DE112010000749T5

DE112010000749T5 - Gentechnische Bearbeitung von NF-YB-Transkriptionsfaktoren für gesteigerte Trockenheitsresistenz und erhöhten Ertrag in transgenen Pflanzen

Info

Publication number: DE112010000749T5
Application number: DE112010000749T
Authority: DE
Inventors: Resham Kulkarni
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Priority date: 2009-01-28
Filing date: 2010-01-25
Publication date: 2012-08-30
Also published as: AR075185A1; BRPI1005303A2; WO2010086277A3; AU2010209843A1; WO2010086277A2; MX2011007597A; US20120042418A1; CN102300992A; EP2391721A2; CA2749708A1; AU2010209843A2

Abstract

Es werden Polynukleotide offenbart, die fähig sind, den Ertrag einer Pflanze, die so transformiert worden war, dass sie diese Polynukleotide enthält, zu erhöhen. Ebenfalls bereitgestellt wurden Verfahren zur Verwendung dieser Polynukleotide sowie transgene Pflanzen und Agrarprodukte, einschließlich Samen/Saatgut, die/das diese Polynukleotide als Transgene enthalten.

Description

Die vorliegende Anmeldung genießt das Prioritätsvorrecht der vorläufigen US-Patentanmeldung mit der Reihennummer 61/147.777, eingereicht am 28. Januar 2009, die hiermit voll inhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen wird.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein transgene Pflanzen, die isolierte Polynukleotide überexprimieren, die für Polypeptide codieren, die bei der Transkriptionsregulation aktiv sind, wodurch der Ertrag dieser Pflanzen verbessert wird.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
In den letzten Jahren haben Bevölkerungszunahme und Klimawandel die Möglichkeit einer weltweiten Nahrungsmittel, Futter- und Brennstoffknappheit drastisch vor Augen geführt. Zu einem Zeitpunkt wo die Niederschlagsmenge in vielen Teilen der Erde rückgängig ist, entfällt auf die Landwirtschaft 70% des vom Menschen verwendeten Wassers. Außerdem werden weniger Hektar Ackerland für den Anbau von Feldfrüchten verfügbar, da sich die Flächennutzung von landwirtschaftlichen Betrieben auf Städte und Vorstädte verlagert. In der Agrarbiotechnologie hat man versucht, den zunehmenden Bedarf der Menschheit durch genetische Modifikationen von Pflanzen zu decken, wodurch der Kulturpflanzenertrag erhöht werden könnte, zum Beispiel dadurch, dass eine bessere Toleranz gegenüber abiotischen Stressreaktionen vermittelt wird oder dass die Biomasse erhöht wird.
Im vorliegenden Zusammenhang wird der Kulturpflanzenertrag als Anzahl Bushel des entsprechenden Agrarprodukts (wie Körner, Futterpflanzen oder Samen), die pro Acre geerntet werden, definiert. Der Kulturpflanzenertrag wird durch abiotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, Salinität und Kältestress sowie durch die Größe (Biomasse) der Pflanze beeinflusst. Traditionelle Pflanzenzüchtungsstrategien sind relativ langsam und waren im Allgemeinen nicht erfolgreich, um eine erhöhte Toleranz gegenüber abiotischen Stressfaktoren zu vermitteln. Die durch die traditionelle Züchtung erzielten Verbesserungen beim Kornertrag haben beim Mais beinahe ein Plateau erreicht. Der Harvest Index, d. h. das Verhältnis zwischen Ertragsbiomasse zu der gesamten kumulativen Biomasse zum Erntezeitpunkt ist beim Mais während der selektiven Züchtung auf Kornertrag über die letzten hundert Jahre im Wesentlichen unverändert geblieben. Dementsprechend ergeben sich die jüngsten Ertragsverbesserungen, die beim Mais erzielt werden, aus einer erhöhten Gesamtbiomasseproduktion pro Kulturflächeneinheit. Diese erhöhte Gesamtbiomasse wurde durch Erhöhung der Saatstärke erzielt, was zu adaptiven phänotypischen Veränderungen wie Verkleinerung des Blattwinkels, was die Beschattung der unteren Blätter verringern kann, und der Fahnengröße, was den Harvest Index erhöhen kann, geführt hat.
Wenn das Bodenwasser zurückgeht oder Wasser während Trockenperioden nicht verfügbar ist, sind die Kulturpflanzenerträge eingeschränkt. Ein Pflanzenwasserdefizit entsteht dann, wenn die Transpiration von den Blättern größer ist als die Versorgung mit Wasser von den Wurzeln. Die Menge an Wasser, die verfügbar ist, steht in Relation zu der Menge an Wasser, die im Boden vorhanden ist, und der Fähigkeit der Pflanze, dieses Wasser mit ihrem Wurzelsystem zu erreichen. Die Transpiration von Wasser von den Blättern steht mit der Fixierung von Kohlendioxid durch die Fotosynthese über die Stomata in Verbindung. Die beiden Vorgänge sind positiv korreliert, so dass ein hoher Kohlendioxid-Influx über die Fotosynthese eng mit dem Wasserverlust durch die Transpiration in Verbindung steht. Wenn Wasser vom Blatt durch Transpiration abgegeben wird, so ist das Blattwasserpotential erniedrigt und die Stomata neigen dazu, sich hydraulisch zu schließen und schränken so die Fotosyntheserate ein. Da der Kulturpflanzenertrag von der Fixierung von Kohlendioxid in der Fotosynthese abhängig ist, sind Wasseraufnahme und Transpiration Faktoren, die zum Kulturpflanzenertrag beitragen. Pflanzen, die fähig sind, weniger Wasser zu verbrauchen, um dieselbe Menge an Kohlendioxid zu fixieren, oder die fähig sind, bei einem niedrigeren Wasserpotential normal zu funktionieren, weisen das Potential für eine höhere Fotosyntheserate und daher für die Produktion von Nährbiomasse und Marktwert in vielen Agrarsystemen auf.
Beim Versuch, transgene Pflanzen, die einen erhöhten Ertrag aufweisen, entweder aufgrund einer erhöhten abiotischen Stresstoleranz oder durch erhöhte Biomasse, zu entwickeln, haben die Agrarbiotechnologen Tests an Modellpflanzensystemen, Gewächshausstudien von Kulturpflanzen und Feldversuche durchgeführt. So ist zum Beispiel die Wassernutzungseffizienz (WUE) ein Parameter, der häufig mit Trockenheitstoleranz korreliert ist. Untersuchungen der Reaktion einer Pflanze auf Austrocknung, osmotischen Schock und Temperaturextreme werden auch dazu verwendet, um die Toleranz oder Resistenz gegen abiotische Stressfaktoren zu bestimmen.
Eine Erhöhung der Biomasse bei niedriger Wasserverfügbarkeit kann auf einer relativ verbesserten Wachstumseffizienz oder auf einem erniedrigten Wasserverbrauch beruhen. Beim Selektieren von Merkmalen für die Verbesserung von Kulturpflanzen wäre eine verringerte Wassernutzung ohne damit einhergehende Wachstumsveränderung in einem Agrarsystem mit Bewässerung, wo die Betriebsmittelkosten für das Wasser hoch sind, besonders günstig. Eine Wachstumserhöhung ohne damit einhergehendes starkes Ansteigen bei der Wassernutzung wäre auf alle Agrarsysteme anwendbar. in vielen Agrarsystemen, in denen die Wasserversorgung nicht limitierend ist, erhöht eine Wachstumserhöhung auch den Ertrag, selbst wenn dies auf Kosten einer erhöhten Wassernutzung ginge.
Die Agrarbiotechnologen verwenden auch Messungen von anderen Parametern, die die mögliche Auswirkung eines Transgens auf den Kulturpflanzenertrag angeben. Bei Futterkulturen wie Luzerne, Silomais und Heu korreliert die Pflanzenbiomasse mit dem Gesamtertrag. Bei Kornfrüchten wurden jedoch andere Parameter eingesetzt, um den Ertrag zu schätzen, wie zum Beispiel die Pflanzengröße, die über Gesamtpflanzentrockengewicht, Trockengewicht der oberirdischen Pflanzenteile, Frischgewicht der oberirdischen Pflanzenteile, Blattfläche, Stengelvolumen, Pflanzenhöhe, Rosettendurchmesser, Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, Anzahl der Bestockungsträger und Anzahl der Blätter bestimmt wird. Die Pflanzengröße in einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße in einem späteren Entwicklungsstadium korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann typischerweise mehr Licht und Kohlendioxid als eine kleinere Pflanze absorbieren, und es ist daher wahrscheinlich, dass sie über denselben Zeitraum mehr an Gewicht zunimmt. Bei der Pflanzengröße und der Wachstumsrate besteht eine starke genetische Komponente, und die Pflanzengröße unter ein- und derselben Umweltbedingung wird für eine Reihe von verschiedenen Genotypen vermutlich mit der Größe unter einer anderen Umweltbedingung korrelieren. So verwendet man eine Standardumwelt, um die verschiedenen und dynamischen Umwelten, die von den Kulturpflanzen im Feld an verschiedenen Standorten und zu verschiedenen Zeiten angetroffen werden, ungefähr wiederzugeben.
Der Harvest Index ist unter vielen Umweltbedingungen relativ stabil und ermöglicht so eine robuste Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag. Pflanzengröße und Kornertrag sind intrinsisch miteinander verbunden, da der Großteil der Kornbiomasse von der gegenwärtigen oder gespeicherten Fotosyntheseproduktivität der Blätter und des Stengels der Pflanze abhängt. Wie bei der abiotischen Stresstoleranz stellen Messungen der Pflanzengröße während der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder im Gewächshaus Standardmethoden dar, um mögliche Ertragsvorteile, die durch das Vorhandensein eines Transgens vermittelt werden, zu messen.
Die NF-Y-Transkriptionsfaktoren binden an die CCAAT-Box-Consensus, und regulieren so eine mannigfaltige Gruppe von Genen als Trimer von drei Proteinen umfassend NF-YA, NF-YB und NF-YC, das mit hoher Affinität und hoher Spezifität an DNA bindet und so die Transkription aktiviert. Die NF-Y-Untereinheiten NF-YA, NF-YB, NF-YC werden auch als CBF-B/HAP2, CBF-A/HAP3 bzw. CBF-C/HAP5 bezeichnet. Alle drei Untereinheiten enthalten konservierte Kerndomänen, die die Histonfaltung umfassen, bei der es sich um einen Kern aus drei Helizes handelt, wobei die lange mittlere Helix beidseitig von der kürzeren flankiert wird. Diese Domänen sind an verschiedenen Funktionen beteiligt, darunter DNA-Bindung, Interaktionen zwischen den Untereinheiten und Kerntransport.
Einzelne Gene für die NF-Y-Untereinheiten finden sich in Pilzen und Tieren, in Pflanzen existieren jedoch multiple Gene. In Arabidopsis thaliana existieren multiple Gene, die für die unterschiedlichen NF-Y-Untereinheiten codieren. NF-YA weist 10 Gene auf, NF-YB 13 Gene und NF-YC 13 Gene. Im Reisgenom existiert eine ähnliche Mannigfaltigkeit. Für NF-YA gibt es 10 Gene, für NF-YB 11 Gene und für NF-YC 7 Gene. Im Genom von Triticum aestivum besteht die NF-YA-Genfamilie auf ähnliche Weise aus 10 Genen, die NF-YB-Genfamilie aus 11 Genen, und 14 Gene machen die NF-YC-Genfamilie aus. In allen Fällen werden die verschiedenen NF-Y-Gene in jeder Art unterschiedlich in Bezug auf Gewebe und Umweltbehandlungen exprimiert, was anzeigt, dass jedes einer unabhängigen Transkriptionsregulation unterliegt.
Die US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2005/0022266 beschreibt, dass die Transformation eines Hap3-Transkriptionsfaktors aus Zea mays in Pflanzen unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promoters die Trockenheitstoleranz verbessert. Die US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2008/040973 beschreibt, dass die Verwendung des 35S-Promoters mit diesem Transkriptionsfaktor zu einem verringerten Ertrag führt, wenn die Pflanzen unter ausreichenden Wasserbedingungen herangezogen werden. Die US 2008/040973 beschreibt weiter, dass die Verwendung eines Reis-Actin-Promoters ohne Enhancer zusammen mit dem NF-YB-Gen aus Z. mays bei transgenen Pflanzen dazu führt, dass diese weniger NF-YB-Protein produzieren, und dass solche transgenen Pflanzen sowohl unter Trockenheitsbedingungen als auch unter ausreichenden Wasserbedingungen einen erhöhten Ertrag aufweisen.
Das US-Patent Nr. 7,482,511 beschreibt den NF-YB-Transkriptionsfaktor EST265 aus Physcomitrella patens als PpCABF-3, und das US-Patent Nr. 7,164,057 beschreibt den NF-YB-Transkriptionsfaktor EST69 aus P. patens als PpCABF-1.
Die US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2007/0199107 beschreibt, dass transgene Pflanzen, in denen gewisse NF-YB-Transkriptionsfaktoren als Transgene überexprimiert werden, im Vergleich zu Wildtyppflanzen, die das Transgen nicht umfassen, früh blühen.
Obwohl die Erniedrigung der Menge an NF-YB-Protein in transgenen Pflanzen den Ertrag verbessert hat, besteht nach wie vor der Bedarf an einer weiteren Erhöhung des Ertrags von Kulturpflanzen.
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt neue funktionelle Kombinationen des NF-Y-Komplexes bereit, und zwar dadurch, dass unterschiedliche Domänen von entweder unterschiedlichen Arten oder von unterschiedlichen Mitgliedern der Genfamilie innerhalb einer Art kombiniert werden. Mit den NF-YB-Polynukleotiden und den chimären Polynukleotiden und Polypeptiden in Tabelle 1 kann man den Ertrag von transgenen Pflanzen verbessern. Tabelle 1

