DE10254564A1

DE10254564A1 - Hybridisierungskammer

Info

Publication number: DE10254564A1
Application number: DE10254564A
Authority: DE
Inventors: Ralph Mueller; Torsten Gerboth
Original assignee: Axaron Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2002-06-14
Filing date: 2002-11-21
Publication date: 2003-12-24

Abstract

Die Hybridisierungskammer hat einen Boden (10) mit einer Aussparung (14) zur Aufnahme eines Microarrays (16). Ferner einen Deckel (12), der auf den Boden (10) auslegbar ist, wodurch ein hermetisch abgeschlossener Raum für das Microarray gebildet wird. Am Deckel (12) ist eine Deckfläche (18) ausgebildet, die einen Abstand von etwa 20 mum vom Microarray hat und parallel zu diesem verläuft. Dadurch wird eine Probenlösung (38) durch Kapillarkräfte in den Raum zwischen Microarray und Deckfläche gezogen und verteilt sich gleichmäßig, ohne dass es irgendwelcher Pumpen bedarf. Die Hybridisierungskammer ermöglicht es, todvolumenfrei mit geringsten Probenmengen zu arbeiten.

Description

In zunehmendem Maße werden Biochips für Analysen im Bereich der Medizin, Genomforschung oder Lebensmittelanalytik eingesetzt. Die Biochips bestehen in der Regel aus einem Objektträger, auf dem in getrennten Spots unterschiedliche Arten von DNA- oder RNA-Oligonukleotiden, Peptiden, Proteinen, Enzymen, etc. immobilisiert sind. Die Spots sind in Form eines Rasters oder Arrays angeordnet, weshalb die Biochips allgemein auch als Microarrays bezeichnet werden. Mit Hilfe dieser Biochips werden beispielsweise Hybridisierungsassays, z. B. Transkriptionsanalysen, durchgeführt, in der Regel mit Hilfe geeignet markierter, etwa fluoreszenzmarkierter Proben. Microarrays sind allgemein für das Studium von Affinitätsreaktionen geeignet.
Um eine Hybridisierungsreaktion mit geringen Volumina an Probenlösung durchführen zu können, wird gelegentlich ein Tropfen Probenlösung auf ein Microarray pipettiert und anschließend ein Deckglas aufgelegt. Das Deckglas verteilt die Probenlösung. Außerdem verteilt sich die Probenlösung aufgrund von Kapillarkräften gut unter dem Deckglas, das, ebenfalls aufgrund der Kapillarkräfte, stark am Microarray haftet, wodurch sich wiederum die Probenlösung gut unter dem Deckglas verteilt. Beim Aufbringen des Deckglases kann es leicht zum Einschluss von Luftblasen kommen, gerade bei niedriger Feuchtigkeit der umgebenden Atmosphäre, und insbesondere wenn sich weder Deckglas noch Microarray vollständig benetzen lassen. Ferner ist dieser in der Regel manuell durchgeführte Schritt wenig reproduzierbar.
Das Microarray mit Probenlösung und aufgebrachtem Deckglas wird anschließend in eine Hybridisierungskammer gelegt. Eine solche Kammer besteht aus einem Boden und einem Deckel. Die beiden Teile werden durch einen O-Ring gegeneinander abgedichtet. Boden, O-Ring und Deckel bilden die Wände eines hermetisch geschlossenen Raums, der das Microarray aufnimmt. Das Wort "Hybridisierungskammer" bezeichnet üblicherweise sowohl das System, bestehend aus Deckel und Boden, als auch den hermetisch geschlossenen Raum.
Hybridisierungskammern sind unter anderem bekannt aus der US 6,238,910 B1. Bei dem dort beschriebenen System wird die Hybridisierungskammer dadurch gebildet, dass ein in den Deckel eingelassener O-Ring auf das Microarray drückt, das im Boden aufgenommen ist. Eine ähnlich ausgebildete Hybridisierungskammer findet sich in der US 2002/0001839 A1. Dort drückt ein vorspringender Rand des Deckels auf das Microarray und bildet dadurch die Hybridisierungskammer zwischen Microarray und Deckel aus. In der US 2002/0048754 A1 wird zusätzlich aus dem Microarray durch Auflegen eines Gitters ein Mikrotiter-Array. In verschiedenen Schriften, z. B. in der US 6,238,910 B1 oder der WO 01/32934 A2, wird ferner beschrieben, wie eine Hybridisierungskammer in ein System mit automatischer Zufuhr der benötigten Probenflüssigkeiten (Fluidik) integriert ist.
