DE102023002417B3

DE102023002417B3 - Verfahren zur Expansion von Zellen

Info

Publication number: DE102023002417B3
Application number: DE102023002417.1A
Authority: DE
Inventors: Hans Hoffmeister; Rainer Mausolf
Original assignee: ZELLWERK GmbH
Current assignee: ZELLWERK GmbH
Priority date: 2023-06-15
Filing date: 2023-06-15
Publication date: 2024-12-05
Anticipated expiration: 2043-06-16

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expansion von Zellen, insbesondere von nicht adhärent wachsenden Zellen, wie invarianten T- Lymphozyten oder nicht adhärent wachsende T- Lymphozyten und NK- Zellen aber auch weiteren Immunzellen z. B. tumorinfiltrierte NK-Zellen (TINK) und schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT) mit einem hohen Anteil an CD 8+ und CD 56+ Antikörper, auch mit einem geringen Anteil an CD3+ Antikörper in einem Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor, bei dem genügende Mengen an Zellen für eine therapeutische Behandlung mit Zellen zur Verfügung gestellt werden und die hohen Kosten, insbesondere durch den Einsatz von humanen Seren bei der Expansion vermieden werden, wobei in Perfusions-Plattenmäander- Bioreaktor mehrere übereinanderliegende, mit Gerinne 10, Überlaufen 14 und Überlaufstege 33 versehene Kultivierungsträger 7 angeordnet sind und wobei die Kultivierungsträger 7 zueinander um 180° verdreht angeordnet sind. Das Kulturmedium strömt im Perfusions- Plattenmäander über einen Luer-Lock- Verbinder 22 für die Zuführung Kulturmedium mäandrierend von oben nach unten und wird durch Luer- Lock- Verbinder 23 aus dem Perfusions- Plattenmäander-Bioreaktor abgeführt, wobei die Overlay- Medien über eine Zufuhrkavität 11 und über Zuführungen 12 über dem Kulturmedium in den Gerinnen 10 owerflow gegensinnig zur Strömung des Kulturmediums geführt wird. Zur Erfassung und Steuerung der Konzentration an Overlay- Medien im Kulturmedium werden diesem mit Fluoreszensmarker beschichtete Indikatorkügelchen zugesetzt, deren Fluoreszenshelligkeit sich mit der Änderung der Konzentration an Overlay- Medien ändert.

Description

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Expansion von Zellen, wie nicht adhärent wachsenden Zellen, nicht adhärent wachsende T- Lymphozyten oder NK- Zellen aber auch weiteren Immunzellen z. B. tumorinfiltrierte NK-Zellen (TINK) und schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT) mit hohen Anteilen an CD8+ und CD56+ Antikörper, aber auch mit einem geringen Anteil an CD3+ Antikörper, in einem Perfusion- Plattenmäander- Bioreaktor
T-Zellen, von denen bekannt ist, dass sie eine einzige invariante TCR haben, sind NKT-Zellen und MAIT-Zellen. Die wichtige Rolle, die NKT-Zellen beim Schutz eines Individuums vor Bakterien und Krebs spielen, sowie ihre Beteiligung an der Pathologie einer Autoimmunerkrankung wurde hauptsächlich durch eine Studie mit Mäusen bekannt gemacht. Inzwischen existieren MAIT-Zellen in großer Zahl im menschlichen peripheren Blut, Darm oder in der Leber, und sie spielen eine wichtige Rolle bei der Immunität der Schleimhaut, aber ein Großteil der Details sind immer noch nicht geklärt. Obwohl es beim Menschen reichlich MAIT-Zellen gibt, hat die Herstellung einer großen Menge von MAIT-Zellen, die von ihrer Vorbereitung aus einem menschlichen lebenden Körper abhängt, Einschränkungen, da MAIT-Zellen schwer zu vermehren sind. MAIT-Zellen müssen durch Präparation aus einem lebenden Körper und Reinigung gewonnen werden, und es gibt weder eine Methode zur Induktion der Differenzierung in vitro/Amplifikation noch eine Technologie in Bezug auf charakteranaloge Zellen (Modellzellen).
Die EP 38 38 288 A1 beschreibt eine Zusammensetzung zur Erweiterung von Lymphozyten, umfassend mindestens zwei Arten von Zytokinen, ausgewählt aus Interleukin2 (IL-2), Interleukin-15 (IL-15) und Interleukin-21 (IL-21). Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung einer Population klinisch relevanter Lymphozyten, das die Schritte umfasst: Gewinnung einer Körperprobe von einem Säugetier, insbesondere einer Gewebeprobe oder einer körperflüssigen Probe, die mindestens einen Lymphozyten umfasst und gegebenenfalls die Zellen in der Körperprobe trennt, die Körperprobe in vitro kultiviert, um Lymphozyten in der Probe zu erweitern und/oder zu stimulieren, wobei die Kultivierung die Verwendung von IL-2 umfasst, IL-15 und/oder IL-21 und gegebenenfalls Bestimmung des Vorhandenseins eines klinisch relevanten Lymphozyten in der kultivierten Probe umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Immuntherapie und die Population klinisch relevanter Lymphozyten. Die T-Zelle ist vorzugsweise ausgewählt aus einer Mucosal-associated invariant T-cell (MAIT), Die Aphaeresis wurde an einem gesunden Spender durchgeführt, der mit NY-ESO-1 vorbereitet wurde. Nach der Trennung der Blutbestandteile wird das die Leukozyten enthaltende Produkt vom Rest getrennt. Die Zellen sind in Cellgro suspendiert, bestehend aus 5 % gepooltem humanem AB-Serum, 1000 U/ml IL-2, 10 ng/ml IL-15 und 10 ng/ml IL-21. Das Medium enthielt zusätzlich 10 µmol NY-ESO-1 Peptid als Expansionsantigen. Die Ausdehnung von Lymphozyten aus peripherem Blut beinhaltete den Schritt der Stimulation durch bestrahlte autologe PBMCs, die mit dem Antigen von Interesse gepulst wurden. Dazu wurden autologe PBMCs zwei Stunden lang mit 10 mM NY-ESO-1-Peptid bei RT gepulst und dann mit 55 Gy bestrahlt. Die gepulsten bestrahlten autologen PBMCs wurden der Lymphozytenkultur am Tag 7 zugesetzt und in frischem Kulturmedium wieder suspendiert, ergänzt mit 5% humanem gepooltem AB-Serum mit Zytokinen in den oben definierten Konzentrationen. Am Tag 10 wurden die Zellen mit Cellgro erweitert, ergänzt mit 5 % gepooltem humanem AB-Serum und Zytokinen. OKT3-Antikörper wurden in einer Konzentration von 30 ng/ml in demselben Kulturmedium wie oben beschrieben plus bestrahlten Feederzellen (55Gy) bei einem 1:10 (Feederzelle: T-Zell-Verhältnis) dem Peptid und den Zytokinen zugesetzt. Am 17. bis 20. Tag der Kultivierung werden die Zellen zur Analyse entnommen oder an den Patienten gegeben. Pankreastumorgewebe wird direkt nach der Operation gewonnen und in einen sterilen Behälter gegeben. Das Tumorgewebe wird mit einem sterilen Skalpell in Stücke von 1 bis 2 mm³ geschnitten. Jedes der Gewebestücke soll in eine Bohrung einer 24-Well-Platte überführt werden. 1 ml des Kulturmediums RPMI 1640 mit 10 % fetalem Rinderserum wurde in jede der Vertiefungen gegeben. Das Medium wurde am 7. und 14. Tag gewechselt, was bedeutet, dass das Kulturmedium entfernt und durch frisches Kulturmedium der gleichen Art ersetzt wurde. Als die Tumorzellen eine sehr hohe Dichte erreichten, wurde die Kultur auf eine 96-Well-Platte übertragen.