Bezeichnung des Gens	Organismus	Polynukleotid-SEQ ID NO	Aminosäure-SEQ ID NO
EST265	P patens	1	2
AT5G47640	A. thaliana	3	4
NM_001112582.1	Z. mays	5	6
NFYB-C1	Künstlich	7	8
NFYB-C2	Künstlich	9	10
NFYB-C3	Künstlich	11	12
NFYB-C4	Künstlich	13	14
NFYB-C5	Künstlich	15	16
NFYB-C6	Künstlich	17	18
NFYB-C7	Künstlich	19	20
NFYB-C8	Künstlich	21	22
NFYB-C9	Künstlich	23	24
NFYB-C10	Künstlich	25	26
NFYB-C11	Künstlich	27	28
NFYB-C12	Künstlich	29	30
EST69	P. patens	31	32
ZM58019377	Z. mays	33	34
ZM61020893	Z. mays	35	36
ZM62014459	Z. mays	37	38
ZM62260706	Z. mays	39	40
ZM59456239	Z. mays	41	42
ZM59473285	Z. mays	43	44
ZM59153552	Z. mays	45	46
ZM62055702	Z. mays	47	48
ZM67286704	Z. mays	49	50
ZM65405678	Z. mays	51	52
ZM62083966	Z. mays	53	54

Bezeichnung des Gens	Organismus	Polynukleotid-SEQ ID NO	Aminosäure-SEQ ID NO
ZmEvi061009.1	Z. mays	55	56
ZmEvi061009.2	Z. mays	-	57
ZmEvi061009.3	Z. mays	-	58
AC198485	Z. mays	59	60
AC203785	Z. mays	61	62
AC210260	Z. mays	63	64
AC205600	Z. mays	65	66
ZmEvi005932	Z. mays	67	68
AC203676	Z. mays	69	70
AC188837	Z. mays	71	72
AC203033	Z. mays	73	74
AC187072	Z. mays	75	76
ZmEvi013724	Z. mays	77	78
AC204839	Z. mays	79	80
AC192373	Z. mays	81	82
AC204642	Z. mays	83	84
AC205067	Z. mays	85	86
AC210260-FG026	Z. mays	87	88
ZmEvi043847	Z. mays	89	90
AC208347-FGT020	Z. mays	91	92
AC208347-FGT011	Z. mays	93	94
ZmEvi090686	Z. mays	95	96
AC210719	Z. mays	97	98
AC204710	Z. mays	99	100
ZmEvi027465	Z. mays	101	102
AC212092	Z. mays	103	104
AT5G08190	A. thaliana	105	106
AT5G23090	A. thaliana	107	108
gi_15225884	A. thaliana	-	109
gi_30695265	A. thaliana	-	110
gi_42562232	A. thaliana	-	111
AT1G09030	A. thaliana	112	113
gi_15227134	A. thaliana	-	114
AT3G53340	A. thaliana	115	116
AT2G37060	A. thaliana	117	118
gi_18404885	A. thaliana	-	119
AT4G14540	A. thaliana	120	121
AT2G13570	A. thaliana	122	123

