DE10346130A1

DE10346130A1 - Mikrodissektion/Verfahren zum Isolieren von kleinen Ausschnitten

Info

Publication number: DE10346130A1
Application number: DE2003146130
Authority: DE
Inventors: Norbert Leclerc; Kay Haupt
Original assignee: LECLERC NORBERT DR
Current assignee: LECLERC NORBERT DR
Priority date: 2003-10-01
Filing date: 2003-10-01
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2023-10-02
Also published as: DE10346130B4

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Mikrodissektion beschrieben, bei dem zunächst ein Präparat (10, 14) elektrostatisch an einem Objektträger (12) fixiert wird. Daraufhin wird ein Dissektat aus dem Präparat mittels Laser-Mikrodissektion ausgeschnitten. Wegen der elektrostatischen Haftung bewegt sich das Dissektat während der Laser-Mikrodissektion nicht. Anschließend wird das Dissektat elektrostatisch abgehoben. Alternativ kann das Dissektat dadurch abgehoben werden, dass es von einem Greifer angesaugt wird, an dessen Außenseite es vor einer kleinen Öffnung haftet.

Description

Zur Aufklärung der molekularen Ursachen von Krankheiten werden sogenannte Genexpressionsstudien durchgeführt. Dabei wird versucht, die tatsächlich in einer Zelle exprimierten Gene zu bestimmen, da die zugehörigen Proteine für die krankhafte Entwicklung der Zellen verantwortlich sind. Eine Möglichkeit, die tatsächlich vorhandenen Proteine zu bestimmen, besteht darin, die in der Zelle synthetisierten m-RNA zu bestimmen, da aus ihnen die Proteine gebildet werden.
Die m-RNA ist jedoch ein sehr kurzlebiges Produkt der Zellen, weshalb die Konzentration an m-RNA in den Zellen sehr gering ist. Will man die m-RNA z. B. einer Tumorzelle bestimmen, so muss daher eine möglichst große Zahl von Tumorzellen gesammelt werden. Die Tumorzellen müssen dazu aus krankem Gewebe isoliert werden. Dazu können die Tumorzellen beispielsweise aus Gewebeschnitten ausgeschnitten (dissektiert) und isoliert gesammelt werden. Anschließend werden die isolierten Tumorzellen aufgeschlossen. Durch geeignete Aufreinigungsschritte wird die m-RNA aus den Zellen isoliert. Danach wird sie mittels der Reversen Transkriptase in c-DNA übersetzt. Diese wird mit i. d. R. linearer PCR amplifiziert. Die so gewonnene c-DNA wird z. B. mit Hilfe von geeigneten DNA-Chips qualitativ bzw. quantitativ analysiert.
In diesem Zusammenhang befasst sich die vorliegende Erfindung mit dem Isolieren bzw. Ausschneiden von zu untersuchenden Zellen, mit der sogenannten Dissektion. Werden dabei einzelne Zellen – mit Durchmessern im Bereich einiger Mikrometer – aus Gewebe ausgeschnitten, spricht man auch von Mikrodissektion.
Bei der Mikrodissektion kommt es u. a. darauf an, äußerst sauber zu arbeiten, d.h. insbesondere RNAsen-frei zu arbeiten, da diese die m-RNA abbauen. Schon eine Berührung mit der bloßen Hand ist zu vermeiden.

Bei bekannten Verfahren zum Schneiden von Gewebe wird der Gewebeschnitt (Präparat) beispielsweise auf einem Objektträger an Luft präpariert. Mit Hilfe eines Lasers wird eine geschlossene Kurve um das kranke Gewebe (Dissektat) beschrieben. Auf der Kurve wird das Gewebe ablatiert, wodurch das zu isolierende kranke Gewebe vom restlichen Gewebe getrennt ist. Das ausgeschnittene Dissektat kann beispielsweise in eine Pipette eingesaugt werden, sofern es in Flüssigkeit vorliegt. Nachteilig an dem bekannten Verfahren ist, dass es sehr zeitaufwendig ist. Um die für eine Analyse benötigte Menge an m-RNA zu sammeln ist eine Person mehrere Tage mit dem Schneiden von Gewebe beschäftigt.

Ein verbessertes Verfahren ist in der DE 196 16 216 A1 beschrieben. Ein auf einem Objektträger präparierter Gewebeschnitt wird auf ein inverses Mikroskop gelegt. Über dem Gewebeschnitt wird ein Deckel eines verschließbaren Röhrchens (Tube) angeordnet. Die Unter- bzw. Innenseite des Deckels ist mit Öl beschichtet. Mittels Laserablation werden Teile des Gewebes ausgeschnitten. Die ausgeschnittenen Teile des Gewebes werden mittels eines Lichtpulses von unten nach oben katapultiert. Dabei treffen sie auf den mit Öl beschichteten Deckel und haften am Öl. Nachteilig an diesem Verfahren ist die schlecht kontrollierbare Bewegung des gelösten Gewebestücks. Dieses erreicht nicht immer den Deckel.

