brauchbar sind, werden auch gefunden, wenn die Elternstämme des Mikroorganismus in Berührung mit einer Lösung von Natriumnitrit gebracht werden. Andere bekannte, eine Mutation herbeiführende Behandlungen, sind ebenfalls geeignet. Ein repräsentativer Elternstamm zum Erhalten der Mutanten ist Arthrobacter citreus 23-2A (ATGC Nr. 17775), der nicht die Fähigkeit zur Erzeugung von L-Glutaminsäure in einem Medium hat, jedoch die Fähigkeit aufweist, L-Isoieucin in einem^-Aminobuttersäure enthaltenden Medium zu erzeugen. (Diese Fähigkeit zur Erzeugung von L-Isoleucin

1 0 9 8 2 3 / Π ? 9 5

ist neu und wurde von den Erfindern gefunden).

Die Mutantenstamme von Arthrobacter citreus, die L-Ornitliin durch Gärung erzeugen, sind dadurch gekennzeichnet, daß sie Citrullin oder Arginin erfordern, und diese Mutantenstämme haben die Fähigkeit, !-Isoleucin in einem Medium, das=£-Aminobuttersäure enthält, zu erzeugen und anzusammeln, wobei diese Fähigkeit von den entsprechenden Eigenschaften der Elternstämme abgeleitet wird. Das Kulturmedium, das zur Erzeugung von L-Ornithin gemäß dem Verfahren nach der Erfindung verwendet wird, kann in anderer Hinsicht ein ganz übliches sein. Das Kulturmedium muß eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und die üblichen Nährstoffe von geringerer Menge enthalten. Geeignete Kohlenstoffquellen sind z»B. Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Rohrzucker (Sucrose), Xylose, Stärkehydrolysat, Melassen und organische Säuren. Die Konzentration der Kohlenstoffquellen in dem Medium soll zweckmäßig auf 5 bis 15$ in Glucoseäquivalenten eingestellt werden.

Stickstoffquellen werden als Nährstoffe zur Vermehrung der Mikroorganismen und als Quellen für Aminogruppen zur Erzeugung von L-Ornithin verwendet. Der der Brühe zugesetzte Stickstoff wird auch zum Regeln des pH-Wertes benutzt.

10982 3/n?95

BAD ORIGINAL

1542678

Stickstoff kann durch Ammoniumsalze von anorganischen oder organischen Säuren und durch Ammoniak in wäßriger Lösung oder in gasförmigem Zustand geliefert werden.

Ergänzende anorganische Nährmittel sind z.B. die essentiellen anorganischen Ionen, die aus Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Ferrosulfat, natriumchlorid und -carbonat zur Verfügung stehen. Or- Λ

ganische wachstrumsfördernde Mittel, welche die Ausbeute und die Geschwindigkeit der Erzeugung von L-Ornithin verbessern, sind z.B. Vitamine und Fettsäuren. Sie können dem Kulturmedium in Form von Substanzen zugesetzt werden, welche den Wirkstoff unter den Gärungs- oder Fermentationsbedingungen ergeben, wie Peptone, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenproteinhydrolysat und verschiedene andere Extrakte von pflanzlichen und tierischen Geweben, wie sie an sich bekannt sind₀

Citrullin oder Arginin soll in dem Kulturmedium vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 10 bis 100 mg/dl vorhanden sein. Bei niedrigeren Konzentrationen sind die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen und das Ausmaß sowie die Geschwindigkeit der L-Ornithinerseugung.sehr gering. Bei höheren Konzentrationen geht das Wachstum der Mikroorganismen gewöhnlich rasch τογ 3ich, aber die Ge-

^109823/0295 ßAD ORIG.NAL·

Jb42B78

schwindigkeit der L-Ornithinerzeugung wird herabgesetzt_Q Wenn das Wachstum der Mikroorganismen durch bekannte Modifikationen der Gärungsbedingungen zurückgehalten oder gedämpft wird, kann eine angemessene Ausbeute an L-Ornithin bei Citrullin- oder Argininkonzentrationen erhalten werden, die oberhalb des angegebenen bevorzugten Bereichs liegen.

Um L-Isoleucin zusammen mit L-Ornithin in der Brühe zu erzeugen und anzusammeln, ist es notwendig,cv-Aminobuttersäure dem Medium zuzusetzen. Die Konzentration der ^-Aminobuttersäure in den Medien soll in einem Bereich von etwa 0,5 bis 3'}6, bezogen auf das Medium, gehalten werden, um gute Ausbeuten an L-Ornithin und L-Isoleucin zu erhalten. Die ganze Menge von oc-Aminobuttersäure kann zu Beginn der Gärung zu einem Medium zugegeben werden, oder sie kann während der Gärung in 'Teilmengen zugeführt \tferden.

