DE112019000467T5

DE112019000467T5 - Rekombinanter Mikroorganismus, Verfahren zu dessen Herstellung und seine Anwendung bei der Herstellung von Coenzym Q10

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Publication number: DE112019000467T5
Application number: DE112019000467.0T
Authority: DE
Inventors: Hongwei Yu; Shenfeng YUAN; Yongqiang Zhu; Mengyao Pan; Kai Yu; Zhirong Chen; Yong Li; Guisheng QIU; Xiaoqing Liu
Original assignee: Zhejiang University ZJU; Zhejiang NHU Co Ltd; Heilongjiang NHU Biotechnology Co Ltd; Shangyu NHU Biological Chemical Co Ltd
Current assignee: Heilongjiang Nhu Biotechnology Co Ltd S Cn; Shangyu Nhu Biological Chemical Co Ltd Sha Cn; Zhejiang Nhu Co Ltd Shaoxing Cn; Zhejiang University Hangzhou Cn
Priority date: 2018-08-28
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2020-10-01
Also published as: CN109055417A; KR102473375B1; WO2020042697A8; JP2021517806A; KR20210005632A; WO2020042697A1; CN109055417B; JP7072809B2; US20210324391A1

Abstract

Die vorliegende Offenlegung bezieht sich auf einen rekombinanten Mikroorganismus, ein Verfahren zu dessen Herstellung und seine Anwendung bei der Herstellung von Coenzym Q10. Insbesondere stellt die vorliegende Offenlegung eine Methode zur exogenen Einführung eines Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, bereit, um einen rekombinanten Mikroorganismus zu konstruieren. Dieser rekombinante Mikroorganismus eignet sich für die Herstellung von Coenzym Q10 durch Fermentationsverfahren und ist besonders geeignet für die Herstellung von oxidiertem Coenzym Q10. Der rekombinante Mikroorganismus der vorliegenden Offenbarung ist stressresistent und weist eine gute Toleranz gegenüber rauen Umgebungsbedingungen einschließlich hohem osmotischem Druck und hohem Redoxpotential auf, wodurch es ermöglicht wird, die Ausbeute an Coenzym Q10, insbesondere die Ausbeute an oxidiertem Coenzym Q10, deutlich zu erhöhen.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Offenbarung betrifft das Gebiet der Biotechnologie, insbesondere einen rekombinanten Mikroorganismus und seine Verwendung in der Herstellung von Coenzym Q10.
HINTERGRUND
Coenzym Q10 (CoQ10) ist auch als Ubichinon oder Decenchinon bekannt, und sein chemischer Name ist 2,3-Dimethoxy-5-methyl-6-decaprenylbenzochinon. Die biologische Aktivität des Coenzyms Q10 ergibt sich aus der Redox-Eigenschaft seines Chinonrings und den physikalischen und chemischen Eigenschaften seiner Seitenkette. Es ist ein natürlicher Antioxidations- und Zellstoffwechselaktivator, der von der Zelle selbst produziert wird, und hat Funktionen wie Antioxidationswirkung, Eliminierung freier Radikale, Verbesserung der Körperimmunität und Anti-Aging-Funktion. Coenzym Q10 wird häufig in der klinischen Behandlung von Krankheiten wie verschiedenen Arten von Herzkrankheiten, Krebs, Diabetes, akuter und chronischer Hepatitis und Parkinson-Krankheit eingesetzt und hat auch viele Anwendungen in Lebensmitteln, Kosmetika und Anti-Aging-Gesundheitsprodukten.
Gegenwärtig ist die mikrobielle Fermentationsmethode die wichtigste Methode zur Herstellung von Coenzym Q10. Die Verwendung der mikrobiellen Fermentationsmethode zur Herstellung von Coenzym Q10 besitzt große Wettbewerbsvorteile sowohl in Bezug auf die Qualität als auch auf die Sicherheit der Produkte und ist für die industrielle Produktion in großem Maßstab geeignet. Während des Wachstums- oder Proliferationsprozesses von Mikroorganismen, insbesondere in einer industriellen Fermentationsumgebung, ist jedoch häufig mit äußerem Druck aus verschiedenen rauen Umgebungsbedingungen zu rechnen. Beispielsweise gibt es gewisse Schwankungen bei Bedingungen wie dem osmotischen Druck, pH-Wert, gelösten Sauerstoff und Nährstoffen in der Fermentationsumgebung. Das Wachstum des Mikroorganismus wird durch diese Schwankungen beeinflusst und ist dadurch charakterisiert, dass es nicht leicht zu kontrollieren ist, und die Produktion des Coenzyms Q10 ist ebenfalls instabil. Unterdessen ist es aufgrund der Einschränkungen der Fermentationsumgebung schwierig, die Biomasse in der industriellen Produktion weiter zu erhöhen. Daher ist es notwendig, die Toleranz des Coenzym Q10-produzierenden Stammes gegenüber rauen Umgebungsbedingungen zu erhöhen, um so die Ausbeute an Coenzym Q10 weiter zu steigern.
Die beschriebenen Forschungsarbeiten über die verwandte Technologie der Fermentation von Coenzym Q10 konzentrieren sich hauptsächlich auf die Verbesserung der Produktionsmenge an Coenzym Q10 durch gentechnologische Transformation oder auf die Untersuchung des Einflusses auf die Synthese von Produkten durch die Mutagenesebehandlung von Stämmen und Experimente, in denen ein einzelner Faktor optimiert und angepasst wird. In einigen Patentdokumenten wurde auch berichtet, dass die Online-Kontrolle von Schlüsselparametern im Fermentationsprozess zur Optimierung des Fermentationsprozesses eingesetzt wird. Obwohl diese Forschungen und Technologien bestimmte Funktionen erfüllen, verbessert keine von ihnen grundlegend die Toleranz des Coenzym Q10-produzierenden Stammes gegenüber ungünstigen Umgebungsbedingungen und erreicht damit den Zweck, die Produktionskapazität zu erhöhen.
Beispielsweise schlägt Patentdokument 1 vor, den Fermentationsprozess von Coenzym Q10 synergistisch zu steuern, indem die Sauerstoffverbrauchsrate (gelöster Sauerstoff) und die elektrische Leitfähigkeit (Nährstoffzufuhrrate) angepasst werden; Patentdokument 2 passt die technologischen Parameter an, wobei die Form der Mikrobe während des Fermentationsprozesses als Beurteilungsgrundlage dient; und Patentdokument 3 verbessert die Fähigkeit eines Mikroorganismus, Coenzym Q10 durch Umwandlung von Rhodobacter sphaeroides zu synthetisieren. Das gemeinsame Merkmal dieser Technologien ist, dass das produzierte Coenzym Q10 eine Mischung aus oxidiertem Coenzym Q10 und reduziertem Coenzym Q10 ist, und der Anteil an reduziertem Coenzym Q10 relativ hoch ist. Insbesondere bei der in Patentdokument 4 beschriebenen Technologie beträgt der Gehalt an reduziertem Coenzym Q10 im vom Mikroorganismus produzierten Coenzym Q10 nach Abschluss der Fermentation 70% oder mehr.
Patentdokument 5 offenbart eine Methode zur Herstellung von oxidiertem Coenzym Q10 durch Fermentation. Die Technologie in diesem Patent ermöglicht es dem Stamm, oxidiertes Coenzym Q10 mit einem hohen Gehalt zu produzieren, indem das Oxidations-Reduktions-Potential (ORP) im späteren Stadium der Synthese und Akkumulationsstufe von Coenzym Q10 geregelt wird, wobei der Gehalt an oxidiertem Coenzym Q10 96% oder mehr beträgt. Diese Methode löst jedoch nicht Probleme wie etwa die Anhäufung von Metaboliten in der Mikrobe, die durch den oxidativen Stress des produzierenden Stammes aufgrund des hohen Redoxpotentials verursacht wird und die Hemmung des Mikrobenwachstums.
Dokumente des Standes der Technik

Patentdokument 1: CN105420417A
Patentdokument 2: CN104561154A
Patentdokument 3: CN103509729B
Patentdokument 4: US7910340B2
Patentdokument 5: CN108048496A

ZUSAMMENFASSUNG
Durch die Offenbarung zu lösende Probleme
Um die oben genannten Probleme zu lösen, die im Fermentationsprozess von Coenzym Q10, insbesondere im Fermentationsprozess von oxidiertem Coenzym Q10, bestehen, und um die Toleranz des Coenzym Q10-produzierenden Stammes gegenüber rauen Umgebungsbedingungen zu erhöhen, wird in der vorliegenden Offenbarung ein rekombinanter Mikroorganismus konstruiert. Das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, wird exogen eingeführt, wodurch die Toleranz des Coenzym Q10-produzierenden Stammes gegenüber rauen Umgebungsbedingungen erhöht wird. Er ist für die Produktion von Coenzym Q10 durch ein Fermentationsverfahren geeignet, besonders für die Produktion von oxidiertem Coenzym Q10.
Dieser rekombinante Mikroorganismus ist stressresistent und hat eine gute Toleranz gegenüber rauen Umgebungsbedingungen, einschließlich hohem osmotischem Druck und hohem Redoxpotential. Diese Eigenschaften des Mikroorganismus im Fermentationsprozess des Coenzyms Q10 können durch eine Überexpression des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, wie in SEQ ID NO: 1 dargelegt, deutlich verbessert werden.
Das globale regulatorische Protein irrE spielt als Schalter, der die entsprechenden wichtigen Gene im Organismus aktiviert, eine zentrale regulatorische Rolle bei der Reparatur von DNA-Schäden und beim Schutz vor der Reaktion auf Strahlenbelastung. Die exogene Einführung des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, kann einerseits die Toleranz des Mikroorganismus gegenüber einer Vielzahl von Belastungen wie osmotischem Druck, Oxidation, Strahlung und Hitze erhöhen. Einerseits wird die logarithmische Wachstumsphase des Stammes verlängert und die weitere Akkumulation von Biomasse gefördert, andererseits wird dem Stamm ermöglicht, während des Fermentationsprozesses ein starkes Wachstum und eine starke Stoffwechselaktivität aufrechtzuerhalten, so dass die Ausbeute an Coenzym Q10, insbesondere die Ausbeute an oxidiertem Coenzym Q10, erhöht wird.
Vorzugsweise kann in der vorliegenden Offenlegung auch ein Promotor in dem rekombinanten Vektor ausgeschaltet werden, wobei der Promotor die Expression des Gens kontrolliert, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, und es können dann durch Promotorersatz ein oder mehrere andere Promotoren eingeführt werden, um so die Expression des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, weiter zu regulieren.
Der eingefügte Promotor ist vorzugsweise ein osmoregulierter Promotor proPB gemäß SEQ ID NO: 2. Die anfängliche Expressionsintensität dieses Promotors ist gering, aber seine Expressionsintensität wird mit dem Anstieg des osmotischen Drucks zunehmen, so dass die Expressionsmenge des globalen regulatorischen Proteins irrE mit dem Anstieg des osmotischen Drucks zunehmen kann und die Toleranz des Mikroorganismus gegenüber Belastungen unterschiedlicher Intensität erhöht wird.
Lösung für die Probleme
Die vorliegende Offenbarung stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines rekombinanten Mikroorganismus bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

Schritt a. Klonieren eines Gens, das für ein globales regulatorisches Protein irrE kodiert, aus einem Elternstamm, der das Gen umfasst, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert;
Schritt b. Ligieren des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, an einen Vektor und Konstruieren eines rekombinanten Vektors, der das Gen umfasst, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert; und
Schritt c. Einführen des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle, um den rekombinanten Mikroorganismus zu erhalten.

