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DE1598149A1 - Verfahren zum Bakteriennachweis - Google Patents

Verfahren zum Bakteriennachweis

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Publication number
DE1598149A1
DE1598149A1 DE19661598149 DE1598149A DE1598149A1 DE 1598149 A1 DE1598149 A1 DE 1598149A1 DE 19661598149 DE19661598149 DE 19661598149 DE 1598149 A DE1598149 A DE 1598149A DE 1598149 A1 DE1598149 A1 DE 1598149A1
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DE
Germany
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violet
hours
urine
bacteria
nutrient medium
Prior art date
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Pending
Application number
DE19661598149
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English (en)
Inventor
Dietrich Dr Rer Nat Krueger
Felix-Helmut Dr Rer Na Schmidt
Harald Dr Med Stork
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
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Filing date
Publication date
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Description

CF. Boehringer & Soehne
GnbH Kannheil
1598U9
1384 b
Verfahren zum Bakteriennachweis
Zusatz zur Fatentanaeldung Aktenzeichen B 86.402 IX b/42 1 und zur Patentaneeldung Aktenzeichen B 88.8I5 IX b/42 1
Gegenstand der Patentanmeldung B 86.402 IX b/42 1 ist ein Verfahren zuiD Nachweis von Bakterien, vorzugsweise in Urin, durch eine Farbreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß man das zu untersuchende Medium mit einem flüssigen oder festen Nährboden und einer nicht wachstumhemmenden Menge einer Verbindung der Formel I,
O0N
-U-
in der X Sauerstoff, Schwefel oder ein alkyliertes Stickstoffatom bedeutet und R die folgenden Reste darstellt,
-CH
-CU
a)
b)
ORlGiNAL
-CH-CH-CHo
OR, OR. 5 4
-CH-CH
d)
C6H5
e)
In denen R, eine gesättigte oder ungesättigte Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Acyl-, Hydroxy- oder Acyloxyalkylgruppe, R. Wasserstoff oder niedere Alkylgruppe, R, und R. Wasserstoff oder zusammen eine Isopropylidengruppe
bedeuten und η die Zahl 2 oder 3 iet, zusammenbringt und naoh 1 bis 18 Stunden Bebrütungszeit bei 20-37° C die Farbveränderung auswertet.
Gegenstand der Zusatzanmeldung B 88.815 IX b/42 1 ist ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien, vorzugsweise in Urin, durch eine Farbreaktion, dadurch gekennzeichnet, daß man das zu untersuchende Medium mit einem flüssigen oder festen Nährboden bebrütet, mit einer nicht waohatumhemmenden Menge einer Verbindung der Formel I zusammenbringt und naoh 5 Minuten bis 2 Stunden Bebrütung·zeit bei 20-37° C die Farbvtriinderung auswertet.
109814/0340
ÖAD ORiQfNAt.
In Ausgestaltung des Verfahrene des Hauptpatente und des Zusatzpatente wurde nun gefunden, daß sich die für die Praxis benötigten Bebrütungezeiten nochmals wesentlich verkürze» lassen und eine schärfere Abgrenzung der Keiasahlbereiche "noraal1* b*w. "asyaptofflatieoh/aignifikant" erreichen läßt, wenn »an die zu watereuchende Probe, wie beispielsweise eine keimhaltige Kährbouillon oder einen mit Nährsubstanz versetzten keimhaltigen Urin;zusätzlich »it Coenzyoen, sowie gewünschtenfalls Sulfhydrylgruppen-haltigen Substanzen und enzymaktivierenden Schwermetallionen versetzt.
Als Coenzyme koaeen licotinadenin-nucleotid (»AD) und Nicotinadenia-nucleotid-phosphat (lADP) bzw. deren Reduktionsprodukte in Frage. Als Sulfhydrylgruppen-haltige Substanzen werden bevorzugt Cystein, re- f duziertes Gluthathion, Cysteamin . oder B-Mercaptoäthanol eingesetzt. Anstelle der Substanzen Bit freien Sulfhydrylgruppen können auch die entsprechendendehydrierten DiSulfidverbindungen eingesetzt werden. Enzymaktivierende Sohweraetallionen liefern insbesondere Salze des Mangans und Kupfers. .
Die erfindungsgemäßen Zusätze beschleunigen die Verfärbung sowohl bei der Arbeitsweise geinäß Anmeldung B 66.402 IX b/42 1 als auch gemäß Anmeldung B 88.515 IX b/42 1, daß heißt sowohl bei ursprünglicher Anwesenheit als auch bei Vorbebrütung und nachträglicher Zugabe der Verbindungen I. Ba der Zeitfaktor für die praktische Anwendung des erfindungsmäßigen Verfahrens eine entscheidende Rolle spielt, wird ' | man vorzugsweise die Arbeitsweise der Zusatzanaeldung durch die erfindungsgemäßen Zusätze nooheals beschleunigen und verbessern.
Gute Effekte lassen bereits durch den Zusatz der Coenzyme allein bewirken; jedoch werden optimale Ergebnisse erhalten, wenn zusätzlich noch Sulfhydrylgruppen-haltige Substanzen und Schweraetallionen, vorzugsweise Mangan-(H)-salze, anwesend sind.
So läßt sich beispielsweise eohon naoh 1 bis 2 Stunden Vorbebrütungszeit bei 37°C, Zusatz der nicht wachstumhemeenden Menge der Substanz I und einer JO-minütigen Ha0 hbebrütung bei 37° eine höhe Keimztfal deutlich
