DE1300710B

DE1300710B - Method and means for determining the content of alkaline phosphates in serum

Info

Publication number: DE1300710B
Application number: DE1966M0068256
Authority: DE
Inventors: Hausamen; Helger; Rick; Dr Roland; Dr Torsten Udo; Dr Wirnt
Original assignee: E Merck AG
Current assignee: Merck KGaA
Priority date: 1966-02-03
Filing date: 1966-02-03
Publication date: 1969-08-07

Description

Die Bestimmung des Gehalts an alkalischer Phosphatase im Serum ist von Bedeutung für die Diagnose und Verlaufskontrolle von Knochenerkrankungen, Tumorkrankheiten sowie von Leber- und Gallengangkrankheiten.The determination of the level of alkaline phosphatase in the serum is of importance for the diagnosis and follow-up of bone diseases and tumor diseases as well as liver and bile duct diseases.

Eine solche Enzymbestimmung kann nach einer großen Zahl von verschiedener Verfahren durchgeführt werden, die sich durch das verwendete Substrat, die Substratkonzentration, durch die Art des Nachweises der Reaktionsprodukte, durch die benötigte Serummenge, durch den pH-Wert, die Inkubationsdauer und -temperatur sowie durch die Art des verwendeten Puffers unterscheiden. Eine der wichtigsten Methoden ist das von B e s s e y, L o w r y und Brock in Journal of the Biological Chemistry, Bd. 164 (1956), S. 321, beschriebene Verfahren. Dabei wird Serum in einem Glycin-NaOH-Puffer bei einem pH-Wert von 10,5 zusammen mit p-Nitrophenylphosphat als Substrat 30 Minuten bei einer Temperatur von 37° C inkubiert und anschließend aus der gebildeten Menge p-Nitrophenol auf den vorhandenen Enzymgehalt geschlossen. Das gebildete p-Nitrophenol kann dabei photometrisch bestimmt werden. Dieser diskontinuierlichen sogenannten Zweipunktmethode haften, wie auch allen übrigen bisher bekannten Verfahren, verschiedene Fehlermöglichkeiten an. So kann z. B. eine während der Inkubationsdauer auftretende Enzymhemmung, d. h. ein nichtlinearer Reaktionsverlauf, hervorgerufen z. B. durch eine p11-Wertverschiebung, nicht beobachtet werden. Das dürfte mit ein Grund gewesen sein, weshalb die Commission of Enzymes of the International Union of Biochemistry (vgl. F 1 o r k i n und S 1 o tz, in Comprehensive Biochemistry, Bd.13 [1964], S. 6) empfohlen hat, wann immer möglich, Enzymreaktionen optisch-kinetisch zu messen, d. h. zum Beispiel bei der Bestimmung der alkalischen Phosphatase die Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse des Phosphorsäureesters zu bestimmen.Such an enzyme determination can be carried out according to a large number of different methods, which depend on the substrate used, the substrate concentration, the type of detection of the reaction products, the amount of serum required, the pH value, the incubation time and temperature as well as differentiate the type of buffer used. One of the most important methods is the method described by B e ssey, Lowry and Brock in Journal of the Biological Chemistry, Vol. 164 (1956), p. 321. Serum is incubated in a glycine-NaOH buffer at a pH of 10.5 together with p-nitrophenyl phosphate as substrate for 30 minutes at a temperature of 37 ° C. and the amount of p-nitrophenol formed is then used to determine the enzyme content present . The p-nitrophenol formed can be determined photometrically. This discontinuous, so-called two-point method, like all other previously known methods, is subject to various possible errors. So z. B. an enzyme inhibition occurring during the incubation period, ie a non-linear course of the reaction, caused z. B. by a p11 value shift, can not be observed. That should have been one of the reasons why the Commission of Enzymes of the International Union of Biochemistry (cf. F 1 orkin and S 1 o tz, in Comprehensive Biochemistry, Vol. 13 [1964], p. 6) recommended when always possible to measure enzyme reactions optically-kinetically, ie for example to determine the initial rate of hydrolysis of the phosphoric acid ester when determining alkaline phosphatase.