In dem oben genannten Verfahren der vorliegenden Offenbarung beinhaltet Schritt b das Ausschalten eines Promotors in dem rekombinanten Vektor, in dem der Promotor die Expression des Gens steuert, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, und dann das Einfügen eines oder mehrerer anderer unterschiedlicher Promotoren durch Promotoraustausch, um so die Expression des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, weiter zu regulieren.
In dem oben genannten Verfahren der vorliegenden Offenbarung ist der in Schritt b eingefügte Promotor ein induzierbarer Promotor, vorzugsweise ein osmoregulierter Promotor proPB. Der osmoregulierte Promotor proPB wird aus einem Polynukleotidmolekül oder einer Polynukleotidsequenz erhalten, das/die eine partielle Nukleotidsequenz von mindestens 70 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 2 umfasst, vorzugsweise mindestens 100 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NO: 2 umfasst, weiter bevorzugt mindestens 150 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NO: 2 umfasst und am meisten bevorzugt die gesamte Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 umfasst. Diese Polynukleotidsequenz hat mindestens 60 % Homologie, vorzugsweise mindestens 80 % Homologie und weiter bevorzugt mindestens 90 % Homologie mit SEQ ID NO: 2. Vorzugsweise ist der osmoregulierte Promotor proPB eine in SEQ ID NO: 2 dargestellte Nukleotidsequenz. Der osmoregulierte Promotor proPB ist aus einem Bakterium isoliert ist, das vorzugsweise Escherichia und weiter bevorzugt Escherichia coli ist.
In dem oben genannten Verfahren der vorliegenden Offenbarung ist der Vektor in Schritt b ausgewählt aus pBR322 und seinen Derivaten, pACYC177, pACYC184 und seinen Derivaten, RK2, pBBR1MCS-2 und einen Kosmid-Vektor und seinen Derivaten, und er ist vorzugsweise pBBR1MCS-2.
In dem oben genannten Verfahren der vorliegenden Offenbarung beinhaltet Schritt a das Entwerfen eines Primers gemäß einer in SEQ ID NO: 1 dargelegten DNA-Sequenz, die Verwendung einer aus dem Elternstamm extrahierten genomischen DNA als Matrize und die Synthese des Gens, das das globale regulatorische Protein irrE kodiert, durch ein PCR-Verfahren.
In dem oben genannten Verfahren der vorliegenden Offenbarung wird das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE in Schritt a kodiert, aus einem Polynukleotidmolekül oder einer Polynukleotidsequenz erhalten wird, das/die eine partielle Nukleotidsequenz von mindestens 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 1 umfasst, vorzugsweise mindestens 300 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NO: 1 umfasst, weiter bevorzugt mindestens 600 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NO: 1 umfasst, und am meisten bevorzugt die gesamte Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 umfasst. Die Polynukleotidsequenz weist mindestens 60% Homologie, vorzugsweise mindestens 80% Homologie und weiter bevorzugt mindestens 90% Homologie mit SEQ ID NO: 1 auf. Vorzugsweise ist das Gen, das das globale regulatorische Protein irrE kodiert, eine in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleotidsequenz. Der Elternstamm ist ein Bakterium, vorzugsweise Deinococcus, weiter bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Deinococcus radiodurans, Deinococcus deserti, Deinococcus gobiensis und Deinococcus proteolyticus, und am meisten bevorzugt Deinococcus radiodurans.
In dem oben genannten Verfahren der vorliegenden Offenbarung ist die Art der Einfügung in Schritt c ausgewählt ist aus Transformation, Transduktion, konjugativem Transfer und Elektroporation. Die Wirtszelle ist ausgewählt ist aus Bakterien und Pilzen, vorzugsweise einem Bakterium von Rhodobacter, und weiter bevorzugt Rhodobacter sphaeroides. Vorzugsweise beinhaltet Schritt c die Transformation des in Schritt b erhaltenen rekombinanten Vektors in eine Escherichia coli S17-1 kompetente Zelle und dann das Einführen des rekombinanten Vektors in die Wirtszelle durch konjugativen Transfer, um einen genetisch stabilen rekombinanten Mikroorganismus zu erhalten.
Die vorliegende Offenbarung stellt auch einen rekombinanten Mikroorganismus bereit, der wenigstens das oben genannte Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, und den osmoregulierten Promotor proPB umfasst.
Die vorliegende Offenbarung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q10 bereit, welches das Erzeugen eines rekombinanten Mikroorganismus unter Verwendung des oben genannten Verfahrens und das Herstellen von Coenzym Q10 unter Verwendung des oben genannten rekombinanten Mikroorganismus umfasst.
Die vorliegende Offenbarung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von oxidiertem Coenzym Q10 bereit, welches das Erzeugen eines rekombinanten Mikroorganismus unter Verwendung des oben genannten Verfahrens und das Herstellen von oxidiertem Coenzym Q10 unter Verwendung des oben genannten rekombinanten Mikroorganismus umfasst.
Wirkungen der Offenbarung
Nach intensiven Forschungen der Erfinder wurde überraschenderweise festgestellt, dass ein rekombinanter Mikroorganismus, der durch die Einführung des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, und den Promotorersatz konstruiert wurde, insbesondere ein rekombinanter Rhodobacter sphaeroides, Stressresistenz und eine gute Toleranz gegenüber rauen Umgebungsbedingungen einschließlich hohem osmotischen Druck und hohem Redoxpotential, aufweist. Einerseits wird die logarithmische Wachstumsphase des Stammes verlängert und die weitere Akkumulation von Biomasse gefördert, andererseits kann der Stamm während des Fermentationsprozesses ein kräftiges Wachstum und eine hohe Stoffwechselaktivität aufrechterhalten.
Darüber hinaus wird bei den bestehenden Technologien zur direkten Produktion von oxidiertem Coenzym Q10 im späteren Stadium der Fermentation eine große Menge an oxidiertem Coenzym Q10 in der Zelle akkumuliert, und die Mikrobe selbst ist einem starken oxidativen Stress ausgesetzt. Der rekombinante Mikroorganismus der vorliegenden Offenbarung erhöht die Toleranz der Mikrobe gegenüber oxidativem Stress und steigert signifikant die Potenz des oxidierten Coenzyms Q10, was dazu beiträgt, den Anteil des oxidierten Coenzyms Q10 an der Gesamtmenge des Coenzyms Q10 zu erhöhen.
Darüber hinaus hat sich bei der Konstruktion des oben genannten rekombinanten Mikroorganismus in der vorliegenden Offenbarung herausgestellt, dass nach dem Austausch des Promotors, der die Expression des Gens kontrolliert, das das globale regulatorische Protein irrE kodiert, durch einen proPB-Promotor, die Expression des globalen regulatorischen Proteins irrE durch Veränderung des osmotischen Drucks geregelt werden kann, um die Stressresistenz des Coenzym Q10-produzierenden Stammes stufenweise zu erhöhen und die Bedürfnisse der Mikroben-Toleranz gegenüber rauen Umgebungsbedingungen in verschiedenen Stadien des Fermentationsprozesses zu befriedigen, wodurch die Produktion von Coenzym Q10, insbesondere die Produktion von oxidiertem Coenzym Q10, begünstigt wird.
Figurenliste

1 ist eine Karte des ursprünglichen Plasmids pBBR1MCS-2.
2 ist eine Karte des rekombinanten Plasmids pBBR1MCS-2-G-proPB-IrrE.
3 ist ein Elektrophoretogramm des rekombinanten Mikroorganismus RSP-CE, der das für das globale regulatorische Protein irrE kodierende Gen enthält, bei dem aber kein Austausch gegen den osmoregulierten Promotor proPB vorgenommen wurde.
4 ist ein Elektrophoretogramm des rekombinanten Mikroorganismus RSP-BE, der das für das globale regulatorische Protein irrE kodierende Gen enthält, und bei dem ein Austausch gegen den osmoregulierten Promotor proPB vorgenommen wurde.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Mikroorganismus für die Herstellung von Coenzym Q10
Die vorliegende Offenlegung konstruiert einen rekombinanten Mikroorganismus durch exogene Einführung des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, um so die Toleranz des Coenzym Q10-produzierenden Stammes gegenüber rauen Umgebungsbedingungen zu erhöhen. Er eignet sich für die Produktion von Coenzym Q10 durch Fermentationsverfahren und ist besonders geeignet für die Produktion von oxidiertem Coenzym Q10.
Das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE der vorliegenden Offenbarung kodiert, kann aus dem Polynukleotidmolekül gewonnen werden, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert und eine partielle Nukleotidsequenz von mindestens 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 1 umfasst, vorzugsweise umfassend eine partielle Nukleotidsequenz von mindestens 300 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 1, oder weiter bevorzugt umfassend eine partielle Nukleotidsequenz von mindestens 600 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 1, und am meisten bevorzugt ein Polynukleotid, umfassend die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 stellt die gesamte Nukleotidsequenz von irrE dar, die aus Deinococcus radiodurans isoliert wurde.
Das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, kann auch aus einer langen Polynukleotidsequenz gewonnen werden, die für das globale regulatorische Protein irrE kodiert. Solche Polynukleotide können z.B. aus Bakterien isoliert werden. Vorzugsweise werden sie aus Bakterien isoliert, die zu Deinococcus gehören. Zu diesen Bakterien gehören unter anderem Deinococcus radiodurans, Deinococcus deserti, Deinococcus gobiensis und Deinococcus proteolyticus.
Wenn solche Polynukleotide aus einer langen Polynukleotidsequenz erhalten werden, ist es möglich, die Homologie zwischen dieser Polynukleotidsequenz und SEQ ID NO: 1 zu bestimmen. In diesem Fall wird vorzugsweise eine Region mit mindestens 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden ausgewählt und mit den entsprechenden Fragmenten, die von anderen Polynukleotiden abgeleitet sind, verglichen. Wenn die Polynukleotidsequenz beispielsweise 60 Nukleotide aufweist, die mit dem entsprechenden Fragment identisch sind, das aus SEQ ID NO: 1 erhältlich ist (durch Vergleich von 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden), dann beträgt die Homologie 60%. Vorzugsweise hat die partielle Polynukleotidsequenz der vorliegenden Offenbarung mindestens 80% Homologie und weiter bevorzugt mindestens 90% Homologie mit SEQ ID NO: 1. Zur Bestimmung der Homologie wird zum Beispiel ein Fragment von mindestens 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, vorzugsweise ein Fragment von mindestens 300 aufeinanderfolgenden Nukleotiden und weiter bevorzugt ein Fragment von mindestens 500 aufeinanderfolgenden Nukleotiden verwendet.
Fachleute verstehen die unten beschriebene Tatsache. Einige Fragmente im Polypeptid sind für die biologischen Funktionen notwendig. Es gibt jedoch auch andere Bereiche, in denen eine Aminosäure eingefügt, entfernt oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden kann, vorzugsweise durch solche Aminosäuren, die der zu ersetzenden Aminosäure ähnlich sind.
Ferner ist es das Ziel der vorliegenden Offenbarung, einen Mikroorganismus bereitzustellen, der geeignet ist, oxidiertes Coenzym Q10 mit einem hohen Gehalt zu produzieren. Patentdokument 5 offenbart eine Fermentationsmethode, bei der der Gehalt an oxidiertem Coenzym Q10 in dem vom Mikroorganismus produzierten Coenzym Q10 durch Kontrolle des ORP der Fermentationsbrühe erhöht wird. Diese Veröffentlichung ist hier durch Verweis inbegriffen.
Wir haben festgestellt, dass unter geeigneten Kulturbedingungen der stressresistente Mikroorganismus zur weiteren Optimierung der direkten Produktion von oxidiertem Coenzym Q10 mit hohem Gehalt eingesetzt werden kann.
Die Begriffe „direkte Produktion“, „direkte Fermentation“, „direkte Transformation“ und dergleichen bedeuten, dass der Mikroorganismus in der Lage ist, ein bestimmtes Substrat über einen oder mehrere biologische Transformationsschritte in ein spezifisches Produkt umzuwandeln, ohne dass ein zusätzlicher chemischer Transformationsschritt erforderlich ist, wie z.B. die Unterwerfung des durch Extraktion erhaltenen reduzierten Coenzyms Q10 unter weitere Oxidationsschritte, um oxidiertes Coenzym Q10 zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Mikroorganismus, der zur Produktion von Coenzym Q10 verwendet wird
Der Erfinder hat den Mikroorganismus, der zur Herstellung von Coenzym Q10 verwendet wird, gentechnisch so verändert, dass die Produktion von Coenzym Q10 optimiert wird.
Die Herstellung des zur Produktion von Coenzym Q10 gemäß der vorliegenden Offenbarung verwendeten Mikroorganismus beinhaltet die folgenden Schritte:

Schritt a. Klonieren eines Gens, das für ein globales regulatorisches Protein irrE kodiert, aus einem Elternstamm, der das Gen umfasst, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert;
Schritt b. Ligieren des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, an einen Vektor und Konstruieren eines rekombinanten Vektors, der das Gen umfasst, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert; und
Schritt c. Konstruieren eines rekombinanten Mikroorganismus, der das Gen umfasst, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, durch ein zum Einführen des Vektors in eine Wirtszelle geeignetes Verfahren, wie beispielsweise Transformation, Transduktion, konjugativen Transfer und/oder Elektroporation, und die Wirtszelle so der rekombinante Organismus der vorliegenden Offenbarung wird.