Die Erfindung gemäß WO 2019 180 270 A1 stellt technisch hergestellte Lymphozyten (z. B. γδ-T-Zellen, NK-Zellen, NK-ähnliche T-Zellen, technisch hergestellte angeborene lymphatische Zellen oder MAIT-Zellen) bereit, die ein heterologes Targeting-Konstrukt enthalten, dem eine intrazelluläre Signaldomäne fehlt, die in der Lage ist, den Lymphozyten zu aktivieren, auf dem das Konstrukt exprimiert wird.Zum Beispiel werden PBMCs in einigen Ausführungsformen unter Verwendung einer magnetischen Perlensortierung vorangereichert, die mehr als 90% γδ-T-Zellen ergeben kann. Diese Zellen können in Gegenwart eines oder mehrerer Faktoren (z. B. TCR-Agonisten, Co-Rezeptoragonisten und/oder Zytokinen, z. B. IL-4, IL-15 und/oder IFN-γ) in gasdurchlässigen Bioreaktorbeuteln für bis zu 21 Tage oder länger kultiviert werden. Variationen dieses Verfahrens und andere Verfahren zur Gewinnung von Vδ1-T-Zellen sind als Teil der vorliegenden Erfindung geeignet. Beispielsweise können aus Blut gewonnene Vδ1-T-Zellen alternativ mit Verfahren erhalten werden,
In der US 2019 382 725 werden Systeme und Methoden zur Modulation der Funktion von schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT) in Abwesenheit eines T-Zell-Rezeptors (TCR)-Signals beschrieben. Die Systeme und Methoden können verwendet werden, um die Funktion von MAIT-Zellen aufzuklären, um mögliche therapeutische Strategien für Erkrankungen im Zusammenhang mit Entzündungen zu bewerten. Mononukleäre Zellen, im Allgemeinen einschließlich Monozyten und Lymphozyten, können z. B. aus Blut, peripherem Blut, Knochenmark, Nabelschnurblut, Schleimhautgewebe, Magen-Darm-Trakt, Leber und Lunge gewonnen werden. Mononukleäre Zellen können durch eine bekannte Methode wie Zentrifugation, magnetische Perlen und Durchflusszytometrie erhalten werden. Mononukleäre Zellen können solche sein, die aus Stammzellen gewonnen werden, wie induzierte pluripotente Stammzellen, embryonale Stammzellen und somatische Stammzellen. Als insbesondere Ausführungsformen können periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) in der vorliegenden Offenbarung als mononukleäre Zellen verwendet werden. PBMCs können durch Dichtegradientenzentrifugation mit häufig verwendetem Dichtegradientenmedium wie Ficoll oder Ficoll-Paque isoliert werden. Das Dichtegradientenmedium kann außerdem Natriumdiatrizoat, Polysaccharide und Wasser umfassen. Die PBMCs können kryokonserviert werden, bevor sie in den Methoden der vorliegenden Offenbarung verwendet werden. Die Kryokonservierung von PBMCs kann die Resuspension der PBMCs in Gefriermedium umfassen. Insbesondere Ausführungsformen ist das Gefriermedium 10-20% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 40% fetales Rinderserum (FBS) oder humanes Serumalbumin (BSA) in RPMI-1640 Medium. Insbesondere können die PBMCs in Gefriermedium über Nacht in einen Gefrierbehälter bei -80° C gegeben werden, um ein allmähliches und gleichmäßiges Abkühlen zu ermöglichen. Die gefrorenen Zellen können zur Langzeitlagerung am nächsten Tag in einen Flüssigstickstofftank gebracht werden.
Kryokonservierte PBMCs können aufgetaut werden, um sie in den Methoden der vorliegenden Offenbarung zu verwenden. Insbesondere umfassen das Auftauen von PBMCs das Entfernen aus flüssigem Stickstoff und das Auflegen auf Eis, wonach sie in einem 37° C warmen Wasserbad aufgetaut werden. Das Auftauen kann weiter umfassen: Hinzufügen von warmem Medium, ergänzt mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und L-Glutamin, Waschen der Zellen, um das DMSO zu entfernen, und Resuspendieren der Zellen in Medium. Das Auftauen kann außerdem das Ausruhen der PBMCs über Nacht umfassen, um apoptotische Zellen zu entfernen. Nach dieser Ruhezeit werden die Zellen gewaschen und sind dann bereit, in Kultur verwendet zu werden. Kryokonservierte PBMCs wurden aufgetaut und unbehandelt in RPMI 1640 (wie oben beschrieben ergänzt) oder mit Zytokinen stimuliert, durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) stimuliert oder durch eine Kombination beider Behandlungen stimuliert. Die Zytokinstimulation wurde mit IL-12 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien), IL-15 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien) und IL-18 (MBLI, Woburn, Mass.) bei 100 ng/ml durchgeführt. Die TCR-Stimulation wurde mit Dynabead Human T-Zellaktivator (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien) Anti-CD3/CD28-Perlen bei einem Verhältnis von 1:1 Wulst/T-Zellen durchgeführt. Ganze PBMCs wurden unstimuliert oder in einer Konzentration von 1,25 × 106 pro Bohrung stimuliert oder stimuliert, wobei eine 96-Well-Platte für 6 und 24 Stunden bei 37 ° C verwendet wurde, um die Expression von CTLA-4 zu ermöglichen. MAIT-Zellen, die nur für 6 Stunden stimuliert wurden, benötigten mindestens 12 Stunden Ruhe in Kultur für eine ausreichende Induktion von CTLA-4. Zytokine und TCR-Kügelchen wurden durch magnetische Extraktion und Waschen entfernt. Kurz gesagt, Dynabeads wurden mit EasySep™ Magnet (STEMCELL Technologies Inc., Cambridge, Mass.) entfernt. Die Zellen wurden in 5 ml runde Polystyrolröhrchen bewegt und 0,5 ml 1×PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) wurden zu jeder Röhre hinzugefügt. Jede Röhre wurde für 1 min in einen EasySep-Magneten™ gelegt. Um das Rohr im Magneten zu halten, wurde der gesamte Inhalt des Rohres in ein anderes Rohr außerhalb des Magneten gegossen. Die magnetischen Dynabeads verblieben in der ersten Röhre innerhalb des EasySep-Magneten™, während Zellen in die neue Röhre bewegt wurden. Die Zellen wurden zweimal durch Zentrifugieren bei 2000 U / min für 3 min und Resuspendieren in 200 µL RPMI 1640 (wie oben beschrieben ergänzt) gewaschen. Nach den Wäschen wurden die Zellen in 200 µL RPMI 1640 (wie oben beschrieben ergänzt) resuspendiert, bevor sie zurück in eine 96-Well-Platte übergingen, um in Kultur zu ruhen. Um die TCR-Signalgebung zu blockieren, wurden Zellen im Zustand „nur Zytokin“ mit einem Anti-MR1-Antikörper (Klon 26.5, Biolegend, San Diego, Kalifornien) bei 50 µg/ml behandelt. Die Zellen wurden dann mit Antikörpern für die durchflusszytometrische Erfassung und Analyse wie oben beschrieben angefärbt.