In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette transformiert ist, die in operativer Verknüpfung Folgendes umfasst: ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert und ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid, bei dem es sich um einen chimären NF-YB-Transkriptionsfaktor handelt, codiert, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen Samen bereit, der von der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze erzeugt wird, wobei der Samen für ein Transgen, das die oben beschriebenen Expressionsvektoren umfasst, reinerbig ist. Pflanzen, die von dem erfindungsgemäßen Samen stammen, weisen eine verstärkte Toleranz gegenüber einem Umweltstress und/oder ein verstärktes Pflanzenwachstum und/oder einen erhöhten Ertrag unter Normalbedingungen oder unter Stressbedingungen im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze auf.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Produkte, die von oder aus den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen, ihren Pflanzenteilen oder ihren Samen erzeugt werden, wie ein Nahrungsmittel, Futtermittel, einen Nahrungsmittelzusatzstoff, einen Futtermittelzusatzstoff, eine Faser, ein Kosmetikum oder ein Pharmazeutikum.
Die Erfindung stellt weiterhin gewisse isolierte Polynukleotide gemäß Tabelle 1 sowie gewisse isolierte Polypeptide gemäß Tabelle 1 bereit. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, umfassend ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid.
In einer weiteren Ausführungsform wiederum betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der genannten transgenen Pflanze, umfassend das Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor umfassend ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid, und Erzeugen einer transgenen Pflanze, die das Polypeptid, das von dem Polynukleotid codiert wird, exprimiert, aus der Pflanzenzelle. Die Expression des Polypeptids in der Pflanze führt zu einer erhöhten Toleranz gegenüber einem Umweltstress und/oder Wachstum und/oder Ertrag unter Normalbedingungen und/oder unter Stressbedingungen im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze.
In einer weiteren Ausführungsform wiederum stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Toleranz einer Pflanze gegenüber einem Umweltstress und/oder zum Erhöhen ihres Wachstums und/oder ihres Ertrags bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte Transformieren einer Pflanzenzelle mit einer Expressionskassette umfassend ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid, und Erzeugen einer transgenen Pflanze aus der Pflanzenzelle, wobei die transgene Pflanze das Polynukleotid umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die einzelnen Domänen in den NF-YB-Genen und ihre mutmaßlichen Funktionen.
2 zeigt einen phylogenetischen Baum, der die Verwandtschaft zwischen Vertretern von ausgewählten NF-YB-Genen darstellt. Nur ein Vertreter von jeder Gruppe, die in Tabelle 2 angegeben ist, ist in dem Stammbaum beinhaltet. Der Stammbaum wurde mit der Maximum-Likelihood-Methode erstellt. Die Gene, die Gruppen darstellen, welche für die chimären Konstrukte ausgewählt wurden, sind durch das durchgezogene graine Oval hervorgehoben. Die gepunkteten Ovale zeigen diejenigen Gene, die Gruppen mit Genen, von denen gezeigt wurde, dass sie Trockenheitstoleranz vermitteln, darstellen.
3 zeigt die Sequenzen aus P. patens, A. thaliana und Mais, die für die chimären Konstrukte verwendet wurden, mit der Bezeichnung EST265 (SEQ ID NO: 2), AT5G47640 (SEQ ID NO: 4), NM_001112582.1 (SEQ ID NO: 6), einschließlich der einzelnen Domänen innerhalb des NF-YB-Proteins. Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vektor NTI erstellt.
Die 4A–4T zeigen ein Alignment der translatierten Sequenzen von ausgewählten NF-YB-Genen aus P. patens, A. thaliana und Mais mit der Bezeichnung ZM58019377 (SEQ ID NO: 34), ZM61020893 (SEQ ID NO: 36), ZM62014459 (SEQ ID NO: 38), ZM62260706 (SEQ ID NO: 40), ZM59456239 (SEQ ID NO: 42), ZM59473285 (SEQ ID NO: 44), ZM59153552 (SEQ ID NO: 46), ZM62055702 (SEQ ID NO: 48), ZM67286704 (SEQ ID NO: 50), ZM65405678 (SEQ ID NO: 52), ZM62083966 (SEQ ID NO: 54), ZmEvi061009.1 (SEQ ID NO: 56), AC198485 (SEQ ID NO: 60), AC203785 (SEQ ID NO: 62), AC210260 (SEQ ID NO: 64), AC205600 (SEQ ID NO: 66), ZmEvi005132 (SEQ ID NO: 68), AC203676 (SEQ ID NO: 70), AC188837 (SEQ ID NO: 72), AC203033 (SEQ ID NO: 74), AC187072 (SEQ ID NO: 76), ZmEvi013724 (SEQ ID NO: 78), AC204839 (SEQ ID NO: 80), AC192373 (SEQ ID NO: 82), AC204642 (SEQ ID NO: 84), AC205067 (SEQ ID NO: 86), AC210260-FG026 (SEQ ID NO: 88), ZmEvi043847 (SEQ ID NO: 90), AC208347-FGT020 (SEQ ID NO: 92), AC208347-FGT011 (SEQ ID NO: 94), ZmEvi090686 (SEQ ID NO: 96), AC210719 (SEQ ID NO: 98), AC204710 (SEQ ID NO: 100), ZmEvi027465 (SEQ ID NO: 102), AC212092 (SEQ ID NO: 104), AT5G08190 (SEQ ID NO: 106), AT5G23090 (SEQ ID NO: 108), gi_15225884 (SEQ ID NO: 109), gi_30695265 (SEQ ID NO: 110), gi_42562232 (SEQ ID NO: 111), AT1G09030 (SEQ ID NO: 113), gi_15227134 (SEQ ID NO: 114), AT3G53340 (SEQ ID NO: 116), AT2G37060 (SEQ ID NO: 118), gi_18404885 (SEQ ID NO: 119), AT4G14540 (SEQ ID NO: 121), AT2G13570 (SEQ ID NO: 123). Das Alignment wurde unter Verwendung von Align X von Vektor NTI erstellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
In der gesamten vorliegenden Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen Bezug genommen. Die Beschreibungen von all diesen Veröffentlichungen und den Literaturangaben, die innerhalb dieser Veröffentlichungen zitiert werden, werden hiermit vollständig durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen, um den Stand der Technik, auf den sich die vorliegende Erfindung bezieht, umfassender zu beschreiben. Die im vorliegenden Zusammenhang verwendete Terminologie dient lediglich der Beschreibung von bestimmten Ausführungsformen und ist als nichteinschränkend zu verstehen. Im vorliegenden Zusammenhang kann „ein/e” ein/e oder mehr bedeuten, je nach dem Zusammenhang, in dem dieses Wort verwendet wird. So kann zum Beispiel, wenn „eine Zelle” erwähnt wird, dies bedeuten, dass mindestens eine Zelle verwendet werden kann.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze, die ein in Tabelle 1 identifiziertes isoliertes Polynukleotid in dem subzellulären Kompartiment und Gewebe, das hier angegeben ist, überexprimiert, bereit. Die erfindungsgemäße transgene Pflanze weist im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze einen verbesserten Ertrag auf. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „verbesserter Ertrag” jegliche Verbesserung bezüglich des Ertrags von irgendeinem gemessenen Pflanzenprodukt, wie Korn, Frucht oder Faser. Erfindungsgemäß können Veränderungen bei unterschiedlichen phänotypischen Merkmalen den Ertrag verbessern. So sind zum Beispiel geeignete Maße für einen verbesserten Ertrag Parameter wie die Blütenorganentwicklung, die Anlage von Wurzeln, die Wurzelbiomasse, die Anzahl Samen, das Samengewicht, der Harvest Index, Toleranz gegenüber abiotischem Umweltstress, Blattbildung, Fototropismus, Apikaldominanz und Fruchtentwicklung, was keine Einschränkung darstellen soll. Jegliche Ertragserhöhung ist erfindungsgemäß ein verbesserter Ertrag. So kann die Ertragsverbesserung zum Beispiel eine Erhöhung von 0,1%, 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder mehr bei einem der gemessenen Parameter umfassen. So ist zum Beispiel eine Erhöhung des in Bushel/Acre angegebenen Ertrags von Sojabohnen oder Mais, die von einer Kultur, die Pflanzen, die für die Nukleotide und Polypeptide gemäß Tabelle 1 transgen sind, umfaßt, abgeleitet sind, verglichen mit dem in Bushel/Acre ausgedrückten Ertrag von unbehandelten Sojabohnen oder unbehandeltem Mais, die/der unter denselben Bedingungen herangezogen wird, ein erfindungsgemäß verbesserter Ertrag.
Wie im vorliegenden Text definiert versteht man unter einer „transgenen Pflanze” eine Pflanze, die unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechnik dahingehend verändert wurde, dass sie eine isolierte Nukleinsäure enthält, die sonst in der Pflanze nicht vorliegen würde. Im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet der Ausdruck „Pflanze” eine ganze Pflanze, Pflanzenzellen und Pflanzenteile. Zu Pflanzenteilen zählen, jedoch nicht einschränkend: Stängel, Wurzeln, Ovula, Staubblätter, Blätter, Embryonen, meristematische Regionen, Kallusgewebe, Gametophyten, Sporophyten, Pollen, Mikrosporen und dergleichen. Die erfindungsgemäße transgene Pflanze kann pollensteril oder pollenfertil sein und kann weiterhin Transgene beinhalten, bei denen es sich nicht um diejenigen, die die im vorliegenden Text beschriebenen isolierten Polynukleotide beinhalten, handelt.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Sorte” auf eine Gruppe von Pflanzen innerhalb einer Art, denen konstante Charakteristika gemeinsam sind, die sie von der typischen Form und von anderen möglichen Sorten innerhalb dieser Art unterscheiden. Eine Sorte weist nicht nur mindestens ein unterscheidbares Merkmal auf, sondern ist auch durch ein gewisses Ausmaß an Variation zwischen den Einzelorganismen innerhalb der Sorte gekennzeichnet, und zwar in erster Linie auf Grundlage der Mendelschen Aufspaltung der Merkmale unter der Nachkommenschaft von aufeinander folgenden Generationen. Eine Sorte gilt als „reinerbig” für ein bestimmtes Merkmal, wenn sie genetisch für dieses Merkmal so stark homozygot ist, dass, wenn die reinerbige Sorte selbstbestäubt wird, kein wesentliches Ausmaß an unabhängiger Aufspaltung dieses Merkmals innerhalb der Nachkommenschaft beobachtet wird. Bei der vorliegenden Erfindung entsteht das Merkmal aufgrund der transgenen Expression von einem oder mehreren isolierten Polynukleotiden, die in eine Pflanzensorte eingeführt werden. Ebenso im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „Wildtypsorte” eine Gruppe von Pflanzen, die aus Vergleichszwecken als Kontrollpflanze analysiert werden, wobei die Pflanze der Wildtypsorte mit der transgenen Pflanze (Pflanze, die mit einem erfindungsgemäßen Isolierten Polynukleotid transformiert wurde) mit der Ausnahme, dass die Pflanze der Wildtypsorte nicht mit einen erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotid transformiert wurde, identisch ist. Der Begriff „Wildtyp” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf eine Pflanzenzelle, einen Samen, einen Pflanzenbestandteil, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan oder eine ganze Pflanze, die/der/das nicht mit einem erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotid genetisch modifiziert worden ist.
Der Begriff „Kontrollpflanze” bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf eine Pflanzenzelle, ein Explantat, einen Samen, einen Pflanzenbestandteil, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan oder eine ganze Pflanze, die/der/das verwendet wird, um einen Vergleich gegen eine transgene oder genetisch modifizierte Pflanze anzustellen, um einen verbesserten Phänotyp oder ein wünschenswertes Merkmal in der transgenen Pflanze oder der genetisch modifizierten Pflanze zu identifizieren. Bei einer „Kontrollpflanze” kann es sich in manchen Fällen um eine transgene Pflanzenlinie handeln, die einen Blankvektor oder ein Markergen umfasst, jedoch das interessierende rekombinante Polynukleotid, das in der transgenen Pflanze oder der genetisch modifizierten Pflanze, die ausgewertet wird, vorhanden ist, nicht enthält. Eine Kontrollpflanze kann eine Pflanze derselben Linie oder Sorte wie die transgene Pflanze oder die genetisch modifizierte Pflanze, die geprüft wird, sein oder eine andere Linie oder Sorte, wie eine Pflanze, von der bekannt ist, dass sie einen spezifischen Phänotyp, ein spezifisches Charakteristikum oder einen bekannten Genotyp aufweist. Eine geeignete Kontrollpflanze würde eine genetisch nichtmodifizierte bzw. nichttransgene Pflanze der Elternlinie, die eingesetzt wurde, um eine transgene Pflanze im vorliegenden Zusammenhang zu erzeugen, beinhalten.
Wie im vorliegenden Zusammenhang definiert sind die Begriffe „Nukleinsäure” und „Polynukleotid” austauschbar und beziehen sich auf RNA oder DNA, die geradkettig oder verzweigt, einzel- oder doppelsträngig oder ein Hybrid davon ist. Der Begriff umfasst auch RNA/DNA-Hybride. Ein „isoliertes” Nukleinsäuremolekül ist eines, das von den anderen Nukleinsäuremolekülen, die in dem natürlichen Ausgangsmaterial der Nukleinsäure vorliegen (d. h. Sequenzen, die für andere Polypeptide kodieren), im Wesentlichen getrennt ist. So zum Beispiel wird eine klonierte Nukleinsäure als isoliert betrachtet. Eine Nukleinsäure wird auch dann als isoliert betrachtet, wenn sie durch das Eingreifen des Menschen verändert wurde oder an einem Lokus oder einer Stelle platziert wurde, bei dem/der es sich nicht um ihren natürlichen Ort handelt, oder wenn sie durch Transformation in eine Zelle eingeführt wurde. Weiterhin kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, frei von einem Teil des sonstigen Zellmaterials, mit dem es auf natürliche Weise assoziiert ist, bzw. von dem Kulturmedium, wenn es mittels Rekombinationstechniken hergestellt wurde, oder chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde, sein. Obwohl es gegebenenfalls eine untranslatierte Sequenz, die sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende der Kodierregion eines Gens vorliegen kann, umfassen kann, kann es bevorzugt sein, die Sequenzen, die die Kodierregion in ihrem natürlich vorkommenden Replikon auf natürliche Weise flankieren, zu entfernen.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Umweltstress” auf eine suboptimale Bedingung, die mit Salinitätsstress, Trockenheitsstress, Stickstoffstress, Temperaturstress, Metallstress, chemischem Stress, pathogen bedingtem Stress oder oxidativem Stress oder einer beliebigen Kombination davon einhergeht. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Trockenheit” auf eine Umweltbedingung, wo die Wassermenge, die verfügbar ist, um das pflanzliche Wachstum bzw. die pflanzliche Entwicklung zu unterstützen, suboptimal ist. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Frischgewicht” auf alles in der Pflanze inklusive Wasser. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Trockengewicht” auf alles in der Pflanze außer Wasser, und er beinhaltet zum Beispiel Kohlenhydrate, Proteine, Öle und mineralische Nährstoffe.