Ein weiteres Verfahren ist in der DE 100 03 588 C2 beschrieben. Dabei wird eine Folie mit einem Gewebeschnitt mit dem Gewebeschnitt nach unten auf einen Mikroskop-Objektträger gelegt. Anschließend wird der Mikroskop-Objektträger in die Objektebene eines inversen Mikroskops gelegt. Ein Klebeband wird mit einem Haftmittel nach unten über der Folie und damit über dem Gewebeschnitt angeordnet. Anschließend wird zu isolierendes Gewebe durch einen fokussierten Laserstrahl ausgeschnitten. Dabei wird auch die Folie durchtrennt. Danach wird das Klebeband aus dem Mikroskop entfernt. Die Dissektate haften am Klebeband. Der Rest der Folie und des Gewebeschnitts bleibt am Mikroskop-Objektträger haften. Ein Ablösen des Dissektats vom Klebeband ist anschließend nicht mehr möglich, so dass dem nachfolgenden biochemischen Prozess das Klebeband mit zugeführt werden muss. Damit verbunden ist ein hoher Bedarf an teuren Verbrauchsmaterialien.

Ein weiterer Nachteil der bisher bekannten Verfahren ist die unzureichende Automatisierbarkeit, da die Dissektate nicht kontrolliert aufgenommen, transportiert und wieder abgegeben werden können. Dies spielt insbesondere dann eine Rolle, wenn mehrere verschiedene Dissektat-Typen in verschiedene Auffanggefäße transportiert werden müssen.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mikrodissektionsverfahren anzugeben, das sich zur Automatisierung eignet.

Ein geeignetes Mikrodissektionsverfahren muss das Präparat beim Schneiden fixieren, damit sich letzteres nicht durch die Einwirkung z. B. des Lasers bewegt. Nach dem Schneiden muss das Dissektat sicher aus dem restlichen Gewebe isoliert werden. Ein zuverlässiger Transport des Dissektats mittels eines Greifers in verschiedene Auffanggefäße und das sichere Loslösen vom Greifer zum Absetzten des Dissektats in den verschiedenen Auffanggefäßen muss gewährleistet sein. Ein hoher Automatisierungsgrad sollte mit vergleichbar geringem Aufwand erreichbar sein.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Bei der Mikrodissektion wird typischerweise mit Hilfe eines Lasers eine geschlossene Kurve um das kranke Gewebe beschrieben. Auf der Kurve wird das Gewebe ablatiert. Bevor die Kurve ganz geschlossen ist, kommt es häufig dazu, dass sich das Dissektat aufrollt oder aufstellt und in manchen Fällen den letzten noch zu schneidenden Kurvenabschnitt verschattet, weshalb es nicht mehr möglich ist, den Schnitt zu vollenden und das Dissektat tatsächlich zu isolieren.

Wichtig ist also zunächst ein Verfahren, das eine gute Fixierung des gesamten Gewebes während des Schneidens gewährleistet.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst das Präparat auf einen dielektrischen Objektträger aufgebracht.

Häufig wird dazu zunächst die Schicht biologischen Materials auf einer Seite einer Stabilisierungsschicht aufgebracht. Die Stabilisierungsschicht kann entfallen, sofern die mechanischen Eigenschaften der Schicht biologischen Materials dies zulassen. Die Schicht biologischen Materials eventuell zusammen mit der Stabilisierungsschicht wird im Folgenden als Präparat bezeichnet.

Die Schicht biologischen Materials kann z. B. ein Gewebeschnitt, ein Zellenausstrich, ausgesäte Zellen oder eine Zellkultur sein.

Als Objektträger kommen insbesondere Objektträger aus Glas für die Mikroskopie in Betracht. Es können aber auch sonstige feste Unterlagen verwendet werden, sofern sie dielektrisch sind. Sie müssen auch nicht zwingend transparent sein.

Danach wird ein elektrisches Feld ausreichender Stärke (beispielsweise zwischen ca. 100 kV/m und 10 MV/m, vorzugsweise 1 MV/m) zwischen der vom Präparat abgewandten Seite des Objektträgers und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats angelegt. Dabei kommt es zu einer dielektrischen Polarisation sowohl des Objektträgers als auch des Präparats.

Werden die auf der dem Objektträger abgewandten Seite des Präparates sich sammelnden Ladungsträger durch eine geeignete erste Elektrode (z. B. ein gegenüber dem Präparat nicht isolierter Draht mit Nullpotential/Erdung) entfernt, verbleibt im Präparat eine Restladung. Diese bewirkt eine verstärkte flächige Anziehung zwischen dem dielektrisch polarisierten Objektträger und dem elektrisch geladenen Präparat, die deutlich über die natürlich vorhandene Adhäsion hinausgeht. Damit ist das Präparat für die auszuführende Dissektion sicher fixiert.

Das geschilderte Verfahren zum elektrostatischen Fixieren einer Schicht biologischen Materials (Präparat) auf einem Objektträger kann in Teilen auch zum Abheben eines Dissektats aus einem Präparat bzw. von einem Objektträger eingesetzt werden, da mit dem elektrostatischen Fixieren stets ein elektrostatisches Aufladen einhergeht, das für das Abheben ausgenutzt werden kann.

Dazu kann z. B. nach dem elektrostatischen Fixieren der zu isolierende Teil (Dissektat) des Präparats aus dem Präparat z. B. mittels Laser-Mikrodissektion ausgeschnitten werden.

Bei der Laser-Mikrodissektion beschreibt der Fokus eines Laserstrahls eine geschlossene oder annähernd geschlossene Kurve um das Dissektat. Auf dieser Kurve wird das Präparat ablatiert, d. h. im Wesentlichen verdampft. Dadurch ist das Dissektat vom Rest des Präparats getrennt.

