-
Die Erfindung betrifft ein Kalibrierungsmittel zur
Kalibrierung von Messsystemen, insbesondere zur Kalibrierung optischer
Detektionssysteme oder zur Kalibrierung quantitativer Assays sowie
zur Kalibrierung, beispielsweise zur Überprüfung der Reinheit oder Aktivität, von Assay-Reagentien. Das Kalibrierungsmittel
weist verschiedene Bereiche zur Aufnahme von Kalibrierungslösungen auf.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Kalibrierung von Messsystemen.
-
In der Biotechnologie werden beispielsweise verschiedene
sogenannte Assays angewandt, die als Modellsyssteme zur Untersuchung
von chemischen und/oder biologischen Wechselwirkungen dienen. Ziel
dieser Assays ist u.a. die effziente Durchmusterung chemischer Substanzen,
das sogenannte Screening, zum Auffinden von Substanzen, die ein Target
in der gewünschten
Art und Weise beeinflussen. Targets sind beispielsweise spezifische
biologische Moleküle,
wie Enzyme, Rezeptoren oder Ionenkanäle, die möglicherweise für bestimmte
Krankheiten und ihre Symptome von Bedeutung sind. Die meisten Wirkstoffe
beeinflussen durch die Bindung an ein Target dessen biologische
Funktion. Die Untersuchung solcher Assays erfolgt durch sogenannte Screening-Anlagen.
Diese Screening-Anlagen sollen insbesondere die Geschwindigkeit,
Genauigkeit und Effizienz der Wirkstoffforschung steigern. Aufgrund der
hohen Empfindlichkeit der innerhalb dieser Screening-Anlagen eingesetzten
Detektionssysteme und der oft sehr schwierigen Bestimmung der Bindung
einer Substanz an ein Target ist eine genaue Kalibrierung der Detektionssysteme
und/oder Assays erforderlich. Des Weiteren ist es von besonderer
Bedeutung, die im Rahmen der Assays eingesetzten Assay-Reagentien beispielsweise
hinsichtlich Reinheit oder Aktivität zu untersuchen.
-
Detektionssysteme, die der Untersuchung solcher
Assays dienen, basieren in der Regel auf Radioaktivität, Kolorimetrie
oder Lumineszenz, insbesondere Phosphoreszenz oder Fluoreszenz.
Bei vielen Detektionssystemen, beispielsweise konfokalen Mikroskopen
oder Spektrometern, die u.a. in Screening-Anlagen zur Wirkstoffsuche
eingesetzt werden, werden zur Kalibierung besondere Kalibrierungslösungen verwendet,
die bekannte, genau definierte Eigenschaften aufweisen.
-
In der Regel werden die Kalibrierungslösungen kurz
vor den jeweiligen Kalibrierungen vom Anwender selbst hergestellt.
Bei der Herstellung der Kalibrierungslösungen können eine Reihe von Fehlern auftreten.
Hierbei handelt es sich um fehlerhafte Verdünnungen oder Fehler bei der
Auswahl der Farbstoffe, Assay-Reagentien oder Lösungsmittel. Dies führt zu einer
ungenauen Kalibrierung und somit zu einer Verfälschung der Messergebnisse
bzw. zu einer Verringerung der Reproduzierbarkeit der Messungen.
Des Weiteren ist diese Vorgehensweise für die Herstellung der Kalibrierungslösungen sehr
zeitintensiv und ist somit beispielsweise im Zusammenhang mit den
vorstehend beschriebenen Screening-Anlagen nicht anwendbar.
-
Aufgabe der Erfindung ist es daher,
Kalibrierungsmittel bereitzustellen, die eine einfache, reproduzierbare
und schnelle Kalibierung von Messsystemen, insbesondere von Detektionssystemen,
quantitativer Assays oder Assay-Reagentien,
ermöglichen.
-
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch
ein Kalibrierungsmittel mit den Merkmalen von Anspruch 1.
-
Das erfindungsgemäße Kalibrierungsmittel weist
mindestens zwei Bereiche zur Aufnahme von Flüssigkeiten auf. Die mindestens
zwei Bereiche enthalten jeweils mindestens eine zur Kalibrierung
des Systems geeignete Kalibrierungslösung. Durch das erfindungsgemäße Kalibrierungsmittel
ist es möglich, mit
einer hohen Reproduzierbarkeit, konstanter Qualität und sehr
guter Handhabbarkeit eine Vielzahl unterschiedlicher Messsysteme
in kurzer Zeit in Bezug auf eine Vielzahl von Parameter zu kalibrieren.