Die WO 2014 069 072 A1 offenbart ein Präparationsverfahren für eine MAIT-ähnliche Zelle, bestehend aus der Einführung eines Reprogrammierungsfaktors in eine MAIT-Zelle, um eine induzierte pluripotente Stammzelle zu erhalten, die ein TCR-α-Kettengen behält, das zu einem MAIT-zellspezifischen Fashon umarrangiert wurde. Dann erfolgt eine Induktion der Differenzierung der induzierten pluripotenten Stammzelle, um eine MAIT-ähnliche Zelle zu erhalten. Die Präparationsmethode einer induzierten pluripotenten Stammzelle besteht aus der Einführung eines Reprogrammierungsfaktors in eine MAIT-Zelle, um eine induzierte pluripotente Stammzelle zu erhalten, die ein TCR-α-Kettengen beibehält, das auf MAITzellspezifische Weise neu angeordnet wird. MAIT-Zellen im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind T-Zellen, deren TCR-α-Kettengen zu einem einzigartigen und einheitlichen Vα-Jα (Vα19-Jα33 in einer Maus, Vα7.2-Jα33 beim Menschen) umgeordnet sind. Besonders bevorzugt können sie als Zellen definiert werden, die CD161 oder IL-18Rα exprimieren. Ferner kann die MAIT-Zelle dadurch charakterisiert werden, dass ihre TCR-α-Kette durch die invariante MR1 eingeschränkt ist. Ferner kann die MAIT-Zelle in der vorliegenden Erfindung durch Expression von Genen, die für die MAIT-Zelle spezifisch sind, oder durch eine zellbiologische Eigenschaft, die für die MAIT-Zelle spezifisch ist, identifiziert werden. Jedes Kultivierungsverfahren zur Gewinnung von MAIT-ähnlichen Zellen durch Induktion der Differenzierung in der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, solange MAIT-ähnliche Zellen erhalten werden können, und Beispiele umfassen Kokultur mit Feederzellen, Float-Kultur, Hanging-Drop-Kultur, Kreiselkultur, Soft-Agar-Kultur, Mikroträgerkultur. In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, MAIT-ähnliche Zellen durch Induktion der Differenzierung von iPS-Zellen durch Kokultur zu erhalten, und insbesondere können MAIT-ähnliche Zellen effizient aus MAIT-iPS-Zellen durch Kokultur unter Verwendung von Stromazellen, wie OP9-Zellen als Feederzellen erhalten werden, gefolgt von einer Kokultur mit OP9-Zellen, die einen Notch-Liganden DLL1 (OP9/DLL1) kraftvoll exprimieren oder eine Kokultur, die von Anfang an mit den OP9/DLL1-Zellen durchgeführt wird. Die mit einer solchen Methode erhaltenen MAIT-ähnlichen Zellen können anschließend mit bekannten Methoden einer Zellgewinnung, -trennung und -reinigung unterzogen werden. Die durch die vorliegende Erfindung erhaltenen MAIT-ähnlichen Zellen sind Zellen mit morphologischen, physiologischen und/oder immunologischen Merkmalen, die denen einer MAIT-Zelle im lebenden Körper nahezu gleichwertig sind.
In der Erfindung WO 2021 0856 450 A1 ist das Kulturverfahren zur Gewinnung von m-reMAIT-ähnlichen Zellen durch Induktion der Differenzierung beschrieben, wobei das Verfahren aber nicht eingeschränkt auf ein Co-Kulturverfahren mit Feederzellen, ein Suspensionskulturverfahren, ein Hängetropfenkulturverfahren und ein Wirbelkulturverfahren, Soft-Agar-Kultur-Methode, Mikroträger-Kultur-Methode und dergleichen ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Kokultur bevorzugt geeignet, die Differenzierung von iPS-Zellen zu induzieren, um m-reMAIT-Zellen zu erhalten. Insbesondere werden Stromazellen wie OP9-Zellen als Feederzellen und weiter kokultiviert. Durch Kokultivierung mit OP9-Zellen (OP9 / dlk-1) durch zwangsexprimierende Expression des Notch-Liganden Delta-like 1 (dlk-1) oder durch Kokultivierung mit OP9 / dlk-1-Zellen von Anfang an. M-re MAIT-Zellen können effizient aus MAIT-iPS-Zellen gewonnen werden.
Die WO 2021 122 961 A1 offenbart ein Verfahren zur Proliferation, Expansion, Aktivierung und/oder das Überleben von MAIT-Zellen. In einigen Ausführungsformen werden die MAIT-Zellen unter stimulierenden Bedingungen oder in Gegenwart eines stimulierenden Mittels inkubiert. Zu diesen Bedingungen gehören solche, die dazu bestimmt sind, die Proliferation, Expansion, Aktivierung und/oder das Überleben von MAIT-Zellen zu induzieren und/oder die Antigenexposition nachzuahmen. Die Bedingungen können eines oder mehrere bestimmte Medien, Temperatur, Sauerstoffgehalt, Kohlendioxidgehalt, Zeit, Wirkstoffe, z. B. Nährstoffe, Aminosäuren, Antibiotika, Ionen und/oder stimulierende Faktoren wie Zytokine, Chemokine, Antigene, Bindungspartner, Fusionsproteine, rekombinante lösliche Rezeptoren und alle anderen Wirkstoffe zur Aktivierung der MAIT-Zellen umfassen. Zum Beispiel können MAIT-Zellen mit einem Anti-CD3-Antikörper und/oder einem Anti-CD28-Antikörper unter Bedingungen, die die Proliferation der Zellen stimulieren, inkubiert werden. In einigen Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen MAIT-Zellen in vitro durch Kokultivierung mit Gewebe oder Zellen erweitert werden. In einigen Ausführungsformen werden die MAIT-Zellen durch Co-Kultivierung mit Feederzellen, wie z. B. nicht teilendem PBMC, expandiert. In einigen Aspekten können die sich nicht teilenden Feederzellen bestrahlte PBMC-Feederzellen, insbesondere autologe oder allogene bestrahlte PBMC, oder andere Zellen umfassen, die MR1 exprimieren. In einigen Ausführungsformen werden MAIT-Zellen in vitro durch CD3/CD28-Stimulation in Gegenwart von autologen oder allogenen bestrahlten PBMCs und IL-2-, IL7-, IL-12-, IL-18- und/oder IL-15-Zytokinen expandiert. In weiteren Ausführungsformen werden MAIT-Zellen in vitro in Gegenwart von MAIT-Zell-aktivierenden Liganden wie 5-OP-RU und/oder 5-OE-RU expandiert und/oder aktiviert. In einigen Ausführungsformen umfasst die Methode einen Schritt der bevorzugten In-vitro-MAIT-Zellexpansion aus einer Zellprobe eines Spenders, insbesondere aus PBMCs eines Spenders. Eine bevorzugte In-vitro-MAIT-Zellexpansion kann durch Kultivierung von PBMCs von einem Spender in Gegenwart von synthetischem 5-OP-RU und gegebenenfalls mit Zytokinen durchgeführt werden. Insbesondere PBMCs von einem Spender werden in Gegenwart von 5-OP-RU und IL-2 (wie rhulL-2) kultiviert. In einigen Ausführungsformen sind die MAIT-Zellen vorzugsweise ex vivo für mindestens etwa 5 Tage, vorzugsweise nicht weniger als etwa 10 Tage, besonders bevorzugt nicht weniger als etwa 15 Tage und ganz besonders bevorzugt nicht weniger als etwa 20 Tage vor der Verabreichung an den Patienten expandiert. In einigen Ausführungsformen sind die MAIT-Zellen mindestens um das 100-fache, vorzugsweise mindestens um das 200-fache und besonders bevorzugt mindestens um das 400-fache, vorzugsweise mindestens um das 600-fache, besonders bevorzugt mindestens um das 1000-fache und noch besonders bevorzugt mindestens um das 1500-fache im Vergleich zum Tag 0 der Expansion erweitert worden. vor der Verabreichung an einen Patienten. In einigen Ausführungsformen umfasst das Herstellungsverfahren Schritte zum Einfrieren, z. B. Kryokonservierung, der Zellen, entweder vor oder nach der Isolierung, Inkubation und/oder Technik.