Die bekannten Hybridisierungskammern sind in der Regel als Durchflusskammern ausgebildet, in der auch verschiedene Spülschritte durchgeführt werden können. In eine solche Hybridisierungskammer wird ein Microarray ohne aufgelegtes Deckglas gelegt. Die zu untersuchende Probenlösung wird anschließend in die Hybridisierungskammer gepumpt. Dadurch wird ein relativ großes Volumen der für die Hybridisierung verwendeten Flüssigkeit (Hybridisierungsvolumen) benötigt. Dieses liegt in der Regel im Bereich von 200 µl und mehr, da es noch in den Schläuchen und Pumpen erhebliche Todvolumina gibt. Eine Probe muss für ein solches System daher häufig verdünnt werden. Dies führt erfahrungsgemäß jedoch zu verringerten Signalstärken und damit einer verminderten Empfindlichkeit.
Von dem Unternehmen Corning wird eine Hybridisierungskammer angeboten, in die die oben genannte Anordnung aus einem Microarray mit einer Probenlösung, die durch ein aufgelegtes Deckgläschen verteilt wird, eingesetzt werden kann. Dieses System weist einen Boden und einen Deckel auf. Im Boden ist eine Aufnahme für das Microarray vorgesehen. Weiterhin enthält der Boden einen großen O-Ring, der das gesamte Microarray umgibt. Der unstrukturierte, ebene Deckel wird auf den Dichtungsring aufgesetzt. Dadurch bildet sich zwischen Boden, Dichtungsring und Deckel eine luftdicht abgeschlossene Hybridisierungskammer aus, in der sich das Microarray befindet.
Eine solche Hybridisierungskammer mit Microarray, Probenlösung und Deckglas wird zur optimalen Durchführung der Hybridisierung in ein Tauchbad gelegt, in dem sie beispielsweise für zwölf Stunden bei 50°C temperiert wird. Anschließend wird das System aus dem Tauchbad entnommen. Deckel und Boden werden getrennt, das Microarray wird entnommen. Das Deckglas wird vorsichtig entfernt. Eine mechanische Beschädigung der Spots und ein Eintrocknen des Microarrays müssen dabei vermieden werden. Daraufhin wird das Microarray in einem Puffer-Bad gewaschen, um überschüssige bzw. ungebundene markierte Moleküle zu entfernen. Es folgt die Trocknung. Anschließend wird die Hybridisierungsreaktion mit Hilfe einer in der Regel optischen Analyseeinrichtung ausgewertet.
Die verschiedenen angesprochenen Schwierigkeiten bei der Durchführung von Hybridisierungsassays verschlechtern die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und lassen eine Automatisierung wünschenswert erscheinen.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Möglichkeiten der Automatisierung und Reproduzierbarkeit von Hybridisierungsanalysen zu verbessern.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.
Erfindungsgemäß wird eine Hybridisierungskammer bzw. eine Anordnung zur Analyse eines Probenmediums mit Hilfe eines Probenträgers, z. B. eines Microarrays, angegeben. Das Probenmedium wird i. d. R. eine Lösung sein.
Die Hybridisierungskammer hat einen Boden, in den das Microarray gelegt wird. Ferner hat sie einen Deckel, der auf den Boden auflegbar ist, wodurch ein abgeschlossener Raum gebildet wird, in dem das Microarray gegen Einflüsse von der umgebenden Atmosphäre geschützt ist. Der Deckel weist eine Deckfläche auf. Die Deckfläche ist derart am Deckel ausgebildet (einstückig oder montiert), dass sie in einem vorgegebenen Abstand über dem Microarray und im Wesentlichen parallel zu diesem angeordnet ist, wobei der Abstand zwischen Microarray und Deckfläche derart gewählt ist, dass das Probenmedium durch Kapillarkräfte in den Raum zwischen Microarray und Deckfläche gezogen werden kann.
Es wird somit eine Hybridisierungskammer für Microarrays geschaffen, bei der das Volumen der für die Hybridisierung verwendeten Flüssigkeit (Hybridisierungsvolumen) zwischen der Oberfläche des Microarrays und einer dicht über dem Microarray angeordneten Deckfläche der Hybridisierungskammer definiert ist.
Wird das Probenmedium beispielsweise durch eine Öffnung in der Deckfläche auf das Microarray pipettiert, manuell oder automatisch, so verteilt sich das Probenmedium aufgrund von Kapillarkräften, die zwischen Microarray und Deckfläche wirken, luftblasenfrei und gleichmäßig über das Microarray. Das Probenmedium breitet sich in dem Raum zwischen Microarray und Deckfläche, also über das Hybridisierungsvolumen aus. Es entsteht auf diese Weise ein gleichmäßiger, dünner Film. Das Fließen des Probenmediums ist aufgrund des vorgegebenen Abstands zwischen Microarray und Deckfläche hoch reproduzierbar. Es bedarf keiner Pumpen um die Verteilung des Probenmediums über das Microarray zu bewirken.