Zur Erzielung einer guten Ausbeute an L-Ornithin soll die Gärung (!Fermentation) unter aeroben Bedingungen mittels Belüften und Rühren ausgeführt v/erden, um genügende Mengen von Sauerstoff der Brühe zuzuführen* Beste Ausbeuten an L—Ornithin mit einer hohen Geschwindigkeit können nur erhalten werdn, wenn die Wasserstoffionenkonaentration in dem Kulturmedium geregelt wird. Vorzugsweise v/ird mit Kulturmedien gearbeitet, deren pH-Wert zwischen 6 und 8 liegt. Es können wäßriges Ammoniak, 0 alcinoic ar bonat oder Alkali-

109823/0295

BAD ORiGiRAL

hydroxy de dem Hährmedium von Zeit zu Zeit zugegeben wer den, je nachdem wie dies zur Aufrechterhaltung des gewünschten pH-Wert-Bereichs erforderlich ist. Zur Erzielung bester Ergebnisse soll die Temperatur des Mediums während der Gärung zwischen 25 und 37⁰O gehalten werden« Die Gärung wird gewöhnlich während einer Zeit von weniger als 80 Stunden ausgeführt.

Die Gewinnung von !-Ornithin und !-Isoleucin aus den Nährmedien kann nach bekannten Methoden erfolgen. Die Bakterienzellen können durch Filtrieren oder durch Zentrifugieren entfernt werden, und !-Ornithin kann dann aus der Flüssigkeit bei einem pH-Wert von 3,5 von Ionenaustauschharz en absorbiert und von Begleitstoffen durch selektives Eluieren getrennt werden. Auch !-Isoleucin kann aus der Brühe durch Verwendung von Ionenaustauschharzen isoliert werden.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand von Beispielen näher erläutert. .

Beispiel 1

Es wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, das 10$ Süßkartoffelstärkeliydrolysat (Glucoseäquivalent), •0,1$ KH₂PO₄, 0,04-fo MgSO₄.7H₂O, 2 Teile je Million (2 ppm) Fe⁺⁺, 2 Teile je Million (2 ppm) Mangan"¹"¹", 3 ml/dl Soja-

1098? 3 / η ? 9 5

BAD OBlGlNAL

I b 4 2 B 7 8

bohnenproteinhydrolysat, 500^/1" Thiaininhydrochlorid und 3?s Ammoniumsulfat enthält. Der pH-Wert des Mediums wurde mit wäßrigem Ammoniak auf 7 eingestellt. Mengen der Lösung von 20 ml wurden in 500 ml-Schüttelkolben eingebracht
und in den Kolben bei 110⁰C 5 Minuten durch Dampf sterilisiert. Dann wurden sie mit Arthrobacter citreus
23-2Α·Χ-10 geimpft, der zuvor auf Hefe-Pepton-Agar-Schrägen gezüchtet worden war, worauf 1 g Calciumcarbonat zu dem Medium zugegeben und die Gärung bei 31 C unter Schütteln während 72 Stunden ausgeführt wurde. Es wurden 3,52 g
L-Ornithin/dl in dem Medium nach 72stündigem Züchten gefunden.

Die Mikrobenzellen und die Calciumsalze wurden aus 1 1 des Mediums durch Filtrieren entfernt und die Lösung wurde mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Die so bereitete Lösung wurde über eine Säule, die mit Kationenaustauschharz des Ammoniumtyps gefüllt war, geführt. Die Säule mit dem absorbierten L-Ornithin wurde mit Wasser gewaschen, und dann wurde das L-ürnithin aus der Säule mit 2n-Ammoniumhydroxydlösung eluiert. Das Eluat wurde auf 200 ml konzentriert und nach Einstellung des pH-Werts mit konzentrierter Salzsäure auf 5,3 weiter auf 100 ml eingeengt.

109R23/0295

BAD ORIGINAL

Aus der Lösung wurden Kristalle des rohen L-OmIthins durch Anwendung der Kühlmethode gefällt. 28,1 g (Trockengewicht) an rohem kristallinen L-Ornithin wurden aus 1 1 des Mediums erhalten. Die Reinheit des so hergestellten L-Ornithinchlorids betrug 87,8$.