Zur Erzeugung einer erfindungsgemäßen transgenen Pflanze kann jede beliebige Pflanzenart transformiert werden. Bei der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze kann es sich um eine dikotyle Pflanze oder eine monokotyle Pflanze handeln. Beispielhaft und nicht einschränkend können erfindungsgemäße transgene Pflanzen von jeder beliebigen der folgenden dikotylen Pflanzenfamilien abstammen: Leguminosae, darunter Pflanzen wie Erbse, Luzerne und Sojabohne; Umbelliferae, darunter Pflanzen wie Karotte und Sellerie; Salanaceae, darunter Pflanzen wie Tomate, Kartoffel, Aubergine, Tabak und Paprika; Cruciferae, insbesondere die Gattung Brassica, die Pflanzen wie Raps, Rübe, Kohl, Blumenkohl und Brokkoli beinhaltet; und A. thaliana, Compositae, darunter Pflanzen wie Salat; Malvaceae, darunter Baumwolle; Fabaceae, darunter Pflanzen wie Erdnuss und dergleichen. Erfindungsgemäße transgene Pflanzen können von monokotylen Pflanzen abstammen, wie zum Beispiel Weizen, Gerste, Sorghumhirse, Millethirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis, Hafer und Zuckerrohr. Erfindungsgemäße transgene Pflanzen können auch Bäume wie Apfel, Birne, Quitte, Pflaume, Kirsche, Pfirsich, Nektarine, Aprikose, Papaya, Mango und andere Gehölzarten, darunter Koniferen und laubabwerfende Bäume wie Pappel, Kiefer, Sequoia, Zeder, Eiche und dergleichen sein. Besonders bevorzugt sind A. thaliana, Nicotiana tabacum, Reis, Raps, Canola, Sojabohne, Mais, Baumwolle und Weizen.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die mit einer Expressionskassette transformiert ist, die in operativer Verknüpfung Folgendes umfasst: ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert; und ein Polynukleotid, das für ein chimäres NF-YB-Transkriptionsfaktorpolypeptid codiert, wobei sich eine oder mehrere Domänen aus der Reihe N-terminale Domäne, konservierte mittlere Domäne oder C-terminale Domäne bezüglich ihres Ursprungs von einer oder mehreren der anderen Domänen unterscheiden, wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist. Der erfindungsgemäße chimäre NF-YB-Transkriptionsfaktor umfasst in der angegebenen Reihenfolge eine N-terminale Domäne, eine konservierte Domäne in der Mitte und eine C-terminale Domäne. Die N-terminale Domäne kann aus P. patens, aus einer dikotylen Pflanze oder aus einer monokotylen Pflanze stammen. Die konservierte Domäne in der Mitte kann aus P. patens, aus einer dikotylen Pflanze oder aus einer monokotylen Pflanze stammen. Die C-terminale Domäne kann aus P. patens, aus einer dikotylen Pflanze oder aus einer monokotylen Pflanze stammen.
Die transgene Pflanze dieser Ausführungsform kann ein beliebiges Nukleotid umfassen, das für ein chimäres NF-YB-Transkriptionsfaktorpolypeptid codiert. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die transgene Pflanze dieser Ausführungsform ein Polynukleotid, das für einen chimären Volllängen-NF-YB-Transkriptionsfaktor codiert, wobei das Polypeptid drei Domänen umfasst, wobei die N-terminale Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 31 von SEQ ID NO: 2; den Aminosäuren 1 bis 23 von SEQ ID NO: 4; den Aminosäuren 1 bis 27 von SEQ ID NO: 6; den Aminosäuren 1 bis 31 von SEQ ID NO: 8; den Aminosäuren 1 bis 31 von SEQ ID NO: 10; den Aminosäuren 1 bis 31 von SEQ ID NO: 12; den Aminosäuren 1 bis 23 von SEQ ID NO: 14; den Aminosäuren 1 bis 23 von SEQ ID NO: 16; den Aminosäuren 1 bis 23 von SEQ ID NO: 18; den Aminosäuren 1 bis 31 von SEQ ID NO: 20; den Aminosäuren 1 bis 31 von SEQ ID NO: 22; den Aminosäuren 1 bis 31 von SEQ ID NO: 24; den Aminosäuren 1 bis 27 von SEQ ID NO: 26; den Aminosäuren 1 bis 27 von SEQ ID NO: 28; den Aminosäuren 1 bis 27 von SEQ ID NO: 30; den Aminosäuren 1 bis 31 von SEQ ID NO: 32; den Aminosäuren 1 bis 37 von SEQ ID NO: 36; den Aminosäuren 1 bis 10 von SEQ ID NO: 38; den Aminosäuren 1 bis 33 von SEQ ID NO: 40; den Aminosäuren 1 bis 29 von SEQ ID NO: 42; den Aminosäuren 1 bis 45 von SEQ ID NO: 44; den Aminosäuren 1 bis 27 von SEQ ID NO: 46; den Aminosäuren 1 bis 29 von SEQ ID NO: 48; den Aminosäuren 1 bis 16 von SEQ ID NO: 50; den Aminosäuren 1 bis 7 von SEQ ID NO: 54, den Aminosäuren 1 bis 27 von SEQ ID NO: 56; den Aminosäuren 1 bis 27 von SEQ ID NO: 57; den Aminosäuren 1 bis 27 von SEQ ID NO: 58; den Aminosäuren 1 bis 27 von SEQ ID NO: 60; den Aminosäuren 1 bis 29 von SEQ ID NO: 62; den Aminosäuren 1 bis 33 von SEQ ID NO: 70; den Aminosäuren 1 bis 45 von SEQ ID NO: 72; den Aminosäuren 1 bis 17 von SEQ ID NO: 76; den Aminosäuren 1 bis 17 von SEQ ID NO: 78; den Aminosäuren 1 bis 18 von SEQ ID NO: 80; den Aminosäuren 1 bis 13 von SEQ ID NO: 82; den Aminosäuren 1 bis 13 von SEQ ID NO: 84; den Aminosäuren 1 bis 22 von SEQ ID NO: 86; den Aminosäuren 1 bis 33 von SEQ ID NO: 88; den Aminosäuren 1 bis 18 von SEQ ID NO: 96; den Aminosäuren 1 bis 19 von SEQ ID NO: 98; den Aminosäuren 1 bis 51 von SEQ ID NO: 100; den Aminosäuren 1 bis 54 von SEQ ID NO: 110; den Aminosäuren 1 bis 55 von SEQ ID NO: 111; den Aminosäuren 1 bis 47 von SEQ ID NO: 114; den Aminosäuren 1 bis 25 von SEQ ID NO: 116; den Aminosäuren 1 bis 26 von SEQ ID NO: 118; den Aminosäuren 1 bis 17 von SEQ ID NO: 119; den Aminosäuren 1 bis 17 von SEQ ID NO: 121; den Aminosäuren 1 bis 32 von SEQ ID NO: 123, wobei die konservierte Domäne in der Mitte ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 32 bis 129 von SEQ ID NO: 2; den Aminosäuren 24 bis 121 von SEQ ID NO: 4; den Aminosäuren 28 bis 132 von SEQ ID NO: 6; den Aminosäuren 32 bis 129 von SEQ ID NO: 8; den Aminosäuren 32 bis 129 von SEQ ID NO: 10; den Aminosäuren 32 bis 129 von SEQ ID NO: 12; den Aminosäuren 24 bis 121 von SEQ ID NO: 14; den Aminosäuren 24 bis 121 von SEQ ID NO: 16; den Aminosäuren 24 bis 121 von SEQ ID NO: 18; den Aminosäuren 32 bis 136 von SEQ ID NO: 20; den Aminosäuren 32 bis 129 von SEQ ID NO: 22; den Aminosäuren 32 bis 136 von SEQ ID NO: 24; den Aminosäuren 28 bis 132 von SEQ ID NO: 26; den Aminosäuren 28 bis 125 von SEQ ID NO: 28; den Aminosäuren 28 bis 125 von SEQ ID NO: 30; den Aminosäuren 32 bis 129 von SEQ ID NO: 32; den Aminosäuren 38 bis 135 von SEQ ID NO: 36; den Aminosäuren 11 bis 105 von SEQ ID NO: 38; den Aminosäuren 34 bis 138 von SEQ ID NO: 40; den Aminosäuren 30 bis 127 von SEQ ID NO: 42; den Aminosäuren 46 bis 143 von SEQ ID NO: 44; den Aminosäuren 28 bis 125 von SEQ ID NO: 46; den Aminosäuren 30 bis 127 von SEQ ID NO: 48; den Aminosäuren 17 bis 113 von SEQ ID NO: 50; den Aminosäuren 8 bis 102 von SEQ ID NO: 54; den Aminosäuren 28 bis 125 von SEQ ID NO: 56; den Aminosäuren 28 bis 125 von SEQ ID NO: 57; den Aminosäuren 28 bis 125 von SEQ ID NO: 58; den Aminosäuren 28 bis 125 von SEQ ID NO: 60; den Aminosäuren 30 bis 126 von SEQ ID NO: 62; den Aminosäuren 30 bis 127 von SEQ ID NO: 64; den Aminosäuren 8 bis 105 von SEQ ID NO: 68; den Aminosäuren 34 bis 137 von SEQ ID NO: 70; den Aminosäuren 46 bis 143 von SEQ ID NO: 72; den Aminosäuren 16 bis 112 von SEQ ID NO: 74; den Aminosäuren 18 bis 115 von SEQ ID NO: 76; den Aminosäuren 18 bis 115 von SEQ ID NO: 78; den Aminosäuren 19 bis 116 von SEQ ID NO: 80; den Aminosäuren 14 bis 102 von SEQ ID NO: 82; den Aminosäuren 14 bis 104 von SEQ ID NO: 84; den Aminosäuren 23 bis 117 von SEQ ID NO: 86; den Aminosäuren 34 bis 131 von SEQ ID NO: 88; den Aminosäuren 32 bis 129 von SEQ ID NO: 92; den Aminosäuren 25 bis 122 von SEQ ID NO: 94; den Aminosäuren 19 bis 116 von SEQ ID NO: 96; den Aminosäuren 20 bis 117 von SEQ ID NO: 98; den Aminosäuren 52 bis 149 von SEQ ID NO: 100; den Aminosäuren 12 bis 101 von SEQ ID NO: 104; den Aminosäuren 8 bis 105 von SEQ ID NO: 106; den Aminosäuren 8 bis 105 von SEQ ID NO: 108; den Aminosäuren 3 bis 105 von SEQ ID NO: 109; den Aminosäuren 55 bis 152 von SEQ ID NO: 110; den Aminosäuren 56 bis 153 von SEQ ID NO: 111; den Aminosäuren 1 bis 97 von SEQ ID NO: 113; den Aminosäuren 48 bis 145 von SEQ ID NO: 114; den Aminosäuren 26 bis 123 von SEQ ID NO: 116; den Aminosäuren 27 bis 124 von SEQ ID NO: 118; den Aminosäuren 18 bis 115 von SEQ ID NO: 119; den Aminosäuren 18 bis 115 von SEQ ID NO: 121; den Aminosäuren 33 bis 130 von SEQ ID NO: 123 und wobei die C-terminale Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 130 bis 218 von SEQ ID NO: 2; den Aminosäuren 122 bis 190 von SEQ ID NO: 4; den Aminosäuren 133 bis 185 von SEQ ID NO: 6; den Aminosäuren 130 bis 218 von SEQ ID NO: 8; den Aminosäuren 130 bis 198 von SEQ ID NO: 10; den Aminosäuren 130 bis 198 von SEQ ID NO: 12; den Aminosäuren 122 bis 210 von SEQ ID NO: 14; den Aminosäuren 122 bis 190 von SEQ ID NO: 16; den Aminosäuren 122 bis 210 von SEQ ID NO: 18; den Aminosäuren 137 bis 225 von SEQ ID NO: 20; den Aminosäuren 130 bis 182 von SEQ ID NO: 22; den Aminosäuren 137 bis 189 von SEQ ID NO: 24; den Aminosäuren 133 bis 221 von SEQ ID NO: 26; den Aminosäuren 126 bis 178 von SEQ ID NO: 28; den Aminosäuren 126 bis 214 von SEQ ID NO: 30; den Aminosäuren 130 bis 218 von SEQ ID NO: 32; den Aminosäuren 89 bis 150 von SEQ ID NO: 34; den Aminosäuren 136 bis 189 von SEQ ID NO: 36; den Aminosäuren 106 bis 301 von SEQ ID NO: 38; den Aminosäuren 139 bis 175 von SEQ ID NO: 40; den Aminosäuren 128 bis 264 von SEQ ID NO: 42; den Aminosäuren 144 bis 261 von SEQ ID NO: 44; den Aminosäuren 126 bis 178 von SEQ ID NO: 46; den Aminosäuren 128 bis 180 von SEQ ID NO: 48; den Aminosäuren 114 bis 164 von SEQ ID NO: 50; den Aminosäuren 82 bis 165 von SEQ ID NO: 52; den Aminosäuren 103 bis 294 von SEQ ID NO: 54; den Aminosäuren 126 bis 164 von SEQ ID NO: 56; den Aminosäuren 126 bis 178 von SEQ ID NO: 57; den Aminosäuren 126 bis 174 von SEQ ID NO: 58; den Aminosäuren 126 bis 149 von SEQ ID NO: 60; den Aminosäuren 127 bis 154 von SEQ ID NO: 62; den Aminosäuren 128 bis 189 von SEQ ID NO: 64; den Aminosäuren 85 bis 280 von SEQ ID NO: 66; den Aminosäuren 106 bis 297 von SEQ ID NO: 68; den Aminosäuren 138 bis 174 von SEQ ID NO: 70; den Aminosäuren 144 bis 262 von SEQ ID NO: 72; den Aminosäuren 113 bis 187 von SEQ ID NO: 74; den Aminosäuren 116 bis 212 von SEQ ID NO: 76; den Aminosäuren 116 bis 212 von SEQ ID NO: 78; den Aminosäuren 117 bis 118 von SEQ ID NO: 80; den Aminosäuren 103 bis 111 von SEQ ID NO: 82; den Aminosäuren 105 bis 111 von SEQ ID NO: 84; den Aminosäuren 118 bis 197 von SEQ ID NO: 86; den Aminosäuren 132 bis 278 von SEQ ID: 88; den Aminosäuren 130 bis 165 von SEQ ID NO: 92; den Aminosäuren 123 bis 178 von SEQ ID NO: 94; den Aminosäuren 117 bis 118 von SEQ ID NO: 96; den Aminosäuren 118 bis 144 von SEQ ID NO: 98; den Aminosäuren 150 bis 259 von SEQ ID NO: 100; den Aminosäuren 82 bis 118 von SEQ ID NO: 102; den Aminosäuren 102 bis 379 von SEQ ID NO: 104; den Aminosäuren 106 bis 163 von SEQ ID NO: 106; den Aminosäuren 106 bis 159 von SEQ ID NO: 108; den Aminosäuren 106 bis 275 von SEQ ID NO: 109; den Aminosäuren 153 bis 234 von SEQ ID NO: 110; den Aminosäuren 154 bis 238 von SEQ ID NO: 111; den Aminosäuren 98 bis 139 von SEQ ID NO: 113; den Aminosäuren 146 bis 160 von SEQ ID NO: 114; den Aminosäuren 124 bis 228 von SEQ ID NO: 116; den Aminosäuren 125 bis 173 von SEQ ID NO: 118; den Aminosäuren 116 bis 141 von SEQ ID NO: 119; den Aminosäuren 116 bis 161 von SEQ ID NO: 121; den Aminosäuren 131 bis 215 von SEQ ID NO: 123.
Die Erfindung stellt weiterhin einen Samen bereit, der für die hier beschriebenen Expressionskassetten (im vorliegenden Text auch als „Transgene” bezeichnet) reinerbig ist, wobei die transgenen Pflanzen, die aus diesem Samen herangezogen werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze aufweisen. Die Erfindung stellt auch ein Produkt, das aus oder von den transgenen Pflanzen, die das Polynukleotid exprimieren, ihren Pflanzenteilen oder ihren Samen produziert wird. Das Produkt kann mit verschiedenen Verfahren, die in der Fachwelt gut bekannt sind, erhalten werden. Im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet das Wort „Produkt”, jedoch ohne Einschränkung, ein Nahrungsmittel, Futtermittel, einen Nahrungsmittelzusatzstoff, einen Futtermittelzusatzstoff, Faser, Kosmetikum oder Pharmazeutikum. Als Nahrungsmittel gelten Zusammensetzungen, die für die Ernährung oder für die Ergänzung der Ernährung eingesetzt werden. Tierfuttermittel und Tierfuttermittelzusatzstoffe insbesondere gelten als Nahrungsmittel. Die Erfindung stellt weiterhin ein Agrarprodukt, das von einer beliebigen der transgenen Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzensamen produziert wird, bereit. Zu den Agrarprodukten zählen, jedoch ohne Einschränkung, Pflanzenextrakte, Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, Fette, Öle, Polymere, Vitamine und dergleichen.
Die Erfindung stellt auch ein isoliertes Polynukleotid bereit, das eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53 aufweist. Das erfindungsgemäß isolierte Polynukleotid umfasst auch ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54 codiert. Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kann unter Verwendung von standardmäßigen Techniken der Molekularbiologie und der hier bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden, zum Beispiel mit einem DNA-Syntheseautomaten.
Die erfindungsgemäßen chimären NF-YB-Polynukleotide und -Polypeptide können unter Verwendung von Homologen von einem beliebigen pflanzlichen NF-YB-Transkriptionsfaktor konstruiert werden. „Homologe” werden im vorliegenden Text als zwei Nukleinsäuren oder Polypeptide mit ähnlichen oder im Wesentlichen identischen Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen definiert. Homologe beinhalten Allelvarianten, Analoge und Orthologe, wie sie im Folgenden definiert sind. Im folgenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Analoge” auf zwei Nukleinsäuren, die dieselbe oder eine ähnliche Funktion ausüben, die jedoch getrennt in nichtverwandten Organismen im Lauf der Evolution entstanden sind. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Orthologe” auf zwei Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Arten, die jedoch im Lauf der Evolution aus einem gemeinsamen Vorfahrengen durch Artbildung entstanden sind. Der Begriff Homolog umfasst weiterhin Nukleinsäuremoleküle, die sich von den für die Herstellung der chimären NF-YB-Transkriptionsfaktoren verwendeten NF-YB-Transkrriptionsfaktorpolynukleotiden, die in Tabelle 1 beispielhaft angeführt sind, aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden und die so für dasselbe Polypeptid codieren.
Zur Bestimmung des Prozentsatzes der Sequenzidentität von zwei NF-YB-Transkriptionsfaktoraminosäuresequenzen (z. B. SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 von Tabelle 1 und ein Homolog davon) werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke als Alignment untereinander geschrieben (zum Beispiel können für ein optimales Alignment mit dem anderen Polypeptid beziehungsweise der anderen Nukleinsäure „Gaps” in die Sequenz eines Polypeptids eingeführt werden). Die Aminosäurereste an entsprechenden Aminosäurepositionen werden dann miteinander verglichen. Wird eine Position in einer Sequenz von demselben Aminosäurerest wie die entsprechende Position in der anderen Sequenz eingenommen, so sind die Moleküle an dieser Position identisch. Dieselbe Art von Vergleich kann zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen angestellt werden.