Die WO 2020 127 513 A1 beschreibt eine schleimhaut-assoziierte invariante T (MAIT)-Zelle, die einen chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimiert, zur Verwendung bei der Behandlung eines Krebses, einer Immunerkrankung oder einer Infektionskrankheit bei einem Probanden, wobei die MAIT-Zelle in Bezug auf das Subjekt allogen ist. In einem Aspekt soll die CAR-MAIT-Zelle einem immungeschwächten Probanden verabreicht werden. Insbesondere ist die CAR-MAIT-Zelle nach einer konditionierenden Behandlung zu verabreichen, die den Probanden immungeschwächt macht. Die konditionierende Behandlung kann in Chemotherapie, Strahlentherapie und/oder lymphodezentierenden Antikörpern bestehen. Vorzugsweise exprimiert die MAIT-Zelle ein CAR, das spezifisch an ein tumorassoziiertes Antigen (TAA) bindet. Das TAA kann an der Oberfläche von Tumorzellen exprimiert werden. Vorzugsweise sind die TAA CD19, GD2, EGFR, CD20, CD22, CD33, CD138, CD52, CD30, ROR1, HER2, EpCAM, MUC-1, MUC5AC, BCMA, CD38, SLAMF7/CS1, CD123, IL-13Ra2, HER2, LeY, MUC16 oder PSMA. Besonders bevorzugt sind das TAA CD19, CD20, CD22, CD33, CD138, BCMA, CD38, SLAMF7/CS1, IL-13Ra2 oder HER2.Die vorliegende Erfindung stellt schleimhautassoziierte invariante T (MAIT)-Zellen bereit, die einen chimären Antigenrezeptor (CAR), hierin CAR-MAIT-Zellen genannt, zur Verwendung auf dem Gebiet der allogenen adoptiven Immuntherapie exprimieren. Die CAR-MAIT-Zellen zeigen kein alloreaktives Potenzial; Sie vermehren sich nicht in vitro als Reaktion auf allogene Zellen und sie nehmen im Gegensatz zu herkömmlichen T-Zellen nicht an der Induktion von Graft versus Host Disease (GvHD) teil. Erfindungsgemäß können CAR-MAIT-Zellen leicht in vitro in großen Mengen hergestellt und erweitert werden. CAR-MAIT-Zellen können z.B. in Tiefkühleinheiten gelagert werden und sind „ready to use“, um eine zeitnahe Verabreichung an mehrere Empfänger zu ermöglichen. Ihre Zubereitung ist kostengünstig und stellt eine universelle Behandlung dar, unabhängig von der HLA-Disparität zwischen den Probanden und ohne das Risiko, GVHD zu induzieren. Die Zellen können sowohl aus Blutproben (einschließlich peripherem Blut und Nabelschnurblut) als auch aus Proben gewonnen werden, die aus einem oder mehreren Verarbeitungsschritten wie Trennung, Zentrifugation, Gentechnik, Waschen und/oder Inkubation resultieren. In einer bestimmten Ausführungsform umfasst die Probe des Spenders periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs). In einer bestimmten Ausführungsform werden MAIT-Zellen von jedem Ort gesammelt, an dem sie sich im Subjekt befinden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf peripheres Blut, periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs), Knochenmark, Nabelschnurblut. In einer bestimmten Ausführungsform werden die MAIT-Zellen durch Apherese, insbesondere durch Leukapherese, gesammelt. Wie einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, stehen verschiedene Methoden zur Isolierung von Immunzellen aus einem Subjekt zur Verfügung oder können an die gegenwärtige Anwendung angepasst werden, beispielsweise mit dem Life Technologies Dynabeads-System®; STEMcell Technologies EasySep, RoboSep™, RosetteSep™, SepMate™; Miltenyi Biotec MACS-Zellseparationskits™, Zelloberflächenmarkerexpression und andere kommerziell erhältliche Zellseparations- und Isolationskits (z. B. ISOCELL von Pierce, Rockford, IL). MAIT-Zellen können durch die Verwendung von Perlen oder anderen Bindemitteln, die in solchen Kits verfügbar sind, die für MAIT-Zelloberflächenmarker spezifisch sind, isoliert werden. Zum Beispiel können MAIT-Zellen mit einem Anti-CD3-Antikörper und/oder einem Anti-CD28-Antikörper unter Bedingungen, die die Proliferation der Zellen stimulieren, inkubiert werden. In einer bestimmten Ausführungsform werden MAIT-Zellen in vitro in Gegenwart von MAIT-Zell-aktivierenden Liganden wie 5-OP-RU und/oder 5-OE-RU expandiert und/oder aktiviert. In einer weiteren besonderen Ausführungsform umfasst das Verfahren einen Schritt der bevorzugten in vitro MAIT-Zellexpansion aus einer Zellprobe eines Spenders, insbesondere aus PBMCs eines Spenders. Eine bevorzugte In-vitro-MAIT-Zellexpansion kann durch Kultivierung von PBMCs von einem Spender in Gegenwart von synthetischem 5-OP-RU und gegebenenfalls mit Zytokinen durchgeführt werden. Insbesondere PBMCs von einem Spender werden in Gegenwart von 5-OP-RU und IL-2 (wie rhuIL-2) kultiviert. In einer besonderen Ausführungsform werden die MAIT-Zellen vorzugsweise ex vivo für mindestens etwa 5 Tage, vorzugsweise nicht weniger als etwa 10 Tage, besonders bevorzugt nicht weniger als etwa 15 Tage und ganz besonders bevorzugt nicht weniger als etwa 20 Tage vor der Verabreichung an den Patienten expandiert. In einer weiteren Ausführungsform sind die MAIT-Zellen mindestens um das 100-fache, vorzugsweise mindestens um das 200-fache und besonders bevorzugt mindestens um das 400-fache, vorzugsweise mindestens um das 600-fache, besonders bevorzugt mindestens um das 1000-fache und noch besonders bevorzugt mindestens um das 1500-fache im Vergleich zum Tag 0 der Expansion erweitert worden. vor der Verabreichung an einen Patienten.
In der EP 09 10 624 B1 wird ein Verfahren zur Vermehrung von Lymphozyten in einer Zellkultur beschrieben, wobei Lymphozyten in einem Zellkulturmedium kultiviert und vermehrt werden, dass einen Lymphozytenwachstumsfaktor sowie zusätzlich Aurintricarbonsäure oder eine Substanz, welche an ein Cyclophilin bindet und in diesem Komplex Calcineurin inhibiert, enthält. Das Zellkulturmedium enthält als Cyclophilin bindende Substanz Cyclosporin, Ascomycin und/oder Tacrolimus. Die Lymphozyten sind Leukozyten, die im Blut, in der Lymphe, in der Milz, in Lymphknoten, in Tumoren, oder in entzündeten Geweben zu finden sind und sind Lymphozyten T-Lymphozyten, B-Lymphozyten oder NK-Zellen sind. Lymphozytenwachstumsfaktoren sind aus T-Lymphozyten-, B-Lymphozyten- oder NK-Lymphozyten-Wachstumsfaktor, vorzugsweise aus der Gruppe IL-2, IL-10, IL-13, IL-14 und IL-15 ausgewählt. Unter einem Lymphozyten-Wachstumsfaktor ist eine Substanz zu verstehen, welche in der Lage ist, die Zellteilung von Lymphozyten zu fördern. Lymphozyten-Wachstumsfaktoren sind dem Fachmann im weiten Umfang bekannt. Geeignete T-Lymphozyten-Wachstumsfaktoren sind beispielsweise Interleukin-2 (IL-2) und Interleukin-15 (IL-15). Ein geeigneter NK-Lymphozyten-Wachstumsfaktor ist z. B. IL-15. Geeignete B-Lymphozyten-Wachstumsfaktoren sind beispielsweise Interleukin-13 (IL-13), IL-14 und IL-10 (Callard, R.E., und Gearing, J.H., The Cytokine Facts Book, Academic Press, London, 1994). Als Lymphozyten werden tumorinfiltrierende Lymphozyten kultiviert und nach zehntägiger Kultur ein Gemisch aus T-Lymphozyten (CD3+, CD4+, CD8+, CD19-), NK- Zellen (CD2+, CD3-, CD56+, CD19-) und B-Lymphozyten (CD19+, CD3-) nachweisbar ist.