Messysteme in erfindungsgemäßen Sinne
sind beispielsweise Detektionssysteme, quantitative Assays oder Assay-Reagentien.
-
Die mindestens zwei Bereiche des
Kalibrierungsmittels enthalten identische oder unterschiedliche
Kalibrierungslösungen.
Die Verwendung unterschiedlicher Kalibrierungslösungen in Zusammenhang mit
einem Kalibrierungsmittel ist bevorzugt, um eine schnelle Kalibrierung
einer Vielzahl unterschiedlicher Parameter und/oder eine Aufnahme
kompletter Kalibrierungskurven zu ermöglichen.
-
Bei den Kalibrierungslösungen handelt
es sich vorzugsweise um wässrige
Lösungen
eines oder mehrerer Kalibrierungsstoffe. Bei diesen Kalibrierungsstoffen
handelt es sich vorzugsweise um Farbstoffe, die von vorne herein
die zu detektierenden Eigenschaften aufweisen oder um Stoffe, die
erst nach einer (i) Komplexierung, d.h. insbesondere einer Anlagerung,
(ii) Interkalation oder (iii) Reaktion die zu detektierenden Eigenschaften
erhalten. Die Kalibrierungsstoffe können somit dem Kalibrierungsmittel
als fertige Kalibrierungsstoffe zugegeben oder erst in den Bereichen
des Kalibrierungsmittels selbst hergestellt werden. In diesem Fall
enthalten die Kalibrierungslösungen
vorzugsweise Teile bzw. Vorstufen der Kalibrierungsstoffe.
-
Die Verwendung von mehreren Kalibrierungsstoffen
in einer Kalibrierungslösung
ist insbesondere bei Mehr-Farben-Anwendungen, beispielsweise Mehr-Farben-Fluoreszenzmessungen,
relevant.
-
Die Farbstoffe bzw. Stoffe können als
freie Farbstoffe bzw. Stoffe oder als an andere Moleküle oder
Partikel gebundene Farbstoffe bzw. Stoffe, d.h. in der Form von
Konjugaten, verwendet werden. Bei solchen Molekülen oder Partikeln handelt
es sich beispielsweise um Antikörper,
Peptide, Proteine, Oligonukleotide oder synthetische Partikel (sogenannte Beads).
Hierbei werden in verschiedenen Anwendungen Mehrfarben-Konjugate
verwendet, die beispielsweise für
FRET Messungen einsetzbar sind.
-
Bei den Farbstoffen handelt es sich
beispielsweise um UV-, VIS-, Infrarot-, Phosphoreszenz- und/oder
Fluoreszenz-Farbstoffe. Vorzugsweise werden Fluoreszenzfarbstoffe
verwendet. Beispiele für
Fluoreszenzfarbstoffe sind Coumarine, Xanthene (Rhodamine, Oxazine)
oder Cyanine. Für Phosphoreszenzmessungen
sind insbesondere Seltenerdmetall-Komplex-Farbstoffe geeignet. Für Absorptionsmessungen
können
insbesondere UV-, VIS- oder Infrarot-Farbstoffe verwendet werden.
-
Beispiele für Stoffe, die beispielsweise
durch Komplexierung, Interkalation oder Reaktion die zu detektierenden
Eigenschaften erhalten, sind bei Proteinbestimmungen Coomassie Brillant
Blue, Bicinchininic Acid, Biuret Reagenz und o-Phthalaldehyd. Beispiele
für Stoffe,
die in Nukleinsäurebestimmungen
eingesetzt werden können
sind beispielsweise Hoechst Farbstoffe, PicoGreen, OliGreen, RiboGreen,
TOTO, JOJO und Ethidiumbromid. Beispiele für Stoffe, die für Kationenbestimmungen
geeignet sind, sind Calcein, Calcium Green, Fluo-3, Newport Green
und APTRA-BTC.
