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Verfahren zur Herstellung von D(--)-a-Aminobenzylpenicillin und von
L(+)-a-Aminobenzylpenicillin Zusatz zur Patentanmeidung B 55077 IV
d / 12 p
(Auslegeschrift 1139 844) Gegenstand der Patentanmeldung
B 55077 IVd/12p (deutsche Auslegesehrift 1 139 844) ist ein Verfahren
zur Herstellung von Penicillinderivaten mit antibiotischer Wirksamkeit durch Einführung
von an der Aminogruppe geschützten Aminoacylsubstituenten in die Aminogruppe der
6-Aminopenicillansäure und katalytische Abspaltung der Schutzgruppe. Eine dieser
Verbindungen ist das "x-Aminobenzylpenicillin mit der Strukturformel
Das Vorhandensein eines asymmetrischen Kohlenstoffatoms (durch »*« gekennzeichnet)
in der Seitenkette dieser Verbindung zeigt an, daß es zwei optisch aktive isomere
Formen dieser Verbindung gibt. Diese isomeren Formen sind aber epimer und nicht
enantiomorph, angesichts der Tatsache, daß die bei der Synthese verwendete 6-Aminopenicillansäure
selbst eine optisch aktive Verbindung ist.
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Als Ausgangsmaterial für die Umsetzung der 6-Aminopenicillansäure
dient ein Säurechlorid, Anhydrid, Säureazid oder Carbodiimid von c#-Aminophenylessigsäure,
deren Aminogruppe abgeschirmt ist, in der optisch inaktiven DL-Form mit dem Ergebnis,
daß das nach der katalytisch hydrierenden Abspaltung erhaltene Verfahrensprodukt
aus einem Gemisch der beide Epimeren bestand. Die Isolierung, die Reinigung sowie
die Bewertung bzw. Analyse eines solchen Produktes stellen ernste Probleme dar,
und für die Fabrikation ist das Produkt insofern unerwünscht, als seine Zusammensetzung
von einer Partie zur anderen schwanken kann.
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Die inaktiven DL-Formen können aus der bei der katalytischen Hydrierung
anfallenden wäßrigen Lösung nur durch Eindampfen im Vakuum bis zur Trockne als festes
Produkt gewonnen werden, wobei aber alle in der Lösung enthaltenen Verunreinigungen
gleichfalls mit eingedampft werden und damit im Endprodukt enthalten sind. Beispielsweise
hatte ein so hergestellteS DL-Aminobenzylpenicillin nur einen Reinheitsgrad von
etwa 48 0/" der aber infolge der im voraus nicht näher bestimmbaren Art und Menge
an Verunreinigungen je nach dem Reaktionsansatz schwanken kann.
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Es wäre nun sehr erwünscht, ein in reiner Form auskristallisierendes
N-Aminobenzylpenicillin in die Hand zu bekommen, welches sich gut aus der betreffenden
Lösung abscheiden läßt und praktisch keine störenden Verunreinigungen mehr enthält
bzw. gegebenenfalls durch einfaches Umkristallisieren gereinigt werden kann. Dieses
Problem läßt sich erfindungsgemäß dadurch lösen, daß man optisch aktive Formen des
Aminobenzylpenicillins herstellt.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur HerstellungdesEpimerenvonoc-Aminobenzylpenicilliii,
nämlich D(-),x-Aminobenzylpenicillin und L(+).x-Aminobenzylpenicillin, gemäß der
Arbeitsweise des Hauptpatents, jedoch unter Einsatz der D- bzw. L-Form der
#x-Aminophenylessigsäure.
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Die Reaktion wird durchweg unter gelinden Bedingungen durchgeführt,
um eine Racemisierung zu vermeiden. Die beiden voneinander verschiedenen Formen
von -,-Aminobenzylpenicillin wurden isoliert und analytisch rein erhalten. Es stellte
sich heraus, daß das D(-)x-Aminobenzylpenicillin an seinem isoelektrischen Punkt
in Wasser mehr löslich und ferner wirksamer gegenüber mehreren Bakterienarten in
vitro ist als das L(+)x-Aminobenzylpenicillin.