Es genügt, wenn das Präparat nicht auf einer vollständig geschlossenen Kurve sondern nur auf einer annähernd geschlossenen Kurve abgetragen wird, sofern der verbleibende Abschnitt so klein ist, dass er beim anschließenden Entfernen des Dissektats aus dem Präparat durchgerissen wird und das Entfernen nicht hindert.

Es unerheblich, ob zunächst elektrostatisch fixiert und aufgeladen wird und dann ausgeschnitten wird, oder umgekehrt.

Das Dissektat verbleibt zunächst zusammen mit dem Präparat an seiner ursprünglichen Stelle auf dem Objektträger, zumal es elektrostatisch am Objektträger haftet. Es ist aber vom restlichen Präparat – zumindest im Wesentlichen – mechanisch getrennt.

Nun wird eine zweite Elektrode von der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats an das Dissektat herangeführt. Daraufhin wird die Richtung des angelegten elektrischen Feldes umgekehrt und ggf. seine Stärke derart verändert, dass sich das Dissektat vom Objektträger löst und sich entlang der Feldlinien zu der zweiten Elektrode bewegen.

Um eine sofortige Umladung des Dissektats durch die zweite Elektrode zu verhindern – woraufhin das Dissektat nicht mehr an der zweiten Elektrode haften würde -, müssen die zweite Elektrode und das Dissektat durch eine elektrisch isolierende Schicht voneinander getrennt werden. Dazu wird vorzugsweise die Elektrode mit einem elektrisch isolierenden Kunststoff überzogen.

Es wird also eine von außen angelegte elektrische Hochspannung für das Fixieren des Präparates und zum Isolieren des Dissektats benutzt.

Es können mehrere Dissektate an einer zweiten Elektrode gesammelt werden.

Haftet das Dissektat an der zweiten Elektrode, so kann es zu einem das Dissektat aufnehmenden Gefäß transportiert werden. Dort kann es dadurch von der zweiten Elektrode getrennt werden, dass die elektrostatische Haftung des Dissektats an der zweiten Elektrode aufgehoben wird. Dies kann z. B. erreicht werden, indem die zweite Elektrode mit einer elektrischen Ladung gleichen Vorzeichens aufgeladen wird, wie die elektrische Ladung des Dissektats.

Das Dissektat kann auf diese Weise gezielt ausgeschnitten, isoliert, transportiert und abgesetzt werden. Es wird dadurch die Möglichkeit einer weitgehenden Automatisierung geschaffen.

Die zweite Elektrode kann auch so ausgebildet sein, dass sie insgesamt oder einzelne Teile von ihr zusammen mit den gesammelten Dissektaten der weiteren biochemischen Prozessierung zugeführt werden kann.

Eine weitere Möglichkeit, das Dissektat vom Objektträger abzuheben und damit vom Rest des Präparats zu trennen, besteht darin, dass ein Greifer an den zu isolierenden Teil der Schicht biologischen Materials (Präparat) herangeführt wird. Der Greifer wird dazu entweder in Kontakt mit dem Präparat oder in dessen unmittelbare Nähe gebracht.

Der Greifer hat vorzugsweise einen durchgängigen Hohlkanal mit einer präparatseitigen Öffnung, die kleiner ist als der zu isolierende Teil des Präparats. Z. B. kann der Greifer eine dünne Pipette sein.

Die Öffnung kann rund oder schlitzförmig ausgebildet sein. Entscheidend ist, dass zumindest eine Dimension der Öffnung kleiner als das Dissektat ist. Somit wird das Eintreten des Dissektats in die Öffnung verhindert.

Unmittelbar um die präparatseitige Öffnung des Greifers herum ist eine vorzugsweise weitgehend ebene Kontaktfläche ausgebildet, mit der der Greifer das Präparat berühren kann. Die Kontaktfläche des Greifers kann auch aus einem porösen Material mit unregelmäßigen Öffnungen bestehen.

Der zu isolierende Teil des Präparats wird durch eine Druckdifferenz an den Greifer angesaugt. In der Regel erfolgt dies durch eine Druckerniedrigung im Hohlkanal bzw, in der Öffnungen des Greifers und einer damit einhergehenden Druckerniedrigung auf einer Seite des Präparats. Der zu isolierende Teil wird dann durch den relativen Überdruck des Umgebungsmediums an die Kontaktfläche des Greifers gepresst. Bei Aufrechterhaltung der Druckdifferenz bleibt die Anpresskraft dauerhaft erhalten. Damit ist das Präparat am Greifer fixiert. Das Fixieren lässt sich z. B. ohne Schwierigkeiten an Luft oder in Flüssigkeit durchführen.

Das Fixieren kann erfolgen, bevor der zu isolierende Teil der Schicht biologischen Materials aus dem Präparat ausgeschnitten wurde. Dadurch wird der zu isolierende Teil während des Schnitts vom Greifer fixiert.

Anschließend wird das Dissektat aus dem Präparat ausgeschnitten. Dies erfolgt vorzugsweise mit Hilfe von Laser-Mikrodissektion.

Vorteilhafterweise ist der Greifer in diesem Fall transparent, um störende Reflexionen und Streuung zu vermeiden. Auch ansonsten bietet es sich an, den Greifer aus einem transparenten Material zu fertigen, damit die Beleuchtung des Präparates nicht beeinträchtigt wird.

Es kann auch zunächst das Dissektat ausgeschnitten werden und erst danach der Greifer das Dissektat aufnehmen. Vorteilhafterweise wird hierzu das Präparat vorher elektrostatisch am Objektträger fixiert.