Bei dem Substrat p-Nitrophenylphosphat ist der Nachweis des im alkalischen Medium unter der Enzymwirkung gebildeten p-Nitrophenols photometrisch (bei 400 nm) direkt möglich, da der pKä Wert von p-Nitrophenol bei 7,16 liegt. Die Bestimmung ist somit nach der optisch-kinetischen Methode möglich, indem die gepufferte Substratlösung mit Serum versetzt und die durch das freigesetzte p-Nitrophenol bedingte Extinktion fortlaufend abgelesen oder mit Hilfe eines Kompensationsschreibers registriert wird. Methoden auf dieser Grundlage wurden kürzlich beschrieben, z. B. für Serum von W. J. T r a j o 1 a unter anderem in American Journal of Clinical Pathology, Bd.43 (1965), S.261, und für Harn von Wacker, Amador, Dorfman und Zimmermann in »Das ärztliche Laboratorium«, Bd. 11 (1965), S. 204. Bei diesen Verfahren erfolgt die Inkubation in bekannten Puffern von üblicher geringer Molarität und mithin geringer Pufferkapazität.In the case of the substrate p-nitrophenyl phosphate, there is evidence of the alkaline Medium p-nitrophenol formed under the action of enzymes photometrically (at 400 nm) directly possible, since the pKa value of p-nitrophenol is 7.16. The determination is thus possible according to the opto-kinetic method by adding the buffered substrate solution mixed with serum and the extinction caused by the released p-nitrophenol is continuously read or registered with the aid of a compensation recorder. Methods based on this have recently been described, e.g. B. for serum from W. J. T r a j o 1 a, inter alia, in American Journal of Clinical Pathology, Vol. 43 (1965), p.261, and for Harn von Wacker, Amador, Dorfman and Zimmermann in »Das ärztliche Laboratorium ”, Vol. 11 (1965), p. 204. In these processes, the incubation takes place in known buffers of the usual low molarity and consequently low buffer capacity.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß bei Verwendung eines Diäthanolamin-Hydrochlorid-Puffers bei einem pH-Bereich von 9,4 bis 10,2 die Enzymaktivität etwa 3mal höher ist als in allen bisher bekannten Puffern. Dieser Effekt, nämlich daß in einem Puffer solcher Stärke das Enzym nicht überdurchschnittlich gehemmt, sondern im Gegenteil stark aktiviert wurde, war nicht vorherzusehen.Surprisingly, it has now been found that when using a diethanolamine hydrochloride buffer at a pH range of 9.4 to 10.2 the enzyme activity is about 3 times higher than in all known buffers. This effect, namely that in a buffer such Strength the enzyme is not inhibited above average, but on the contrary strong was activated, could not have been foreseen.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an alkalischer Phosphatase im Serum unter Verwendung einer gepufferten wäßrigen p-Nitrophenylphosphatlösung als Substrat und mit Hilfe einer photometrischen Messung der Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse dieses Phosphorsäureesters, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Puffersubstanz Diäthanolamin-Hydrochlorid verwendet.The invention thus relates to a method for determining the content of alkaline phosphatase in serum using a buffered aqueous p-Nitrophenyl phosphate solution as a substrate and with the help of a photometric measurement the initial rate of hydrolysis of this phosphoric acid ester, which thereby is characterized in that diethanolamine hydrochloride is used as the buffer substance.

Ferner betrifft die Erfindung ein Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Gehalt an gepuffertem p-Nitrophenylphosphat als Substrat, das gekennzeichnet ist durch die Verwendung von Diäthanolamin-Hydrochlorid als Puffer.The invention also relates to a means for carrying out the invention Process with a content of buffered p-nitrophenyl phosphate as substrate, the is characterized by the use of diethanolamine hydrochloride as a buffer.