Der Abstand zwischen Microarray und Deckfläche bestimmt das Probenvolumen mit. Dieser Abstand kann durch geeignete Maßnahmen sehr klein gewählt werden, wodurch auch das Probenvolumen sehr klein ist. Für wässrige Probenlösung mit einer relativ geringen Viskosität und einer mäßigen Benetzbarkeit der in der Regel aus Glas bestehenden Oberfläche des Microarrays ist ein Abstand von etwa 20 µm geeignet. Es bedecken dann weniger als 50 µl einen ganzen Microarray mit einer Fläche von typischerweise 10 cm².
Wird die Deckfläche gleich groß oder größer als das Microarray gewählt, so ist es möglich, dass sich das Probenmedium über das gesamte Microarray verteilt. Es kann dann das gesamte Microarray bis zum Rand für Hybridisierungsanalysen genutzt werden.
Wird die Deckfläche kleiner als das Microarray gewählt, so bestimmt die Größe der Deckfläche die Größe derjenigen Fläche des Microarrays, die durch das Probenmedium benetzt wird, auf der es somit zu Hybridisierung kommen kann. Der Hybridisierungsbereich bleibt auf die Größe der Deckfläche beschränkt. Letzteres ergibt sich dadurch, dass die Probenflüssigkeit sich bis an den Rand desjenigen Volumens ausbreitet, in dem Deckfläche und Microarray eng beabstandet sind. An diesem Rand bildet sich ein kapillarer Krümmungsdruck aus, der das weitere Ausbreiteten der Probenflüssigkeit verhindert. Ein mögliches Fließen der Probeflüssigkeit über das Microarray hinaus wird verhindert.
Die Größe des benötigten Probenvolumens bzw. des Hybridisierungsvolumens wird damit nicht durch irgendwelche Dichtungen oder Gefäßwände bestimmt, die auf das Microarray drücken, sondern entweder dadurch, dass das pipettierte Probenvolumen so klein ist, dass das Microarray nur teilweise bedeckt wird, oder aber durch die Größe des Microarrays bzw. der Deckfläche. Eine Dichtung wird lediglich dazu verwendet, die Hybridisierungskammer als Ganzes abzudichten. Üblicherweise wird eine Dichtung in den Boden eingelegt. Die Dichtung umgibt dabei die Fläche, die zur Aufnahme des Microarrays vorgesehen ist, in einem gewissen Abstand. Der Deckel drückt im zusammengebauten Zustand der Hybridisierungskammer gegen die in den Boden eingelassene Dichtung.
Eine Möglichkeit, den Abstand zwischen Deckfläche und Microarray genau einzustellen, wird dadurch erreicht, dass in die Deckfläche erhöhte Abstandshalter (Spacer) integriert werden. Es bietet sich eine Höhe der Abstandshalter von beispielsweise 20 µm an. Üblicherweise werden die Abstandshalter derart in der Deckfläche angeordnet, dass sie auf die typischerweise vier Ecken des Microarrays drücken. Dadurch bleibt der größte Teil der Fläche des Microarrays frei für Hybridisierungsanalysen. Eine einfache Form, derartige Abstandshalter auszubilden, besteht darin, auf der Deckfläche einen dünnen Film zu befestigen.
Eine weitere Möglichkeit, den Abstand zwischen Deckfläche und Microarray einzustellen, kann dadurch erreicht werden, dass der Abstand zwischen Deckel und Boden durch Justierschrauben eingestellt wird. Ferner dadurch, dass geeignete Abstandshalter in den Boden oder Deckel integriert werden, die direkt zwischen Deckel und Boden wirken und nicht auf das Microarray. Dabei können verschiedene Deckel derart vorgeformt werden, dass sie auf bestimmte Abstände von z. B. 20, 30 oder 40 µm eingestellt sind.
Noch eine weitere Möglichkeit, den Abstand zwischen Deckfläche und Microarray genau einzustellen, kann dadurch erreicht werden, dass in den Deckel in einem Bereich außerhalb der Deckfläche von außen Senkbohrungen eingebracht werden, in der Regel vier Stück in den Ecken eines Rechtecks, das größer ist als das Microarray. Die Senkbohrungen werden so ausgebildet, dass sie nur eine dünne Schicht des Deckels angrenzend an die Hybridisierungskammer belassen. Zusätzlich wird in die Senkbohrungen ein Gewinde geschnitten. Es kann dann eine Schraube, z. B. eine Madenschraube, in jede Senkbohrung eingeführt werden, und zwar derart, dass sie auf die dünne verbliebene Schicht drückt und diese elastisch verformt. Von der Hybridisierungskammer aus betrachtet, weist der Deckel dann eine konvexe Verformung auf. Diese kann auf geeignete Widerlager im Boden der Hybridisierungskammer einwirken, wodurch der gewünschte Abstand zwischen Deckfläche und Microarray eingestellt werden kann.