Da die präparatseitige Öffnung des Greifers kleiner ist als das Dissektat, bleibt letzteres vor der Öffnung des Greifers haften.

Nach erfolgter Dissektion bleibt das Dissektat am Greifer haften, auch wenn der Greifer vom Präparat entfernt wird. Dafür muss mindestens eine Öffnung des Greifers von dem Dissektat zumindest teilweise bedeckt sein. Das kann durch die Positionierung des Greifers vor der Dissektion erreicht werden. Dadurch wird das Dissektat von der übrigen Schicht isoliert.

Mit Hilfe des Greifers wird somit das Dissektat angesaugt, aber nicht eingesaugt. Dies erlaubt es, dass Dissektat zu transportieren und in einem Auffanggefäß wieder abzulegen. Dazu genügt es, die Druckdifferenz derart zu verändern, dass das Dissektat vom Greifer nicht mehr gehalten wird und von diesem abfällt. Dazu kann die Druckdifferenz z. B. abgeschwächt oder umgekehrt werden.

Mit Auffanggefäß wird ein Ort bezeichnet, an dem das Dissektat für eine weitere Prozessierung aufbewahrt oder einer weiteren Prozessierung zugeführt wird.

Das beschriebene Verfahren ist relativ einfach durchzuführen. Es fixiert das Präparat während des Schneidens und es erlaubt einen zuverlässigen Transport des Dissektats in ein Auffanggefäß, wo es abgelegt werden kann. Damit eignet sich das beschriebene Verfahren in besonderer Weise zur Automatisierung.

Zum Fixieren einer Mehrzahl von Dissektaten auf einem Greifer an unterschiedlichen Positionen kann der Greifer eine Mehrzahl von präparatseitigen Öffnungen aufweisen, die kleiner sind als die Dissektate und das Fixieren von einer entsprechenden Mehrzahl von Dissektaten vor den jeweiligen präparatseitigen Öffnungen ermöglichen. Dazu wird der Greifer nach Aufnahme des ersten Dissektats erneut auf dem Präparat aufgesetzt. Damit lassen sich mehrere Dissektate einfach auf einem Greifer sammeln.

Es können auch mehrere Greifer in einer gemeinsamen Halterung angebracht sein und nacheinander unterschiedliche Phasen des Verfahrens durchlaufen.

Die unterschiedlichen Öffnungen eines solchen Greifers lassen sich entweder einzeln oder gemeinsam mit einer Druckdifferenz beaufschlagen. Um sie einzeln zu beaufschlagen ist ein Kanalsystem innerhalb des Greifers denkbar, bei dem jede Öffnung an einen eigenen Hohlkanal angeschlossen ist.

Zwischen dem Greifer und dem Präparat kann sich eine ebenfalls mit Öffnungen versehene Schicht befinden. Diese wird im Folgenden als Zwischenschicht bezeichnet. Eine der Öffnungen dieser Zwischenschicht wird vor dem Absenken des Greifers auf das Präparat mit einer Öffnung des Greifers in Deckung gebracht. Die Durchmesser der Öffnungen müssen dabei nicht übereinstimmen. Wichtig ist nur, dass eine der Öffnungen – vorzugsweise die Öffnung in der Zwischenschicht – kleiner ist als das aufzunehmende Dissektat.

Nach erfolgter Dissektion und dem Abheben des Greifers und der Zwischenschicht vom Präparat kann die Zwischenschicht so bewegt werden, dass:

a) erneut eine freie Öffnung mit einer Öffnung des Greifers zur Deckung kommt
b) die mit einem Dissektat belegte Öffnung zu einer dem Greifer äquivalenten Vorrichtung gelangt, an der die Ablösung des Dissektats durch Veränderung der Druckdifferenz erfolgt.

Da der Greifer nur mit der kontaminationsfreien Zwischenschicht in Berührung kommt, besteht keine Kontaminations- oder Verschleppungsgefahr, so dass das Verfahren unbegrenzt wiederholt werden kann.

Durch die Wahl eines geeigneten Materials der Zwischenschicht kann erreicht werden, dass die Dissektate nach der Isolation an der Zwischenschicht adhäsiv haften und sich auch dann nicht von der Zwischenschicht lösen, wenn der Greifer und/oder die Druckdifferenz nicht mehr unmittelbar anliegen. Dazu kann die Zwischenschicht beispielsweise aus Polycarbonat bestehen.

Der Vorteil des beschriebenen Verfahrens liegt in der sicheren Probenaufnahme und in der Möglichkeit der einfachen Automatisierung. Da die Proben einfach in verschiedenen Auffanggefäßen abgelegt werden können, ist das Verfahren sehr flexibel. Des weiteren können die isolierten Dissektate einfach auf dem Greifer kontrolliert werden, da der Greifer mit dem vorhandenen Mikroskop untersucht werden kann.

Die geschilderten Verfahren ergänzen sich und lassen sich geeignet kombinieren, um die Automatisierungsmöglichkeiten zu verbessern. So kann beispielsweise zunächst das Präparat auf einen dielektrischen Objektträger aufgebracht werden. Auf dem Objektträger kann es in der beschriebenen Weise elektrostatisch fixiert werden. Anschließend wird der zu isolierende Teil (Dissektat) des Präparats aus dem Präparat ausgeschnitten. Schließlich wird das Dissektat mit Hilfe der oben geschilderten zweiten Elektrode oder mit Hilfe des Greifers vom Rest des Präparats getrennt.

