DE1518314C3

DE1518314C3 - Verfahren zur Isolierung von Bacitracin

Info

Publication number: DE1518314C3
Application number: DE1518314A
Authority: DE
Inventors: Vladimir Kalina; Artur Masita; Stanislav Ulbert
Original assignee: SPOFA SDRUZENI PODNIKU PRO ZDRAVOTNICKOU VYROBU PRAG
Current assignee: SPOFA SDRUZENI PODNIKU PRO ZDRAVOTNICKOU VYROBU PRAG
Priority date: 1964-06-26
Filing date: 1965-06-24
Publication date: 1975-01-09
Also published as: CH476838A; NO122475B; NL150511B; DE1518314B2; US3384631A; FI43718B; AT257047B; DK116271B; DE1518314A1; BR6570770D0; NL6508299A; GB1103667A; SE344165B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Bacitracin aus rohen wäßrigen Lösungen, bei dem man eine schwerlösliche Bacitracin enthaltende Komplexverbindung bildet, diese abtrennt, dann löst und anschließend Bacitracin mit Hilfe von Ionenaustauschern isoliert.

Man erzeugt das Antibiotikum Bacitracin durch Kultivierung von Nährmedien mit verschiedenen Mikroorganismen, insbesondere mit dem Stamm Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis. Die Isolierung erfolgt z. B. durch Extraktion mit höheren Alkoholen (USA.-Patentschrift 2 609 324) oder durch Adsorption an Ionenaustauscherharzen (USA.-Patentschrift 776 240, britische Patentschrift 837 302). Es sind auch Fällungsmethoden beschrieben worden, welche sich der Bildung von wasserunlöslichen oder schwerlöslichen Bacitracinkomplexen bedienen. Zum Beispiel ist die Bildung eines Bacitracinsalzes mit Polargelb 5 G und mit Ammoniummolybdat in USA.-Patentschriften 556 375 und 2 556 376 bzw. 2 763 590 erwähnt sowie die Bildung eines Komplexes mit der Methylendisalicylsäure in der USA.-Patentschrift 2 774 712 und mit Metallen, z. B. Zink, in der USA.-Patentschrift 834 711. Das erstgenannte Isolierverfahren ist verhältnismäßig kostspielig, die Adsorptionsverfahren liefern niedrige Ausbeuten. Die Fällungsmethoden lassen sich nur dann anwenden, wenn konzentriertere Bacitracinlösungen vorliegen. Dazu ist das vorhergehende Einengen des fermentierten Nährmediums erforderlich, was mit Rücksicht auf die Empfindlichkeit des Bacitracins eine heikle mit problematischen Ergebnissen verbundene Operation darstellt.

Die genannten Schwierigkeiten werden durch das Verfahren der Erfindung zur Isolierung von Bacitracin beseitigt, weil man dieses bereits auf rohe wäßrige Lösungen, insbesondere aus fermentierten! Nährmedium, nach der Kultivierung mit einem Bacitracin produzierenden Mikroorganismus anwenden kann und hierbei sehr hohe Ausbeuten an Bacitracin erzielt.

Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß man als unlösliche Komplexverbindung eine Verbindung der allgemeinen Formel I

(R-SO₃H)₄„(Me)„(Bacitracin)„

verwendet, worin R einen Alkyl- oder Alkenylrest mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen oder einen Arylrest, der im Kern mindestens einen Alkylrest mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen enthält, bedeutet, wobei der Rest R mit der SO₃H-Gruppe direkt oder mittels einer Sauerstoff brücke —O— verknüpft ist, und worin Me für ein Atom eines komplexbildenden Metalls (Zink, Kobalt, Mangan oder Kupfer) steht, in dem man Verbindungen der allgemeinen Formel II

R-SO₃H

worin R dasselbe wie in Formel I bedeutet, oder ihre löslichen Salze in Gegenwart eines löslichen Salzes des komplexbildenden Metalls in einer sauer reagierenden Lösung einwirken läßt, und daß man den ausgeschiedenen abgetrennten Niederschlag der Komplexverbindung in einem Alkanol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bei einem pH-Wert von 4 bis 9 löst.

Bei der Isolierung kann man so vorgehen, daß man aus der Bacitracin enthaltenden Komplexverbindung der allgemeinen Formel I nach Lösen in einem Alkanol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bei einem pH-Wert von 4 bis 9, das RSO₃~-Anion durch Einwirkung eines starken anionischen Austauscherharzes in Säureform, vorteilhaft in CH₃COO-Form, entfernt, worauf man die erhaltene Lösung einengt und durch Zusatz eines

.. löslichen zur Ausscheidung der Komplexverbindung der allgemeinen Formel I benutzten Metallsalzes den Metallkomplex des Bacitracins ausfällt, den man abtrennt, beispielsweise durch Abschleudern oder Filtrieren.
Man kann dann weiter so vorgehen, daß man die alkoholische Bacitracin enthaltende Lösung nach Entfernung des RSO₃"-Anions durch Einwirkung eines stark vernetzten Kationen-Austauscherharzes in H-Form von Kationen befreit, die erhaltene Lösung neutralisiert, vorteilhaft durch Einwirkung eines schwachen anionischen Austauscherharzes in OH-Form, worauf man aus der auf dieser Weise behandelten Lösung das reine Bacitracin isoliert, beispielsweise durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Butanol und durch Abdampfen des Extraktes.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zur Überführung des Bacitracins in die unlösliche Verbindung der allgemeinen Formel I Verbindungen der allgemeinen Formel II verwendet.