Wenn in Schritt a das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, aus einem Stamm isoliert wird, der das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, enthält, können in diesem Schritt a die folgenden exemplarischen Methoden angewendet werden.

(i) Das Zielgen wird durch PCR unter Verwendung des Primers, der auf der Grundlage der hier offenbarten DNA-Sequenz entworfen wurde, mit Hilfe von im Fachbereich bekannten Methoden erhalten.
(ii) Nach dem Verdau des Genoms in mehrere Abschnitte mittels Restriktionsenzym wird das Zielgen unter Verwendung einer markierten Nukleinsäuresonde herausgesucht.
(iii) Das Zielgen wird durch im Fachbereich bekannte Methoden synthetisiert, z.B. unter Verwendung eines DNA-Synthesizers.

Sobald ein Klon erhalten wird, der das gewünschte Gen trägt, kann die Nukleotidsequenz des Zielgens mit im Fachbereich bekannten Methoden bestimmt werden.
In Schritt b kann bei der Klonierung der doppelsträngigen DNA eine Reihe von Kombinationen aus Wirt/Klonierungsvektor verwendet werden. Ein bevorzugter Vektor, der zur Expression des Gens der vorliegenden Offenbarung (d.h. des irrE-Gens) in E.coli verwendet wird, kann aus beliebigen in E.coli üblicherweise verwendeten Vektoren ausgewählt werden, z.B. pBR322 oder Derivate davon (wie pUC18 und pBluescriptll (Stratagene Cloining Systems, Calif, USA)), pACYC177 und pACYC184 sowie deren Derivate und Vektoren, die von Plasmiden mit großem Wirtsbereich abgeleitet sind, wie z.B. RK2 und pBBR1MCS-2. Ein bevorzugter Vektor, der zur Expression der Nukleotidsequenz der vorliegenden Offenbarung in Rhodobacter sphaeroides verwendet wird, wird aus beliebigen Vektoren ausgewählt, die in Rhodobacter sphaeroides, sowie in bevorzugten Klonierungsorganismen (wie E.coli) repliziert werden können. Ein bevorzugter Vektor ist ein Vektor mit einem breiten Wirtsbereich, z.B. ein Cosmid-Vektor (wie pVK100) und dessen Derivate, und pBBR1MCS-2. In einem Fall, in dem die Eigenschaften der Wirtszelle und des Vektors berücksichtigt werden, können solche Vektoren unter Verwendung beliebiger im Fachbereich bekannter Methoden wie Transformation, Transduktion, konjugativer Transfer oder Elektroporation in einen bevorzugten Wirt übertragen werden.
Die Gen-/Nukleotidsequenz von irrE, die durch die vorliegende Offenbarung bereitgestellt wird, kann unter Verwendung von im Fachbereich wohlbekannten Methoden an einen geeigneten Vektor ligiert werden. Dieser Vektor umfasst eine regulatorische Sequenz, die in der Wirtszelle funktionsfähig ist, wie z.B. einen Promotor, eine Ribosomen-Bindungsstelle und einen Transkriptionsterminator, so dass der rekombinante Vektor erzeugt wird.
In Schritt b ist es auch möglich, den Promotor in dem rekombinanten Vektor auszuschalten, in dem der Promotor die Expression des Gens steuert, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, und dann durch Promotorersatz andere unterschiedliche Promotoren einzufügen, um die Expression des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, weiter zu regulieren. Der eingefügte Promotor kann ein konstitutiver Promotor oder ein induzierbarer Promotor sein, z.B. ein ursprünglicher Promotor eines Gens, ein Promotor eines Antibiotikaresistenzgens, ein osmoregulierter Promotor, ein temperaturinduzierbarer Promotor, ein beta-Galaktosidase (lac), trp-, tac-, trc-Promotor von E.coli und jeder Promotor, der in der Wirtszelle funktionieren kann. Vorzugsweise ist dieser Promotor ein induzierbarer Promotor, insbesondere ein osmoregulierter Promotor, und noch bevorzugter ein osmoregulierter Promotor proPB.
Der osmoregulierte Promotor proPB kann aus dem Polynukleotidmolekül des osmoregulierten Promotors proPB gewonnen werden, das eine partielle Nukleotidsequenz von mindestens 70 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 2 umfasst, vorzugsweise umfassend eine partielle Nukleotidsequenz von mindestens 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 2, weiter bevorzugt umfassend eine partielle Nukleotidsequenz von mindestens 150 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 2, und am meisten bevorzugt umfassend die Polynukleotide der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 stellt die gesamte Nukleotidsequenz des aus Escherichia coli isolierten proPB-Promotors dar.
Der osmoregulierte Promotor proPB kann auch aus einer langen Polynukleotidsequenz erhalten werden, die den osmoregulierten Promotor proPB enthält. Solche Polynukleotide können z.B. aus Bakterien isoliert werden, vorzugsweise aus Escherichia, und weiter bevorzugt aus Escherichia coli. Wenn solche Polynukleotide aus einer langen Polynukleotidsequenz gewonnen werden, ist es möglich, die Homologie zwischen einer solchen Polynukleotidsequenz und SEQ ID NO: 2 zu bestimmen, wobei die Definition der Homologie die gleiche ist wie bei der vorgenannten SEQ ID NO: 1. Vorzugsweise besitzt die partielle Polynukleotidsequenz der vorliegenden Offenbarung mindestens 80% Homologie und weiter bevorzugt mindestens 90% Homologie mit SEQ ID NO: 2. Zur Bestimmung der Homologie wird zum Beispiel ein Fragment von mindestens 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden und vorzugsweise ein Fragment von mindestens 200 aufeinanderfolgenden Nukleotiden verwendet.
Zum Zweck der Expression können zusammen mit dem oben beschriebenen Promotor andere regulatorische Elemente, z.B. die in der Wirtszelle operable Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz (in diese wird eine kodierende Sequenz eingefügt, um die rekombinante Zelle der vorliegenden Offenbarung bereitzustellen) (z.B. AGGAGG und dergleichen, einschließlich natürlicher und synthetischer Sequenzen, die in der Wirtszelle operabel sind), und ein Transkriptionsterminator (invertierte Wiederholungsstruktur, einschließlich aller natürlichen und synthetischen Sequenzen) verwendet werden.
In Schritt c kann zur Konstruktion eines rekombinanten Mikroorganismus, der den rekombinanten Vektor trägt, eine Vielzahl von Gentransfermethoden verwendet werden, wie etwa Transformation, Transduktion, konjugativer Transfer oder Elektroporation. Die Methode zur Konstruktione einer rekombinanten Zelle kann aus auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut bekannten Methoden ausgewählt werden. Beispielsweise kann bei Escherichia coli ein konventionelles Transformationssystem verwendet werden. Auch ein Transduktionssystem kann bei Escherichia coli verwendet werden, und ein konjugatives Transfersystem kann bei grampositiven und gramnegativen Bakterien, wie Escherichia coli und Rhodobacter sphaeroides, weithin verwendet werden. CN103509816B offenbart ein konjugatives Transferverfahren, wobei die Konjugation in einem flüssigen Medium oder auf der Oberfläche eines festen Mediums erfolgen kann. Dem Rezeptor, der für den konjugativen Transfer verwendet wird, kann ein selektiver Marker zugesetzt werden, z.B. wird üblicherweise ein Kanamycin-resistenter Marker ausgewählt. Es kann auch ein natürlicher resistenter Marker verwendet werden, z.B. kann bei Rhodobacter sphaeroides ein Nalidixinsäure-resistenter Marker verwendet werden.
Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auch auf einen rekombinanten Vektor, der diese Polynukleotide enthält, vorzugsweise einen rekombinanten Vektor, der in einer geeigneten Wirtszelle funktionieren kann.
Mikroorganismen, die im Fachbereich üblicherweise für die Herstellung von Coenzym Q10 verwendet werden, einschließlich Bakterien, Hefe und Schimmel, können in der vorliegenden Offenbarung verwendet werden, und der oben genannte rekombinante Mikroorganismus der vorliegenden Offenbarung kann nach Anwendung gentechnischer Techniken, die im Fachbereich gut bekannt sind, auf diese Mikroorganismen erhalten werden. Zu diesen Mikroorganismen gehören insbesondere Mikroorganismen wie Agrobacterium, Agromonas, Brevundimonas, Pseudomonas, Rhodotorula, Rhizomonas, Rhodobium, Rhodoplanes, Rhodopseudomonas, Rhodobacter, Rhizobium und dergleichen, vorzugsweise Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Agromonas oligotrophica, Brevundimonas diminuta, Pseudomonas denitrificans, Rhodotorula minuta, Rhodopseudomonas palustris, Phodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides und dergleichen, und weiter bevorzugt Rhodobacter sphaeroides.
Daher bezieht sich die vorliegende Offenbarung auch auf die Wirtszelle, wie oben beschrieben, wobei die Wirtszelle einen rekombinanten Vektor aufweist, der die Polynukleotide enthält. Solche Wirtszellen werden, nachdem sie durch Gentechnik modifiziert wurden, als rekombinante Wirtszellen oder rekombinante Mikroorganismen bezeichnet.
Herstellung von Coenzym Q10 durch mikrobielle Fermentation
Das mikrobielle Fermentationsverfahren, das für die Produktion von Coenzym Q10 in der vorliegenden Offenbarung verwendet wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass der oben genannte rekombinante Mikroorganismus zur Durchführung der Fermentationsproduktion verwendet wird. Da der rekombinante Mikroorganismus der vorliegenden Offenbarung einerseits die Toleranz des Mikroorganismus gegenüber einer Vielzahl von Belastungen wie osmotischem Druck, Oxidation, Strahlung und Wärme im Vergleich zu den Coenzyms Q10-Fermentationsmethoden des Standes der Technik verbessern kann, wird einerseits die logarithmische Wachstumsphase des Stammes verlängert und die weitere Akkumulation von Biomasse gefördert, andererseits sind Wachstum und Metabolismus des Stammes kräftig, was die Potenz des Coenzyms Q10 signifikant erhöht. In dem Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann bezüglich der Bedingungen der Fermentationstechnologie, die bei der Herstellung von Coenzym Q10 unter Verwendung eines rekombinanten Mikroorganismus eingesetzt wird, auf das Patentdokument 1 verwiesen werden. Die spezifische Methode ist wie folgt.
Während des Fermentationsprozesses des Coenzym Q10-produzierenden Stammes wird die Sauerstoffverbrauchsrate zwischen 30 mmol/ l·h und 150 mmol/ l·h gehalten, während die elektrische Leitfähigkeit zwischen 5,0 ms/cm und 30,0 ms/cm gehalten wird, um das Wachstum der Mikrobe sowie die Einleitung der Coenzym Q10-Synthese und die Anreicherung von Coenzym Q10 zu begünstigen. Vorzugsweise wird während des Fermentationsprozesses des Coenzym Q10-produzierenden Stammes die Sauerstoffverbrauchsrate zwischen 30 mmol/ l·h und 90 mmol/ l·h geregelt. Vorzugsweise wird während des Fermentationsprozesses des Coenzym Q10-produzierenden Stammes die elektrische Leitfähigkeit der Fermentationsbrühe zwischen 10 ms/cm und 20 ms/cm geregelt.
Bei der Fermentationsproduktionsmethode des Coenzyms Q10 der vorliegenden Offenbarung wird die Sauerstoffverbrauchsrate über die Rührgeschwindigkeit und die Luftströmungsrate eingestellt, und die elektrische Leitfähigkeit wird durch Fließ- oder Chargenfütterung eingestellt. Darunter ist die Formel der bei Fließ- oder Chargenfütterung verwendeten Fütterungsflüssigkeit wie folgt: bezogen auf einen Liter Fütterungsflüssigkeit 8 bis 12 g Hefepulver, 5 bis 10 g (NH₄)₂SO₄, 1 bis 2 g MgSO₄, 3 bis 6 g NaCl, 2 bis 4 g KH₂PO₄, 2 bis 4 g K₂HPO₄, 1 bis 2 g CaCl₂, 0,013 bis 0,025 g Biotin. Der pH-Wert beträgt 7,0, und die elektrische Leitfähigkeit des Fütterungsmediums beträgt 13,5 ms/cm bis 23 ms/cm.
In der Fermentationsproduktionsmethode des Coenzyms Q10 der vorliegenden Offenbarung ist es möglich, nicht nur Rhodobacter sphaeroides RSP-BE zu verwenden, sondern auch Stämme, die durch physikalische oder chemische Mutagenesemethoden gezüchtet wurden, oder Stämme, die durch gentechnische Methoden modifiziert wurden.
Die Methode der vorliegenden Offenbarung ermöglicht es, dass die Potenz des Coenzyms Q10 mindestens 1000 mg/L, vorzugsweise mindestens 2000 mg/L, und weiter bevorzugt mindestens 3000 mg/L beträgt. Die Potenz von Coenzym Q10 bezieht sich auf den Gehalt von Coenzym Q10 pro Volumeneinheit der Fermentationsbrühe.
Wie aus den oben beschriebenen Gehalten ersichtlich ist, besitzt der rekombinante Mikroorganismus der vorliegenden Offenbarung offensichtliche Vorteile bei der Erhöhung der Potenz von Coenzym Q10, selbst wenn eine konventionelle Fermentationsmethode von Coenzym Q10 im Fachbereich angewendet wird. Dementsprechend ist der rekombinante Mikroorganismus der vorliegenden Offenbarung für die konventionellen Fermentationstechnologien von Coenzym Q10 im Fachbereich geeignet.