Eine weitere Möglichkeit der räumlichen Trennung der ausgeschnittenen Dissektate vom restlichen Präparat besteht darin, das restliche Präparat auf geeignete Weise vom Objektträger abzuheben, z. B. mit einer Pinzette. Die elektrostatisch anhaftenden Dissektate verbleiben dann auf dem Objektträger. Diese können mittels des Greifers in ein Auffanggefäß überführt werden.

Die Aufgabe wird auch durch Vorrichtungen gelöst, die geeignet sind, die Erfindung auszuführen. Dies Vorrichtungen sind in den Vorrichtungsansprüchen beschrieben.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Beispiele beschränkt. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche oder funktionsgleiche bzw. hinsichtlich ihrer Funktionen einander entsprechende Elemente. Im Einzelnen zeigt:
1A eine schematische Darstellung des Polarisationsschrittes des elektrostatischen Fixierens eines Präparats auf einem Objektträger;
1B eine schematische Darstellung des Aufladungsschrittes des elektrostatischen Fixierens eines Präparats auf einem Objektträger;
2 eine schematische Darstellung des elektrostatischen Abhebens eines Dissektats;
3A eine schematische Darstellung der Annäherung eines pneumatischen Greifers an ein Präparat;
3B das Ansaugen des Präparats bzw. Dissektats an den Greifer;
3C das Abheben des Dissektats mit Hilfe des Greifers;
3D das Absetzen des Dissektats in einem Auffanggefäß; und
4 eine schematische Darstellung des Einsatzes einer Zwischenschicht zwischen Greifer und Präparat.
Im Folgenden wird auf 1A Bezug genommen.
In Paraffin eingebettetes oder gefrorenes Gewebe wird durch einen Hobel in dünne Gewebeschnitte 10 zerlegt. Diese rollen sich in der Regel auf.
Ein dielektrischer Mikroskop-Objektträger 12 wird mit Alkohol besprüht. Ein wenige Quadratzentimeter großes Stück einer Folie 14, welches auf einer Papierschicht aufgetragen ist, wird auf die mit Alkohol besprühte Fläche des Mikroskop-Objektträgers 12 aufgebracht. Die Folie 14 besteht z. B. aus 2 μm dickem, UV absorbierendem PET oder PEN. Sie dient als Stabilisierungsschicht. Das Papier wird anschließend entfernt.
Anschließend wird der aufgerollte Gewebeschnitt 10 auf die Folie 14 gebracht. Der Mikroskop-Objektträger 12 mit Folie 14 und Gewebeschnitt 10 wird auf 60° erhitzt, wodurch das Paraffin schmilzt und sich der Gewebeschnitt 10 ausrollt.
Danach kann der Aufbau aus Folie 14 und Gewebeschnitt 10 – der gemeinsam als Präparat bezeichnet wird – umgedreht werden, wodurch der Gewebeschnitt 10 auf dem Objektträger 12 zu liegen kommt. Der Gewebeschnitt 10 liegt dann zwischen Objektträger und Stabilisierungsschicht bzw. Folie 14.
Das Präparat wird zusammen mit dem dielektrischen Objektträger 12 in die Objektebene eines inversen Mikroskops so eingelegt, dass der Objektträger unten liegt und die Schicht biologischen Materials von oben zugänglich ist.
Das Mikroskop besitzt einen motorischen x-y-Tisch, der das Präparat verfahren kann. Ebenfalls am Tisch angebracht sind Auffanggefäße, in die die zu isolierenden Teile nach der Dissektion verbracht werden sollen.
Danach wird ein elektrisches Feld 18 (siehe 1A) ausreichender Stärke (vorzugsweise 1 MV/m) zwischen der vom Präparat abgewandten Seite des Objektträgers 12 und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparates, also der Folie 14, angelegt. Dazu werden zwei Elektroden, eine präparatseitige Elektrode 15 und eine objektträgerseitige Elektrode 16 eingesetzt. Letztere weißt eine Aussparung 17 auf, um das Objektiv des inversen Mikroskops nicht zu behindern.
Durch Anlegen des elektrischen Feldes 18 kommt es zu einer dielektrischen Polarisation sowohl des Objektträgers 12 als auch des Präparates.
Bei dem in 1A gezeigten Beispiel sammeln sich an der vom Präparat abgewandten Seite des Objektträgers 12 negative Ladungen. An der dem Präparat zugewandten Seite des Objektträgers 12 sammeln sich positive Ladungen. Entsprechend sammeln sich an der auf dem Objektträger 12 liegenden Seite des Gewebeschnitts 10 negative Ladungen und an der vom Objektträger abgewandten Seite der Folie 14 wiederum positive Ladungen.
Werden die auf der dem Objektträger 12 abgewandten Seite des Präparates sich sammelnden Ladungsträger durch eine geeignete Elektrode 20 (z. B. durch einen gegenüber dem Präparat nicht isolierter Draht mit Nullpotential/Erdung) entfernt, verbleibt im Präparat eine Restladung (1B). Bei dem in 1 gezeigten Beispiel werden die positiven Ladungen an der vom Objektträger 12 abgewandten Seite der Folie 14 abgezogen. Das Präparat bleibt negativ geladen zurück.
Dies bewirkt eine verstärkte flächige Anziehung zwischen dem dielektrisch polarisierten Objektträger mit seinen positiven Ladungen auf der Seite des Präparats und dem elektrisch negativ geladenen Präparat. Diese elektrostatische Anziehungskraft geht deutlich über die natürlich vorhandene Adhäsion hinaus. Damit ist das Präparat sicher fixiert.