Die Vermehrung von Tumor-infiltrierenden Lymphozyten erfolgt in einem Medium, das Interleukin-2 (IL-2) und Aurintricarbonsäure (ATA) enthält, wobei der Knoten eines menschlichen Kolonkarzinoms, der durch Operation aus dem Dickdarm entfernt wurde, von Bindegewebe und
normalen Darmanteilen befreit wird und in ca. 2 × 2 × 3 mm große Teile zerschnitten. Die Tumorfragmente werden in Iscove-modifiziertem DME-Medium (Gibco), das 15 % FKS (BM) enthält, aufgenommen und gleichmäßig auf vier Kulturschälchen verteilt.
In der DE 10 2021 002 748 A1 wird ein Verfahren zur Isolierung, Aktivierung und Vermehrung von Immunzellen, insbesondere von tumorinfiltrierten autologen T-Lymphozyten (TIL) aus primären Tumorgewebe, Metastasen, Lymphgewebe, aber auch T-Zellenaus anderen Geweben (z. B. Blut, Lymphflüssigkeit) in einem Mäander-Perfusions-Bioreaktor und die Herstellung von Immunzell-Therapeutika daraus zur Bekämpfung von Tumoren der Bauchspeicheldrüse, Lunge, Leber, Prostata, Brust, des Eierstocks,Magens, Dickdarms, Rektums, Knochens, Hirns, der Haut und anderer maligner Tumore offenbart, wobei

• die Strömungsverhältnisse im Gerinne eines Perfusions-Bioreaktors,
• die Ausbildung einer weitgehend ruhenden Zellschicht, in der sie sich die Zellen berühren, aber auch leichte Bewegungen auftreten können, wobei TIL-Zellzahlen in der sedimentierteSchicht bei 0,1 bis 2 × 106 TIL/cm2, vorzugsweise 0,5 bis 1× 106 TIL/cm für eine stetige Vermehrung liegen,
• das Kulturmedium Cytokine und Antikörper enthält, wobei die Cytokine in der Form des Interleukin 12 oder aus einem Gemisch aus Interleukin 2 und Interleukin 12 und die Antikörper in der Form des Antikörper 4-1bb bestehen und
• die hyperoxische oder auch normoxische Versorgung der Zellen mit supplementiertem Medium und Sauerstoff in Abhängigkeit von der hochgewachsenen Menge an TIL oder anderen T-Zellen

Die EP 3 601 533 B1 beschreibt ein verbessertes und/oder verkürztes Verfahren zur Erweiterung von TILs und zur Herstellung therapeutischer Populationen von TILs, einschließlich neuartiger Verfahren zur Erweiterung von TIL-Populationen in einem geschlossenen System, die zu einer verbesserten Wirksamkeit, einem verbesserten Phänotyp und einer erhöhten metabolischen Gesundheit der TILs in einem kürzeren Zeitraum führen und gleichzeitig eine reduzierte mikrobielle Kontamination sowie geringere Kosten ermöglichen. Solche TILs finden Verwendung in therapeutischen Behandlungsschemata. Das Verfahren besteht aus:

(a) Gewinnung einer ersten Population von TILs aus einem Tumor, der von einem Patienten reseziert wurde
(b) Hinzufügen der Tumorfragmente in ein geschlossenes System;
(c) Durchführen einer ersten Expansion durch Kultivieren der ersten Population von TILs in einem Zellkulturmedium, das IL-2 enthält, um eine zweite Population von TILs zu erzeugen, wobei die erste Expansion in einem geschlossenen Behälter durchgeführt wird, der eine erste gasdurchlässige Oberfläche bietet, wobei die erste Expansion für etwa 3 bis 14 Tage durchgeführt wird, um die zweite Population von TILs zu erhalten, wobei die zweite Population von TILs mindestens 50-mal größer ist als die erste Population von TILs, und wobei der Übergang von Schritt (b) zu Schritt (c) erfolgt, ohne das System zu öffnen;
(d) Durchführen einer zweiten Expansion durch Ergänzen des Zellkulturmediums der zweiten Population von TILs mit zusätzlichen IL-2-, OKT-3- und Antigenpräsentierenden Zellen (APCs), um eine dritte Population von TILs zu erzeugen, wobei die zweite Expansion für etwa 7 bis 14 Tage durchgeführt wird, um die dritte Population von TILs zu erhalten, wobei die dritte Population von TILs eine therapeutische Population von TILs ist, wobei die zweite Expansion in einem geschlossenen Behälter durchgeführt wird, der eine zweite gasdurchlässige Oberfläche bietet, und wobei der Übergang von Schritt (c) zu Schritt (d) erfolgt, ohne das System zu öffnen;
(e) Entnahme der therapeutischen Population von TILs, die aus Schritt (d) gewonnen wurden, wobei der Übergang von Schritt (d) zu Schritt (e) erfolgt, ohne das System zu öffnen; und
(f) Übertragung der geernteten TIL-Population von Schritt e) in einen Infusionsbeutel, wobei der Übergang von Schritt (e) zu (f) erfolgt, ohne das System zu öffnen.

Die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren zur Expansion von Zellen, insbesondere nicht adhärent wachsenden T- Lymphozyten oder NK- Zellen aber auch weiteren Immunzellen z. B. tumorinfiltrierte NK-Zellen (TINK) werden in Kulturschälchen oder 24 oder 96 Well- Platten durchgeführt, wobei dem Kulturmedium ein hoher Anteil humanem gepooltem AB-Serum (5% bis 10%) zugegeben wird, die ein wesentlicher Kostenfaktor bei der Expansion von T-Lymphozyten darstellt und womit auch nicht ausreichende Mengen an T-Lymphozyten für eine therapeutische Behandlung zur Verfügung gestellt werden können. Des Weiteren ist nach der Kultivierung ein Gemisch aus T-Lymphozyten (CD3+, CD4+, CD8+), NK- Zellen (CD2+, CD56+) und B-Lymphozyten (CD19+), nachweisbar, wobei aber kein hoher Anteil an T- Lymphozyten, die einem Gemisch aus CD8 und CD56 Antikörper enthalten, expandiert wurde.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Expansion von Zellen, insbesondere von nicht adhärent wachsenden Zellen, wie invarianten T- Lymphozyten oder nicht adhärent wachsende T- Lymphozyten und NK- Zellen aber auch weiteren Immunzellen z. B. tumorinfiltrierte NK-Zellen (TINK) und schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT) mit einem hohen Anteil an CD 8+ und CD 56+ Antikörper, auch mit einem geringen Anteil an CD3+ Antikörper, zu entwickeln, bei dem genügende Mengen an Zellen für eine therapeutische Behandlung mit Zellen zur Verfügung gestellt werden und die hohen Kosten, insbesondere durch den Einsatz von humanen Seren bei der Expansion vermieden werden.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Expansion von Zellen, insbesondere von nicht adhärent wachsende Zellen, wie invarianten T- Lymphozyten oder nicht adhärent wachsende T- Lymphozyten und NK- Zellen aber auch weiteren Immunzellen z. B. tumorinfiltrierte NK-Zellen (TINK) und schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT) mit einem hohen Anteil an CD 8 und CD 56 Antikörper, auch mit einem geringen Anteil an CD3+ Antikörper, in einem Perfusion-Plattenmäander- Bioreaktor, wobei das in Gerinnen 10 geführte Kulturmedium von Overlay- Medien überströmt wird, gelöst, wobei der Perfusions- Plattenmäander-Bioreaktor aus mehreren übereinanderliegenden und gegeneinander um 180° verdrehten, mit durch Stege 13 gebildete Gerinnen 10 und mit in den Kultivierungsträger angeordneten Überläufen 14 sowie in Strömungsrichtung vor den Überläufen 14 angeordneten Überlaufstegen 33 besteht und wobei das Kulturmedium in einem Bioreaktorgefäß 1 in den Gerinnen 10 auf den Kultivierungsträgern 7 des Bioreaktorgefäßes 1 horizontal und durch die Überläufe 14 sowie über den Überlaufsteg 33 auf den darunterliegenden Kultivierungsträger 7 vertikal mäandrierend von Kultivierungsplatte 7 zu Kultivierungsplatte 7 bis zum Abfluss 23 für das Kulturmedium geführt wird. Die Overlay- Medien werden zur Gasdiffusion der Overlay- Medien in das Kulturmedium und zur Konstanthaltung der Konzentration der gelösten Overlay- Medien in dem Kulturmedium oberhalb der Oberfläche des Kulturmediums in den Gerinnen 10 von der speisenden Overlay-Kavität 12 in Richtung der Überläufe 14 und mäandierend von unten nach oben bis zum Abfluss 22 für Overlay- Medien geführt.