Vorzugsweise sind die NF-YB-Transkriptionsfaktoraminosäurehomologe, -analoge und -orthologe der Polypeptide der vorliegenden Erfindung mindestens ungefähr 50–60%, vorzugsweise mindestens ungefähr 60–70% und noch stärker bevorzugt mindestens ungefähr 70–75%, 75–80%, 80–85%, 85–90% oder 90–95% und am stärksten bevorzugt mindestens ungefähr 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 identisch. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäurehomolog der Erfindung eine Nukleotidsequenz, die mindestens ungefähr vorzugsweise 40–60%, mindestens ungefähr 60–70%, stärker bevorzugt mindestens ungefähr 70–75%, 75–80%, 80–85%, 85–90% oder 90–95% und noch stärker bevorzugt mindestens ungefähr 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 identisch ist.
Für die Zwecke der Erfindung wird der Prozentsatz der Identität zwischen zwei Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen unter Verwendung von Align 2.0 (Myers and Miller, CABIOS (1989) 4: 11–17), wobei alle Parameter in der Default-Einstellung vorgegeben werden, oder Software-Paket Vector NTI 9.0 (PC) (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA92008) bestimmt. Für die mit Vector NTI berechnete Bestimmung des Prozentsatzes der Identität von zwei Nukleinsäuren werden eine „gap opening penalty” von 15 und eine „gap extension penalty” von 6,66 verwendet. Für die Bestimmung des Prozentsatzes der Identität von zwei Polypeptiden werden eine „gap opening penalty” von 10 und eine „gap extension penalty” von 0,1 verwendet. Alle anderen Parameter werden in der Default-Einstellung vorgegeben. Für ein multiples Alignment (Clustal W-Algorithmus) beträgt mit der blosum62-Matrix die „gap opening penalty” 10 und die „gap extension penalty” 0,05. Es ist klar, dass beim Vergleich einer DNA-Sequenz mit einer RNA-Sequenz zwecks Bestimmung der Sequenzidentität ein Thymidinnukleotid einem Uracilnukleotid entspricht.
Nukleinsäuremoleküle, die Homologen, Analogen und Orthologen der SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 angeführten Polypeptiden entsprechen, können aufgrund ihrer Identität zu diesen Polypeptiden isoliert werden, und zwar unter Verwendung der Polynukleotide, die für die entsprechenden Polypeptide kodieren, oder hierauf beruhenden Primern als Hybridisierungssonden gemäß Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff „stringente Bedingungen” in Bezug auf die Hybridisierung für DNA an einem DNA-Blot eine Hybridisierung über Nacht bei 60°C in 10X Denhart-Lösung, 6X SSC, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA. Die Blots werden der Reihe nach bei 62°C jeweils 30 Minuten mit 3X SSC/0,1% SDS und anschließend 1X SSC/0,1% SDS, und abschließend 0,1X SSC/0,1% SDS gewaschen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet die Wendung „stringente Bedingungen” ebenfalls im vorliegenden Zusammenhang eine Hybridisierung in einer 6X SSC-Lösung bei 65°C. In einer anderen Ausführungsform bezieht sich „hochstringente Bedingungen” auf eine Hybridisierung über Nacht bei 65°C in 10X Denhart-Lösung, 6X SSC, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA. Die Blots werden der Reihe nach bei 65°C jeweils 30 Minuten mit 3X SSC/0,1% SDS und anschließend 1X SSC/0,1% SDS und abschließend 0,1X SSC/0,1 SDS gewaschen. Verfahren für Nukleinsäurehybridisierungen sind gut fachbekannt. Die in der Erfindung verwendeten isolierten Polynukleotide können optimiert werden, also genetisch dahingehend verändert werden, dass ihre Expression in einer bestimmten Pflanze oder einem bestimmten Tier erhöht wird. Zur Bereitstellung von für Pflanzen optimierten Nukleinsäuren kann die DNA-Sequenz des Gens dahingehend modifiziert werden, dass: 1) sie von stark exprimierten Pflanzengenen bevorzugte Codons umfasst; 2) sie einen A + T-Gehalt der Nukleotidbasenzusammensetzung umfasst, der im Wesentlichen in Pflanzen angetroffen wird; 3) sie eine Pflanzeninitiationssequenz bildet; 4) sie Sequenzen, die Destabilisierung, unerwünschte Polyadenylierung, Abbau und Termination der RNA verursachen oder die Sekundärstruktur-„Hairpins” oder RNA-Spleißstellen bilden, eliminiert; oder 5) Antisense-orientierte Leseraster eliminiert werden. Die erhöhte Expression von Nukleinsäuren in Pflanzen kann dadurch erzielt werden, dass man die Verteilungshäufigkeit des Codon Usage bei Pflanzen im Allgemeinen oder in einer bestimmten Pflanze verwendet. Verfahren für die Optimierung der Nukleinsäureexpression in Pflanzen finden sich in EPA 0359472 ; EPA 0385962 ; PCT-Anmeldung Nr. WO 91/16432 ; US-Patent Nr, 5,380,831 ; US-Patent Nr. 5,436,391 ; Perlack et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324-3328; und Murray et el., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 477–498.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße rekombinante Expressionsvektor ein isoliertes Polynukleotid mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53. Weiterhin umfasst der erfindungsgemäße rekombinante Expressionsvektor ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54 codiert.
Der erfindungsgemäße rekombinante Expressionsvektor beinhaltet eine oder mehrere Regulationssequenzen, die auf Grundlage der für die Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt wird und die in operativer Verknüpfung mit dem zu exprimierenden isolierten Polynukleotid steht. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet „in operativer Verknüpfung” oder „operativ verknüpft” in Bezug auf einen rekombinanten Expressionsvektor, dass das interessierende Polynukleotid so mit der Regulationssequenz bzw. den Regulationssequenzen verbunden ist, dass eine Expression des Polynukleotids möglich ist, wenn der Vektor in die Wirtszelle (z. B. in eine Bakterienzelle oder eine pflanzliche Wirtszelle) eingeführt wird. Der Begriff „Regulationssequenz” soll Promoter, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente, z. B. Polyadenulierungssignale, beinhalten.
Wie oben ausgeführt werden bei gewissen Ausführungsformen der Erfindung Promoter eingesetzt, die fähig sind, die Genexpression in Blättern zu verstärken. In manchen Ausführungsformen handelt es sich bei dem Promoter um einen blattspezifischen Promoter. In diesen Ausführungsformen der Erfindung kann jeder beliebige blattspezifische Promoter eingesetzt werden. Es sind viele solche Promoter bekannt, zum Beispiel der USP-Promoter aus Vicia faba (Baeumlein et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225, 459–67), Promoter von lichtinduzierbaren Genen wie Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase (rbcS-Promoter), Promoter von Genen, die für Chlorophyll-a/b-Bindungsproteinen (Cab) codieren, die Rubisco-Activase, die B-Untereinheit der Chloroplasten-Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase aus A. thaliana, (Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105, 357–67) und andere blattspezifische Promoter, wie diejenigen, die bei Aleman, I. (2001) Isolation and characterization of leaf-specific promoters from alfalfa (Medicago sativa), Masters thesis, New Mexico State University, Los Cruces, NM, identifiziert sind.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird ein wurzel- oder sprossspezifischer Promoter eingesetzt. So führt zum Beispiel der Super-Promoter zu einem hohen Expressionsniveau in sowohl Wurzel als auch Sprossen (Ni et al. (1995) Plant J. 7: 661–676). Zu weiteren wurzelspezifischen Promotern zählen, jedoch ohne Einschränkung, der TobRB7-Promoter (Yamamoto et al. (1991) Plant Cell 3, 371–382), der roID-Promoter (Leach et al. (1991) Plant Science 79, 69–76); die CaMV-35S-Domäne A (Benfey et al. (1989) Science 244, 174–181) und dergleichen.
In anderen Ausführungsformen wird ein konstitutiver Promoter eingesetzt. Konstitutive Promoter sind unter den meisten Bedingungen aktiv. Zu Beispielen von konstitutiven Promotern, die sich für die Verwendung in diesen Ausführungsformen eignen, zählen der Petersilie-Ubiquitinpromoter, der in WO 2003/102198 (SEQ ID NO: 65) beschrieben ist, der CaMV-19S- und -35S-Promoter, der sX-CaMV-35S-Promoter, der Sep1-Promoter, der Reis-Actin-Promoter, der Arabidopsis-Actin-Promoter, der Mais-Ubiquitinpromoter, pEmu, der Figwort Mosaic Virus 35S-Promoter, der Smas-Promoter, der „Super-Promoter” ( US-Patent Nr. 5, 955,646 ), der GRP1-8-Promoter, der Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promoter ( US-Patent Nr. 5,683,439 ), Promoter der T-DNA von Agrobacterium, wie Mannopinsynthase-Promoter, Nopalinsynthase-Promoter und Octopinsynthase-Promoter, und der Promoter der kleinen Untereinheit der Ribulosebiphosphatcarboxylase (ssuRUBISCO) und dergleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in Tabelle 1 angeführten Polynukleotide in Pflanzenzellen von höheren Pflanzen (z. B. den Spermatophyten, wie Kulturpflanzen) exprimiert. Ein Polynukleotid kann auf unterschiedliche Art und Weise in eine Pflanze „eingeführt” werden, darunter Transfektion, Transformation oder Transduktion, Elektroporation, Beschuss mit der Genkanone, Agroinfektion und dergleichen. Geeignete Verfahren für die Transformation oder Transfektion von Pflanzenzellen sind zum Beispiel unter der Verwendung der Genkanone gemäß US-Patent Nr. 4,945,050 ; 5,036,006 ; 5,100,792 ; 5,302,523 ; 5,464,765 ; 5,120,657 ; 6,084,154 und dergleichen beschrieben. Stärker bevorzugt kann der erfindungsgemäße transgene Maissamen unter Verwendung der Agrobacterium-Transformation wie in US-Pat. Nr. 5,591,616 ; 5,731,179 ; 5,981,840 ; 5,990,387 ; 6,162,965 ; 6,420,630 , der US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2002/0104132 und dergleichen beschrieben erzeugt werden. Die Transformation von Sojabohnen kann zum Beispiel unter Verwendung einer der Techniken durchgeführt werden, die in dem europäischen Patent Nr. EP 0424047 , dem US-Patent Nr. 5,322,783 , dem europäischen Patent Nr. EP 0397 687 , dem US-Patent Nr. 5,376,543 oder dem US-Patent Nr. 5,169,770 beschrieben werden. Ein spezifisches Beispiel für die Weizentransformation findet sich in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/07256 . Baumwolle kann unter Verwendung der in den US-Patenten Nr. 5,004,863 ; 5,159,135 ; 5,846,797 und dergleichen beschriebenen Verfahren transformiert werden. Reis kann unter Verwendung der in den US-Patenten Nr. 4,666,844 ; 5,350,688 ; 6,153,813 ; 6,333,449 ; 6,288,312 ; 6,365,807 ; 6,329,571 und dergleichen beschriebenen Verfahren transformiert werden. Canola kann zum Beispiel unter Verwendung von Methoden, wie sie in den US-Patenten Nr. 5,188,958 , 5,463,174 ; 5,750,871 ; EP 1566443 ; WO 02/00900 und dergleichen beschrieben werden, transformiert werden. Andere Verfahren für die Transformation von Pflanzen werden zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 5,932,782 ; 6,153,811 ; 6,140,553 ; 5,969,213 ; 6,020,539 und dergleichen beschrieben. Für die Insertion eines Transgens in eine bestimmte Pflanze kann erfindungsgemäß jegliches geeignete Verfahren für die Transformation von Pflanzen verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das eingeführte Polynukleotid in der Pflanzenzelle stabil aufrechterhalten werden, wenn es in ein nichtchromosomales autonomes Replikon eingebaut wird oder wenn es in die pflanzlichen Chromosomen integriert wird. Alternativ dazu kann das eingeführte Polynukleotid auf einem extrachromosomalen nichtreplizierenden Vektor vorliegen und kann transient exprimiert werden oder transient aktiv sein.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze umfassend mindestens ein chimäres NF-YB-Polynukleotid, wobei die Expression des Polynukleotids in der Pflanze zu einem erhöhten Wachstum und/oder Ertrag der Pflanze unter normalen Bedingungen oder wasserlimitierten Bedingungen und/oder einer erhöhten Toleranz gegenüber einem Umweltstress im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze führt, umfassend die folgenden Schritte: (a) Einführen einer oben beschriebenen Expressionskassette in eine Pflanzenzelle, und (b) ausgehend von der transformierten Pflanzenzelle Erzeugen einer transgenen Pflanze; und Selektieren von Pflanzen mit höherem Ertrag aus den regenerierten Pflanzenzellen. Bei der Pflanzenzelle kann es sich um einen Protoplasten, eine gametenproduzierende Zelle bzw. eine Zelle, die sich zu einer ganzen Pflanze regeneriert, handeln, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff „transgen” auf eine beliebige Pflanze, eine beliebige Pflanzenzelle, einen beliebigen Kallus, ein beliebiges Pflanzengewebe oder einen beliebigen Pflanzenteil, der/die/das die oben beschriebene Expressionskassette enthält. Erfindungsgemäß ist die Expressionskassette stabil in ein Chromosom oder ein stabiles extrachromosomales Element eingebaut, so dass sie an Folgegenerationen vererbt wird.
Die Auswirkung der genetischen Modifikation auf das Wachstum und/oder den Ertrag und/oder die Stresstoleranz der Pflanze kann dadurch beurteilt werden, dass man die modifizierte Pflanze unter normalen und/oder suboptimalen Bedingungen heranzieht und dann die Wachstumseigenschaften und/oder den Stoffwechsel der Pflanze analysiert. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann gut bekannt; dazu zählen Trockengewicht, Feuchtgewicht, Samengewicht, Samenanzahl, Polypeptidsynthese, Kohlen hydratsynthese, Lipidosynthese, Evapotranspirationsraten, allgemeiner Pflanzen- und/oder Kulturpflanzenertrag, Blüte, Reproduktion, Samenansatz, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Fotosyntheseraten, Stoffwechselproduktzusammensetzung usw.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht dahingehend anzusehen sind, dass sie den Erfindungsumfang auf irgendeine Weise einschränken.
BEISPIEL 1
Struktur der NF-YB-Transkriptionsfaktoren
Das Alignment der verschiedenen NF-YB-Sequenzen zeigt drei einzelne Regionen innerhalb der NF-YB-Proteinsequenzen: eine divergierende N-terminale Region, eine konservierte Domäne in der Mitte und einen divergenten C-Terminus. Die C-terminale Region scheint spezifische Aminosäurereste gehäuft zu enthalten. 1 zeigt die verschiedenen Domänen und mögliche Funktionen. Alignments der Gene sind in den 2, 3 und 4 dargestellt.
Die NF-YB-Proteinsequenzen aus P. patens (SEQ ID NO: 2), A. thaliana, (SEQ ID NO: 4) und Mais (SEQ ID NO: 6) wurden unter Verwendung von TBLASTN mit einem e-Wert-Cutoff von 1e-05 durchmustert. Mit den translatierten Proteinsequenzen wurde eine Suche gegen die PFAM-Domäne-Datenbank durchgeführt, um zu suchen, ob die konservierte Domäne, die für das NF-YB-Protein charakteristisch ist, vorhanden war. Alle Gene enthielten die PFAM-PF00808-Domäne mit Ausnahme von einer Proteinsequenz, nämlich SEQ ID NO: 44, die eine Homologie zu PF00125 enthielt). Mit diesen Proteinsequenzen wurde auch eine Rücksuche gegen öffentlich zugängliche NF-YB-Sequenzen einschließlich Arabidopsis durchgeführt, um zu bestätigen, dass sie Identitäten mit diesen Sequenzen aufweisen.