1098U/O34O ^ ~4~
BAD ORIGINAL
erkennen. Durch «ine Nachbebrütung von weiteren 1 bis 2 Stunden lassen sich kleinere, aber für die Praxis ebenfalls interessante Keimzahlen bis su 100.000 Keinen/ml Harn identifizieren.
Zur Durchführung des erfindungsgenäßen Verfahrens wird prinzipiell an der Arbeitsweise der Hauptanmeldung und der Zusatzanmeldung festgehalten. Besonders bewährt haben sich weiterhin Gelatine-Steckkapseln, die bereits alle Bestandteile der Nährbouillon und die erfindungsgemäßen Zusätze enthalten. Der Kapselinhalt, der für je eine Urinuntersuchung ausreicht, wird in die Urinprobe geschüttet. Nach der Vorbebrütungs-· zeit werden die Substanzen I vorzugsweise in Form einer stabilen Lösung zugegeben. Nach einer relativ kurzen Naohbebrütungszeit wird die Verfärbung ausgewertet.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in den naohfolgenden Beispielen näher erläutert.
ßAO ORIGINAL
109814/0340
-S-
Beispiel 1
In 1,8 ml keimhaltigern Urin löst nan den Inhalt einer Gelatine-Steokkapsel, der folgende Zusammensetzung hatι
Sojapepton 10 mg
Dextrose VJl mg
Natriumchlorid 10 mg
Dikaliumphosphat 5 mg
sowie die reaktionsbegünstigenden Zusätze ι
DFN 4 mg
Cystein 1 mg
Mangan-(II)chlorid λ 1 m« (Tetrahydrat)
Die Probe wird 2 Stunden bei 370C bebrütet und mit 0,2 ml einer Lösung versetzt, die Do 29 in einer Konzentration von 500yttg/ml enthält (zur Herstellung dieser Lösung werden 10 mg Do 29 in 2 ml Dimethylformamid und 2 ml Polyoxyäthylensorbitanlaureat ("tween 20") gelöst, anschließend mit 6 ml aqua dest.versetzt und mit aqua dest.nochmals im Verhältnis Ii1 verdünnt) Naoh einer halbstündigen Bebrütungezeit wird die Verfärbung erstmals ausgewertet. Weitere Auswertungen werden naoh 1 und 2 Stunden Naohbtbrütung vorgenoemtn»
In der nachstehenden Tabelle I sind einige typische Ergebnisse dieser Versuche mit Keimzahlen von oa 3 Mill./ml zusammengestellt.
Tabelle I
Teetkeime Farbe naoh der Naohbebrütun« 1 Stunde 2 Stunden
Escheriohia
ooli (1Θ)
Proteus mira-
belis (290)
Klebsiella
pneuBoniae
(100) 		1/2 Stunde tief violet
violett
violett 		tief violett
violett
violett
violett
g«lb
sohwaoh
violett
BAD ORIGINAL'
- O violett 15 violett
- schwach
violett 		violett
Fortsetzung
violett
gelb
Streptococcus
faecalis (155)
Staphylococoue
aureus SG 511
(12).
1598H9
Bei Parallel-Versuchen mit den gleichen Nährboden ohne die Zusätze von DPN etc. sind nach so kurzen Vorbebrütungszeiten nooh keine mit bloßem Auge sichtbaren Parbveränderungen festzustellen.
Beispiel 2
Die Farbe, die sioh beim Bebrüten keimhaltiger Lösungen mit Do 29 bildet, kann im Photometer bei 578 nm auch schon bei niedrigeren Konzentrationen gemessen werden. Die folgenden Messungen, die an einer wässrigen Suspension mit 30 Mill. Keimen/ml untersofortigem Zuaatz der Substanz Do 29 durchgeführt wurden, zeigen, daß durch den Zusatz von 1 mg DPN oder TPN die Farbentwicklung wesentlich früher eintritt. Hierbei ist zu beaohten, daß etwa bei einer Extinktion von E-O,200 ein für das bloße Auge sichtbarer Umschlag von gelb naoh violett wahrnehmbar ist. Tabelle II faßt die Ergebnisse zusammen»
Tabelle II
Bebrütungezeit DPN TPN ohne Zusatz
Ausgangswert E-O,150
(gelb) 		E-O,160
(gelb) 		E-O,102
(gelb)
1 Stunde E-O,180
(gelb) 		E-O,180
(gelb) 		E-O,130
(gelb)
2 Stunden E-O,475
(violett) 		E-O,400
(violett) 		E-O,200
(gelb)
3 Stunden E»0,710
(violett) 		E-O,660
(violett) 		E-0,445
(violett)
4 Stunden E-O,750
(violett) 		E-O,750
(violett) 		E-O,725 ·
(violett)
5 Stunden E-O,680
(violett) 		E«O,68O
(violett) 		E-O,700
(violett)
1098U/G340
BAD ORIGINAL
Bei β ρ i e 1 5
In der gleichen Weise, wie ie Beispiel 2 beschrieben, wurden Bakteriensuspenaioaen ran Eseheriohia eoli (ΐβ) mit 63Ο.ΟΟΟ Keiaen/nil und steigenden Mengen DFIf bebrütet und photoeetrisoh ausgewertet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III stueaeeengesteilt»
Tabelle III
DPN-Konzentration 2 Std. 3 Std. 4 Std. 5 Std.
0 mg/Ansatz 0,079 0,071 0,096 0,120
1 mg/Ansatz 0,196 0,690 0,745 0,638
2 mg/Ansätζ 0,234 0,720 0,745 0,630
3 mg/Ansatz 0,274 0,760 0,750 0,690
4 mg/Ansatz 0,304 0,820 0,760 0,650
Beispiel 4
Harne von klinisohen Patienten, in denen auf herkömmliche Weise Keimzahlen zwischen 10.000 und 3 Millionen nachgewiesen waren, ohne daß bereite eine Spezifizierung der Keioart Torlag, wurden gemäß Beispiel 1 untersucht. Bereits nach 2 Stunden Vorbebrtitung und einer halben Stunde Nachbebrütungszeit zeigten Harnproben sit sehr als 2 Hillionen Keimen eine violette Farbe. Harnproben ait etwa 100.000 Keimen/ml verfärbten sich nach weiteren 1 bis 2 Stunden Hachbebrütungszeit violett.
BA0
109814/0340