-
Die erfindungsgemäßen Kalibrierungsmittel eignen
sind insbesondere für
die Kalibrierung von Detektionssystemen, beispielsweise Mikroskopen. Vorzugsweise
sind die Kalibrierungsmittel so ausgestaltet, dass sie zur Kalibrierung
konfokaler Mikroskope geeignet sind. Dies gilt insbesondere in Bezug auf
die physikalische Ausgestaltung der Kalibrierungsmittel (beispielsweise
Material, Bodendicke) oder die Art und Konzentration der verwendeten
Kalibrierungslösungen.
Dabei müssen
zum einen optische Parameter, wie beispielsweise die Fokusgeometrie
oder zum anderen Parameter, d.h. Eigenschaften, verschiedener zu
messender Analyten oder Komponenten, wie beispielsweise Proteinen, Nukleinsäuren, Anionen,
Kationen oder Rezeptor-Ligand-Komplexen, kalibriert werden. Beispiele
für solche
Parameter sind Fluoreszenintensität, Fluoreszenzpolarisation,
Fluoreszenzlebensdauer, Rotationskorrelationszeit, translationale
Diffusion, Kreuzkorrelationsintensität, Teilchenzahlen) oder Konzentrationen)
des (der) Kalibrierungsstoffe(s). Kombinationen der vorstehenden
Parameter sind ebenfalls möglich.
Des Weiteren kann beispielsweise die Absorption der Kalibrierungsstoffe
gemessen werden.
-
Kalibrierungsmittel sind beispielsweise
auch für
die Kalibrierung quantitativer Assays, wie Protein- oder Nukleinsäurebestimmungen,
von großer
Bedeutung. Des Weiteren können
Kalibrierungslösungen
zur Kalibrierung intra-und extrazellulärer Anionen wie Chlorid, Nitrit,
Phosphat, sowie von Kationen verwendet werden. Bei den Kalibrierungslösungen handelt
es sich in diesen Fällen
vorzugsweise um wässrige
Pufferlösungen.
Diese enthalten den zu bestimmenden Analyten, wie beispielsweise
das Protein oder die Nukleinsäure,
sowie das (die) zur Quantifizierung notwendige Reagenz (Reagentien).
Die Verwendung von Kalibrierungslösungen mehrerer Analytkonzentrationen
innerhalb eines Kalibrierungsmittels ist hierbei zur Aufnahme der
kompletten Kalibrierungskurve relevant. Der Analyt und das (die)
Reagenz (Reagentien) bilden beispielsweise einen Komplex, der in
Abhängigkeit
von der Analytkonzentration unterschiedliche kolorimetrische oder
fluorimetrische Signale ergibt, die ggf. in einer Kalibrierungskurve
zusammengefasst werden.
-
Beispiele für in solchen Fällen untersuchte Signale
sind Fluoreszenintensität,
Fluoreszenzpolarisation, Fluoreszenzlebensdauer, Rotationskorrelationszeit,
translationale Diffusion, Kreuzkorrelationsintensität, Teilchenzahlen)
oder Konzentration(en). Des Weiteren können beispielsweise die Absorptionen
gemessen werden.
-
Die Bestimmung der Konzentration
eines Analyten unbekannter Konzentration erfolgt dann vorzugsweise
durch den Vergleich des erhaltenen Messwertes mit der Kalibrierungskurve
bzw. einzelnen Kalibrierungspunkten. Wie bereits vorstehend beschrieben,
werden vorzugsweise Farbstoffe, die die zu detektierenden Eigenschaften
von vorne herein aufweisen oder Stoffe, die erst nach einer Komplexierung,
d.h. insbesondere einer Anlagerung, Interkalation oder Reaktion
die zu detektierenden Eigenschaften erhalten, eingesetzt.
-
Die erfindungsgemäßen Kalibrierungslösungen können des
Weiteren auch in Kalibrierungsverfahren zur Qualitätskontrolle
von Assay-Reagentien verwendet werden. Bei diesen Kalibrierungslösungen handelt
es sich vorzugsweise um wässrige
Pufferlösungen.