Im wesentlichen handelt es sich um leicht zugängliche Netzmittel vom Alkylarylsulfonat- bzw. Alkylsulfat-Typ. Man kann bereits Verbindungen, in welchen die R-Gruppe mindestens 4 Kohlenstoffatome enthält,

benutzen, mit steigender Zahl der Kohlenstoffatome in dieser Gruppe sinkt die Löslichkeit der Komplexverbindung im vorliegenden Medium.

Von komplexbildenden Metallen Me kommen vor allem diejenigen in Frage, welche technisch anwendbare Komplexe liefern, beispielsweise Zink, Kobalt, Kupfer, Mangan, Nickel. Diese Komplexe dienen dann entweder zur Herstellung von Arzneimittelformen oder zur Gewinnung von reinem Bacitracin oder zur Zubereitung von Tierfutterzusätzen. Zu diesem Zwecke kann man die rohe fermentierte Maische mit Biomasse verarbeiten.

Die Ausfällung des Bacitracins aus einer sauren wäßrigen, sogar sehr verdünnten Lösung ist außerordentlich selektiv. Der entstandene Komplex ist in saurem Medium sehr stabil und fast unlöslich. Leichtlöslich ist er in gewöhnlichen Alkoholen bei pH 4 bis 9, wobei seine Zersetzung eintritt. Dies kann vorteilhaft bei der Aufarbeitung in die erwünschte Form des Bacitracins ausgenutzt werden.

Das RSO₃~-Anion kann man bei schwach alkalischer Reaktion aus einem wäßrigen oder alkoholischen Medium mit Hilfe eines schwachen anionischen porösen Austauscherharzes entfernen oder aus einem wäßrigen Medium mit einer äquivalenten Menge eines kationaktiven Netzmittels ausfällen. Den erhaltenen Niederschlag kann man mit nichtpolaren Lösungsmitteln extrahieren. Die wäßrige Bacitracinlösung, frei von der komplexbildenden Komponente, läßt sich mit Hilfe eines stark vernetzten, sulfonierten Kationenaustauscherharzes demineralisieren und die gewonnene Lösung nach Entfärben mit Aktivkohle mit Hilfe eines schwach anionischen Austauscherharzes neutralisieren.

Es ist auch möglich, zuerst das komplexbildende Metall zu beseitigen und danach bei sauerer Reaktion die RSO₃-Komponente zu extrahieren. Die auf diese Weise gewonnenen Bacitracinlösungen kann man entweder direkt oder nach vorheriger Reinigung des Bacitracins, ζ. B. durch Extraktion mit Butanol, lyophilisieren. Aus der Bacitracinlösung nach Entfernung des RSOg-Anions kann man auch unlösliche Salze, z. B. Zink-Bacitracin, Mangan-Bacitracin usw. ausfällen.

Im Bedarfsfalle ist es zweckmäßig, die ausgeschiedene Bacitracinkomplexverbindung unter Zugabe eines Filtrierhilfsmittels abzufiltrieren und das vorliegende Produkt im Vakuum zu trocknen. In dieser Form kann es zur Zubereitung von Tierfutterzusätzen dienen, gegebenenfalls unter Zusatz von weiteren Stoffen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von Bacitracin stellt im Vergleich mit bekannten Methoden eine bedeutende Ökonomisierung der industriellen Fabrikation des Bacitracins mit einer Reihe von möglichen Variationen dar.

Beispiele

1. 1300 ml einer rohen saueren Bacitracinlösung, z. B. fermentiertes Nährmedium, wird nach Ansäuren mit Schwefelsäure auf pH 2,3 von der Biomasse befreit, und zwar durch Filtrieren unter Zugabe von Kieselgur. Das Filtrat, mit Bacitracingehalt 122 Einheiten pro Millimeter, wird mit 1,5 g Zinksulfat in Form einer gesättigten wäßrigen Lösung und mit 50 ml einer 10%igen wäßrigen Lösung von Diisobutylnaphthalinsulfosäurenatriumsalz versetzt. Nach Ausscheiden des Niederschlages wird 10 g Kieselgur zugesetzt, filtriert und der Filterkuchen einigemal mit Wasser gewaschen.

Nach gründlichem Absaugen wird das erhaltene Produkt im Vakuum bei 50⁰C getrocknet. Die Komplexverbindung des Bacitracins wird in einer Ausbeute von 16 g gewonnen, das sind 91 %, bezogen auf den Wirkstoffgehalt in der rohen Ausgangslösung. Biologische Aktivität 9 Einheiten pro Milligramm.