Anschließend wird das Präparat mittels Laser-Mikrodissektion geschnitten. Erfolgt die Mikrodissektion auf einer geschlossenen Kontur, verbleibt das Dissektat 22 zusammen mit dem Präparat an ursprünglicher Stelle auf dem Objektträger 12. Es ist jetzt vom restlichen Präparat mechanisch getrennt.
Im Folgenden wird auf 2 Bezug genommen. Nach der Mikrodissektion wird eine zweite Elektrode 24 von der vom Objektträger 12 abgewandten Seite des Präparats an das Dissektat 22 herangeführt. Wird jetzt die Richtung des angelegten elektrischen Feldes umgekehrt und ggf. seine Stärke verändert, wird sich das Dissektat 22 vom Objektträger 12 lösen und sich entlang der Feldlinien zu der zweiten Elektrode 24 bewegen. Um eine sofortige Umladung des Dissektats 22 zu verhindern, ist diese Elektrode elektrisch gegenüber dem Dissektat 22 zu isolieren. Dies erfolgt vorzugsweise durch einen Kunststoff-Überzug 26.
Im Folgenden wird auf 3 Bezug genommen.
Ein transparenter Greifer 28 ist über dem Präparat angebracht (3A). Er kann auf das Präparat abgesenkt werden und im abgesenkten Zustand mit dem Präparat auf dem Mikroskoptisch mitbewegt werden, wenn sich der Mikroskoptisch für die Ablation bzw. Mikrodissektion relativ zum Laserfokus bewegt.
Der Greifer 28 besitzt an seinem unteren Ende eine weitgehend ebene Kontaktfläche 30, die mehrere kleine Öffnungen 32 aufweist. Zweckmäßigerweise ist die Kontaktfläche 30 so groß, dass mehrere Dissektate darauf Platz finden können.
Vorzugsweise hat die Kontaktfläche 30 einen Durchmesser von 500 μm. Die Öffnungen 32 haben einen Durchmesser von ca. 8 μm und sind in Form einer 10 × 10 Matrix angeordnet.
Diese Öffnungen 32 sind über Hohlkanäle 34 mit einer (nicht gezeigten) pneumatischen Vorrichtung verbunden, die Unter- und Überdruck erzeugen kann.
Der zu isolierende Teil 22 des Präparats wird ausgewählt und der transparente Greifer 28 von oben mit dem Präparat so in Kontakt gebracht, dass eine Öffnung 32 der Kontaktfläche 30 innerhalb der zu schneidenden Kontur liegt. Die Bewegungsrichtung des Greifers 28 ist in 3A durch eine fett gedruckten Pfeil angedeutet.
Dann wird ein Unterdruck im Hohlkanal 34 des Greifers 28 erzeugt und dadurch das Präparat an den Greifer angesaugt und damit fixiert. Die unterschiedlichen Drücke sind in 3B durch dünne Pfeile angedeutet.
Der Unterdruck kann sowohl über alle Öffnungen bzw. Kanäle gleich verteilt sein, als auch für jeden Kanal individuell ausgebildet werden.
Nun wird die Kontur geschnitten, um den zu isolierenden Teil 22 zu dissektieren. Danach wird der Greifer 28 mit dem anhaftenden Dissektat 22 nach oben herausgehoben. Die Bewegungsrichtung ist in 3C durch einen fett gedruckten Pfeil angedeutet.
Um weitere Dissektate 22 auf dem Greifer 28 zu sammeln, wird dieser Vorgang mit den jeweils noch freien Öffnungen 32 des Greifers wiederholt.
3D deutet schematisch an, wie das Dissektat 22 nach Abheben vom Objektträger 12 mit Hilfe des Greifers 28 zu einem Auffanggefäß 36 transportiert wird. Über dem Auffanggefäß 36 wird der Hohlkanal 34 mit einem (durch einen dünnen Pfeil angedeuteten) Überdruck beaufschlagt. Dies löst das Dissektat 22 von der Öffnung 32. Daraufhin fällt (angedeutet durch den fett gedruckten Pfeil) das Dissektat 22 in das Auffanggefäß 36.
Wird – wie im bevorzugten Beispiel – der Gewebeschnitt 10 unmittelbar auf den Objektträger 12 gelegt und durch die Stabilisierungsschicht 14 bedeckt, so wird der Greifer 28 stets auf der vom Präparat abgewandten Seite mit der Stabilisierungsschicht 14 in Kontakt gebracht. Eine Kontamination und Verschleppung von biologischem Material wird auf diese Weise wirkungsvoll verhindert, da der Greifer 28 nie direkt mit der biologischen Schicht 10 in Kontakt kommt.
Im Folgenden wird auf 4 Bezug genommen.
Zwischen dem Greifer 28 und dem Präparat kann sich eine ebenfalls mit Öffnungen 40 versehene Schicht 38 befinden. Diese wird im Folgenden als Zwischenschicht 38 bezeichnet. Eine der Öffnungen 40 dieser Zwischenschicht 38 wird vor dem Absenken des Greifers 28 auf das Präparat mit einer Öffnung 32 des Greifers 28 in Deckung gebracht. Die Durchmesser der Öffnungen müssen dabei nicht übereinstimmen. Wichtig ist nur, dass eine der Öffnungen – vorzugsweise die Öffnung 40 in der Zwischenschicht 38 – kleiner ist als das aufzunehmende Dissektat 22.
Nach erfolgter Dissektion und dem Abheben des Greifers 28 und der Zwischenschicht 38 vom Präparat kann die Zwischenschicht so bewegt werden (angedeutet durch den fett gedruckten Pfeil in 4), dass:

a) erneut eine freie Öffnung 40 mit einer Öffnung 32 des Greifers 28 zur Deckung kommt; oder
b) die mit einem Dissektat 22 belegte Öffnung 40 zu einer dem Greifer 28 äquivalenten Vorrichtung gelangt, an der die Ablösung des Dissektats 22 wie oben beschrieben erfolgt.