Der Deckel ist vorteilhafterweise ein Kunststoffblock oder Spritzgussteil aus Kunststoff, das durch Fräsen nachbearbeitet wurde. Wichtig ist, dass der Deckel hinreichend steif ist, damit er sich über die Länge des Microarrays möglichst nicht verformt. Dazu hat der Deckel typischerweise eine Dicke von mindestens 10 mm, i. d. R. 12 mm, bei einer durch die Form von Microarrays, die regelmäßig auf Objektträger ausgebildet werden, vorgegebenen Länge von etwa 10 cm.
Als Material für den Deckel sind viele Möglichkeiten denkbar, etwa verschiedene Kunststoffe, wie PMMA, Silikon, Teflon, oder Glas, usw. Möglich sind auch Teflonarten, Polysulphone oder PEEK (Polyetheretherketon). Besonders geeignet ist jedoch Polycarbonat (PC). Polycarbonate sind lineare Polykondensate und zeigen daher thermoplastisches Verhalten. Gegenüber anderen Thermoplasten besitzen Polycarbonate gute mechanische und thermische Eigenschaften. Dadurch eignet sich Polycarbonat gut sowohl für eine klassische maschinelle Bearbeitung als auch für das Spritzgussverfahren. Die Dauergebrauchstemperatur für PC beträgt 130°C. Ferner lagert Polycarbonat Farbstoffe nicht ein, im Gegensatz zu anderen Kunststoffen, die hydrophobe und hydrophile Farbstoffe einlagern. Polycarbonat ist mechanisch stabil, chemisch im Wesentlichen inert, kann gereinigt werden, nimmt kein Wasser auf und quillt nicht.
Ferner ist Polycarbonat transparent. Damit ist die Benetzung des Microarrays während des Aufbringens einer Probe mit dem bloßen Auge beobachtbar. Die Hybridisierung kann optisch online detektiert werden, durch den Deckel hindurch.
Werden Deckel und Boden aus kostengünstigem Kunststoff gefertigt, so kann die Hybridisierungskammer auch als Verbrauchsartikel verwendet werden. In einem solchen Fall kann die Hybridisierungskammer auch als Verpackung für zu transportierende Microarrays dienen. Die Verpackung bzw. Hybridisierungskammer kann nach dem Transport sofort für einen durchzuführenden Assay eingesetzt werden, ohne dass das Microarray aus seiner Verpackung genommen werden muss. Dies vermindert die Gefahr von Verunreinigungen.
Der Deckel weist im Bereich über dem Microarray eine Einlassöffnung auf, durch die das Probenmedium auf das Microarray pipettiert werden kann. Diese Einlassöffnung kann mittig über dem Microarray oder am Rand des Microarrays angeordnet sein. Die Einlassöffnung ist durch ein Septum verschlossen, z. B. durch ein Taschenseptum. Ein Septum ist eine elastische Lippe. Durch die Lippe kann eine Kapillare zum Pipettieren des Probenmediums geschoben werden. Wird die Kapillare zurückgezogen, verschließt sich die elastische Lippe wieder luftdicht.
Mit einem solchen System kann komplett Todvolumen-frei gearbeitet werden. Dazu wird eine Kapillare im so genannten "humming bird"-Betrieb verwendet ("humming bird" = Kolibri), d. h. die Kapillare wird von oben an ein flüssiges Probenmedium herangeführt. Ein Teil der Probe wird in die Kapillare gesaugt. Anschließend wird die Kapillare durch das Septum durchgeführt. Das in die Kapillare eingesaugte Probenvolumen kann dann auf das Microarray pipettiert werden, ohne dass nennenswerte Rückstände in der Kapillare verbleiben. Anschließend wird die Kapillare wieder durch das Septum entfernt. Das auf das Microarray pipettierte Probenvolumen verteilt sich aufgrund der Kapillarkräfte über den Microarray. Das System ist damit in der Lage, sehr sparsam zu arbeiten und praktisch nichts von einer Probe zu verlieren. Die Probe wird optimal genutzt.
Der Deckel kann einen individuellen, vorzugsweise maschinenlesbaren Code aufweisen. Dies ermöglicht es, die Qualität der mit Hilfe des jeweiligen Deckels erzielten Analysenergebnisse regelmäßig zu überprüfen. Ist erkennbar, dass ein bestimmter Deckel wiederholt schlechte Ergebnisse liefert, so kann dieser Deckel von der weiteren Verwendung ausgeschlossen werden. Ein solcher Code kann z. B. in Form eines Barcodes auf den Deckel aufgebracht sein.
Ebenso ist es denkbar einen so genannten elektronischen Telefonkarten-Chip (Smart card) in den Deckel zu integrieren. Dieser Chip kann Informationen über Eigenschaften des Deckels enthalten, etwa über die Größe und/oder Lage der Hybridisierungsfläche oder den Abstand zwischen Deckfläche und Microarray.