Diese enthalten beispielsweise das Rezeptorprotein, einen mit einem
Farbstoff markierten Liganden und bei Bedarf auch Kompetitoren oder
Inhibitoren. Die Verwendung von Kalibrierungslösungen mehrerer Rezeptor-/Ligandkonzentrationen
in einem entsprechenden Kalibrierungsverfahren ist hierbei zur Aufnahme
der Bindungskurve bzw. einzelner Bindungspunkte relevant. Der markierte
Ligand bindet an das Rezeptorprotein und bildet einen Rezeptor-Ligand-Komplex,
der in Abhängigkeit
der Rezeptor-/Ligandkonzentration beispielsweise unterschiedliche
kolorimetrische oder fluorimetrische Signale ergibt. Die Bestimmung
der Qualität,
beispielsweise der Reinheit, von Assay-Reagentien erfolgt dann durch
den Vergleich des erhaltenen Messwertes mit der Bindekurve bzw.
einzelner Bindungspunkte.
-
Die Kalibrierungslösungen können neben den
Farbstoffen bzw. den Quantifizierungsreagentien (beispielsweise
Inhibitoren, Rezeptorproteine etc.) verschiedene Zusätze enthalten,
die insbesondere zur Stabilisierung der Lösungen dienen. Vorzugsweise
handelt es sich bei solchen Zusätzen
um Photostabilisatoren, Fungizide, anti-bakterielle Verbindungen
(ein Beispiel für
einen Zusatz ist Natriumazid) oder Detergentien. In verschiedenen
Anwendungen kann es des Weiteren bevorzugt sein, Zusätze zu verwenden, die
die optische Eigenschaften der Kalibrierungslösungen verändern oder solche, die zur Angleichung
an die unterschiedlichen Messmedien dienen.
-
Für
die einzelnen Kalibrierungen kann es erforderlich sein, bestimmte
pH-Werte in den
einzelnen Kalibrierungslösungen
einzustellen. Dies erfolgt in der Regel durch die Verwendung verschiedener
Puffer. Welcher Puffer verwendet wird, hängt von dem Farbstoff und dem
angestrebten pH-Wert ab. Generell können alle kommerziell erhältlichen
Puffer, die die Wirkung der Farbstoffe nicht oder nur in gewünschter
Weise beeinflussen, verwendet werden. Beispiele für solche
Puffer umfassen PBS-, HEPES-, Phosphat-, Citrat- sowie Acetat-Puffer.
-
Die Stabilität bzw. Handhabbarkeit der einzelnen
Kalibrierungslösungen
kann weiter erhöht bzw.
verbessert werden, indem das Kalibrierungsmittel mittels einer Abdeckung
verschlossen wird. Vorzugsweise erfolgt durch die Abdeckung ein
im Wesentlichen luftdichter Abschluss der Kalibrierungslösungen gegenüber der
Außenluft.
Vorzugsweise handelt es sich bei der Abdeckung um eine Folie oder um
einen festen, massiven Deckel aus Kunststoff. Als Kunststoffmaterial
ist insbesondere Polypropylen geeignet.
-
Je nach verwendetem Farbstoff kann
die Abdeckung transparent, d.h. durchsichtig, oder nicht transparent
ausgebildet sein. Durch die Verwendung einer nicht transparenten
Abdeckung kann bei verschiedenen Farbstoffen die Stabilität weiter
erhöht werden,
da die Kalibrierungslösungen
in geringerem Masse dem Außenlicht
ausgesetzt sind.
-
Das Kalibrierungsmittel kann Bereiche
aufweisen, die keine Kalibrierungslösungen enthalten. Dies ist
insbesondere relevant bei der Durchführung individueller Assays.
Insbesondere bei der Durchführung
quantitativer Assays und bei der Kalibrierung, d.h. Überprüfung von
Assay-Reagentien
unter Einsatz des Kalibrierungsmittels, ermöglicht dies aufgrund identischer
Versuchsbedingungen einen optimalen Vergleich der Messdaten.
-
Bei dem Kalibrierungsmittel handelt
es sich beispielsweise um eine Glasplatte, die so ausgestaltet ist,
dass es sich bei den mindestens zwei Bereichen zur Aufnahme der
Kalibrierungslösungen
um durch die Kalibrierungslösungen
benetzbare Flächen handelt.