2. 1300 ml einer Bacitracinlösung (nach Behandlung wie im Beispiel 1) wird mit 1,5 g Mangansulfat in Form einer gesättigten wäßrigen Lösung und mit 50 ml

ίο einer 10%igen wäßrigen Suspension des Gemisches von Cetylsulfosäure- und Oleylsulfosäurenatriumsalz versetzt. Nach Ausscheiden des Niederschlages wird 10 g Kieselgur zugesetzt, und die weitere Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel 1. Die Ausbeute der Komplexverbindung des Bacitracins beträgt 13,8 g, das sind 87%, bezoten auf den Wirkstoffgehalt in der rohen Ausgangslösung. Biologische Aktivität 10 Einheiten pro Milligramm.

3. 1300 ml einer Bacitracinlösung (nach Behandlung wie im Beispiel 1) wird mit 1,5 g Kobaltsulfat in Form einer gesättigten wäßrigen Lösung und mit 50 ml einer 10%igen wäßrigen Lösung eines Gemisches von Natriumsalzen sulfonierter Alkohole C₈ bis C₁₆ versetzt. Nach Ausscheiden des Niederschlages und Zusatz von 10 g Kieselgur erfolgt die Aufarbeitung wie im Beispiel 1. Die Ausbeute der Komplexverbindung des Bacitracins beträgt 17,7 g, das sind 89,3%, bezogen auf den Wirkstoffgehalt in der rohen Ausgangslösung. Biologische Aktivität 8 Einheiten pro Milligramm.

4.1300 ml einer Bacitracinlösung (nach Behandlung wie im Beispiel 1) wird mit 1,5 g Zinksulfat in Form einer gesättigten wäßrigen Lösung und mit 50 ml einer 10%igen wäßrigen Lösung von technischem Dodecylbenzolsulfosäurenatriumsalz versetzt. Nach Ausscheiden des Niederschlages und Zusatz von 10 g Kieselgur erfolgt die Aufarbeitung wie im Beispiel 1. Die Ausbeute der Komplexverbindung des Bacitracins beträgt 16,2 g, das sind 90 %, bezogen auf den Wirkstoff gehalt in der rohen Ausgangslösung. Biologische Aktivität 9 Einheiten pro Milligramm.

5. Der frisch abgesaugte Niederschlag der Komplexverbindung aus Beispiel 1 wird in möglichst wenig Methanol gelöst. Die Lösung wird in zwei gleiche Teile geteilt. Den ersten Teil leitet man nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 langsam über eine Säule eines stark anionischen Austauscherharzes (z. B. Zerolit®FF) in CH₃COO-Form. Das von der anionaktiven Komponente befreite Effluent wird auf ein kleines Volumen eingeengt und nach Ansäuern mit Aktivkohle filtriert.

Nach Neutralisierung wird das Filtrat mit Zinksulfat versetzt und der ausgeschiedene Niederschlag abgeschleudert. Die zurückbleibende Suspension wird durch Gefiertrocknung getrocknet. Man erhält 1,0 g Zink-Bacitracin mit einer biologischen Aktivität von 55 Einheiten pro Milligramm. Ausbeute 69,3 %.

Der zweite Teil der methanolischen Lösung wird über eine Säule eines stark vernetzten sulfonierten Kationen-Austauscherharzes in Η-Form geleitet und nachher an einer Säule, welche mit einem schwach anionischen Austauscherharz in OH-Form gefüllt wurde, neutralisiert. Die gewonnene Lösung extrahiert man 2mal mit Butanol im Volumenverhältnis 2:1. Den abgetrennten alkoholischen Extrakt engt man nach Zugabe von wenig Wasser im Vakuum ein, und das Konzentrat trocknet man durch Gefriertrocknung. Man erhält reines Bacitracin in einer Ausbeute von 0,55 g, Aktivität 87 Einheiten pro Milligramm.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Isolierung von Bacitracin aus rohen wäßrigen Lösungen, bei dem man eine schwerlösliche Bacitracin enthaltende Komplexverbindung bildet, diese abtrennt, dann löst und anschließend Bacitracin mit Hilfe von Ionenaustauschern isoliert, dadurch gekennzeichnet, daß man als unlösliche Komplexverbindung eine Verbindung der allgemeinen Formel I

(R-SO₃H) ₄„(Me)„(Bacitracin)„

verwendet, worin R einen Alkyl- oder Alkenylrest mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen oder einen Arylrest, der im Kern mindestens einen Alkylrest mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen enthält, bedeutet, wobei der Rest R mit der SO₃H-Gruppe direkt oder mittels einer Sauerstoff brücke — O— verknüpft ist, und worin Me für ein Atom eines komplexbildenden Metalls steht, in dem man Verbindungen der allgemeinen Formel II

R - SO₃H

worin R dasselbe wie in Formel I bedeutet, oder ihre löslichen Salze in Gegenwart eines löslichen Salzes des komplexbildenden Metalls in einer sauer reagierenden Lösung einwirken läßt und daß man den ausgeschiedenen abgetrennten Niederschlag der Komplexverbindung in einem Alkanol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bei einem pH-Wert von 4 bis 9 löst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung eines starken anionischen Austauscherharzes in Säureform für die Entfernung des RSO₃"-Anions nach dem Lösen des Komplexes.