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Die DL-m-Aii-iinophenylessigsäure wurde nach bekannten Verfahren gespalten
(Betti und Mayer,
»Berichte der deutschen Chemischen Gesellschaft«,
Bd. 41, 1908, S. 2073; Ingersoll und Adams, Journal of the American Chemical
Society«, Bd. 47, 1925, S. 1168).
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Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung:
Beispiel 1
D(-)oc-Aminobenzylpenicillin D(-)oc - (Carbobenzyloxyamino)
- phenylessigsäure mit einem Schmelzpunkt von 130 bis 130,5'C, [ocl
-- -119,4' (C = 3 in Äthanol) wurde hergestellt durch Einwirkung
von Chlorkohlensäurebenzylester auf eine eiskalte Lösung von D(-)oc-Aminophenylessigsäure
in einem Äquivalent n-Natronlauge; bei fortschreitender Reaktion wurde weitere Natronlauge
hinzugesetzt, um den pH-Wert auf 8 bis 9 zu halten.
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4,8 ml Chlorkohlensäureäthylester wurden zu einer eisgekühlten Lösung
von 14,3 g des obigen Carbobenzyloxyderivats und 8,3 ml Triäthylamin
in 420 ml wasserfreien Acetons hinzugesetzt. Das Gemisch wurde bei O'C
5 Minuten lang gerührt, wobei Triäthylamin-hydrochlorid ausfiel und das gemischte
Anhydrid der D(-)a-(Carbobenzyloxyamino)-phenylessigsäure in Lösung ging. Die Suspension
wurde auf -50'C gekühlt und kräftig gerührt, wobei man so rasch wie möglich eine
eisgekühlte Lösung von 13 g
6-Aminopenicillansäure in 420 ml einer 30/,igen
wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat hinzusetzte; die Temperatur des Gemisches
ließ man dabei niemals über O'C ansteigen, Die resultierende klare Lösung wurde
30 Minuten bei O'C gerührt und dann weitere 30 Minuten lang, wobei
die Lösung Zimmertemperatur annahm; schließlich wurde sie mit dreimal 400 ml Äther
extrahiert, wobei man nur die wäßrige Phase aufbewahrte. Diese wäßrige Lösung wurde
durch Zusatz von Salzsäure auf einen pR-Wert von 2 gebracht, und das hierbei frei
gemachte D(-)cc-(Carbobenzyloxyamino)-benzylpenicillin wurde mit dreimal
150 ml Äther extrahiert. Eine teilweise Reinigung dieses Zwischenproduktes
erfolgte durch nochmaliges Extrahieren mit wäßriger Natriumbicarbonatlösung als
Natriumsalz und dann, nach Wiedereinstellung auf den pH-Wert von 2, durch erneute
Extraktion mit Äther als freie Säure. Schließlich erfolgte die Wiederumwandlung
in das Natriumsalz durch Schütteln der ätherischen Lösung mit einer ausreichenden
Menge einer 3%igen Natriumbicarbonatlösung, Abtrennen der dabei erhaltenen neutralen
wäßrigen Phase und Eindampfen bei niedriger Temperatur und niedrigern Druck. Das
Produkt wurde schließlich über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet, wobei man
13 g
eines mäßig reinen NatriUM-D(-)cc-(carbobenzyloxyamino)-benzylpenicillinats
bekam, welches auf einem Papierchromatogramm eine einzelne Zone antibiotischer Wirksamkeit
ergab.
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Eine Suspension von Palladium auf Bariumcarbonat (38 g, 300/,)
in 125 ml Wasser wurde in einer Wasserstoffatmosphäre bei Zimmertemperatur
und Atmosphärendruck 1 Stunde lang geschüttelt. Es wurde dann eine neutrale
Lösung von 20,4 g Natrium-D(-)oc-(carbobenzyloxyamino)-benzylpenicillinat
in 250 ml Wasser hinzugesetzt, worauf das Schütteln in der Wasserstoffatmosphäre
eine weitere Stunde fortgesetzt wurde. Die Suspension wurde filtriert, das mit den
wäßrigen Waschlaugen kombinierte Filtrat wurde mit n-Salzsäure auf einen pia-Wert
von 2 gebracht und dann mit dreimal 100 ml Äther gewaschen. Die wäßrige Phase
wurde mittels einer 30/,igen Natriumbicarbonatlösung auf einen pH-Wert von 4,65
gebracht und dann bei niedriger Temperatur und niedrigem Druck auf ein Volumen von
etwa 50 ml eingedampft, wobei sich feine farblose Nadeln abschieden. Nach
30 Minuten wurden die Kristalle aufgesammelt, mit ein wenig kaltem Wasser
gewaschen und über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet, wobei man 5,5 g
reines D(-)x-Aminobenzylpenicillin-monohydrat bekam; [x]'D' = +281' (C =
1 in Wasser), Zersetzung bei etwa 202'C. Bei der Umkristallisation
aus Wasser wurde die optische Drehung nicht geändert. (Die Analyse ergab
52,5 0/, C, 5,7 "/, H, 11,9 0/, N und 8,9 0/0 S; die
Bruttoformel C"H, gN,0,S - 11,0 erfordert 52,3 0/, C, 5,8 0/, H,
11,4 l)/,# N, 8,7 0/, S).