Die Umgebung dieser Flächen
ist derart ausgestaltet, dass die jeweiligen Kalibrierungslösungen diese
nicht benetzen. Die einzelnen Bereiche können beispielsweise durch eine
entsprechende Oberflächenbehandlung
der Glasplatte erhalten werden. Im Falle einer Glasplatte als Kalibrierungsmittel
handelt es sich bei der Abdeckung vorzugsweise um einen festen,
massiven Deckel, der im Wesentlichen luftdicht auf die Glasplatte
aufgesetzt wird.
-
Des Weiteren kann es sich bei dem
Kalibrierungsmittel um eine Titerplatte handeln. Diese Titerplatte
weist üblicherweise
eine Basisplatte mit durchgehenden Vertiefungen auf, die durch eine
Bodenplatte, beispielsweise eine Glasplatte, verschlossen werden.
Bei solchen Titerplatten sind die einzelnen Vertiefungen vorzugsweise
in regelmäßigen Abständen angeordnet,
um in die einzelnen Vertiefungen Kalibierungslösungen mit Hilfe eines automatisierten Prozesses
einführen
und anschließend
vermessen zu können.
Insbesondere handelt es sich bei den Vertiefungen um solche mit
einem Volumen im μl-Bereich
oder darunter. Im Falle einer Titerplatte erfolgt der im Wesentlichen
luftdichte Verschluß der
Vertiefungen vorzugsweise über
eine Kunststofffolie, die die Titerplatte auf der der Bodenplatte
gegenüberliegenden
Seite verschließt.
Der im Wesentlichen luftdichte Abschluß wird in diesem Falle dadurch
erreicht, dass die Abdeckung und die Titerplatte miteinander verschweißt werden.
-
Bei der Bodenplatte handelt es sich
vorzugsweise um eine durchsichtige Glasplatte oder eine durchsichtige
Kunststofffolie. Die Glasplatte weist vorzugsweise eine Dicke von
100-300 μm,
vorzugsweise 100-150 μm,
auf.
-
Die Basisplatten der Kalibrierungmittel
werden vorzugsweise aus einem inerten Material, vorzugsweise einem
inerten Kunststoff oder Glas, hergestellt. Beispiele für bevorzugte
Kunststoffe umfassen Polyproplyen oder Polystyrol.
-
Zur Erhöhung der Stabilität des Kalibrierungmittels
kann in die Basisplatte ein die Vertiefungen umgebender Trägerkern
aus höherschmelzendem Material
eingebettet werden. Das Kalibrierungmittel kann somit bei automatisierten
Kalibrierungen nicht so leicht verbogen werden. Dies hat den Vorteil,
dass die Postionen der einzelnen Vertiefungen nicht durch die Einwirkung
von äußeren Kräften beeinträchtigt werden.
Somit können
Verfälschungen
der Kalibrierungen durch verbogene Titerplatten vermieden werden.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Trägerkern um eine Metallplatte
mit zu den Vertiefungen korrespondierenden Öffnungen. Des Weiteren ist
es bevorzugt, dass jede Vertiefung von dem Trägerkern umgeben ist. Die Öffnungen
des Trägerkerns
sind vorzugsweise in ihren Abmessungen geringfügig größer als die Vertiefungen der
Basisplatte.
-
Wenn es sich bei der Bodenplatte
um eine Glasplatte handelt, wird diese vorzugsweise aufgeklebt.
Werden als Bodenplatte Kunststofffolien verwendet, erfolgt die Befestigung
vorzugsweise durch Aufschweißen.
-
Die Basisplatten weisen beispielsweise
24, 96, 384, 1536 oder 2080 Vertiefungen auf. Besonders bevorzugt
weist die Basisplatte 24, 96 oder 384 Vertiefungen auf. Ganz besonders
bevorzugt weist die Basisplatte 24 Vertiefungen auf, die mit Kalibrierunglösungen befällt werden
können.