Herstellung von oxidiertem Coenzym Q10 mit einem hohen Gehalt durch mikrobielle Fermentation
Wie oben beschrieben, liegt die Verbesserung des rekombinanten Mikroorganismus der vorliegenden Offenbarung im Vergleich zum Stand der Technik auch darin, dass er in der Lage ist, die Ausbeute an oxidiertem Coenzym Q10 weiter zu erhöhen.
Durch die Verwendung spezifischer rekombinanter Mikroorganismen kann die Methode der vorliegenden Offenbarung die Toleranz gegenüber rauen Umgebungsbedingungen, einschließlich hohem osmotischen Druck und hohem Redoxpotential, signifikant erhöhen, die nachteiligen Auswirkungen auf die Mikrobe, die durch das hohe Redoxpotential in der Fermentationsproduktionsmethode des oxidierten Coenzyms Q10 hervorgerufen werden, eliminieren, den oxidativen Stress auf die unter Verwendung der Mikrobe durchgeführte Herstellung von Coenzym Q10 weiter abmildern und die Potenz des oxidierten Coenzyms Q10 erhöhen. In dem Verfahren der vorliegenden Offenbarung kann bezüglich der Bedingungen der Fermentationstechnologie, die bei der Produktion von oxidiertem Coenzym Q10 unter Verwendung der Fermentation eines rekombinanten Mikroorganismus eingesetzt werden, auf das Patentdokument 5 verwiesen werden. Die spezifische Methode ist wie folgt.
Es wird ein Verfahren zur Herstellung von oxidiertem Coenzym Q10 durch Fermentation bereitgestellt, bei dem das ORP der Fermentationsbrühe während des Fermentationsprozesses auf der Synthese- und Akkumulationsstufe des Coenzyms Q10 kontrolliert wird. Vorzugsweise wird das ORP der Fermentationsbrühe während des Fermentationsprozesses in der mittleren und späteren Phase der Synthese- und Akkumulationsphase des Coenzyms Q10 kontrolliert. Es ist auch bevorzugt, das ORP der Fermentationsbrühe in der späteren Phase der Synthese- und Akkumulationsstufe von Coenzym Q10 während des Fermentationsprozesses zu kontrollieren. Während des Fermentationsprozesses des produzierenden Stammes wird das Oxidations-Reduktions-Potential ORP der Fermentationsbrühe auf -50 bis 300 mV geregelt, vorzugsweise wird das Oxidations-Reduktions-Potential ORP der Fermentationsbrühe auf 50 bis 200 mV geregelt.
Bei dem oben genannten Fermentationsproduktionsverfahren wird während des oben beschriebenen Fermentationsprozesses die elektrische Leitfähigkeit der Fermentationsbrühe zwischen 5,0 ms/cm und 30,0 ms/cm geregelt. Vorzugsweise wird in der Wachstumsphase der Mikrobe die Sauerstoffverbrauchsrate zwischen 30 mmol/(l·h) und 150 mmol/l·h) und die elektrische Leitfähigkeit der Fermentationsbrühe zwischen 5,0 ms/cm und 30,0 ms/cm geregelt. Es ist außerdem bevorzugt, dass in der Synthese- und Akkumulationsphase des Coenzyms Q10 die Sauerstoffverbrauchsrate zwischen 60 mmol/(l·h) und 120 mmol/(l·h) und die elektrische Leitfähigkeit der Fermentationsbrühe zwischen 8,0 ms/cm und 15,0 ms/cm geregelt wird.
Bei dem oben genannten Fermentationsproduktionsverfahren wird das Oxidations-Reduktions-Potential ORP der Fermentationsbrühe auf mindestens eine der folgenden Weisen gesteuert: Steuerung des gelösten Sauerstoffs in der Fermentationsbrühe und Steuerung des pH-Wertes der Fermentationsbrühe. Es ist bevorzugt, die Steuerung des gelösten Sauerstoffs in der Fermentationsbrühe und die Steuerung des pH-Wertes der Fermentationsbrühe zu kombinieren.
Bei dem oben erwähnten Fermentationsproduktionsverfahren wird der gelöste Sauerstoff in der Fermentationsbrühe auf mindestens eine der folgenden Arten gesteuert: Steuerung der Eingangsleistung des Rührens pro Volumeneinheit des Fermentationsbehälters, Steuerung der Lufteinlassströmungsrate pro Volumeneinheit der Fermentationsbrühe und Steuerung des Innendrucks des Fermentationsbehälters. Es ist bevorzugt, zwei oder mehrere der oben beschriebenen Wege zu kombinieren, um den gelösten Sauerstoff in der Fermentationsbrühe zu steuern.
Bei dem oben genannten Fermentationsproduktionsverfahren liegt in der Synthese- und Akkumulationsstufe des Coenzyms Q10 die Eingangsleistung des Rührens pro Volumeneinheit des Fermentationsbehälters vorzugsweise zwischen 0,25 kw/m³ und 0,50 kw/m³, die Lufteinlassströmungsrate pro Volumeneinheit der Fermentationsbrühe vorzugsweise zwischen 1,0 vvm und 15,0 vvm und/oder der Innendruck des Fermentationsbehälters vorzugsweise zwischen 0,05 MPa und 0,3 MPa; weiter bevorzugt liegt die Eingangsleistung des Rührens pro Volumeneinheit des Fermentationsbehälters zwischen 0,30 kw/m³ und 0,40 kw/m³, die Lufteinlassströmungsrate pro Volumeneinheit der Fermentationsbrühe zwischen 5,0 vvm und 8,0 vvm und/oder der Innendruck des Fermentationsbehälters zwischen 0,08 MPa und 0,15 MPa.
Bei dem oben erwähnten Fermentationsproduktionsverfahren wird in der Synthese- und Akkumulationsstufe des Coenzyms Q10 der pH-Wert der Fermentationsbrühe durch Steuerung des pH-Wertes der Fermentationsbrühe zwischen 3,5 und 6,0 geregelt. Vorzugsweise wird der pH-Wert der Fermentationsbrühe durch Steuerung des pH-Wertes der Fermentationsbrühe zwischen 4,0 und 5,0 geregelt. Es ist außerdem bevorzugt, den pH-Wert der Fermentationsbrühe durch Zugabe einer Säure oder einer Base zu steuern. Es ist weiter bevorzugt, den pH-Wert der Fermentationsbrühe durch stufenweise oder kontinuierliche Zugabe der Säure oder der Base zu steuern.
Bei dem oben genannten Fermentationsproduktionsverfahren ist die Säure eine organische Säure oder eine anorganische Säure und/oder die Base ist eine organische Base oder eine anorganische Base; vorzugsweise ist die Säure eine oder zwei oder mehrere von Phosphorsäure, Salzsäure, Schwefelsäure, Milchsäure, Propionsäure, Zitronensäure und Oxalsäure, und/oder die Base ist vorzugsweise eine oder zwei oder mehrere von wässrigem Ammoniak, Natriumhydroxid und flüssigem Ammoniak; und weiter bevorzugt ist die Säure Phosphorsäure, Milchsäure oder Zitronensäure, und/oder die Base ist wässriger Ammoniak oder flüssiger Ammoniak.
Bei dem oben genannten Fermentationsproduktionsverfahren ist es möglich, nicht nur Rhodobacter sphaeroides RSP-BE zu verwenden, sondern auch Stämme, die durch physikalische oder chemische Mutageneseverfahren gezüchtet wurden, oder Stämme, die durch gentechnische Methoden modifiziert wurden.
Bei dem oben genannten Fermentationsproduktionsverfahren hat das Coenzym Q10 der Produktion einen höheren Gehalt an oxidiertem Coenzym Q10. Der Gehalt an oxidiertem Coenzym Q10 beträgt vorzugsweise 96% oder mehr, weiter bevorzugt 97% oder mehr und am meisten bevorzugt 99% oder mehr.
In dem oben genannten Fermentationsproduktionsverfahren hat das oxidierte Coenzym Q10 eine Potenz von mindestens 1000mg/l, vorzugsweise mindestens 2000mg/l, und weiter bevorzugt mindestens 3000mg/L. Die Potenz des oxidierten Coenzyms Q10 bezieht sich auf den Gehalt an oxidiertem Coenzym Q10 pro Volumeneinheit der Fermentationsbrühe.
Das oxidierte Coenzym Q10, das durch das oben genannte Fermentationsproduktionsverfahren gewonnen wird, kann für die Zubereitung aller Arten von Lebensmitteln, einschließlich funktioneller Nahrungsmittel und spezieller Gesundheitsnahrung, verwendet werden. Es kann auch für die Herstellung von Nahrungsergänzungsmitteln, Nährmitteln, Tierarzneimitteln, Getränken, Futtermitteln, Kosmetika, Arzneimitteln, Medikamenten und Präventivmedizin verwendet werden.
Die vorliegende Offenbarung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen und Beispiele ausführlich beschrieben, und die vorliegende Offenbarung ist nicht darauf beschränkt.
Beispiele
Die Konstruktion der rekombinanten Mikroorganismen in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beinhaltete die folgenden Grundoperationen.
Die in der vorliegenden Offenbarung verwendeten Medien waren wie folgt:
Die Formel des Schrägkulturmediums (100 ml) lautete: 0,8 g Hefeextrakt, 0,01 g FeSO₄, 0,13 g K₂HPO₄, 0,003 g CoCl₂, 0,2 g NaCl, 0,0001 g MnSO₄, 0,025 g MgSO₄, 0,3 g Glucose, 0,1 µg Vitamin B1, 0,1 µg Vitamin K, 0,15 µg Vitamin A und 1,5 g Agarpulver, und der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt.
Die Formel des Saatkulturmediums (100 ml) war: 0,25 g (NH₄)₂SO₄, 0,05 g Maisquellwasser, 0,14 g Hefeextrakt, 0,2 g NaCl, 0,3 g Glukose, 0,05 g K₂HPO₄, 0,05 g KH₂PO₄, 0,1 g MgSO₄, 0,01 g FeSO₄, 0,003 g CoCl₂, 0,0001 g MnSO₄, 0,8 g CaCO₃, 0,1 µg Vitamin B1, 0,1 µg Vitamin K und 0,15 µg Vitamin A, und der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt.
Die Formel des Fermentationskulturmediums (100 ml) war: 0,3 g (NH₄)₂SO₄, 0,28 g NaCl, 4 g Glucose, 0,15 g KH₂PO₄, 0,3 g Mononatriumglutamat, 0,63 g MgSO₄, 0,4 g Maisquellwasser, 0,12 g FeSO₄, 0,005 g CoCl2, 0,6 g CaCO₃, 0,1 µg Vitamin B1, 0,1 µg Vitamin K und 0,15 µg Vitamin A, und der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt.
Die Bestimmung der Potenz erfolgte wie folgt.
Probenvorbereitung: Unter Stickstoffatmosphäre wurde 1 ml der Fermentationsbrühe entnommen und in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 180 µl 1 mol/l HCl hinzugefügt. Die Mischung wurde gut durchmischt, 3 bis 5 Minuten stehen gelassen und dann in ein Wasserbad von 92°C gegeben und 30 Minuten lang erhitzt. Die Mischung wurde zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, es wurden 8 ml Auslaugungsflüssigkeit (Ethylacetat : Ethanol = 5 : 3) hinzugefügt, die Extraktion dauerte 2 h, und die resultierende Mischung wurde mittels Umkehrphasen-HPLC getestet. HPLC-Bedingungen: C18-Säule: 150 mm × 4,6 mm, mobile Phase: Methanol : Isopropanol = 75 : 25 (bezogen auf das Volumen), Flussrate: 1,00 ml/min, Nachweiswellenlänge: 275 nm, Injektionsvolumen: 40 µl, Retentionszeit: 12 min.
Der Gehalt an oxidiertem Coenzym Q10 wurde wie folgt bestimmt.
Probenvorbereitung: Unter Stickstoffatmosphäre wurde 1 ml der Fermentationsbrühe entnommen und in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 180 µl 1 mol/l HCl hinzugefügt. Die Mischung wurde gut durchmischt, 3 bis 5 Minuten stehen gelassen und dann in ein Wasserbad von 92°C gegeben und 30 Minuten lang erhitzt. Die Mischung wurde zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, es wurden 8 ml Auslaugungsflüssigkeit (Ethylacetat : Ethanol = 5: 3) hinzugefügt, die Extraktion dauerte 2 h, und die resultierende Mischung wurde mittels Umkehrphasen-HPLC getestet. HPLC-Bedingungen: Säule: YMC-Pack 250 mm × 4,6 mm, mobile Phase: Methanol/n-Hexan = 85 : 15 (bezogen auf das Volumen), Flussrate: 1ml/min, Detektionswellenlänge: 275 nm, Injektionsvolumen: 40 µl, Retentionszeit: 13,5 min für reduziertes Coenzym Q10, 22,0 min für oxidiertes Coenzym Q10.
Die Bestimmung der Biomasse erfolgte wie folgt. 10 ml der Fermentationsbrühe wurden entnommen und gewogen, 2 mol/l Salzsäurelösung hinzugefügt und der pH-Wert auf etwa 4,0 eingestellt. Die Mischung wurde 20 Minuten lang bei 80°C aufbewahrt, zentrifugiert, um den Überstand zu verwerfen, mit Wasser gewaschen, zentrifugiert, um den Überstand zu verwerfen, und 20 Stunden lang bei 60°C getrocknet. Das Ergebnis wurde gewogen, und der Mikrobengehalt in jedem Kilo der Fermentationsbrühe wurde berechnet.
Für die Bestimmung der Restglukose können technische Mittel verwendet werden, die im Fachbereich gut bekannt sind, wie z.B. eine Bestimmungsmethode mit einem Glukoseanalysator. Für die Bestimmung des gelösten Phosphats können im Fachbereich bekannte technische Mittel wie die Molybdänblau-Kolorimetrie verwendet werden.
Beispiel 1 Amplifikation des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, und Konstruktion eines rekombinanten Vektors
Das Genom von Deinococcus radiodurans wurde extrahiert (die Reagenzien wurden aus dem von Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. hergestellten Ezup Column Bacteria Genomic DNA Purification Kit gewonnen), und der Extraktionsprozess wurde gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen durchgeführt.
Gemäß der in SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz wurde die Primerdesign-Software Primer 5 verwendet, um die folgenden Primer zu entwerfen und zu erhalten: den Vorwärtsprimer irrE-F als SEQ ID Nr. 3, d.h, 5'-ccgGAATTCGTGCCCAGTGCCAACGTCGTCAGCCCCCCTTG-3' (der unterstrichene Teil war eine EcoRI-Restriktionsstelle) und den Rückwärtsprimer irrE-R, d.h. 5'-cgcGGATCCTCACTGTGCAGCGTCCTGCGGCTCGTCGTC-3' als SEQ ID Nr. 4 (der unterstrichene Teil war eine BamHI-Restriktionsstelle).