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Weitere 9 g eines weniger reinen Produkts erhielt man durch
Eindampfen des wäßrigen Filtrats. Wie bei der ersten Ausbeute erhielt man auch hier
auf einem Papierehromatogramm nur eine einzige Zone antibiotischer Wirksamkeit,
die aber verschieden ist von derjenigen, welche das unreduzierte Carbobenzyloxy-Zwischenprodukt
liefert. Beispiel 2 L(-L,),x-Aminobenzylpenicillin L(+)OC - (Carbobenzyloxyamino)
- phenylessigsäure mit einem Schmelzpunkt von 130 bis 130,5'C, [x]'0'
= +117' (C = 3 in Äthanol) wurde hergestellt aus L(+)cc-Aminophenylessigsäure,
und zwar nach dem Verfahren, wie es für deren Enantiomorph beschrieben wurde. 14,3
g des Produkts wurden mit Chlorkohlensäureäthylester, wie es vorher beschrieben
wurde, in das gemischte Anhydrid umgewandelt und mit 13 g
6-Aminopenicillansäure
gekuppelt, wobei man 17,6 g
mäßig reinen NatriuM-L(+)oc-(carbobenzyloxyamino)-benzylpenicillinats
bekam, welches auf einen Papierchromatogramm eine einzige Zone antibiotischer Wirksamkeit
ergab.
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Die Hydrierung dieses Zwischenprodukts wurde im gleichen Maßstab und
nach dem gleichen Verfahren vorgenommen, wie sie im Beispiel 1 beschrieben
sind. Die erste Kristallisation (6,2 g) bestand aus reinem wasserfreieln
L(+).x-Aminobenzylpenicillin, [oc] ' '
= +209' (C = 0,2
in Wasser), Zersetzung bei etwa 205'C. Umkristallisation aus Wasser änderte
die optische Drehung nicht. (Die Analyse ergab 54,9 0/, C,
5,60/,H,
11,80/,N und 9,20/,S; die Bruttoformel Cl,H"N104S erfordert 55,0 0/0 C,
5,5 0/, H, 12,0 0/, N,
9,20/0s).
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Man erhielt weitere 6 g eines weniger reinen Produkts durch
Eindampfen des wäßrigen Filtrats. Wie bei der ersten Ausbeute gab es auch hier auf
einem Papierchromatogramm nur eine einzelne Zone antibiotischer Wirksamkeit, verschieden
von derjenigen, welche man durch das unreduzierte Carbobenzyloxy-Zwischenprodukt
erhält. Beispiel 3
7,25 g (0,0255 MOI) D(-)o#-(Carbobenzoxyamino)-phenylessigsäure
mit einem Schmelzpunkt von 128 bis 129'C, [ix]'D5 = -116,5'
(C = 1 in Alkohol), und 4,25 ml Triäthylamin wurden in 210 ml Aceton
aufgelöst, und die Lösung wurde bei O'C 5 Minuten gerührt. Nach Zusatz von
2,4 ml (0,0255 Mol) Chlorkohlensäureäthylester kam das Gemisch sofort in
ein Bad aus Trockeneis und wasserfreiem Aceton von -50'C Temperatur. Eine Lösungvon
6,5 g(0,030 Mol) 6-Aminopenicillansäure und 16 g Natriumbicarbonat
in
2 10 ml Wasser wurde sofort hinzugesetzt, worauf das Gemisch aus dem Bad
von Trockeneis und Aceton herausgenommen, 1/, Stunde bei - 10 bis O'C und
dann 1/2Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt wurde. Die Lösung wurde mit
11 Äther verdünnt, wobei die sich abscheidende wäßrige Schicht entfernt wurde.