Zerkleinerten Gewebestücken, insbesondere kleingeschnittenen Gewebestücken, die aus anfallenden OP-Gewebeteilen oder aus Biopsien stammen werden in das Kulturmedium eingebracht und in einem für das Auswachsen der Zellen geeigneten Perfusions-Mäander -Bioreaktor wachsen in einer ersten Stufe Zellen aus. Nach Erreichen einer bestimmten Dichte an ausgewachsenen und expandierten Zellen werden diese von den Gewebeteilen separiert und im Kulturmedium supplementiert, wobei das Kulturmedium aus üblichen Basismedien mit einem Gemisch aus AB-Humanserum, Antikörper, Cytokinen., Lymphozytenwachstumsfaktoren und humanen Feederzellen Glycol besteht und in einen Perfusion- Plattenmäander- Bioreaktor verbracht, expandiert, aktiviert und geerntet werden und wobei dem Kulturmedium AB Humanserum in einer Menge von 2% an der Gesamtmenge und mit Membrananteilen aus lysierten humanen, autologen Feederzellen supplementiert wird.
Außerdem werden dem Kulturmedium beschichtete Partikeln als Indikatorkügelchen in einer Größe von 10 -100 µm, insbesondere aus Polystyrol oder aus Sprühgranulat hergestellte Keramikhohlkugeln, die mit Fluoreszensmarker, insbesondere Indocyaningrün, beschichtet sind, beigemischt und durch eine geeignete Lichtquelle 18 mit einer Wellenlänge von zwischen 750 nm und 950 nm, insbesondere mit einer Lichtquelle mit einer Wellenlänge im Fluoreszenzspektrum für Blut von 830 nm, angestrahlt, wobei sich die Fluoreszenshelligkeit des Fluoreszensmarker durch die Änderung der Konzentration von Overlay- Medien, insbesondere von O₂, verändert. Je niedriger die Konzentration an Overlay-Medien, insbesondere an O₂, in dem Kulturmedium ist, desto größer ist die Fluoreszenshelligkeit.
Die Dichte vom Kulturmedium beträgt 1,077 g/cm³, die Dichte der keramischen Hohlkugeln mit Lufteinschluss beträgt 1,09 bis 1,1 g/cm³ und ist nur geringförmig höher als die des Kulturmediums. Ein Absinken der Kügelchen im fließenden Medium ist also in größeren Zeiteinheiten zu erwarten. Durch den am Rütteltisch 30 befestigten Impulsgeber 31 werden in definierten Zeitintervallen, insbesondere 1 bis 3x pro Tag das Kulturmedium im Gerinne 10 vertikal zur Strömungsrichtung durch Rucke zwischen 2-5 m/s³ impulsartig beschleunigt und eine Durchmischung der Medienbestandteile und der Indikatorkügelchen erreicht.
Mit zunehmender Zellzahl während des Kultivierungsprozesses steigt auch der Glucose- Bedarf und der Bedarf an Sauerstoff im Overlay.
Wird der Helligkeitsgradient der lichtemittierenden Indikatorkügelchen beim Einströmen und beim Ausströmen gemessen und ausgewertet kann durch die Veränderung der Strömungsgeschwindigkeit des Kulturmediums und der Overlay-Medien nach festgelegten Algorithmen die Vermehrungsrate der Zellen gesteigert werden. Dies führt zum Zeitgewinn und Kosteneinsparung beim Kulturmedium bei der Zellkultivierung.
Wie oben beschrieben, erfolgt die Glukosezufuhr über das Kulturmedium in Abhängigkeit der O₂- Konzentration in dem Kulturmedium, wobei die Konzentration an O₂ an der Fluoreszenshelligkeit des Fluoreszensmarkers ermittelt und geregelt wird.
Die Breite der Gerinne 10 ist so gewählt und die zugeführte und abgeführte Menge an Kulturmedium ist so eingestellt, dass sich in den Stromfäden in den Gerinnen 10 eine laminare Strömung mit einer Bodensteinzahl von 0,001 bis 0,1 ausbildet und die Bodenströmung dabei nahe bei einer Bodensteinzahl 0 verbleibt. Der Abstand b der Gerinne von den Stirnwänden ist so gewählt, dass das Kulturmedium ohne Strömungsverluste durch die Überläufe 14 und über die Überlaufstege 33 abfließen kann.
Die Bodenstein-Zahl ist eine dimensionslose Kennzahl, die das Verhältnis der konvektiv zugeführten zu den durch Diffusion zugeführten Molen beschreibt. Damit charakterisiert die Bodenstein-Zahl die Rückvermischung innerhalb eines Systems (je größer die Bodenstein-Zahl, desto geringer die Rückvermischung) und ermöglicht Aussagen darüber, ob und wie stark sich Volumenelemente oder Stoffe innerhalb der Gerinne 10 durch die herrschenden Strömungen vermischen. Bei der Bodensteinzahl 0 oder nahe 0 ist die Rückvermischung am größten, das heißt, dass bei einer Bodensteinzahl nahe 0 die Overlay- Medien optimal mit dem Kulturmedium vermischt sind und so die Zellen bei ihrer Expansion optimal mit den Overlay- Medien versorgt werden. Die Bodensteinzahl Bo ist definiert mit Bo= u × L/D_ax, wobei u die Strömungsgeschwindigkeit, L die Länge des Reaktors, hier die Länge der Gerinne 10 und D_ax den Dispersionskoeffizient darstellen. Da die Länge der Gerinne 10 gegeben ist und die Bodensteinzahl Bo=0 für die ideale Rückvermischung steht, hängt der Dispersionskoeffizient und damit die Verteilung der Overlay- Medien, insbesondere die Verteilung von O₂, von der Strömungsgeschwindigkeit des Kulturmediums und der Länge des Reaktors ab, die dann entsprechend der Overlay- Medien- Verteilung in dem Kulturmedium in den Gerinnen 10 an der Fluorenszenshelligkeit zu erkennen ist und geregelt wird.
Die Overlay- Medien strömen über das Kulturmedium in den auf den Kultivierungsträger 7 angeordneten Gerinne 10 mit einer laminaren Strömung, die durch die Froudsche Zahl 0 < Fr <1 gekennzeichnet ist.