Auch kann eine solcher Chip als Schutz gegen das Nachahmen von Deckeln eingesetzt werden. Dazu wird ein Identifikationsalgorithmus für den Deckel zum Teil im Chip und zum Teil extern, in einem Rechner gespeichert.
Die Hybridisierungskammer wird typischerweise in einen Aufnahmerahmen geschoben, in dem Deckel und Boden im Klemmsitz aneinander gedrückt werden. Dieser Aufnahme Rahmen ist vorzugsweise heiz- und kühlbar. Die Temperierung der Hybridisierungskammer kann durch geeignete Heiz- oder Kühlelemente, z. B. einen Thermostaten bzw. ein Peltier- Element, erfolgen, die auch direkt in den Boden integriert werden können. Es ist auch möglich, die Hybridisierungskammer in eine geeignete Aufnahme zu setzen, die ihrerseits kompatibel ist mit kommerziell erhältlichen PCR-Maschinen (PCR = polymerase chain reaction). Letztere können dann zur Temperierung der Hybridisierungskammer genutzt werden. Es ist auch möglich, die Hybridisierungskammer Temperaturzyklen zu unterwerfen bzw. in ihr eine PCR ablaufen zu lassen.
Weiterhin kann die Hybridisierungskammer in ein System integriert werden, das zur automatischen Befüllung der Kammer ausgelegt ist. Ein solches System kann auch zum automatischen Durchführen von Wasch-, Spül- und Trocknungsschritten ausgelegt sein. Ein solches System kann einen xyz-Roboter zum automatischen Aufnehmen von Probenmedium und Abgabe des Probenmediums auf das Microarray nach Durchstehen des Septums aufweisen.
Möglich ist es auch, die Hybridisierungskammer in ein System zu integrieren, bei dem zunächst die Microarrays - bei abgenommenem Deckel - Spot für Spot aufgebaut werden. Anschließend wird der Deckel aufgesetzt und das soeben erzeugte Microarray wird für eine Hybridisierungsanalysen verwendet.
Denkbar ist auch die Integration von Rühr- oder Agitationsmitteln, etwa eine Ultraschallquelle in Deckel, Deckfläche oder Boden. Ferner können Druckwellen in die Kammer geleitet werden. Schließlich ist es auch möglich, durch mechanischen Druck auf den Deckel das Probenmedium auf dem Microarray zu bewegen.
Die erfindungsgemäße Anordnung kann auch zur parallelen Verarbeitung mehrerer Microarrays eine Mehrzahl von Hybridisierungskammern aufweisen. Oder es kann eine große Hybridisierungskammer mit einem entsprechend großen Boden mit mehreren Aussparungen zur Aufnahme einer Mehrzahl von Microarrays unter einem entsprechend großen Deckel aufweisen. Dies bietet sich insbesondere in Kombination mit der Handhabung durch einen Roboter an.
Das durch die erfindungsgemäße Anordnung erreichte Aufbringen eines dünnen Films eines Probenmediums auf einen Probenträger, z. B. ein Microarray, kann allgemein als Verfahren beschrieben werden. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst über dem Probenträger und im Wesentlichen parallel zu diesem in einem vorgegebenen Abstand eine Deckfläche positioniert, wodurch sich ein Spalt zwischen Probenträger und Deckfläche bildet. Der Abstand zwischen Microarray und Deckfläche wird derart gewählt, dass das Probenmedium durch Kapillarkräfte in den Raum zwischen Microarray und Deckfläche gezogen werden kann. Daraufhin wird das Probenmedium an einem Ort aufgebracht, an dem der zwischen Probeträger und Deckfläche gebildete Spalt offen liegt, etwa am unteren Ende einer Einlassöffnung in der Deckfläche auf dem Probenträger. Das Probenmedium wird dann durch Kapillarkräfte in den Raum zwischen Microarray und Deckfläche gezogen und breitet sich in Form eines dünnen Films auf dem Probenträger aus.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche Elemente. Im Einzelnen zeigt:
Fig. 1 eine Schnittansicht der Hybridisierungskammer; und
Fig. 2 drei Ansichten des Deckels.
Fig. 1 zeigt die Hybridisierungskammer. Sie besteht aus einem Boden 10 und einem Deckel 12. Fig. 2 zeigt drei Ansichten des Deckels 12.
Der Boden 10 weist eine Aussparung 14 auf, in die ein Microarray 16 eingelegt ist. Die Aussparung 14 ist flacher als die Höhe des Microarrays 16. Ferner weist der Boden 10 eine ringförmige Nut 20 zur Aufnahme eines O-Rings 22 auf. Der O-Ring 22 dichtet den Raum um das Microarray 16 ab, wenn der Boden 10 und der Deckel 12 aufeinander gepresst werden.