Claims (1)

1598Η9
Patentanspruch
Verfahren zum Nachweis von Bakterien, vorzugsweise in Urin, durch Bebrüten des zu untersuchenden Mediums mit einem flüssigen oder festen Nährboden unter sofortigem oder späterem Zusatz einer nicht wachstumhemmenden Menge einer Verbindung der Formel I,
in der X Sauerstoff, Schwefel oder ein alkyliertes Stickstoffatom bedeutet und R die folgenden Reste darstellt,
-CH
R,
-CH
NO2 H-CH-CH,
OR OR 3 4
o)
ORIGINAL
1098U/03A0"
1598H9
-CH -CH
-CH
in denen R, eine gesättigte oder ungesättigte Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Acyl-, Hydroxy- oder Acyloxyalkgruppe, Rp Wisserstoff oder eine niedere Alkylgruppe, R, und R, Wasserstoff oder zusammen eine Ieopropylidengruppe bedeuten und η die Zahl 2 oder 3 ist, und Auswertung der Farbänderung,
dadurch gekennzeichnet, daß man in Ausgestaltung des Verfahrens der Hauptpatentanmeldung B 86.402 IX b/42 1 und der Zusatzanmeldung B B6.OI5 IX t/42 1 den Nährboden zusätzlioh mit Coenzymen sowie ^___ \^ gewünschtenfalls Sulfhydrylgruppen-haltigen Substanzen und enzyraaktivierenden Sohwermetallionen versetzt.
1098U/0340 badorwhal
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