Zum Abschluss des Verfahrens wird – entsprechend 3D – der Greifer 28 abgehoben und das Auffanggefäß 36 zum Greifer 28 transportiert oder aber der Greifer 28 zum Auffanggefäß 36 transportiert. In dieser Stellung können durch eine Druckerhöhung im Hohlkanal 34 die am Greifer 28 fixierten Dissektate 22 abgelöst werden. Sie fallen dann in das Auffanggefäß 36. Die Druckerhöhung kann z. B. durch einen oder mehrere kurze Druckstöße oder durch Schallwellen erfolgen.
Da der Greifer 28 nur mit der kontaminationsfreien Zwischenschicht 38 in Berührung kommt, besteht keine Kontaminations- oder Verschleppungsgefahr für den Greifer. Dieser kann unbegrenzt wiederholt eingesetzt werden.
Im Rahmen der Erfindung sind zahlreiche Abwandlungen und Weiterbildungen der beschriebenen Ausführungsbeispiele verwirklichbar. So kann z. B. auch ein aufrechtes Mikroskop verwendet werden. Dabei ordnen sich alle Komponenten entsprechend an.

10: Gewebeschnitt
12: Mikroskop-Objektträger
14: Folie bzw. Stabilisierungsschicht
15: präparatseitige Elektrode
16: objektträgerseitige Elektrode
17: Aussparung in der objektträgerseitigen Elektrode 16
18: elektrisches Feld
20: erste Elektrode
22: Dissektat
24: zweite Elektrode
26: Kunststoff-Überzug zum Isolieren der Elektrode 24
28: Greifer
30: Kontaktfläche
32: Öffnung des Greifers 28 in der Kontaktfläche 30
34: Hohlkanal im Greifer 28
36: Auffanggefäß
38: Zwischenschicht
40: Öffnungen der Zwischenschicht 38