Mit den zusätzlichen Mais-NF-YB-Transkriptionsfaktoren, die in Tabelle 1 als SEQ ID NO: 34 bis SEQ ID NO: 54 angeführt sind, wurde eine Suche gegen die vorhergesagten Gene einer jüngst freigegebenen Mais-Genomsequenz (Version 2a.50) durchgeführt. In Tabelle 2 sind Proteine angeführt, die Identitäten zu den bekannten NF-YB-Genen aufwiesen (Cutoff 1e-05 in BLASTP-Suchen) und die die PFAM PF00808-Domäne enthielten. Außerdem wiesen SEQ ID NO: 44 und SEQ ID NO: 72 Homologie mit der PF00125-Domäne auf. In Tabelle 2 sind auch die phylogenetischen Gruppen, zu denen jede Sequenz gehört, angeführt. Tabelle 2

SEQ ID	Phylogenetische Gruppe
2	PP
6	ZM Gruppe 1
32	PP
46	ZM Gruppe 1
56	ZM Gruppe 1
57	ZM Gruppe 1
58	ZM Gruppe 1
48	ZM Gruppe 1
60	ZM Gruppe 1
62	ZM Gruppe 1
34	ZM Gruppe 2
64	ZM Gruppe 2
36	ZM Gruppe 2
38	ZM Gruppe 3
66	ZM Gruppe 3
54	ZM Gruppe 3
68	ZM Gruppe 3
40	ZM Gruppe 4
70	ZM Gruppe 4
44	ZM Gruppe 5
72	ZM Gruppe 5
50	ZM Gruppe 6
74	ZM Gruppe 6
76	ZM Gruppe 7
78	ZM Gruppe 7
80	ZM Gruppe 7
82	ZM Gruppe 8
84	ZM Gruppe 8
86	ZM
42	ZM
88	ZM
90	ZM
92	ZM
94	ZM
52	ZM
96	ZM
98	ZM
100	ZM
102	ZM
104	ZM
4	AT