Der zum Abdichten benötigte Anpressdruck zwischen Boden 10 und Deckel 12 wird dadurch erreicht, dass die aus Deckel 10 und Boden 12 zusammengesetzte Hybridisierungskammer in einen Aufnahmerahmen (nicht gezeigt) eingeschoben wird. Der Aufnahmerahmen ist derart gestaltet, dass die Hybridisierungskammer im Klemmsitz in ihm gehalten wird. Dabei übt der Aufnahmerahmen Kräfte auf den Deckel und den Boden der Hybridisierungskammer derart aus, dass diese aufeinander gepresst werden. Der O-Ring im Boden der Hybridisierungskammer bewirkt die dazu nötige elastische Rückstellkraft.
Der Deckel 12 wird durch spanabhebende Bearbeitung aus Polycarbonat-Vollmaterial geformt. Er weist gegenüber dem Microarray 16 eine erhöhte Deckfläche 18 auf. Die Deckfläche 18 hat die Funktion eines Deckglases und verkleinert den Abstand zwischen Deckel 12 und Microarray 16 auf ca. 20 µm. Zur gegenseitigen Lagefixierung von Boden 10 und Deckel 12 bzw. Microarray 16 und Deckfläche 18 weist der Boden 10 mindestens zwei hochstehende Passer 24 auf, die in korrespondierende Aussparungen 26 im Deckel 12 eingreifen.
Die genaue Justierung des Abstands zwischen Microarray 16 und Deckfläche 18 wird mit Hilfe der in den Deckel 12 eingefrästen Senkbohrungen 28 gewährleistet. Die Senkbohrungen 28 enden in Vorsprüngen 30, die in der dem Microarray 16 zugewandten Fläche des Deckels 12 ausgebildet sind. Es sind vier Vorsprünge 30 in den Ecken eines Rechtecks, das größer ist als das Microarray 16, im Deckel 12 ausgebildet. Die Senkbohrungen 28 sind so ausgebildet, dass sie nur eine dünne Schicht 32 des Deckels 12 angrenzend an die Hybridisierungskammer belassen. Zusätzlich ist in die Senkbohrungen 28 ein Gewinde geschnitten. In jede Senkbohrung 28 ist eine Madenschraube 34eingeführt, und zwar derart, dass sie auf die dünne verbliebene Schicht 32 drückt und diese elastisch verformt. Von der Hybridisierungskammer aus betrachtet, weist der Deckel 12 eine konvexe Verformung auf. Mit Hilfe dieser konvexen Verformung wird der gewünschte Abstand von ca. 20 µm zwischen Deckfläche 18 und Microarray 16 eingestellt, indem die Madenschrauben 34 in ihrer Position geändert werden.
Zum Einfüllen der Probenlösung weist der Deckel 12 eine über dem Microarray 16 angeordnete Ausfräsung 36 auf, die in Richtung auf das Microarray 16 hin trichterförmig zuläuft. Die Ausfräsung 36 dient als Einlassöffnung für eine Kapillare, die die Probenlösung 38 enthält.
Um Verlust durch Verdampfung der Probenlösung 38 zu vermeiden, ist in die Einlassöffnung 36 ein austauschbares Septum 40 eingelassen, dass durch zwei im Wesentlichen zylinderisch ausgestaltete Kunststoffteile 42, 44 in seiner Lage fixiert wird. Die beiden zylindrischen Kunststoffteile 42, 44 sind in die Einlassöffnung 36 geschraubt.
Sticht man zum Aufbringen der Probenlösung 38 auf das Microarray 16 mit einer Kapillare oder Pipette durch das Septum 40, so werden die Gummi-Lippen des Septums 40 auseinander gedrückt. Beim Herausziehen der Kapillare oder Pipette verschließen sich die Lippen wieder.
Typischerweise wird zum Aufbringen der Probenlösung 38 eine Kapillare mit einem Durchmesser von z. B. 1/16 Zoll verwendet. Mit der Kapillare wird das Septum 40 durchstochen bis die Kapillare das Microarray 16 berührt oder nur noch einen kleinen Abstand zum Microarray 16 hat. Anschließend wird die Probenlösung 38 durch einen leichten Überdruck aus der Kapillare heraus in die Öffnung 50 oder auf das Microarray 16 gefördert. Danach wird die Kapillare durch das Septum 40 zurück entfernt. Das Septum 40 schließt sich aufgrund seiner elastischen Rückstellkräfte erneut hermetisch.
Die Probenlösung 38 steht dann zunächst in Form eines Tropfens auf dem Microarray 16. Der Probentransport in den Reaktionsraum zwischen Microarray 16 und Deckfläche 18 erfolgt weiter über Kapillarkräfte. Sind die Oberflächen des Microarrays 16 und der Deckfläche 18 z. B. mit Wasserdampf benetzt, breitet sich die Probenflüssigkeit schnell im dünnen Kapillarspalt zwischen Microarray 16 und Deckfläche 18 aus.