Der pH-Wert wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 2 gesenkt, und das Penicillin
wurde zweimal in 300 ml Äther extrahiert. Der Äther wurde mit Wasser und
schließlich mit 75 ml einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung gewaschen.
Die wäßrige Bicarbonatlösung wurde mit 8 g einer 50/,igen Suspension von
Palladium auf Strontiumcarbonat (Engelhard) gemischt und bei einem Druck von
3,5 kg/CM2 1 Stunde lang in einer Parr-Niederdruck-I-lydriervorrichtung
hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert, der pH-Wert des Filtrats wurde mit
konzentrierter Salzsäure auf 2 gesenkt, und das Filtrat wurde mit Äther extrahiert.
Nach dem Einstellen des pH-Wertes mit festem Natriumbicarbonat auf einen pli-Wert
von 4,65 wurde die Lösung unter vermindertem Druck (Wasserstrahlpumpe) bei 32'C
auf ein Volumen von 20 ml eingedampft. Die dabei gebildeten Kristalle wurden abfiltriert;
sie wogen 2,85 g. 1 g des Produktes wurde aus 10 ml Wasser umkristallisiert,
wobei der pH-Wert mit einigen Tropfen konzentrierter Salzsäure auf 2 gesenkt und
dann wieder mit festem Natriumbicarbonat auf 4,65 angehoben wurde. Man erhielt eine
Ausbeute von 0, 25 gdes reinen Produkts, D(-)x-Aminobenzylpenicillin-monohydrat,
das bei 201'C unter Zersetzung schmolz. Die Bruttoformel Cl,H,gN,0,S
- H20 erfordert einen N-Gehalt von 11,40/,; die Analyse ergab 11,140/,. Die
spezifische Drehung war [#x]1" = +287' (C = 0,1 in Wasser).
Beispiel 4 Zu 5,5 g (0,0 193 MOI) D(-)oc-(Carbobenzoxyamino)-phenylessigsäure
und 2,6 g (0,0243 Mol) 2,6-Lutidin in 25 ml p-Dioxan und
25 ml wasserfreiern Acetons wurden bei O'C 1,83 ml (0,0193
Mol) Chlorkohlensäureäthylester hinzugesetzt. Es bildete sich ein weißer Niederschlag,
und das Gemisch wurde 20 Minuten lang gerührt. Eine Lösung von 4,95 g 6-Aminopenicillansäure
in 50 ml Wasser sowie 15 ml 2,6-Lutidin wurde sofort hinzugesetzt.
Die klare Lösung wurde '/,Stunde lang gerührt und mit 500 ml Äther
verdünnt. Nach dem Abtrennen der wäßrigen Schicht wurde festes Natriumbicarbonat
hinzugesetzt, um den pH-Wert auf 8 zu halten. Der p.H-Wert der wäßrigen Lösung
wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 2 gesenkt, worauf das Penicillin in Äther
extrahiert wurde. Die Ätherschicht wurde mit Wasser gewaschen und mit
25 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die das Penicillinderivat
enthaltende Natriumbicarbonatlösung wurde zu 10 g einer 50/,igen Suspension
von Palladium auf Kieselgur (Engelhard), durch den Zusatz von 15m1 Wasser zu einer
Paste angerührt, hinzugesetzt. Das Penicillin wurde bei einem Druck von
3,5 kg/CM2 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur in der Parr-Niederdruck-Hydriervorrichtung
hydriert. Wegen der Bildung eines Kolloids wurde das Gemisch durch einen Seitzfilter
filtriert. Der pH-Wert wurde durch den Zusatz von konzentrierter Salzsäure auf 2
gesenkt, worauf das Filtrat mit Äther extrahiert wurde, um alles Ausgangspenicillin
zu entfernen. Nach dem Abtrennen der wäßrigen Schicht wurde der p.H-Wert durch den
Zusatz festen Natriumbicarbonats auf 4,65 eingestellt. Unter vermindertem Druck
(Wasserstrahlpumpe) wurde die Lösung auf 20 ml eingedampft. Die festen Kristalle
von D(-)x-Aminobenzyl-penicillin-monohydrat wurden abfiltriert. Die Bruttoformel
C"H"N104S. H,0 erfordert einen N-Gehalt von 11,40/,; die Analyse ergab 11,340/,.