-
Hochempfindliche Messgeräte wie sie
beispielsweise in den vorstehend beschriebenen Untersuchungen verwendet
werden, erfordern oft mehrstufige Kalibrierungsverfahren. Beispielsweise
kann in einer ersten Stufe mit bestimmten Kalbrierungslösungen eine
Vorkalibrierung vorgenommen werden. In einer zweiten Stufe kann
anschließend
mit anderen Kalibrierungslösungen
eine Feinkalibrierung vorgenommen werden. Dieser mehrstufige Prozess
ist mit den herkömmlichen
Kalibrierungsmitteln nur mit sehr hohem Zeitaufwand durchführbar. Die
Art und die Konzentrationen der Farbstoffe, insbesondere der Fluoreszenfarbstoffe,
in den Kalibrierungslösungen ist
in dem erfindungsgemäßen Kalibrierungsmittel
so ausgewählt,
dass für
jede zu kalibrierende Wellenlänge
mindestens eine Kalibrierungslösung
zur Vorkalibrierung und mindestens eine Kalibrierungslösung zur
Feinkalibrierung geeignet ist. Vorzugsweise liegen die Konzentrationen
der Fluoreszenzfarbstoffe für
die Vorkalibrierung im Bereich von 100 μM–1 mM und die Konzentrationen
der Fluoreszenzfarbstoffe für
die Feinkalibrierung im nanomolaren Bereich. Für Feinkalibrierungen werden
Fluoreszenzfarbstoffe mit einer Konzentration im Bereich von 0,1
nM–5 nM
verwendet. Die tatsächlichen
Konzentrationen sind abhängig
von den zu kalibrierenden Parametern.
-
Für
die Kalibrierung von Fluoreszenzmikroskopen, insbesondere von konfokalen
Mikroskopen, werden vorzugsweise Fluoreszenzfarbstoffe mit Konzentrationen
im Bereich von 1 nM–5
nM verwendet.
-
Das erfindungsgemäße Kalibrierungsmittel eignet
sich insbesondere für
die Kalibrierung von absoluten Parametern. Beispiele für absolute
Parameter, die mit dem erfindungsgemäßen Kalibrierungsmittel kalibriert
werden können,
sind Fluoreszenzintensität,
Fluoreszenzpolarisation, Fluoreszenzlebensdauer, Rotationskorrelationszeit,
translationale Diffusion, Kreuzkorrelationsintensität, Teilchenzahlen)
bzw. Konzentrationen) des (der) Kalibrierungsfarbstoffe(s), sowie
die Bestimmung der Fokusgeometrie. Durch die Verwendung dieser Parameter
ist eine absolute Kalibrierung der Messgeräte möglich, da beispielsweise die
entsprechenden Parameter der Moleküle bekannt oder mit anderen
Methoden zuvor ermittelt wurden. Solche absoluten Kalibrierungen
ermöglichen
wesentlich aussagekräftigere
Messungen als relative Kalibrierungen.
-
Die erfindungsgemäßen Kalibrierungsmittel können auch
Justiermarkierungen zur Orientierung der Kalibrierungsmittel in
Bezug auf die Messgeräte aufweisen.
Die Justiermarkierungen sind beispielsweise punkt- oder kreuzförmige Ausnehmungen
auf der Unter- und/oder Oberseite der Kalibrierungsmittel.
-
Die Erfindung betrifft auch ein Kalibrierungsverfahren
für Messsysteme.
Dieses wird unter Verwendung der erfindungsgemäßen Kalibrierungsmittel durchgeführt. Das
erfindungsgemäße Verfahren
umfasst die Schritte:
- – Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Kalibrierungsmittels
und
- – Bestimmung
von mindestens einem Wert eines zu kalibrierenden Parameters.
-
Beispiele für bestimmbare Parameter sind Fluoreszenzintensität, Fluoreszenzpolarisation,
Fluoreszenzlebensdauer, Rotationskorrelationszeit, translationale
Diffusion, Kreuzkorrelationsintensität, Teilchenzahlen) bzw. Konzentrationen)
des (der) Kalibrierungsfarbstoffe(s), sowie die Bestimmung der Fokusgeometrie.
Kombinationen der vorstehenden Parameter ist möglich.
-
Durch die Verwendung dieser Parameter
ist beispielsweise eine absolute Kalibrierung der Messgeräte möglich, da
die entsprechenden Parameter der Moleküle bekannt oder mit anderen
Methoden zuvor ermittelt wurden. Solche absoluten Kalibrierungen
ermöglichen
wesentlich aussagekräftigere
Messungen als relative Kalibrierungen. Beispielsweise ist die Konzentration
der Kalibrierungslösungen
sehr genau bekannt. Es ist somit aufgrund der Kenntnis der Parameter
möglich,
beispielsweise aus der Teilchenzahl, die pro Zeiteinheit durch den
Fokus tritt und der Fokusgeometrie, beispielsweise des Volumen des
Fokus, die Konzentration der Kalibrierungslösungen zu bestimmen. Dieser
Wert wird mit dem vorher bekannten Wert der Konzentration der Kalibrierungslösung verglichen
und beispielsweise das Detektionssystem nachjustiert.