Nach dem neuen Verfahren ist es möglich, mit nur wenig Serum in äußerst kurzer Zeit die Anfangsgeschwindigkeit der Enzymreaktion zu messen. Das neue Verfahren gestattet somit die Bestimmung der alkalischen Phosphatase auf optisch-kinetischem Wege unter optimalen Bedingungen.According to the new procedure, it is extremely possible to use only a little serum to measure the initial rate of the enzyme reaction in a short time. The new procedure thus allows the determination of alkaline phosphatase on an opto-kinetic basis Paths under optimal conditions.

Bei den bisher bekannten Verfahren verwendet man üblicherweise einen 0,05- bis 0,5molaren Puffer. Bei dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung ist es jedoch besonders vorteilhaft, den Diäthanolamin-Hydrochlorid-Pufffer in einer Konzentration von 0,5- bis 1,5molar, vorzugsweise lmolar, zu verwenden. Durch Anwendung dieser relativ hohen Pufferkonzentration erhält man eine hohe Pufferkapazität, die die schädlichen Einwirkungen von C02 (aus der Luft) ausschließt und den pH-Wert während der gesamten Versuchsdauer konstant hält.In the previously known methods, one usually uses one 0.05 to 0.5 molar buffer. In the method according to the present invention however, it is particularly advantageous to use the diethanolamine hydrochloride buffer in one Concentration of 0.5 to 1.5 molar, preferably 1 molar, to be used. By application this relatively high buffer concentration gives a high buffer capacity, which the harmful effects of C02 (from the air) and the pH value keeps constant during the entire duration of the experiment.

Eine besonders optimale Steigerung der Enzymaktivität wird erreicht, wenn man bei einem pH-Wert von 9,8 arbeitet und eine lmolare Pufferkonzentration verwendet.A particularly optimal increase in enzyme activity is achieved, when working at a pH of 9.8 and an imolar buffer concentration used.

Ein wesentlicher Vorteil der neuen Methode besteht ferner darin, daß sie schnell und einfach arbeitet und daß sie vor allem eine sehr gute Reproduzierbarkeit besitzt. Gerade die bisher bekannten Methoden zeichneten sich durch eine sehr unvollkommene Reproduzierbarkeit aus, was immer zu relativ unsicheren Meßergebnissen führte.Another major advantage of the new method is that it works quickly and easily and, above all, it has very good reproducibility owns. The previously known methods in particular were characterized by a very imperfect one Reproducibility, which always led to relatively uncertain measurement results.

Beispiel Herstellung des Puffers und der Puffer-Substratlösung 525,7 g Diäthanolamin (kristallisierbar) werden in 3000 ml bidestilliertem Wasser gelöst. Unter Rühren (Glasrührer) wird durch Zugabe von etwa 70 ml 25o/oiger Salzsäure auf pH 9,9 eingestellt. Hierzu werden 508,3 mg MgC12 - 6 H20 und 2,5 g Natriumazid gegeben. Die Lösung wird in einen 5000-ml-Meßkolben übergeführt und mit Wasser nachgespült. Der pH-Wert wird durch tropfenweise Zugabe von 25o/oiger Salzsäure auf 9,8 eingestellt, und die Lösung wird anschließend mit bidestilliertem Wasser auf 5000 ml aufgefüllt.Example Preparation of the buffer and the buffer-substrate solution 525.7 g diethanolamine (crystallisable) are dissolved in 3000 ml of double-distilled water. While stirring (glass stirrer), about 70 ml of 25% hydrochloric acid is added pH adjusted to 9.9. To this end, 508.3 mg MgC12-6 H20 and 2.5 g sodium azide are added. The solution is transferred to a 5000 ml volumetric flask and rinsed with water. The pH is adjusted to 9.8 by the dropwise addition of 25% hydrochloric acid, and the solution is then made up to 5000 ml with double-distilled water.