Die Froude-Zahl beschreibt das Verhältnis von Fließgeschwindigkeit und der Ausbreitungsgeschwindigkeit einer Flachwasserwelle, wobei bei einem strömenden Strömungszustand die Wellenausbreitung ein parabelförmiges Muster zeigt.
Das Kulturmedium im Perfusion- Plattenmäander- Bioreaktor wird über die Kultivierungsträger 7 mit Gerinnen 10 und Überläufen 14 mäanderförmig von oben nach unten und die Overlay- Medien overflow alternierend gleich- und gegensinnig zur Strömung des Kulturmediums geführt, wobei die Zellen über die Overlay- Medien während der Expansion normoxämisch mit O₂ und auch hyperoxämisch mit einer O₂-Konzentration von 23 - 25 % versorgt werden.
Der Anteil der expandierten Zellen, die mit den Antikörpern CD 8+ und CD 56+ versehen ist, liegt bei Expansion nach diesem Verfahren bei 70 bis 80 %, wobei der Antikörper CD3+ in geringen Mengen ebenfalls an die Zellen angedockt ist.
Als Lymphozytenwachstumsfaktoren werden Interleukin 12 allein oder als Gemisch aus Interleukin 2 und Interleukin 12 oder als ein Gemisch von IL12, IL15 mit zusätzlich den Antikörper 4-1 BB eingesetzt.
In einer Auslegung der Erfindung wird die Plattenebene der Kultivierungsträger 7 des auf einer Rüttelplatte 30 mit einem Impulsgeber 31 angeordneten Perfusion-Plattenmäander- Bioreaktors horizontal liegen angeordnet und mechanisch in Richtung der Schwerkraft in Zeitintervallen, insbesondere 1- bis 3-mal/d gerüttelt, wobei der eingebrachte Ruck zwischen 2-5 m/s³ beträgt.
Die Plattenebene der Kultivierungsträger 7 kann auch elektromechanisch gerüttelt werden.
Dadurch wird die Segregation der TIL-Zellen infolge Sedimentation während der Strömung in den Gerinnen verringert, die Vermehrungsrate gesteigert und die Durchlaufzeit der geplanten Zellvermehrung gesenkt. Dies führt zu einem früheren Therapiebeginn der Behandlung mit dem positiven Effekt der höheren Heilungschancen, sowie auch zu geringeren Kosten.
In einer weiteren Auslegung der Erfindung können die Zellen in den Kulturmedien, während der Expansion einem Scherstress ausgesetzt werden, wobei ein Teil des Kulturmediums durch einen Bypass 26 außerhalb des Perfusions- Plattenmäander-Bioreaktor durch eine mit einer elektromagnetischen Schlauchklemme 27 erzeugte Verengung des Bypasses 26 geführt werden.
Die Erfindung wird anhand eines Beispiels näher erläutert, wobei die 1 ein Fließschema des Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor, die 2 eine schematische Seitendarstellung, die 4 eine 3- D- Draufsicht auf den Bioreaktor, die 5 eine Darstellung des Kultivierungsträgers 7 und die 3 eine schematische Seitendarstellung mit dem Bypass 26 des Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor mit Rütteltisch 30 und Impulsgeber 31,
wobei

1: Bioreaktorgefäß
2: Boden
3: Deckel
4: Stirnwand
5: Stirnwand
6: Seitenwand
7: Kultivierungsträger
8: Spannbügel
9: Spannmutter
10: Gerinne
11: Zufuhrkavität
12: Zuführungen Overlay- Medien
13: Stege
14: Überlauf
15: Auffangkammer
16: Raum für Overlay- Medien
17: Fuß
18: Lichtquelle
19: Lichtfenster
20: Luer- Lock- Verbinder für die Zuführung Overlay- Medien
21: Luer- Lock- Verbinder für die Zuführung Kulturmedium
22: Luer- Lock- Verbinder für die Abführung Overlay- Medien
23: Luer- Lock- Verbinder für die Abführung Kulturmedium
24: Overlay- Kavität
25: Kulturmedien
26: Bypass
27: elektromagnetische Schlauchklemme
28: Dreiwegekükenhahn
29: Luer- Lock- Verbinder
30: Rütteltisch
31: Impulsgeber
32: Kamera
33: Überlaufsteg

Ein Kulturmedium besteht aus einem Zellwachstum-Medium, das mit einem spezifischen Gemisch aus AB Humanserum, Cytokinen, Antikörpern und irradiierten humanen Feeder Zellen zeitweilig supplementiert wird. Diesem Kulturmedium werden die während einer Operation vom Patienten entnommenen und zerkleinerten autologen Tumor- Gewebestücke in einer Größe von 1 bis 2 mm³ sowie mit Indocyaningrün beschichtete Polystyrol- Partikeln in einer Größe von 10 -100 µm zugegeben und mit dem Kulturmedium über den Luer- Lock-Verbinder 21 für die Zuführung von Kulturmedium dem Bioreaktorgefäß 1 zugeführt. Das Kulturmedien wird nur mit AB Humanserum in einer Menge von 2% an der Gesamtmenge und mit Membrananteilen aus lysierten humanen, autologen Feederzellen supplementiert, wobei die Membrananteile der lysierten Feederzellen nach 4 - 5 Tagen nach Beginn der Expansion zugesetzt werden. Die zerkleinerten Gewebestücke werden im Bioreaktor gleichmäßig verteilt und im Perfusionsbetrieb kultiviert, wobei das Kulturmedium durch die über den Zufuhrkavität 11 und die Zuführungen 12 für Overlay- Medien in die Overlay- Räume 16 zugeführten Overlay-Medien mit der entsprechenden Overlay-Atmosphäre geregelt versorgt wird. In einem Kultivierungslauf über 7 bis 14 Tage wachsen Zellen (TIL oder andere Zellen) in ausreichender Menge aus. Mit zunehmender Zellzahl wird im Verlauf der Vermehrung der Zellmenge (TIL oder andere Zellen) die Zufuhr von frischem Medium kontinuierlich erhöht, wobei das erhöhte Zuführen von frischem Medium durch einen entsprechenden Algorithmus automatisch gesteuert wird.
Der Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor besteht dabei aus einem Bioreaktorgefäß 1 aus Polystyrol, das aus einen Boden 2, einem Deckel 3, aus Stirnwänden 4,5 und aus Seitenwänden 6 gebildet wird. In dem Bioreaktorgefäß 1 sind über die Spannmuttern 9 und einem Spannbügel 8 mehrere, insbesondere acht Kultivierungsträger 7 mit einem Abstand von 11,5 mm befestigt. Auf den Kultivierungsträgern 7 werden durch Stege 13 Gerinne 10 gebildet, durch die das Kulturmedium die gasförmigen Overlay- Medien geführt werden und wobei das Kulturmedium und über einen Überlaufsteg 33 von 6 mm Höhe und durch einen oder mehrere Überläufe 14 auf den darunterliegenden Kultivierungsträger 7 abgeführt wird. Dieser darunterliegende Kultivierungsträger 7 ist mit seinem Überläufen 14 und seinem Überlaufsteg 33 gegenüber dem darüber liegenden Kultivierungsträger 7 um 180° gedreht angebracht, so dass das Kulturmedium mäanderartig von oben nach unten in die Auffangkammer 15 für das Kulturmedium fließt und über den Luer- Lock-Verbinder 23 aus dem Bioreaktorgefäß 1 abgeführt wird. Der Abstand a der Stege 13 voneinander ist so gewählt und die zugeführte und abgeführte Menge an Kulturmedium ist so eingestellt, dass sich in dem Stromfaden, in dem durch die Stege 13 gebildeten Gerinne 10 zur optimalen Versorgung der expandieren Zellen eine laminare Strömung mit einer Bodensteinzahl von 0,001 bis 0,1 ausbildet und die Bodenströmung dabei nahe bei einer Bodensteinzahl 0 verbleibt. Dies wird maßgeblich durch den Überlaufsteg 33 mit einer Höhe von bis zu 6 mm erreicht, weil die Strömungsgeschwindigkeit (u) in der laminaren Grenzschicht an der Sohle des Gerinnes 10 nahe 0 ist und somit die Bodensteinzahl Bo ca. 0) beträgt (u ist proportional Bo).