SEQ ID	Phylogenetische Gruppe
106	AT
108	AT
109	AT
110	AT
111	AT
113	AT
114	AT
116	AT
118	AT
119	AT
121	AT
123	AT

BEISPIEL 2
Entwicklung von chimären Genen auf Grundlage der funktionellen Domänen zwecks Veränderung des pflanzlichen Phänotyps

Tabelle 3 zeigt Beispiele für chimäre Gene, die Domänen enthalten, die von P. patens (SEQ ID NO: 2) und A. thaliana (SEQ ID NO: 4) stammen. Tabelle 4 zeigt Beispiele für chimäre NFYB-Konstrukte umfassend Domänen der NF-YB-Gene aus P. patens und Mais. Ähnliche chimäre Konstrukte können mit den NF-YB-Genen aus anderen Pflanzenarten hergestellt werden. Die Gene, die für die in diesen beispielhaften chimären Konstrukten verwendeten Wildtyp-NF-YB-Proteine cordieren, sind unter der Bezeichnung SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 aufgeführt. Tabelle 3

Konstrukt	SEQ ID NO:	N-terminal	konserviert mittig	C-terminal
NFYB-C1	7/8	SEQ ID NO: 2 (CDS 1-93)	SEQ ID NO: 4 (CDS 70-363)	SEQ ID NO: 2 (CDS 388-657)
NFYB-C2	9/10	SEQ ID NO: 2 (CDS 1-93)	SEQ ID NO: 2 (CDS 94-387)	SEQ ID NO: 4 (CDS 364-573)
NFYB-C3	11/12	SEQ ID NO: 2 (CDS 1-93)	SEQ ID NO: 4 (CDS 70-363)	SEQ ID NO: 4 (CDS 364-573)
NFYB-C4	13/14	SEQ ID NO: 4 (CDS 1-69)	SEQ ID NO: 4 (CDS 70-363)	SEQ ID NO: 2 (CDS 388-657)
NFYB-C5	15/16	SEQ ID NO: 4 (CDS 1-69)	SEQ ID NO: 2 (CDS 94-387)	SEQ ID NO: 4 (CDS 364-573)
NFYB-C6	17/18	SEQ ID NO: 4 (CDS 1-69)	SEQ ID NO: 2 (CDS 94-387)	SEQ ID NO: 2 (CDS 388-657)

Tabelle 4

Konstrukt	SEQ ID NO:	N-terminal	konserviert mittig	C-terminal
NFYB-C7	19/20	SEQ ID NO: 2 (CDS 1-93)	SEQ ID NO: 6 (CDS 82-396)	SEQ ID NO: 2 (CDS 388-657)
NFYB-C8	21/22	SEQ ID NO: 2 (CDS 1-93)	SEQ ID NO: 2 (CDS 94-387)	SEQ ID NO: 6 (CDS 397-558)
NFYB-C9	23/24	SEQ ID NO: 2 (CDS 1-93)	SEQ ID NO: 6 (CDS 82-396)	SEQ ID NO: 6 (CDS 397-558)
NFYB-C10	25/26	SEQ ID NO: 6 (CDS 1-81)	SEQ ID NO: 6 (CDS 82-396)	SEQ ID NO: 2 (CDS 388-657)
NFYB-C11	27/28	SEQ ID NO: 6 (CDS 1-81)	SEQ ID NO: 2 (CDS 94-387)	SEQ ID NO: 6 (CDS 397-558)
NFYB-C12	29/30	SEQ ID NO: 6 (CDS 1-81)	SEQ ID NO: 2 (CDS 94-387)	SEQ ID NO: 2 (CDS 388-657)

Die in den Tabellen 3 und 4 angeführten Gene wurden unter Verwendung von bekannten Verfahren in eine Expressionskassette ligiert. Um die Expression der Transgene in Z mays zu kontrollieren, wurde der ScBV-Promoter (SEQ ID NO: 124) verwendet. Eine Mais-Inzuchtpflanze wurde mit Konstrukten, die die Gene enthielten, unter Verwendung von bekannten Verfahren transformiert. Mehrere unabhängige transgene Pflanzen mit einer unabhängigen Insertion einer einzelnen Kopie des Transgens (Events) wurden im Gewächshaus herangezogen und selbst bestäubt. Samen der T1-Generation wurde von jeder T0-Pflanze gewonnen und während der Selektion, Samenproduktion und Phänotyp-Prüfung separat weitergeführt. Das T1-Saatgut spaltete auf die übliche Art und Weise mit einer 3:1-Mendelschen Vererbung des Transgens. Aus diesem T1-Saatgut wurden in einem Zuchtgarten Pflanzen herangezogen und selbstbestäubt, wodurch man homozygotes Saatgut der T2-Generation erhielt. Zum Identifizieren von transgenen Pflanzen verwendete man molekulare Tests unter Verwendung von bekannten Identifizierungsverfahren, und Saatgut von diesen Pflanzen der T2-Generation wurde im Gewächshaus herangezogen. Aufgrund der unterschiedlichen Stellen der DNA-Insertion und anderen Faktoren, die das Ausmaß bzw. Muster der Genexpression beeinflussen, erwartet man eine Variation zwischen den transgenen Pflanzen, die dasselbe Transgen enthalten. Es wurden daher multiple Events mit demselben Transgen geprüft.
Die Samen wurden keimen gelassen und die Pflanzen wurden im Gewächshaus unter guten Bewässerungsbedingungen herangezogen. Fünfzehn Tage nach dem Pflanzen wurden mit einem im Handel erhältlichen Imaging-System Bilder der transgenen Pflanzen aufgenommen. Anschließend wurden die Pflanzen dadurch unter chronischem Wasserstress herangezogen, dass man nur selten goss, wodurch der Boden zwischen den Bewässerungen austrocknen konnte. 30 Tage nach dem Pflanzen wurden wiederum Bilder der transgenen Pflanzen aufgenommen. Die Pflanzen wurden destruktiv geerntet und die Sprossen wurden zu Ende des Versuchs gewogen.
Zum Vergleich der Bilder der in demselben Versuch herangezogenen transgenen Pflanzen und Kontrollpflanzen verwendete man eine Bildanalyse-Software. Mit Hilfe der Bilder wurde die relative Größe der Pflanzen bestimmt. Mit Bildern von oben und von zwei Seiten wurde das Volumen berechnet. Weitere Werte, darunter die Farbe der Pflanzen, Höhe, Breite und Fläche, wurden aufgezeichnet.