Claims

Verfahren zum Fixieren einer Schicht biologischen Materials (Präparat) auf einem Objektträger (12) mit folgenden Schritten: a) das Präparat (10, 14) wird auf einen dielektrischen Objektträger (12) aufgebracht; b) ein elektrisches Feld (18) ausreichender Stärke wird zwischen der vom Präparat (10, 14) abgewandten Seite des Objektträgers (12) und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats angelegt; und c) die auf der dem Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14) sich sammelnden Ladungsträger werden durch eine erste Elektrode (20) entfernt.
Verfahren zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit folgenden Schritten: a) das Präparat (10, 14) wird auf einen dielektrischen Objektträger (12) aufgebracht; b) ein elektrisches Feld (18) ausreichender Stärke wird zwischen der vom Präparat (10, 14) abgewandten Seite des Objektträgers (12) und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats angelegt; c) die auf der dem Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14) sich sammelnden Ladungsträger werden durch eine erste Elektrode (20) entfernt; d) der zu isolierende Teil (Dissektat) (22) des Präparats (10, 14) wird aus dem Präparat ausgeschnitten; e) eine zweite Elektrode (24) wird von der vom Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14) an das Dissektat (22) herangeführt; und f) die Richtung des elektrischen Feldes (18) wird derart umgekehrt, dass das Dissektat (22) von der zweiten Elektrode (24) angezogen wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrostatische Haftung des Dissektats (22) an der zweiten Elektrode (24) derart aufgehoben wird, dass sich das Dissektat von der zweiten Elektrode löst.
Verfahren zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit folgenden Schritten a) ein Greifer (28) wird an den zu isolierenden Teil (22) der Schicht biologischen Materials herangeführt; b) der Greifer (28) wird derart ausgebildet, dass er einen durchgängigen Hohlkanal (34) mit einer präparatseitigen Öffnung (32) hat, die in mindestens einer Dimension kleiner ist als die entsprechende Dimension des zu isolierenden Teils (22) des Präparats; c) durch eine Druckdifferenz wird der zu isolierende Teil (22) vor der präparatseitigen Öffnung (32) des Greifers (28) fixiert; d) der zu isolierende Teil (22) wird aus der Schicht (10) biologischen Materials ausgeschnitten, wodurch ein Dissektat gebildet wird; und e) das Dissektat (22) wird vom Rest der Schicht (10) biologischen Materials durch Entfernen des Greifers (28) von der Schicht biologischen Materials getrennt.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Greifer (28) derart ausgebildet wird, dass er eine Mehrzahl von präparatseitigen Öffnungen (32) aufweist, die kleiner sind als zu isolierende Teile (22) des Präparats (10, 14) und das Fixieren von einer entsprechenden Mehrzahl von Dissektaten vor den jeweiligen präparatseitigen Öffnungen ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Dissektat (22) mit Hilfe des Greifers (28) an einen Zielort (3b) transportiert wird und dort durch Verändern der Druckdifferenz abgelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Greifer (28) und dem Präparat (10, 14) eine mit Öffnungen (40) versehene Zwischenschicht (38) angeordnet wird.
Verfahren zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit folgenden Schritten: a) das Präparat (10, 14) wird auf einen dielektrischen Objektträger (12) aufgebracht; b) das Präparat (10, 14) wird gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 am Objektträger fixiert; c) anschließend wird der zu isolierende Teil (Dissektat) (22) des Präparats (10, 14) aus dem Präparat ausgeschnitten; d) schließlich wird das Dissektat (22) gemäß einem der Verfahren nach Anspruch 2 oder 4 vom Rest des Präparats (10, 14) getrennt.
Verfahren zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit folgenden Schritten: a) das Präparat (10, 14) wird gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 auf einem dielektrischen Objektträger (12) fixiert; b) anschließend wird der zu isolierende Teil (Dissektat) (22) des Präparats (10, 14) aus dem Präparat ausgeschnitten; c) schließlich wird das Dissektat (22) dadurch vom Rest des Präparats (10, 14) getrennt, dass der Rest des Präparats vom Objektträger (12) abgehoben wird.
Vorrichtung zum Fixieren einer Schicht biologischen Materials (Präparat) auf einem Objektträger (12) mit: a) einem dielektrischen Objektträger (12) zur Aufnahme des Präparats (10, 14); b) Mitteln zum Anlegen eines elektrischen Felds (18) ausreichender Stärke zwischen der vom Präparat (10, 14) abgewandten Seite des Objektträgers (12) und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats; und mit c) einer ersten Elektrode (20) zum Entfernen der auf der dem Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14) sich sammelnden Ladungsträger.
Vorrichtung zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit: a) einem dielektrischen Objektträger (12) zur Aufnahme des Präparats (10, 14); b) Mitteln zum Anlegen eines elektrischen Felds (18) ausreichender Stärke zwischen der vom Präparat (10, 14) abgewandten Seite des Objektträgers (12) und der vom Objektträger abgewandten Seite des Präparats; c) einer ersten Elektrode (20) zum Entfernen der auf der dem Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14) sich sammelnden Ladungsträger; d) Mitteln zum Ausschneiden des zu isolierenden Teils (Dissektat) (22) des Präparats (10, 14) aus dem Präparat; e) Mitteln zum Heranführen einer zweiten Elektrode (24) an das Dissektat (22) von der vom Objektträger (12) abgewandten Seite des Präparats (10, 14); und mit f) Mitteln zum Umkehren der Richtung des elektrischen Feldes (18) derart, dass das Dissektat (22) von der zweiten Elektrode (24) angezogen wird.
Vorrichtung zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit: a) einem Greifer (28), der an den zu isolierenden Teil (22) der Schicht biologischen Materials herangeführt werden kann; b) wobei der Greifer (28) derart ausgebildet ist, dass er einen durchgängigen Hohlkanal (34) mit einer präparatseitigen Öffnung (32) hat, die kleiner ist als der zu isolierende Teil (22) des Präparats; c) Mitteln zum Fixieren des zu isolierenden Teils (22) durch eine Druckdifferenz vor der präparatseitigen Öffnung (32) des Greifers (28); d) Mittel zum Ausschneiden des zu isolierenden Teils (22) aus der Schicht (10) biologischen Materials, wodurch ein Dissektat gebildet werden kann; und mit e) Mittel zum Entfernen des Greifers (28) vom Rest der Schicht (10) biologischen Materials.
Vorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Greifer (28) eine Mehrzahl von präparatseitigen Öffnungen (32) aufweist, die kleiner sind als zu isolierende Teile (22) des Präparats (10, 14) und das Fixieren von einer entsprechenden Mehrzahl von Dissektaten (22) vor den jeweiligen präparatseitigen Öffnungen (32) ermöglichen.
Vorrichtung nach Anspruch 12, gekennzeichnet durch Mittel zum Transportieren des Dissektats (22) mit Hilfe des Greifers (28) an einen Zielort (36); und mit Mittel zum Verändern der Druckdifferenz vor der präparatseitigen Öffnung (32) des Greifers (28).
Vorrichtung nach Anspruch 12, gekennzeichnet durch eine Zwischenschicht (38) zwischen dem Greifer (28) und dem Präparat (10, 14), wobei die Zwischenschicht (38) eine Mehrzahl von Öffnungen (40) aufweist.
Vorrichtung zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit: a) einer Vorrichtung nach Anspruch 10 zum Fixieren des Präparats (10, 14) auf einem dielektrischen Objektträger (12); b) Mitteln zum Ausschneiden des zu isolierenden Teils (Dissektat) (22) des Präparats (10, 14) aus dem Präparat; und mit c) einer Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12 zum Trennen des Dissektats (22) vom Rest des Präparats (10, 14).
Vorrichtung zum Isolieren eines Teils einer Schicht biologischen Materials (Präparat) mit: a) einer Vorrichtung nach Anspruch 10 zum Fixieren des Präparats (10, 14) auf einem dielektrischen Objektträger (12); b) Mitteln zum Ausschneiden des zu isolierenden Teils (Dissektat) (22) des Präparats (10, 14) aus dem Präparat; und mit c) Mitteln zum Trennen des Dissektats (22) vom Rest des Präparats (10, 14) dadurch, dass die Mittel den Rest des Präparats vom Objektträger (12) abheben können.