Die genomische DNA, die aus Deinococcus radiodurans extrahiert wurde, wurde als Matrize verwendet, die High-Fidelity-Primerase PrimeSTAR DNA Polymerase (bezogen von Dalian Takara Bio Corporation) und die in SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 gezeigten Primer wurden verwendet, und es wurde ein PCR-Verfahren angewendet, um das Gen des globalen regulatorischen Proteins irrE zu synthetisieren. Das folgende Standard-Reaktionssystem wurde eingesetzt.

GC Puffer	25 µl
Wasser	16 µl
dNTP	4 µl
Vorwärts-Primer	1,5 µl (10 µM)
Rückwärts-Primer	1,5 µl (10 µM)
Genomische DNA aus Deinococcus radiodurans	1,5 µl
PrimeSTAR DNA Polymerase	0,5 µl
Gesamt	50 µl

Das Amplifikationsverfahren beinhaltete 30 Zyklen, und jeder Zyklus beinhaltete Denaturierung bei 98°C für 10 Sekunden, Annealing bei 55°C für 15 Sekunden und Verlängerung bei 72°C für 1 Minute.
Das PCR-Produkt wurde entnommen und einer PCR-Reinigung unterzogen (die Reagenzien wurden aus dem Axygen PrepPCR Clean-up Kit erhalten), der Reinigungsprozess wurde gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen durchgeführt, und das aus der PCR-Reinigung resultierende Produkt wurde gewonnen.
Der Enzymverdau wurde gemäß dem Endonuklease-Standardsystem der Takara Corporation durchgeführt. Das Standardsystem war wie folgt:

EcoRI 1 µl

BamHI 1 µl

10x Puffer 3 µl

Produkt aus PCR-Reinigung 25 µl

Gesamt 30 µl

EcoRI 1 µl

BamHI 1 µl

10x Puffer 3 µl

pBBR1MCS-2Pplasmid 25 µl

Gesamt 30 µl
Das enzymatisch verdaute Produkt wurde entnommen und einer Gelextraktion unterzogen (die Reagenzien wurden aus dem Axygen PrepDNA Gel-Extraktions-Kit erhalten), der Extraktionsprozess wurde gemäß den dem Kit beiliegenden Anweisungen durchgeführt, und die extrahierten Genfragmente wurden gewonnen.
Gemäß den Anweisungen der von der Takara Corporation hergestellten T4-Ligase und in Übereinstimmung mit dem Standardsystem wurden 5,5 µl des irrE-Gens, das durch Gelextraktion gewonnen wurde, 3 µl des Plasmids pBBR1MCS-2, das durch Gelextraktion gewonnen wurde, 0,5 µl T4-Ligase und 1 µl T4-Ligase-Puffer gemischt und 60 Minuten lang in einem Wasserbad von 22°C ligiert, um ein rekombinantes Plasmid pBBR1MCS-2-irrE zu erhalten.
Beispiel 2 Substitution des osmoregulierten Promotors proPB
Der rekombinante Vektor pBBR1MCS-2-irrE wurde mit der Hitzeschockmethode in Escherichia coli BL21-kompetente Zellen transformiert, Kolonien, die auf einem LB-Plattenmedium mit 50 µg/ml Kanamycin wachsen können, wurden nacheinander auf diesem LB-Plattenmedium kultiviert, und es wurde ein genetisch stabiles rekombinantes Escherichia coli erhalten.
Das Plasmid des genetisch stabilen rekombinanten Escherichia coli wurde extrahiert (die Reagenzien wurden aus dem AxyPrep-Plasmid-DNA-Miniprep-Kit erhalten), und der Extraktionsprozess wurde gemäß den dem Kit beiliegenden Anweisungen durchgeführt.
Die PCR-Verifizierung wurde unter Verwendung der Primer irrE-F und irrE-R durchgeführt, und es wurde ein Fragment von ca. 1,0 kb erhalten, was darauf hinweist, dass das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, erfolgreich in die rekombinanten Escherichia coli eingeführt worden war.
Der Vorwärtsprimer lac-F, d.h. 5’-GCCTGGGGGTGCCTAATGAG TGAGCTAACTCACATTAATTGCG-3' (der unterstrichene Teil war die homologe Sequenz) als SEQ ID Nr. 5 und der Rückwärtsprimer lac-R, d.h. 5’-CTCATTAGGCACCCCAGGCTGTGGAATTGTGAGCGGGATAACAATTTC-3' (der unterstrichene Teil war die homologe Sequenz) als SEQ ID Nr. 6 wurden entworfen.

Als Matrize wurde die durch PCR verifizierte Plasmid-DNA der rekombinanten Escherichia coli verwendet, High-Fidelity-PrimSTAR-DNA-Polymerase der Takara Corporation (Dalian Takara Bio Corporation) und ein empfohlenes System wurden verwendet, und die Amplifikation wurde mittels zirkularisierter PCR-Methode unter Verwendung der Primer wie in SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 gezeigt durchgeführt. Es wurde ein Standard-Reaktionssystem angewendet.