Die Tabellen 5 bis 7 zeigen den Vergleich der Größe der Maispflanzen, ausgedrückt als Volumen, Höhe und Breite, die aufgrund der Bilder berechnet wurde, und zwar unter guten Bewässerungsbedingungen und unter chronischen Wasserstressbedingungen. Die Differenz in Prozent zeigt den Wert der transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen als Prozentsatz der nichttransgenen Kontrollpflanzen; der p-Wert ist die statistische Signifikanz des Unterschieds zwischen den transgenen Pflanzen und den Kontrollpflanzen aufgrund eines t-Test-Vergleichs, wobei NS nicht signifikant auf dem 5-%-Wahrscheinlichkeitsniveau bedeutet. Tabelle 5 zeigt die Größe (Pflanzenvolumen) der transgenen Pflanzen, die die chimären NF-YB-Transgene unter der Kontrolle des ScBV-Promoters unter guten Bewässerungsbedingungen 15 Tage nach dem Pflanzen (vor dem Stress) bzw. 30 Tage nach dem Pflanzen (nach dem Stress) exprimieren. Vor dem Wasserstress waren die transgenen Pflanzen beim Großteil der unabhängigen transgenen Events kleiner als die entsprechenden nichttransgenen Kontrollpflanzen. Die Konstrukte hatten unterschiedliche Auswirkungen auf das Wachstum der Pflanzen vor und während der Stressbehandlung. Die Kontrollpflanzen waren nichttransgene Pflanzen. Eine Variation wurde auch zwischen den Events mit demselben Konstrukt beobachtet, was Unterschiede bezüglich der Stelle der T-DNA-Integration oder der Expression des Transgens nahelegte Tabelle 5

Pflanzenvolumen		Vor dem Stress		Nach dem Stress
Konstrukt ID	Event ID	Unterschied in Prozent	P-Wert	Unterschied in Prozent	P-Wert
NFYB-C1	104234431	–9,5	0,05	–1,2	0,70
NFYB-C1	104234481	–6,5	0,16	0,3	0,93
NFYB-C1	104234531	–9,1	0,05	–4,1	0,17
NFYB-C1	104234561	–16,2	0,00	–8,0	0,01
NFYB-C3	104071671	1,7	0,68	–3,8	0,26
NFYB-C3	104071681	–13,6	0,00	–0,1	0,97
NFYB-C3	104071761	8,3	0,05	0,4	0,90
NFYB-C3	104071821	-3,0	0,52	–0,7	0,83
NFYB-C3	104071971	9,9	0,02	0,5	0,87
NFYB-C3	104092431	–43,9	0,00	–4,7	0,14
NFYB-C6	104369081	2,0	0,65	0,4	0,91
NFYB-C6	104369121	–56,7	0,00	–15,1	0,00
NFYB-C6	104369141	–55,4	0,00	–14,3	0,00
NFYB-C6	104381411	–59,7	0,00	–13,7	0,00

Tabelle 6 zeigt die Länge von transgenen Pflanzen, die die chimären NF-YB-Transgene unter der Kontrolle des SCBV-Promoters unter guten Bewässerungsbedingungen 15 Tage nach der Behandlung (vor dem Stress) und 30 Tage nach dem Pflanzen (nach dem Stress) exprimierten. Die Konstrukte hatten unterschiedliche Auswirkungen auf das Wachstum der Pflanzen vor und während der Stressbehandlung. Die Kontrollpflanzen waren nichttransgene Pflanzen. Eine Variation wurde auch zwischen den Events mit demselben Konstrukt beobachtet, was Unterschiede bezüglich der Stelle der T-DNA-Integration oder der Expression des Transgens nahelegte. Tabelle 6

Pflanzenlänge		Vor dem Stress		Nach dem Stress
Konstruct ID	Event ID	Unterschied in Prozent	P-Wert	Unterschied in Prozent	P-Wert
NFYB-C1	104234431	–7,5	0,01	–1,2	0,56
NFYB-C1	104234481	1,2	0,69	–4,8	0,02
NFYB-C1	104234531	–4,4	0,15	–5,2	0,01
NFYB-C1	104234561	–4,8	0,11	–6,8	0,00
NFYB-C3	104071671	5,9	0,01	–3,5	0,08
NFYB-C3	104071681	–2,4	0,26	0,8	0,70
NFYB-C3	104071761	4,5	0,04	–1,8	0,37
NFYB-C3	104071821	1,1	0,66	–3,6	0,10
NFYB-C3	104071971	9,3	0,00	–3,5	0,09
NFYB-C3	104092431	–12,2	0,00	–0,6	0,77
NFYB-C6	104369081	2,4	0,27	–2,6	0,23
NFYB-C6	104369121	–27,7	0,00	–6,3	0,00
NFYB-C6	104369141	–27,9	0,00	–7,4	0,00
NFYB-C6	104381411	–30,0	0,00	–5,8	0,01

Tabelle 7 zeigt die Breite von transgenen Pflanzen, die die chimären NF-YB-Transgene unter der Kontrolle des SCBV-Promoters unter guten Bewässerungsbedingungen 15 Tage nach der Behandlung (vor dem Stress) und 30 Tage nach dem Pflanzen (nach dem Stress) exprimierten. Die Konstrukte hatten unterschiedliche Auswirkungen auf das Wachstum der Pflanzen vor und während der Stressbehandlung. Die Kontrollpflanzen waren nichttransgene Pflanzen. Eine Variation wurde auch zwischen den Events mit demselben Konstrukt beobachtet, was Unterschiede bezüglich der Stelle der T-DNA-Integration oder der Expression des Transgens nahelegte. Tabelle 7

Pflanzenbreite		Vor dem Stress		Nach dem Stress
Konstruct ID	Event ID	Unterschied in Prozent	P-Wert	Unterschied in Prozent	P-Wert
NFYB-C1	104234431	–5,9	0,01	–2,9	0,30
NFYB-C1	104234481	–5,6	0,01	–9,4	0,00
NFYB-C1	104234531	–0,7	0,70	1,7	0,52
NFYB-C1	104234561	–13,9	0,00	–5,2	0,04
NFYB-C3	104071671	4,8	0,03	–4,3	0,12
NFYB-C3	104071681	–5,7	0,01	–6,4	0,03
NFYB-C3	104071761	2,9	0,19	1,1	0,70
NFYB-C3	104071821	–6,8	0,01	–3,5	0,24
NFYB-C3	104071971	3,5	0,12	–4,9	0,08
NFYB-C3	104092431	–25,8	0,00	–1,6	0,55
NFYB-C6	104369081	–1,2	0,59	–1,6	0,58
NFYB-C6	104369121	–37,8	0,00	–18,2	0,00
NFYB-C6	104369141	–28,8	0,00	–16,2	0,00
NFYB-C6	104381411	–38,3	0,00	–13,8	0,00

SEQUENZLISTE

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Transgene Pflanze, die mit einer Expressionskassette transformiert ist, die in operativer Verknüpfung Folgendes umfasst: a) ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert; b) ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid, bei dem es sich um einen chimären NF-YB-Transkriptionsfaktor handelt, codiert; wobei die transgene Pflanze einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 1, wobei das NF-YB-Polypeptid in der angegebenen Reihenfolge Folgendes umfasst: i) eine N-terminale Domäne, die von einem Physcomitrella-patens-NF-YB-Transkriptionsfaktor, einem NF-YB-Transkriptionsfaktor einer dikotylen Pflanze oder einem NF-YB-Transkriptionsfaktor einer monokotylen Pflanze abstammt; ii) eine konservierte Domäne in der Mitte, die aus einem Physcomitrella-patens-NF-YB-Transkriptionsfaktor, einem NF-YB-Transkriptionsfaktor einer dikotylen Pflanze oder einem NF-YB-Transkriptionsfaktor einer monokotylen Pflanze stammt; und iii) eine C-terminale Domäne, die aus einem Physcomitrella-patens-NF-YB-Transkriptionsfaktor, einem NF-YB-Transkriptionsfaktor einer dikotylen Pflanze oder einem NF-YB-Transkriptionsfaktor einer monokotylen Pflanze stammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 2, wobei der NF-YB-Transkriptionsfaktor einer dikotylen Pflanze aus Arabidopsis thaliana stammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 2, wobei der NF-YB-Transkriptionsfaktor einer monokotylen Pflanze aus Zea mays stammt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 1, die weiterhin als Art aus der Gruppe Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Tritikale, Reis, Gerste, Sojoabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Art, Erbse, Luzerne, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Art, Ölpalme, Kokosnuss, mehrjährige Gräser und Futterkulturpflanze definiert ist.
Samen, der für ein Transgen, das in operativer Verknüpfung Folgendes umfasst: a) ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert; b) ein isoliertes Polynukleotid, das für ein chimäres Volllängen-NF-YB-Transkriptionsfaktorpolypeptid codiert reinerbig ist, wobei eine transgene Pflanze, die aus diesem Samen herangezogen wird, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu einer Wildtyppflanze derselben Sorte, die die Expressionskassette nicht umfasst, aufweist.
Samen nach Anspruch 6, wobei das NF-YB-Polypeptid in der angegebenen Reihenfolge Folgendes umfasst: i) eine N-terminale Domäne, die von einem Physcomitrella-patens-NF-YB-Transkriptionsfaktor, einem NF-YB-Transkriptionsfaktor einer dikotylen Pflanze oder einem NF-YB-Transkriptionsfaktor einer monokotylen Pflanze abstammt; ii) eine konservierte Domäne in der Mitte, die aus einem Physcomitrella-patens-NF-YB-Transkriptionsfaktor, einem NF-YB-Transkriptionsfaktor einer dikotylen Pflanze oder einem NF-YB-Transkriptionsfaktor einer monokotylen Pflanze stammt; und iii) eine C-terminale Domäne, die aus einem Physcomitrella-patens-NF-YB-Transkriptionsfaktor, einem NF-YB-Transkriptionsfaktor einer dikotylen Pflanze oder einem NF-YB-Transkriptionsfaktor einer monokotylen Pflanze stammt.
Samen nach Anspruch 7, wobei der NF-YB-Transkriptionsfaktor der dikotylen Pflanze aus Arabidopsis thaliana stammt.
Samen nach Anspruch 8, wobei der NF-YB-Transkriptionsfaktor der monokotylen Pflanze aus Zea mays stammt.
Samen nach Anspruch 7, der weiterhin als Art aus der Gruppe Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Tritikale, Reis, Gerste, Sojoabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Art, Erbse, Luzerne, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Art, Ölpalme, Kokosnuss, mehrjährige Gräser und als Futterkulturpflanze definiert ist.
Verfahren zum Erhöhen des Ertrags einer Pflanze, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der in operativer Verknüpfung Folgendes umfasst: i) ein isoliertes Polynukleotid, das für einen Promoter codiert; und ii) ein isoliertes Polynukleotid, das für ein Volllängenpolypeptid, bei dem es sich um einen chimären NF-YB-Transkriptionsfaktor handelt, codiert; b) Regenerieren von transgenen Pflanzen aus der transformierten Pflanzenzelle; und c) Selektieren von trockenheitsresistenten Pflanzen aus den regenerierten transgenen Pflanzen.
Isoliertes Polynukleotid mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51 und SEQ ID NO: 53.
Isoliertes Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52 und SEQ ID NO: 54 codiert.