-
In verschiedenen Anwendungen können auch
mehrere Werte als Kalibrierungskurve zusammengefasst werden, beispielsweise
bei der quantitativen Kalibrierung von Assays oder der Bestimmung der
Qualität
von Assay-Reagentien. Vorzugsweise erfolgt ein Vergleich eines gemessenen
Wertes einer Probe mit der Kalibrierungskurve oder einzelnen Kalibrierungspunkten.
Dabei ist die Untersuchung von Bindungsereignissen, wie vorstehend
beschrieben, eingeschlossen.
-
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des
erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt der Vergleich der in Proben gemessenen Werte und der Kalibrierungskurven
bzw. Kalibrierungspunkten durch Vergleich von Kalibrierungslösungen und
Proben, die sich auf demselben Kalibrierungsmittel befinden. Damit
ist eine optimale Kalibrierung unter identischen Bedingungen möglich.
-
Die erfindungsgemäßen Kalibrierungsmittel werden
vorzugsweise zur Kalibrierung von Mikroskopen, zur Kalibrierung
von quantitativen Assays, sowie zur Bestimmung der Qualität von Assay-Reagentien
eingesetzt.
-
Bei dem Mikroskop handelt es sich
vorzugsweise um ein Fluoreszenzmikroskop, insbesondere ein konfokales
Mikroskop oder um ein Spektrometer.
-
Anschließend wird die Erfindung anhand
einer bevorzugten Ausführungsform
unter Bezugnahme auf die anliegende Zeichnungen näher erläutert.
-
Es zeigen:
-
1 eine
schematisch perspektivische Ansicht einer bevorzugten Ausführungsform
des Kalibrierungsmittels in Form einer Titerplatte von unten ohne
Bodenplatte,
-
2 eine
Schnittansicht entlang der Linie II – II in 1 mit Bodenplatte und Abdeckung auf der der
Bodenplatte gegenüberliegenden
Seite der Basisplatte der Titerplatte.
-
Die in 1 dargestellte
Basisplatte 10 eines Kalibrierungsmittels ist ohne Bodenplatte 12 (2), bei der es sich beispielsweise
um eine Glasplatte handelt, dargestellt. Die Basisplatte 10 weist
einen in diese eingebetteten Trägerkern 14,
in Form einer Metallplatte, auf. Die Metallplatte 14 weist
dieselbe Länge
wie die Basisplatte 10 auf. Im mittleren Bereich der Basisplatte
sind die Vertiefungen 16 zur Aufnahme der Kalibrierungslösungen vorgesehen. Die
Vertiefungen 16 erstrecken sich über die gesamte Höhe der Basisplatte 10.
Es handelt sich somit um durchgehende Vertiefungen 16.
Dementsprechend weist die Metallplatte 14 zu den Vertiefungen 16 korrespondierende Öffnungen 18 (2) auf. Der Durchmesser
der kreisrunden Öffnungen 18 ist
geringfügig
größer als
der Durchmesser der Vertiefungen 16. Hierdurch weisen die
Vertiefungen 16 im Bereich der Metallplatte 14 eine
dünne Wandung 20 auf. Die
Vertiefungen 16 sowie die korrespondierenden Öffnungen 18 können auch
eine andere, beispielsweise achteckige Form haben. Ebenso können die Vertiefungen 16 und
die Öffnungen 18 konisch
ausgebildet sein. Die Wandstärke
der Wandung 20 ist hierbei möglichst stets gleich dick.
-
Die Vertiefungen 16 sind
regelmäßig angeordnet.
Im dargestellten Ausführungsbeispiel
handelt es sich um vier Zeilen mit jeweils sechs Vertiefungen 16,
so dass das dargestellte Ausführungsbeispiel
des Kalibrierungsmittels vierundzwanzig Vertiefungen aufweist. Sämtliche
Vertiefungen weisen denselben Durchmesser auf.