GC Puffer	12,5 µl
Wasser	7 µl
dNTP	2 µl
Vorwärts-Primer	1,0 µl (10µM)
Rückwärts-Primer	1,0 µl (10µM)
Plasmid DNA aus recombinanten Escherichia coli	1,0 µl
PrimeSTAR DNA Polymerase	0,5 µl
Gesamt	25 µl

Das Amplifikationsverfahren umfasste 20 Zyklen, und jeder Zyklus beinhaltete Denaturierung bei 98°C für 10 Sekunden, Annealing bei 55°C für 15 Sekunden, und Verlängerung bei 72°C für 6 Minuten.
[Das PCR-Produkt wurde entnommen und einer PCR-Reinigung unterzogen (die Reagenzien wurden aus dem Axygen PrepPCR Clean-up Kit erhalten), der Reinigungsprozess wurde gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen durchgeführt, und das aus der PCR-Reinigung resultierende Produkt wurde gewonnen.
Das aus der PCR-Reinigung resultierende Produkt wurde durch die Hitzeschockmethode in Escherichia coli BL21-kompetente Zellen transformiert, Kolonien, die auf einem LB-Plattenmedium mit 50 µg/ml Kanamycin wachsen können, wurden nacheinander auf diesem LB-Plattenmedium kultiviert, und es wurde ein genetisch stabiles rekombinantes Escherichia coli erhalten.
Das Plasmid des genetisch stabilen rekombinanten Escherichia coli wurde extrahiert (die Reagenzien wurden aus dem AxyPrep-Plasmid-DNA-Miniprep-Kit erhalten), der Extraktionsprozess wurde gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen durchgeführt, und es wurde ein rekombinantes Plasmid pBBR1MCS-2-G-irrE erhalten, in dem der Lac-Promotor ausgeschaltet war.
Durch die von Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. durchgeführte Plasmidsequenzierung und Verifizierung wurde bestätigt, dass der Lac-Promotor ausgeknockt wurde und die Gensequenz von irrE korrekt war. Das Genom von Escherichia coli wurde extrahiert (die Reagenzien wurden aus dem von Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. hergestellten Ezup Column Bacteria Genomic DNA Purification Kit erhalten), und der Extraktionsprozess wurde gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen durchgeführt.
Der Vorwärtsprimer proPB-F, d.h. 5'- ccgCTCGAGCATGTGTGAAGTT GATCACAAATTT-3' (der unterstrichene Teil war eine Xhol-Restriktionsschnittstelle) als SEQ ID Nr. 7, und der Rückwärtsprimer proPB-R, d.h. 5'-cccAAGCTT GGAGTTGGGCCCATTTCCGCAAACG-3' (der unterstrichene Teil war eine Hindlll-Restriktionsschnittstelle) als SEQ ID Nr. 8 wurden entworfen.

Die genomische DNA, die aus Escherichia coli extrahiert wurde, wurde als Matrize verwendet, die High-Fidelity-PrimSTAR-DNA-Polymerase (bezogen von der Dalian Takara Bio Corporation) und die Primer, wie in SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8 gezeigt, wurden verwendet, und es wurde eine PCR-Methode zur Synthese des Gens des globalen regulatorischen Proteins irrE angewendet. Das folgende Standard-Reaktionssystem wurde angewendet.

GC Puffer	25 µl
Wasser	16 µl
dNTP	4 µl
Vorwärts-Primer	1,5 µl (10µM)
Rückwärts-Primer	1,5 µl (10µM)
Genomische DNA aus Escherichia coli	1,5 µl
PrimeSTAR DNA Polymerase	0,5 µl
Gesamt	50 µl

Das Amplifikationsverfahren umfasste 30 Zyklen, und jeder Zyklus beinhaltete Denaturierung bei 98°C für 10 Sekunden, Annealing bei 55°Cfür 15 Sekunden und Verlängerung bei 72°C für 1 Minute.
Das PCR-Produkt wurde entnommen und einer PCR-Reinigung unterzogen (die Reagenzien wurden aus dem Axygen PrepPCR Clean-up Kit erhalten), der Reinigungsprozess wurde gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen durchgeführt, und das aus der PCR-Reinigung resultierende Produkt wurde gewonnen.
Der Der Enzymverdau wurde gemäß dem Endonuklease-Standardsystem der Takara Corporation durchgeführt. Das Standardsystem war wie folgt:

Xhol 1 µl

Hindlll 1 µl

10x Puffer 3 µl

Produkt aus PCR-Reinigung 25 µl

Gesamt 30 µl

Xhol 1 µl

HindIII 1 µl

10×Puffer 3 µl

pBBR1MCS-2-G-irrE Plasmid 25 µl

Gesamt 30 µl
Das enzymatisch verdaute Produkt wurde entnommen und einer Gelextraktion unterzogen (die Reagenzien wurden aus dem Axygen PrepDNA Gel-Extraktions-Kit erhalten), der Extraktionsprozess wurde gemäß den dem Kit beigefügten Anweisungen durchgeführt, und die extrahierten Genfragmente wurden gewonnen.
Gemäß den Anweisungen der von der Takara Corporation hergestellten T4-Ligase und in Übereinstimmung mit dem Standardsystem wurden 5,5 µl proPB-Sequenz aus der Gelextraktion, 3 µl Plasmid pBBR1MCS-2-G-irrE aus der Gelextraktion, 0,5 µl T4-Ligase und 1 µl T4-Ligase-PUFFER gemischt und 60 Minuten lang in einem Wasserbad von 22°C ligiert, und es wurde ein rekombinantes Plasmid pBBR1MCS-2-G-proPB-irrE erhalten, wie in 2 dargestellt.
Beispiel 3 Konstruktion eines rekombinanten Mikroorganismus der das Gen umfasst, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert und den osmoregulierten Promotor proPB
Der rekombinante Vektor pBBR1MCS-2-G-proPB-irrE wurde durch die Hitzeschock-Methode in Escherichia coli S17-1 kompetente Zellen transformiert, Kolonien, die auf einem LB-Plattenmedium mit 50 µg/ml Kanamycin wachsen können, wurden auf diesem LB-Plattenmedium kultiviert, und es wurde ein rekombinantes Escheyrichia coli erhalten. Das rekombinante Escherichia coli wurde gepflückt und das Genom extrahiert. Die PCR-Verifizierung wurde unter Verwendung der Primer proPB-F und irrE-R durchgeführt, und es wurde ein Fragment von etwa 1,2 kb erhalten, was darauf hinweist, dass der proPB-Promotor und das Gen, das das globale regulatorische Protein irrE kodiert, erfolgreich in die rekombinanten Escherichia coli eingefügt worden sind. Auch durch die von Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. durchgeführte Sequenzierung und Verifizierung wurde bestätigt, dass die Sequenz mit der Sequenz im NCBI übereinstimmt.
Der rekombinante Vektor pBBR1MCS-2-G-proPB-irrE in den rekombinanten Escherichia coli wurde durch konjugativen Transfer in Rhodobacter sphaeroides eingebracht, Rhodobacter sphaeroides, das auf einem Plattenmedium mit 50 µg/ml Nalidixinsäure und Kanamycin wachsen kann, wurde drei Generationen hintereinander auf diesem Plattenmedium inokuliert und transformiert, und es wurde ein genetisch stabiler rekombinanter Rhodobacter sphaeroides RSP-BE erhalten.
Das rekombinante Rhodobacter sphaeroides wurde gepflückt und das Genom extrahiert. Die PCR-Verifizierung wurde unter Verwendung der Primer proPB-F und irrE-R durchgeführt, und es wurde ein Fragment von etwa 1,2 kb erhalten, was darauf hinweist, dass der proPB-Promotor und das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, erfolgreich in das rekombinante Rhodobacter sphaeroides RSP-BE eingefügt worden sind.
Während des Konstruktionsverfahrens des oben genannten rekombinanten Mikroorganismus waren die spezifischen Operationen zur Transformation des rekombinanten Vektors in Escherichia coli S17-1 wie folgt.
Das Röhrchen mit Escherichia coli S17-1-kompatiblen Zellen wurde herausgenommen und für 10 Minuten in ein Eisbad gelegt. Danach wurde das rekombinante Plasmid pBBR1MCS-2-G-proPB-irrE hinzugefügt. Das Röhrchen wurde 20 Minuten lang in ein Eisbad gelegt, 90 Sekunden lang einem Hitzeschock ausgesetzt und 5 Minuten lang in ein Eisbad gelegt. 600 µl LB Flüssigmedium wurde hinzugefügt. Nach einer 45-minütigen Inkubation bei 37°C wurde die Mischung 5 Minuten lang bei 5000 Upm zentrifugiert. 500 µl des Überstandes wurde verworfen, und die verbleibende Flüssigkeit wurde auf ein Plattenmedium mit Kanamycin geschmiert.
Die spezifischen Operationen des konjugativen Transfers waren wie folgt.
Rhodobacter sphaeroides wurde in einem Reagenzglas mit 10 ml flüssigem Medium beimpft und unter den Bedingungen von 30°C und 200 U/min für 50 h kultiviert.
Nach 32 Stunden wurden die positiven Klone der transformierten Escherichia coli S17-1 in LB-Flüssigmedium geimpft und unter Bedingungen von 37°C und 200 U/min über Nacht kultiviert. Nach 15 Stunden wurde Escherichia coli S17-1 inokuliert und transformiert. In jedem Reagenzglas wurden 100 µl der Bakterienlösung zu 5 ml LB-Medium und 5 µl Kanamycin hinzugefügt, und das Reagenzglas wurde zur Kultivierung in einen Schüttler bei 37°C gestellt. Nach 3- bis 4-stündiger Kultivierung wurden 4 ml Rhodobacter sphaeroides-Bakterienlösung und 2 ml Escherichia coli-Bakterienlösung entnommen und getrennt in 2-ml-Zentrifugenröhrchen mit je 1 ml in jedes Zentrifugenröhrchen gegeben, und die Zentrifugenröhrchen wurden 5 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden getrennt verworfen, 1 ml frisches LB-Medium hinzugefügt, die Bakterien wurden vorsichtig resuspendiert, und die resultierende Mischung wurde 5 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden getrennt verworfen, 1 ml frisches LB-Medium zugegeben und die Bakterien schonend resuspendiert. Die Bakterienlösung wurde gleichmäßig gemischt, wobei das Verhältnis von Rhodobacter sphaeroides zu Escherichia coli 100: 50 oder 100: 100 betrug, eine Filtermembran (0,22 µm) wurde in die Mitte der LB-Platte geklebt, und die gemischte Bakterienlösung wurde in den zentralen Bereich der Filtermembran gegossen. Die LB-Platte wurde vorsichtig in einen Inkubator bei 32°C überführt und über Nacht bebrütet.
Die Filtermembran wurde mit einer Pinzette in ein 2-mL-EP-Röhrchen überführt. Danach wurden die Bakterien auf der Filtermembran mit 500 µl LB-Flüssigmedium gewaschen, dispergiert bzw. verteilt und auf das Plattenmedium geschmiert, wobei jede Platte 350 µl Bakterienlösung enthielt, und dann in einen Inkubator bei 32°C gegeben und 72 Stunden lang kultiviert.
Ob ein Klon positiv war, wurde nach dem konjugativen Transfer getestet.
2 bis 5 gut gewachsene Kolonien wurden gepflückt und 48 bis 60 Stunden lang kultiviert, inokuliert und transformiert und für weitere 2 bis 4 Stunden kultiviert. Danach wurde das Plasmid gemäß den Arbeitsschritten in der Anleitung des Sauerstoff-Plasmid-Extraktionskits extrahiert. Es wurde ein Zentrifugenröhrchen genommen, 34 µl des in Schritt 2 aus der Extraktion gewonnenen Plasmids hinzugefügt, 1 µl Xhol und 1 µl BamHI hinzugefügt und 4 µl Puffer hinzugefügt. Das Zentrifugenröhrchen wurde in ein Wasserbad von 37°C gestellt und der Enzymaufschluss dauerte 1,5 Stunden. Nach dem Enzymaufschluss wurde die resultierende Mischung einer Elektrophorese-Detektion unterzogen, und die Elektrophorese zeigte eine klare Bande um 1,2 kb, was den Erwartungen entsprach. Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden nach der Gelextraktion einer Sequenzierung und Verifizierung unterzogen und als positive Klone bestätigt.
Der mit diesem Verfahren erhaltene Stamm wurde einer Kulturkonservierung unterzogen. Das Bakterium war Rhodobacter sphaeroides mit dem lateinischen wissenschaftlichen Namen Rhodobacter sphaeroides und wurde als RSP-BE-Stamm bezeichnet. Es wurde im China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC, Institut für Mikrobiologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, NO. 1 West Beichen Road, Distrikt Chaoyang, Peking, Postleitzahl: 100101) am 11. Juni 2018 hinterlegt, und die Hinterlegungsnummer war CGMCC Nr. 15927.
Beispiel 4 Herstellung von Coenzym Q10 unter Verwendung der Fermentation des rekombinanten Mikroorganismus
Eine einzelne Kolonie des rekombinanten Rhodobacter sphaeroides RSP-BE, die etwa 7 Tage lang auf einer Platte kultiviert worden war, wurde ausgewählt, entsprechend gepflückt und zur Kultivierung in einem kleinen Reagenzglas auf das Schrägkulturmedium übertragen. Die Schräge, auf der die Bakterien kultiviert wurden, wurde mit sterilem Wasser gewaschen und eine Bakteriensuspension mit einer Bakterienkonzentration von 10⁸ bis 10⁹ Zellen pro Milliliter hergestellt. Die zubereitete Bakteriensuspension wurde in ein Saatmedium mit einer Beimpfungsmenge von 2% beimpft und einer Saatkultur unterzogen, wobei das Volumen des Mediums 100 ml betrug, die Temperatur betrug 32°C, die Rotationsgeschwindigkeit betrug 180 U/min und die Mischung wurde 22 bis 26 Stunden kultiviert.
Der Rhodobacter sphaeroides-Stamm CGMCC Nr. 15927, der nach der Saatkultur erhalten wurde, wurde in einen 10-I-Fermentationsbehälter mit einer Inokulationsmenge von 10% beimpft. Die Inokulationsmenge könnte ein im Fachbereich üblicher Gehalt sein, z.B. 1% bis 30%, vorzugsweise 2,5% bis 20%, und weiter bevorzugt 5% bis 15%. Die Inokulationsmenge könnte nach Bedarf angepasst werden.
Die Fermentation der Saatflüssigkeit wurde in einem 10-I-Fermentationsbehälter eingeleitet, die Fermentationstemperatur betrug 31°C, der Druck im Behälter betrug 0,03 MPa, und es wurde eine Strategie zur stufenweisen Regulierung der Sauerstoffzufuhr gewählt. Von 0 bis 24 Stunden wurde die Rührgeschwindigkeit auf 500 U/min und die Luftströmungsrate auf 6 l/min geregelt. Mit dem Wachstum der Bakterien wurde OUR langsam stabil und erreichte 50 mmol/l·h. Zu diesem Zeitpunkt befanden sich die Bakterien noch in der exponentiellen Wachstumsphase, und die Sauerstoffzufuhr war zu einer wachstumsbegrenzenden Bedingung geworden. Die Höhe der Sauerstoffversorgung wurde durch Erhöhung der Rührgeschwindigkeit und des Belüftungsvolumens verbessert. OUR wurde von 24 bis 36 Stunden bei 60 mmol/l·h und von 36 bis 60 Stunden bei 70 mmol/l·h gehalten, um so das Wachstum der Bakterien zu fördern. Nach 60 Stunden traten die Bakterien dieses Stadiums allmählich in eine stabile Phase ein, die Anzahl der Bakterien nahm nicht mehr zu, und das Coenzym Q10 wurde schnell synthetisiert und akkumuliert. Die Sauerstoffzufuhr wurde allmählich reduziert, um eine hohe spezifische Produktionsrate von Coenzym Q10 aufrechtzuerhalten. OUR wurde von 60 bis 90 Stunden bei 90 mmol/l·h gehalten, von 90 bis 100 Stunden bei 80 mmol/l·h und nach 100 Stunden bei 60 mmol/l·h.
Kontrolle der Fütterungstechnologie während des Fermentationsprozesses. Zusätzlich zur Fütterung von Glukose und Kaliumdihydrogenphosphat in der Fermentationstechnologie auf der Basis der Restglukose und des gelösten Phosphats wie im Fachbereit bekannt, begann in der vorliegenden Offenbarung die Fließfütterung des Mediums, als die elektrische Leitfähigkeit auf 15,0 ms/cm sank. Die Formel des Fütterungsmediums lautete wie folgt. Jeder Liter der Fütterungsflüssigkeit enthielt 12 g Hefepulver, 10 g (NH₄)₂SO₄, 2 g MgSO₄, 6 g NaCl, 4 g KH₂PO₄, 4 g K₂HPO₄, 2 g CaCl₂ und 0,025 g Biotin, und der pH-Wert betrug 7,0. Die Zufuhrgeschwindigkeit des Mediums wurde so gesteuert, dass die elektrische Leitfähigkeit innerhalb von 15 ms/cm gehalten wurde und die Restglukose während des gesamten Prozesses bei 2,0 % gehalten wurde. Nach 110 Stunden, wenn die Fermentation abgeschlossen war, wurde teilweise Fermentationsbrühe entnommen, extrahiert und unter Inertgasatmosphäre untersucht. Die gemessene Potenz betrug 3637 mg/l, und die Biomasse betrug 125 g/kg.
Beispiel 5 Herstellung von oxidiertem Coenzym Q10 unter Verwendung der Fermentation des rekombinanten Mikroorganismus
Eine einzelne Kolonie des rekombinanten Rhodobacter sphaeroides RSP-BE, die etwa 7 Tage lang auf einer Platte kultiviert worden war, wurde ausgewählt, entsprechend gepflückt und zur Kultivierung in einem kleinen Reagenzglas auf das Schrägkulturmedium übertragen. Die Schräge, auf der die Bakterien kultiviert wurden, wurde mit sterilem Wasser gewaschen und eine Bakteriensuspension mit einer Bakterienkonzentration von 10⁸ bis 10⁹ Zellen pro Milliliter hergestellt. Die zubereitete Bakteriensuspension wurde in ein Saatmedium mit einer Beimpfungsmenge von 2% beimpft und einer Saatkultur unterzogen, wobei das Volumen des Mediums 100 ml betrug, die Temperatur betrug 32°C, die Rotationsgeschwindigkeit betrug 180 U/min und die Mischung wurde 22 bis 26 Stunden kultiviert.
Der Rhodobacter sphaeroides-Stamm CGMCC Nr. 15927, der nach der Saatkultur erhalten wurde, wurde in einen 10-I-Fermentationsbehälter mit einer Inokulationsmenge von 10% beimpft. Die Inokulationsmenge könnte ein im Fachbereich üblicher Gehalt sein, z.B. 1% bis 30%, vorzugsweise 2,5% bis 20%, und weiter bevorzugt 5% bis 15%. Die Inokulationsmenge könnte nach Bedarf angepasst werden.
Die Fermentation der Saatflüssigkeit wurde in einem 10-I-Fermentationsbehälter eingeleitet, die Fermentationstemperatur betrug 30°C, die Lufteinlassströmungsrate pro Volumeneinheit der Fermentationsbrühe im Fermentationsbehälter wurde auf 0,4 vvm geregelt, die Eingangsleistung des Rührens pro Volumeneinheit wurde auf 0,1 kw/m³ geregelt, der Druck im Behälter betrug 0,02 MPa, die Sauerstoffverbrauchsrate wurde auf 50 mmol/(l·h) geregelt, die elektrische Leitfähigkeit der Fermentationsbrühe wurde auf 12 ms/cm geregelt, und der pH-Wert wurde auf etwa 7,0 geregelt.
Das Fütterungsmedium enthielt 12 g Hefepulver, 10 g (NH₄)₂SO₄, 2 g MgSO₄, 6 g NaCl, 4 g KH₂PO₄, 4 g K₂HPO₄, 2 g CaCl₂ und 0,025 g Biotin in jedem Liter der Fütterungsflüssigkeit, und der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt.
Nach 15 Stunden wurde die Sauerstoffzufuhr erhöht, die Lufteinlassströmungsrate pro Volumeneinheit der Fermentationsbrühe im Fermentationsbehälter auf 0,6 vvm geregelt, die Eingangsleistung des Rührens pro Volumeneinheit auf 0,2 kw/m³ geregelt, der Druck im Behälter betrug 0,04 MPa, die Sauerstoffverbrauchsrate wurde nach einem Anstieg auf 70 mmol/(l·h) konstant gehalten, die elektrische Leitfähigkeit der Fermentationsbrühe wurde auf 12 ms/cm geregelt, der pH-Wert wurde auf 7,0 geregelt, und die Fermentation wurde fortgesetzt. Die Fermentation befand sich zu diesem Zeitpunkt im Wachstumsstadium der Bakterien.
Nach 20 Stunden wurde die Sauerstoffzufuhr wieder erhöht, der Lufteinlassströmungsrate pro Volumeneinheit der Fermentationsbrühe im Fermentationsbehälter wurde auf 0,8 vvm geregelt, die Eingangsleistung des Rührens pro Volumeneinheit wurde auf 0,2 kw/m³ geregelt, der Druck im Behälter betrug 0,05 MPa, die Sauerstoffverbrauchsrate wurde nach einem Anstieg auf 90 mmol/(l·h) konstant gehalten, die elektrische Leitfähigkeit der Fermentationsbrühe wurde auf 12 ms/cm geregelt, der pH-Wert wurde auf 7,0 gereglt, und die Fermentation wurde fortgesetzt. Die Fermentation befand sich zu diesem Zeitpunkt im Wachstumsstadium der Bakterien.
Nach 10 Stunden wurde die Sauerstoffverbrauchsrate bei etwa 70 mmol/(l·h) gehalten, die elektrische Leitfähigkeit der Fermentationsbrühe auf 12 ms/cm geregelt, der pH-Wert auf etwa 6,0 geregelt und die Fermentation fortgesetzt. Die Fermentation befand sich zu diesem Zeitpunkt in der frühen Phase des Synthese- und Akkumulationsstadiums des Coenzyms Q10.
Nach 20 Stunden neigte die Zunahme der Fermentationspotenz dazu, zu diesem Zeitpunkt ein Gleichgewicht zu erreichen, und die Fermentation trat in die spätere Phase des Synthese- und Akkumulationsstadiums von Coenzym Q10 ein. Die Lufteinlassströmungsrate pro Volumeneinheit der Fermentationsbrühe im Fermentationsbehälter wurde auf 6,0 vvm geregelt, die Eingangsleistung des Rührens pro Volumeneinheit wurde auf 0,3 kw/m³ geregelt, der Druck im Behälter betrug 0,1 MPa, der pH-Wert wurde durch kontinuierliche Zugabe von Phosphorsäure über etwa 2 h auf etwa 4,0 eingestellt, die elektrische Leitfähigkeit der Fermentationsbrühe wurde auf 12 ms/cm geregelt, und die Fermentation wurde fortgesetzt. Der ORP-Wert der Fermentationsbrühe wurde nach Erreichen eines stabilen Zustands zwischen 100 und 200 mv gehalten.
Nach 15 Stunden wurde die Fermentation beendet. Fermentationsbrühe wurde teilweise entnommen, extrahiert und unter einer Inertgasatmosphäre untersucht. Die Potenz betrug 3533 mg/l, oxidiertes Coenzym Q10 : reduziertes Coenzym Q10 betrug 99,3 : 0,7, und die Biomasse betrug 123 g/kg.
Vergleichsbeispiel 1 Konstruktion eines rekombinanten Mikroorganismus ohne osmoregulierten Promotor proPB-Ersatz
Der in Beispiel 1 konstruierte rekombinante Vektor pBBR1MCS-2-irrE wurde keinem osmoregulierten Promotor proPB-Ersatz unterzogen. Der rekombinante Vektor pBBR1MCS-2-irrE wurde unter Bezugnahme auf Beispiel 3 in Escherichia coli S17-1 kompetente Zellen transformiert und auf einem LB-Medium, das Kanamycin enthält, 24 h lang kultiviert, um ein rekombinantes Escherichia coli zu erhalten. Das rekombinante Escherichia coli wurde entnommen und das Plasmid extrahiert. Die PCR-Verifizierung wurde unter Verwendung der Primer irrE-F und irrE-R durchgeführt, und es wurde ein Fragment von etwa 1,0 kb erhalten, was darauf hinweist, dass das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, erfolgreich in Escherichia coli S17-1 eingeführt worden war.
Der rekombinante Vektor pBBR1MCS-2-irrE in dem erhaltenen rekombinanten Escherichia coli S17-1 wurde durch konjugativen Transfer in Rhodobacter sphaeroides eingeführt und mit einem Plattenmedium, das Nalidixinsäure und Kanamycin enthält, kultiviert, um das rekombinante Rhodobacter sphaeroides RSP-CE zu erhalten. Nach der PCR-Verifizierung unter Verwendung der Primer irrE-F und irrE-R wurde ein Fragment von etwa 1,0 kb erhalten, was darauf hinweist, dass das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, erfolgreich in Rhodobacter sphaeroides RSP-CE eingeführt wurde.
Vergleichsbeispiel 2 Vergleich rekombinanter Mikroorganismen in der Verwendung zur Fermentation von Coenzym Q10
Der ursprüngliche Stamm von Rhodobacter sphaeroides, der rekombinante Rhodobacter sphaeroides RSP-BE und der rekombinante Rhodobacter sphaeroides RSP-CE wurden unter Bezugnahme auf das Fermentationsverfahren in Beispiel 4 einer Fermentation unterzogen, und die Ergebnisse der Fermentation waren wie folgt.