Durch die trichterförmige Ausbildung der Einlassöffnung 36 weitet sich ihr Durchmesser sehr schnell mit steigendem Abstand vom Microarray 16. Dadurch kommt es nach oben hin rasch zu großen Abständen zwischen der Kapillare und den Wänden der Einlassöffnung 36. Dies verhindert, dass die Probenlösung 38 auf Grund von Kapillarkräften in den Bereich zwischen Kapillare und Wand der Einlassöffnung 36 im Deckel 12 gesogen wird. Dadurch wird Probenverlust verhindert.
Hat sich die Probenlösung 38 gleichmäßig über das Microarray 16 verteilt, so wird die Hybridisierungskammer zusammen mit dem Aufnahmerahmen temperiert. Typischerweise geschieht dies für 12 Stunden bei 40-60°C, um eine optimale Hybridisierung zu ermöglichen. Vorzugsweise wird zur Temperierung der Hybridisierungskammer ein Wasserbad verwendet.
Bei diesen Temperaturen kann die Probenlösung 38 an den offenen Enden des Hybridisierungsvolumens zwischen Microarray 16 und Deckfläche 18 verdunsten. Um dies zu verhindern ist im Boden 10 ein Reservoir 46 vorgesehen, in das Wasser eingefüllt wird. Das dort eingefüllte Wasser schafft eine gesättigte Wasserdampf-Atmosphäre im abgeschlossenen Raum der Hybridisierungskammer und verhindert somit eine Verdunstung der Probenlösung 38. Eine Vergrößerung des Reservoirs 46 kann dadurch erreicht werden, dass Kanäle unterhalb des Microarrays 16 ausgebildet werden, die eine größere Menge an Wasser aufnehmen können.
Nachdem die Hybridisierung möglichst vollständig abgelaufen ist, ist es für eine Reihe von Hybridisierungsassays nötig, die Probenlösung 38 vom Microarray 16 durch Spülen zu entfernen.
Dazu weist der Deckel 12 verschließbare Durchgangsbohrungen 48 vorzugsweise zum Absaugen auf, durch die Flüssigkeiten für Spülvorgänge oder Stickstoff zum Trocknen in die Hybridisierungskammer geführt werden können. Wird die vollständig zusammengesetzte Hybridisierungskammer in den Aufnahmerahmen eingesetzt, so befinden sich im System der Flüssigkeits- und Gaszuführung passende Anschlüsse unmittelbar über den Öffnungen der Durchgangsbohrungen 48, so dass die Flüssigkeiten bzw. Gase unmittelbar in die Durchgangsbohrungen 48 gelangen können.
Generell braucht das Microarray 16 nicht aus der Hybridisierungskammer entnommen zu werden, um das Spülen und Trocknen durchzuführen. Es wird nach der Hybridisierung die Hybridisierungskammer mit dem darin befindlichen Microarray 16 aus dem Wasserbad entnommen. Die Einlassöffnung 36 und/oder die Durchgangsbohrungen 48 werden geöffnet.
Zum Spülen wird in der Regel eine Waschlösung, Wasser oder Puffer verwendet. Diese können durch die Einlassöffnung 36 und/oder die Durchgangsbohrungen 48 in die Kammer gelangen und durch die Kammer gepumpt oder gezogen werden. Vorzugsweise wird die Waschlösung mit Hilfe einer Spritze durch die Einlassöffnung 36 in die Kammer injiziert.
Zum Durchführen der Wasch- oder Spülschritte kann gegebenenfalls der Abstand zwischen Microarray und Deckfläche kurzfristig vergrößert werden. Zum Trocknen wird Stickstoff oder trockene Pressluft mit etwa 5 bar für wenige Sekunden durch die Hybridisierungskammer gepresst, was alle Feuchtigkeit entfernt. Außer mit Pressluft kann auch mit einem Vakuum gearbeitet werden. Denkbar ist auch, dass Pressluft durch das Septum 40 in die Kammer gepresst wird, die durch die Durchgangsbohrungen 48 wieder entweicht.
Nach dem der Hybridisierungsassay vollständig abgeschlossen ist, wird das Microarray 16 ausgewertet. Dazu wird es aus der Hybridisierungskammer entnommen und in einen Biochip-Reader gelegt.
Das Microarray 16 wird i. d. R. nur einmal verwendet. Deckel 12 und Septum 40 hingegen werden gespült und erneut verwendet. Bezugszeichen 10 Boden
12 Deckel
14 Aussparung zur Aufnahme des Microarrays 16
16 Microarray, Probenträger
18 Deckfläche
20 ringförmige Nut zur Aufnahme des O-Rings 22
22 O-Ring
24 hochstehender Passer
26 mit dem hochstehenden Passer 24 korrespondierende Aussparungen
28 Senkbohrungen
30 Vorsprünge
32 dünne Schicht
34 Madenschraube
36 Einlassöffnung
38 Probenlösung, Probenmedium
40 Septum
42 erstes Kunststoffteil zur Lagefixierung des Septums 40
44 zweites Kunststoffteil zur Lagefixierung des Septums 40
46 Lösungsmittel-Reservoir
48 Durchgangsbohrungen für die Versorgung der Hybridisierungskammer mit Medien
50 Öffnung des Einlasses 36