-
Zum Verschließen der Vertiefungen 16 ist
auf der Unterseite 22 der Basisplatte 10 eine
Glasplatte 12 angebracht. Das Befestigen der Glasplatte 12 auf der
Unterseite 22 erfolgt beispielsweise durch Aufkleben. Zur
genauen Lagebestimmung der Glasplatte 12 sind an den Rahmenteilen 24,
die an den Längskanten
der Trägerplatte 10,
vorgesehen sind, Ansätze 26 vorgesehen.
Hierdurch ist ein Verrutschen der Glasplatte 12 beim Aufkleben
vermieden, so dass die Glasplatte im Bereich der Vertiefungen 16 nicht
durch Klebstoff verunreinigt wird.
-
Die Höhe der Rahmenteile 24 ist
so gewählt, dass
die Rahmenteile auch bei eingeklebter Glasplatte über diese
vorstehen. Hierdurch ist es möglich, mehrere
Kalibrierungsmittel aufeinander zu stapeln, ohne dass eine Glasplatte
ein darunter liegendes Kalibrierungsmittel berührt und hierbei beschädigt werden
könnte.
Zur seitlichen Fixierung gestapelter Kalibrierungsmittel weist die
den Rahmenteilen 24 gegenüberliegende Seite, d.h. die
Oberseite der Kalibrierungsmittel eine geringere Breite auf, so
dass beim Aufeinanderstapeln die einzelnen Titerplatten ineinanderrutschen.
Um ein Berühren
der Glasplatte 12 zu vermeiden, sind zusätzlich zu
den Ansätzen 26,
zwischen denen die Glasplatte liegt, Ansätze 28 vorgesehen.
Bei aufeinander gestapelten Kalibrierungsmitteln liegt das benachbarte
Kalibrierungsmittel jeweils auf der Oberseite der Ansätze 26 und 28 auf.
-
Der sich über die gesamte Länge der
Basisplatte 10 erstreckende Trägerkern 14 ist nicht
notwendigerweise vollständig
mit Kunststoff umspritzt, sondern weist an beiden Endbereichen jeweils
eine Kontaktfläche 30 auf. Über die
Kontaktfläche 30 kann in
den Trägerkern,
beispielsweise eine Metallplatte 14, Wärme zur Erwärmung zugeführt oder zur Kühlung abgeführt werden.
Zur Lagefixierung der Kalibrierungsmitteln sind in den Kontaktflächen 30 zusätzlich Ausrichtbohrungen 32 vorgesehen.
-
Ferner kann die Basisplatte 10 im
Bereich der Ausnehmungen 16 Homogenisierungsausnehmungen 34 aufweisen.
Dies Homogenisierungsausnehmungen 34 sind zwischen den
Vertiefungen 16 derart angeordnet, dass jede Vertiefung 16 zu
mindestens einer Homogenisierungsausnehmung 34 benachbart
ist. Homogenisierungsausnehmungen 34 erstrecken sich nicht
durch die gesamte Basisplatte. Dies bedeutet, dass die Metallplatte
keine korrespondierenden Öffnungen
aufweist (2). Den in 1 dargestellten Homogenisierungsausnehmungen 34 ist
jeweils eine weitere Homogenisierungsausnehmung 34 gegenüberliegend
zugeordnet. Die Homogenisierungsausnehmungen dienen insbesondere bei
der Erwärmung
des Kalbrierungsmittels zum Ausgleich der Dehnungen des Kunststoffs
der Basisplatte.
-
Zusätzlich weist die Metallplatte 14 seitlich neben
dem Bereich, an dem die Vertiefungen 16 bzw. die korrespondierenden Öffnungen 18 vorgesehen sind Öffnungen
auf, die beim Umspritzen der Metallplatte 14 vollständig mit
Kunststoff gefüllt
werden. Diese Öffnungen
dienen zur formschlüssigen
Fixierung der Kunststoffhülle
an der Metallplatte 14.
-
Die der Bodenplatte 12 gegenüberliegende Seite
der Basisplatte 10 der als Kalibrierungsmittel dienenden
Titerplatte kann bei der vorstehend beschriebenen Ausführungsform
durch eine Abdeckung, vorzugsweise eine Kunststofffolie 36,
die durch Verschweißen
aufgebracht wird, im Wesentlichen luftdicht verschlossen werden.