Art des Stammes Potenz von Coenzym Q10 Biomasse

Ursprüngl. Stamm 2975 mg/L 110 g/kg

RSP-CE 3276 mg/L 119 g/kg

RSP-BE 3510 mg/L 123 g/kg
Vergleichsbeispiel 3 Vergleich rekombinanter Mikroorganismen in der Verwendung zur Fermentation von oxidiertem Coenzym Q10

Der ursprüngliche Stamm von Rhodobacter sphaeroides, der rekombinante Rhodobacter sphaeroides RSP-BE und der rekombinante Rhodobacter sphaeroides RSP-CE wurden unter Bezugnahme auf das Fermentationsverfahren in Beispiel 5 einer Fermentation unterzogen, und die Ergebnisse der Fermentation waren wie folgt.

Art des Stammes	Potenz von oxidiertem Coenzym Q10	Oxidiertes Coenzym Q10 : Reduziertes Coenzym Q10	Biomasse
Ursprüngl. Stamm	2780 mg/L	96,3:3,7	100 g/kg
RSP-CE	3113 mg/L	98,5:1,5	113 g/kg
RSP-BE	3436 mg/L	99,6:0,4	120 g/kg

Die Ergebnisse von Vergleichsbeispiel 3 zeigten, dass die Potenz des oxidierten Coenzyms Q10, das durch die Fermentation des ursprünglichen Stammes von Rhodobacter sphaeroides erhalten wurde, und das Verhältnis dieses oxidierten Coenzyms Q10 zum reduzierten Coenzym Q10 aufgrund der nachteiligen Auswirkungen eines hohen Redoxpotentials auf die Bakterien während des Fermentationsproduktionsprozesses gering waren. Da das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, eine zentrale regulatorische Rolle bei der Reparatur von DNA-Schäden und beim Schutz vor der Reaktion auf Strahlenbelastung spielte, ermöglichte die exogene Einführung des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, die Verbesserung der Toleranz des Mikroorganismus gegenüber rauen Umgebungsbedingungen, einschließlich der Toleranz gegenüber einer Vielzahl von Belastungen wie osmotischem Druck, Oxidation, Strahlung und Hitze, was dem Wachstum und der Stoffwechselaktivität des Stammes sowie der Zunahme der Biomasse förderlich war und die Potenz und den relativen Anteil des oxidierten Coenzyms Q10 in gewissem Maß erhöhte. Aufgrund des Fehlens des osmoregulierten Promotor-ProPB-Ersatzes war die in der Fermentationsbrühe nachgewiesene Potenz des rekombinanten Rhodobacter sphaeroides-Stammes RSP-CE jedoch niedriger als die des rekombinanten Rhodobacter sphaeroides-Stammes RSP-BE. Es zeigte sich, dass der osmoregulierte Promotor proPB in der Lage war, die Expression von irrE in Abhängigkeit von der Veränderung der Bedingungen in der tatsächlichen Fermentationsumgebung effektiv zu regulieren und so die Toleranz des Coenzym Q10-produzierenden Stammes gegenüber Belastungen unterschiedlicher Intensität zu erhöhen.
Industrielle Verfügbarkeit
Da der von der vorliegenden Offenbarung bereitgestellte rekombinante Mikroorganismus, der für die Herstellung von Coenzym Q10 durch Fermentationsverfahren verwendet wird, das Gen enthält, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, ist es möglich, die Toleranz des Mikroorganismus gegenüber einer Vielzahl von Belastungen wie osmotischem Druck, Oxidation, Strahlung und Wärme zu erhöhen, sodass nicht nur die logarithmische Wachstumsphase des Stammes verlängert und die weitere Akkumulation von Biomasse gefördert wird, sondern auch das kräftige Wachstum und die metabolische Aktivität des Stammes während des Fermentationsprozesses aufrechterhalten werden, wodurch die Ausbeute an Coenzym Q10, insbesondere die Ausbeute an oxidiertem Coenzym Q10, erhöht wird. Daher ist der rekombinante Mikroorganismus, der durch dieses Gen konstruiert wurde, in der Lage, die Potenz des Coenzyms Q10 auf vorteilhafte Weise zu erhöhen, insbesondere den Gehalt an oxidiertem Coenzym Q10 signifikant zu erhöhen. Dementsprechend hat der rekombinante Mikroorganismus, der nach der Methode der vorliegenden Offenbarung konstruiert wurde, eine breite Anwendungsperspektive in der industriellen Produktion von Coenzym Q10.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

CN 105420417 A [0006]
CN 104561154 A [0006]
CN 103509729 B [0006]
US 7910340 B2 [0006]
CN 108048496 A [0006]
CN 103509816 B [0043]

Claims

Verfahren zur Erzeugung eines rekombinanten Mikroorganismus, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Schritt a. Klonieren eines Gens, das für ein globales regulatorisches Protein irrE kodiert, aus einem Elternstamm, der das Gen umfasst, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert; Schritt b. Ligieren des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, an einen Vektor und Konstruieren eines rekombinanten Vektors, der das Gen umfasst, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert; und Schritt c. Einführen des rekombinanten Vektors in eine Wirtszelle, um den rekombinanten Mikroorganismus zu erhalten.
Verfahren zur Erzeugung des rekombinanten Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei Schritt b das Ausschalten eines Promotors in dem rekombinanten Vektor, in dem der Promotor die Expression des Gens steuert, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, und dann das Einfügen eines oder mehrerer anderer unterschiedlicher Promotoren durch Promotorersatz einschließt, um so die Expression des Gens, das für das globale regulatorische Protein irrE kodiert, weiter zu regulieren.
Verfahren zur Erzeugung des rekombinanten Mikroorganismus nach Anspruch 1 oder 2, wobei der in Schritt b eingefügte Promotor ein induzierbarer Promotor ist, vorzugsweise ein osmoregulierter Promotor proPB, und der osmoregulierte Promotor proPB aus einem Polynukleotidmolekül oder einer Polynukleotidsequenz erhalten wird, umfassend eine partielle Nukleotidsequenz von mindestens 70 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 2, vorzugsweise umfassend mindestens 100 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NO: 2, weiter bevorzugt umfassend mindestens 150 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NO: 2, und am meisten bevorzugt umfassend die gesamte Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2, wobei die Polynukleotidsequenz mindestens 60% Homologie, vorzugsweise mindestens 80% Homologie und weiter bevorzugt mindestens 90% Homologie mit SEQ ID NO: 2 aufweist, und vorzugsweise der osmoregulierte Promotor proPB eine in SEQ ID NO: 2 dargestellte Nukleotidsequenz ist.
Verfahren zur Erzeugung des rekombinanten Mikroorganismus nach Anspruch 3, wobei der osmoregulierte Promotor proPB aus einem Bakterium isoliert ist, bei dem es sich vorzugsweise um Escherichia und weiter bevorzugt um Escherichia coli handelt.
Verfahren zur Erzeugung des rekombinanten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Vektor in Schritt b ausgewählt ist aus pBR322 und seinen Derivaten, pACYC177, pACYC184 und seinen Derivaten, RK2, pBBR1MCS-2 und einem Cosmid-Vektor und seinen Derivaten, und vorzugsweise pBBR1MCS-2 ist.
Verfahren zur Erzeugung des rekombinanten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Schritt a das Entwerfen eines Primers gemäß einer in SEQ ID NO: 1 dargelegten DNA-Sequenz, die Verwendung einer aus dem Elternstamm extrahierten genomischen DNA als Matrize und die Synthese des Gens, das das globale regulatorische Protein irrE kodiert, durch ein PCR-Verfahren einschließt.
Verfahren zur Erzeugung des rekombinanten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE in Schritt a kodiert, aus einem Polynukleotidmolekül oder einer Polynukleotidsequenz erhalten wird, umfassend eine partielle Nukleotidsequenz von mindestens 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 1, vorzugsweise umfassend mindestens 300 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NO: 1, weiter bevorzugt umfassend mindestens 600 aufeinanderfolgende Nukleotide der SEQ ID NO: 1, und am meisten bevorzugt umfassend die gesamte Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, wobei die Polynukleotidsequenz mindestens 60% Homologie, vorzugsweise mindestens 80% Homologie und weiter bevorzugt mindestens 90% Homologie mit SEQ ID NO: 1 aufweist, und vorzugsweise das Gen, das das globale regulatorische Protein irrE kodiert, eine in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleotidsequenz ist.
Verfahren zur Erzeugung des rekombinanten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Elternstamm ein Bakterium ist, vorzugsweise Deinococcus, weiter bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Deinococcus radiodurans, Deinococcus deserti, Deinococcus gobiensis und Deinococcus proteolyticus, und am meisten bevorzugt Deinococcus radiodurans.
Verfahren zur Erzeugung des rekombinanten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei eine Art der Einfügung in Schritt c ausgewählt ist aus Transformation, Transduktion, konjugativem Transfer und Elektroporation, die Wirtszelle ausgewählt ist aus Bakterien und Pilzen, vorzugsweise einem Bakterium von Rhodobacter, und weiter bevorzugt Rhodobacter sphaeroides, und vorzugsweise Schritt c die Transformation des in Schritt b erhaltenen rekombinanten Vektors in eine Escherichia coli S17-1 kompetente Zelle und dann das Einfügen des rekombinanten Vektors in die Wirtszelle durch konjugativen Transfer umfasst, um einen genetisch stabilen rekombinanten Mikroorganismus zu erhalten.
Rekombinanter Vektor, wobei der rekombinante Vektor das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE nach Anspruch 7 kodiert, und den osmoregulierten Promotor proPB nach Anspruch 3 umfasst.
Rekombinanter Mikroorganismus, wobei der rekombinante Mikroorganismus das Gen, das für das globale regulatorische Protein irrE nach Anspruch 7 kodiert, und den osmoregulierten Promotor proPB nach Anspruch 3 umfasst.
Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q10, wobei das Verfahren die Erzeugung eines rekombinanten Mikroorganismus unter Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und die Herstellung von Coenzym Q10 unter Verwendung des rekombinanten Mikroorganismus umfasst.
Verfahren zur Herstellung von oxidiertem Coenzym Q10, wobei das Verfahren die Erzeugung eines rekombinanten Mikroorganismus unter Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und die Herstellung von oxidiertem Coenzym Q10 unter Verwendung des rekombinanten Mikroorganismus umfasst.