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Beispiel 5
Das im Beispie14 beschriebene Verfahren wurde wiederholt
unter Verwendung von L(+)x-(Carbobenzoxyamino)-phenylessigsäure, [oc]2,5
= -i-85,50 (C = 1 in Alkohol), an Stelle von D(-)o#-(Carbobeiizoxyamino)-phenylessigsäure.
An Stelle von 5 %
Palladium auf Kieselgur wie im Beispiel 4 nahm man
5 % Palladium auf Strontiumearbonat. Das Produkt, L(+)x-Aminobenzylpenicillin-monohydrat,
zeigte die folgende spezifische Drehung und Elementaranalyse: [#%]2D5=
+201' (C # 0,197 in Wasser). Die Bruttoformel S - C"H"N,0,.
H20 erfordert 52,3 "/, C, 5,7 "/, H und 11,4 % N; die Analyse
ergab 52,44 0/0 C, 5,69 0/0 H und 11,26 % N.
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Die hemmend wirkende Mindestkonzentration (M. I.
C.) in y/ml
in vitro wurde bei einer Anzahl gramnegativer Mikroorganismen bestimmt durch laufende
Verdünnung in Agar-Agar, wobei ein direkter Vergleich der Wirksamkeit gegenüber
diesen Organismen zwischen D(-),-,c-Aminobenzylpenicillin
(A), L(-'r)x-Aminobenzylpenicillin
(B) und Penicillin
G sowie der DL-Form des Aminobenzylpenicillins
(C) erstellt wurde. Die Resultate sind in der nachstehenden Tabelle angegeben:
| M. 1. C., 7/MI |
| A C Peni- |
| (Reinheit (Reinheit cillin |
| 71%) 930/,) G |
| E. coli ............ 6,25 125 6,25 25,0 |
| E. coh ............ 12,5 12:5 112,5 50,0 |
| Proteus vulgaris ... 6,25 12,5 6,25 25,0 |
| Proteus vulgaris ... 2,5 12,5 12,5 6,25 |
| Salm. typhi ........ 0,5 2,5 2,5 2,5 |
| Salm. typhi ........ 0,5 1,25 2,5 2,5 |
| Salm. typhi ........ 0,6 2,5 2,5 2,5 |
| Salm. typhi murium 0,5 5,0 5,0 0,6 |
| Salm. paratyphi A 2,5 1 5,0 5,0 6,25 |
| Salm. paratyphi B 2,5 5,0 5,0 5,0 |
| Salm. paratyphi B 2,5 5,0 5,0 6,25 |
| Salm. paratyphi B 5,0 12,5 6,25 6,25 |
| Shigella shigae ..... 1,25 5,0 2,5 5,0 |
| Shigella schmitzi ... 2,5 5,0 5,0 6,25 |
| Shigella sonnei .... 6,25 25,0 12,5 50,0 |
| Klebsiella pneurno- |
| niae ............ 2,5 5,0 2,5 ! 5,0 |
Diese Ergebnisse bestätigen, daß das D(-)-Epimere eine ausgesprochene überlegene
Wirkung zeigt, und zwar sowohl im Vergleich zu Penicillin
G als auch im Vergleich
zu der DL-Form des Alpha-Aminobenzylpenicillins. Das L(+)-Epimere zeigt etwa die
gleichen Hemmkonzentrationen wie die Di,-Form, erweist sich aber gleichfalls dem
Penicillin
G überlegen. Der verfahrenstechnische Vorteil bei der Herstellung
auch des D(+)-Epimeren wurde bereits aufgezeigt.
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Es wird in diesem Zusammenhang noch darauf hingewiesen, daß sich die
Aktivitäten des DL-Form des Aminobenzylpenicillins gegenüber den einzelnen Bakterienarten
nicht additiv aus den Aktivitäten der
jeweiligen Anteile an der
D(-)- und der L(-L,)-Form zusammensetzen, wie insbesondere ein Vergleich
der vorstehend mitgeteilten experimentellen Ergebnisse lehrt. Eine Deutung dieses
experimentellen Befundes steht noch aus.