Claims

1. Anordnung zur Analyse eines Probenmediums (38) mit Hilfe eines Probenträgers (16)

a) mit einem Boden (10), der den Probenträger (16) aufnehmen kann;

b) mit einem Deckel (12), der auf den Boden (10) auflegbar ist, wodurch ein abgeschlossener Raum gebildet wird, in dem sich der Probenträger (16) befinden kann;

dadurch gekennzeichnet,

a) dass der Deckel (12) eine Deckfläche (18) aufweist;

b) dass die Deckfläche (18) derart am Deckel (12) ausgebildet ist, dass sie in einem vorgegebenen Abstand über dem Probenträger (16) und im Wesentlichen parallel zu diesem angeordnet ist,

c) wobei der Abstand zwischen Probenträger (16) und Deckfläche (18) derart gewählt ist, dass das Probenmedium (38) durch Kapillarkräfte in den Raum zwischen Probenträger und Deckfläche gezogen werden kann.

2. Anordnung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet,
dass im Deckel (12) Senkbohrungen (28) ausgebildet sind; und
dass die Senkbohrungen (28) so ausgebildet sind, dass sie eine dünne Schicht (32) des Deckels (12) in Richtung des Probenträgers (16) belassen.

3. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel (12) ein Verhältnis von seiner Dicke zu seiner Länge von mindestens eins zu zehn hat.

4. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel (12) aus Polycarbonat ausgebildet ist.

5. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
dass der Deckel (12) im Bereich über dem Probenträger (16) eine Einlassöffnung (36) aufweist; und
dass die Einlassöffnung (36) durch ein Septum (40) verschlossen ist.

6. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel (12) durch einen individuellen Code gekennzeichnet ist.

7. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur Temperierung des Probenträgers (16).

8. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zum automatischen Handhaben des Probenmediums (38) sowie zum Durchführen von Waschschritten und/oder Spülschritten und/oder Trocknungsschritten.

9. Verfahren zum Aufbringen eines dünnen Films eines Probenmediums (38) auf einen Probenträger (16) mit folgenden Schritten:

a) über dem Probenträger (16) und im Wesentlichen parallel zu diesem wird in einem vorgegebenen Abstand eine Deckfläche (18) positioniert, wodurch sich ein Spalt zwischen Probenträger und Deckfläche bildet;

b) der Abstand zwischen Probenträger (16) und Deckfläche (18) wird derart gewählt, dass das Probenmedium (38) durch Kapillarkräfte in den Raum zwischen Probenträger und Deckfläche gezogen werden kann; und

c) das Probenmedium (38) wird an einem Ort aufgebracht, an dem der zwischen Probenträger (16) und Deckfläche (18) gebildete Spalt offen liegt, sodass das Probenmedium durch Kapillarkräfte in den Raum zwischen Probenträger und Deckfläche gezogen wird und sich in Form eines dünnen Films auf dem Probenträger ausbreitet.