Eine Tablette, die 39,5 mg 100o/oiges p-Nitrophenylphosphat-Dinatriumsalz enthält und welche bis zum Gesamtgewicht von 100 mg noch Natriumchlorid und gegebenenfalls etwas Feuchtigkeit enthält, wird in 10m1 der obengenannten Pufferlösung gelöst. Diese Lösung ist, bei 4° C unter Lichtausschluß aufbewahrt, für die nachfolgend beschriebene Enzymbestimmung 2 Tage verwendbar.One tablet containing 39.5 mg 100% p-nitrophenyl phosphate disodium salt contains and which up to a total weight of 100 mg also sodium chloride and optionally contains some moisture, is dissolved in 10m1 of the above-mentioned buffer solution. This solution is stored at 4 ° C with exclusion of light for the following The described enzyme determination can be used for 2 days.

Beispiel für eine Enzymbestimmung Puffer-Substrat und Serum werden auf 25° C erwärmt. Die Temperatur wird in der Lösung kontrolliert. 2 ml der Puffer-Substratlösung werden mit 0,02 ml Serum (frisch) versetzt und sehr gut gemischt. Nach etwa einer Minute wird die Extinktion bei 25° C gemessen und gleichzeitig die Zeit festgestellt (Stoppuhr). Die Messung wird jede Minute, 3 Minuten lang, wiederholt.Example of an enzyme determination Buffer substrate and serum are used warmed to 25 ° C. The temperature is controlled in the solution. 2 ml of the buffer-substrate solution are mixed with 0.02 ml of serum (fresh) and very well mixed. After about one minute, the absorbance is measured at 25 ° C and at the same time the time is determined (stop watch). The measurement is made every minute, 3 minutes long, repeated.

Die Extinktionsmessung erfolgt z. B. mit einem Photometer, das mit einem Filter für die Quecksilberlinie bei 405 nm ausgerüstet ist. Die Schichtdicke beträgt 1 cm.The absorbance measurement is carried out e.g. B. with a photometer with equipped with a filter for the mercury line at 405 nm. The layer thickness is 1 cm.

Sind die Extinktionsdifferenzen 4 E/Min. zu Beginn der Messung größer als 0,2, so wird die Bestimmung mit dem 1:5 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntem Serum wiederholt und das Ergebnis mit 5 multipliziert.If the absorbance differences are 4 U / min. larger at the beginning of the measurement than 0.2, the determination is made with the 1: 5 diluted with physiological saline solution Serum repeated and the result multiplied by 5.

Internationale Enzymeinheit (U) ist die Enzymmenge, die 1 [Mol Substrat in einer Minute unter Standardbedingungen umsetzt. 1 Millieinheit (mU) = 1/1000 U.International Enzyme Unit (U) is the amount of enzyme that contains 1 [mole of substrate implemented in one minute under standard conditions. 1 milliunit (mU) = 1/1000 U.

Die Extinktionsdifferenz pro Minute 4E405 wird in folgende Berechnungsformel eingesetzt: Enzymkonzentration = 4 E405 - 5460 mU/ml. Als Normalbereich gelten 60 bis 170 mU (25° C)/ ml.The extinction difference per minute 4E405 is used in the following calculation formula: Enzyme concentration = 4 E405 - 5460 mU / ml. The normal range is 60 to 170 mU (25 ° C) / ml.

Claims

Claims: 1. Method for determining the content of alkaline Phosphatase in serum using a buffered aqueous p-nitrophenyl phosphate solution as a substrate and with the help of a photometric measurement of the initial speed the hydrolysis of this phosphoric acid ester, characterized in that the buffer substance Diethanolamine hydrochloride is used.

2. The method according to claim 1, characterized in that that the diethanolamine hydrochloride buffer in a concentration of about 0.5 up to 1.5 molar used.

3. Means for performing the method according to the claims 1 and / or 2 with a content of buffered p-nitrophenyl phosphate as substrate, characterized by the use of diethanolamine hydrochloride as a buffer.