Beispiel 2

Ss wurde das gleiche wäßrige Kulturmedium, das in Beispiel 1 verwendet wurde, jedoch ohne Ammoniumsulfat, hergestellt. Eine Menge von 250 ml Lösung wurde in ein 1 Liter-G-ärgefäß (lermentor) eingebracht und in dem Gefäß bei 11Q⁰C während 5 Minuten durch Dampf sterilisiert. Die Lösung wurde dann mit Arthrobacter citreus 23-2A°X-4 (ATCO Ur. 21040) geimpft, der zuvor auf einer Hefe-Pepton-Agar-Schräge gezüchtet worden war, worauf Ammoniak in gasförmigem Zustand von Zeit zu Zeit zugeführt wurde, um den pH-Wert der Brühe auf etwa 7 einzustellen und die Stickstoffquelle dem Medium zuzuführen. Die Gärung wurde bei 31⁰C 60 Stunden unter Schütteln ausgeführt. 4,05 g/dl L-Ornithin wurden in dem Medium gefunden,

Beispiel 3

Es wurde ein wäßriges Kulturmedium hergestellt, das 10$ Süßkartoffelstärkehydrolysat (Gluooseäquivalent), 0,1$

109823/0295

- ίο -

KH₂PO., 0,04$ MgSO-· 7H₂O, 2 Teile je Million (2 ppm) Fe⁺⁴", 2 Teile je Million (2 ppm) Mangan"¹"**, 3 ml/dl Sojabohnenpro te inhydroly sat, 500 Äg/l Thiaminhydro Chlorid, tyfo AmiuoniuBisulfat und 1 ,O$wt--Aminobutt er säure enthielt. Der pH-Wert Wurde mit wäßrigem Ammoniak auf 7 eingestellt. Es wurden 20 ml-Mengen der lösung in einem 500 ml-Schüttelkolben eingebracht und durch Dampf in dem Kolben bei 110 C während 5 Minuten sterilisiert. Das Medium wurde dann mit Arthrobacter citreus 23-2Α·Χ-4 (ATGG Fr.21040) geimpft, der zuvor auf eine Hefe-Pepton-Agar-Schräge gezüchtet worden war, worauf 1 g Calciumcarbonat zu dem Medium zugegeben und die G-ärung bei 31°C während 72 Stunden unter Schütteln ausgeführt wurde. Es wurden 3,05 g/dl !-Ornithin und 0,93 g/dl L-Isoleucin in der fermentierten Brühe gefunden.

Die Mikrobenzel-len und Oalciumsalze wurden aus 1 1 des Mediums durch Filtrieren entfernt, und der pH-Wert der Lösung wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Die so bereitete Lösung wurde über eine mit einem Kationenaustauschharz des Ammoniumtyps gefüllte Säule geführt. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, und dann wurde das von dem Harz absorbierte L-Ornithin aus der Säule mit 2n-Ammoniumhydroxydlösung eluiert. Das Eluat wurde konzentriert, und Kristalle von rohera L-Ornithin wurden aus

109823/0295

BAD ORIGINAL

der Lösung durch die Kühlmethode, wie in Beispiel 1 geschildert, gefällt. 20,3 g (Trockengewicht) an rohem kristallinem L-Ornithin wurden aus 1 1 des Mediums erhalten (die Reinheit "betrug 92,5$).

Der pH-Wert der ausfließenden Lösung, die frei von L-Ornithin war, wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 1,5 eingestellt, und dann wurde die Lösung über eine Säule geführt, die mit einem Kationenaustauschharz des Ammoniumtyps gefüllt war. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, und dann wurde das von dem Harz absorbierte L-Isoleucin aus der Säule mit 2n-Ammoniumhydroxydlösung eluierto Das Eluat wurde konzentriert, und es wurden Kristalle des rohen L-Isoleucins aus der Lösung gefällt. 5,9 g (Trockengewicht) von rohem kristallinem L-Isoleucin wurden aus 1 1 des Mediums erhalten (die Reinheit betrug 78,5?°).

109823/n?95

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von L-Ornithin und gegebenenfalls L-Isoleucin auf biologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen Citrullin oder Arginin benötigenden auxotrophen Mutantenstamm von Arthrobacter citreus verwendet, der unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet wird, das eine assimilierbare Kohlenetoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle, einen organischen Nährstoff, essentielle anorganische Ionen und von dem Mutantenstamm benötigtes Citrullin oder Arginin und gegebenenfallsct-Aminobuttersäure enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, d'aß man ein Nährmedium verwendet, dem das Citrullin oder Arginin in einer Menge von etwa 10 bis 100 mg/dl, bezogen auf das Medium, zugesetzt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nahrmedium verwendet, dem dieqc-Aminobuttersäure in einer Menge von etwa 0,5 bis 3 #, bezogen auf das Medium, zugesetzt ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch "gekennzeichnet, daß man als Mutantenstamm von Arthrobacter citreus den Stamm 23-2Α·Χ-10 oder 23-2A-X-4 verwendet.

109823/0295