In die Stirnwand 4 ist eine Zufuhrkavität 11 für Overlay- Medien eingearbeitet, die über Zuführungen 12 für Overlay- Medien mit Overlay- Räumen 16 verbunden ist, die sich über den Kultivierungsträgern 7 mit den fließenden Kulturmedium befinden. Über den Luer- Lock-Verbinder 20, der mit der Zufuhrkavität 11 für Overlay- Medien verbunden ist, werden die Overlay- Medien im Gegenstrom über das Kultivierungsmedium bis in die Auffang-Kammer 24 für Overlay- Medien geführt und über den Luer- Lock- Verbinder 22 für die Abführung der Overlay- Medien aus dem Bioreaktorgefäß 1 abgeführt.
Der Boden 2 des Bioreaktorgefäßes 1 weist ein Lichtfenster 19 auf, unter dem eine Lichtquelle 20 mit einer Wellenlänge im Fluoreszenzspektrum für Blut von 830 nm mit einer Videokamera 32 angebracht ist, mit dessen Hilfe die Rückvermischung der Overlay- Medien in dem Kulturmedien kontrolliert und gesteuert wird, wobei das Kulturmedium zur Erkennung der Rückvermischung mit Indocyaningrün beschichteten Polystyrol- Partikel versehen ist, deren Farbveränderung die Änderung der Konzentration von Overlay- Medien, insbesondere die Konzentration von O₂ anzeigt. Je niedriger die Konzentration an Overlay-Medien, insbesondere an O₂ in dem Kulturmedium ist, desto größer ist die Fluoreszenshelligkeit.
Anstelle des Luer- Lock- Verbinder 20 kann in der Stirnwand 4 ein Dreiwegekükenhahn 28 und in der Stirnwand 5 kann über dem mittig angeordneten Kultivierungsträger 7 ein mit dem Raum für das Kulturmedium 25 dieses Kultivierungsträgers 7 verbundener Luer- Lock- Verbinder 29 angeordnet sein, wobei der Dreiwegekükenhahn 28 und der Luer- Lock- Verbinder 29 über einen Bypass 26 miteinander verbunden sind und wobei im Bypass 26 eine elektromagnetische Schlauchklemme 27 angeordnet ist.
Damit kann durch Umschalten des Dreiwegekükenhahns 28 und des Luer- Lock-Verbinder 29 ein Teil des Kulturmediums über den Bypass 26 geführt und durch die Verengung des Querschnitts des Bypasses 26 kann auf die expandierenden Zellen in den Kulturmedien ein definierbarer Scherstress ausgeübt werden. Die Aktivierung von Zellen, insbesondere von T- Zellen, ist sowohl eine mechanischer als auch ein biochemischer Prozess. Mit der elektromagnetischen Schlauchklemme 27 wird ein reproduzierbarer definierter Scherstress auf die Zellen, insbesondere T- Zellen, ausgeübt und so wird die Aktivierung mechanisch stimuliert
Das Bioreaktorgefäß 1 ist auf einen Rütteltisch 30 mit einem Impulsgeber 31 angeordnet, wobei am Boden 2 des Bioreaktorgefäßes 1 unter einem poliertem Lichtfenster 19 eine Lichtquelle 18 mit einer Wellenlänge im Fluoreszenzspektrum für Blut von 830 nm, mit einer Kamera 32 befestigt ist.
Die Steuerung der Glukosezufuhr über das Kulturmedium erfolgt in Abhängigkeit der O₂- Konzentration in den Kulturmedien, wobei die Konzentration von O₂ an der Fluoreszenshelligkeit des Fluoreszensmarkers ermittelt und die Glucosezufuhr damit geregelt wird.
Das Kulturmedium, das in 10 parallellaufenden, hydraulisch getrennten, Gerinnen 10 auf dem Kultivierungsträger 7 durch die Gerinne 10 strömt und am Ende der Kultivierungsplatte 7 durch die Überläufe 14 auf die darunterliegende Kultivierungsplatte 7 strömt und dann gegensinnig wieder durch die Gerinne 10 strömt hat eine sehr geringe Strömungsgeschwindigkeit von ca. 1 cm/min und mäandriert somit vertikal. Bezogen auf die gesamte Gerinnefläche ergibt sich eine Reynoldszahl zwischen10<Re<50 <<2320 =Rekrit., was bei der geringen Strömungsgeschwindigkeit zu einer gesichert laminaren Strömung bei einer Bodensteinzahl Bo nahe null führt.
Die Bodensteinzahl Bo ist definiert mit Bo= u × L/Dax, wobei u die Strömungsgeschwindigkeit, L die Länge des Reaktors, hier die Länge der Gerinne 10 und D_ax der Dispersionskoeffizient darstellen. Da die Länge der Gerinne 10 gegeben ist und die Bodensteinzahl Bo=0 für die ideale Rückvermischung steht, hängt der Dispersionskoeffizient und damit die Verteilung der Overlay- Medien, insbesondere die Verteilung von O₂, von der Strömungsgeschwindigkeit des Kulturmediums ab, die dann entsprechend der Overlay- Medien- Verteilung in dem Kulturmedium in den Gerinnen 10 an der Fluorenszenshelligkeit zu erkennen ist und geregelt werden kann.
Die Overlay- Medien strömen über dem Kulturmedium in den auf den Kultivierungsträger angeordneten Gerinne 10 mit einer laminaren Strömung, die durch die Froudsche Zahl nahe 0 gekennzeichnet ist.
Das Kulturmedium im Perfusion- Plattenmäander- Bioreaktor werden über die Kultivierungsträger 7 mit den Gerinnen 10 und Überläufen 14 mäanderförmig von oben nach unten und die Overlay- Medien overflow von unten nach oben gegensinnig zur Strömung des Kulturmediums geführt, wobei die Zellen über die Overlay- Medien mit O₂ während der Expansion normoxämisch oder hyperoxämisch mit einer O₂- Konzentration von 23 - 25 % versorgt werden.
Der Anteil der expandierten Zellen, die mit den Antikörpern CD 8+ und CD 56+ versehen ist, liegt bei Expansion nach diesem Verfahren 70 bis 80 %, wobei der Antikörper CD3+ in geringen Mengen ebenfalls an die Zellen angedockt ist.
Als Lymphozytenwachstumsfaktoren werden Interleukin 12 allein oder als Gemisch aus Interleukin 2 und Interleukin 12 oder als ein Gemisch von IL12, IL15 mit zusätzlich den Antikörper 4-1 BB eingesetzt.
Die Plattenebene der Kultivierungsträger 7 des auf einer Rüttelplatte 30 mit einem Impulsgeber 31 angeordneten Perfusion- Plattenmäander- Bioreaktors liegt horizontal angeordnet und wird mechanisch in Richtung der Schwerkraft in Zeitintervallen, insbesondere 1- bis 3-mal /d geruckt, wobei der eingebrachte Ruck zwischen 2-5 m/s³ beträgt.
Die Plattenebene der Kultivierungsträger 7 kann auch elektromechanisch gerüttelt werden.
Die Zellen in dem Kulturmedium werden während der Expansion einem Scherstress ausgesetzt werden, wobei ein Teil des Kulturmediums durch einen Bypass 26 außerhalb des Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor durch eine mit einer elektromagnetische Schlauchklemme 27 erzeugte Verengung des Bypasses 26 geführt wird.

Claims

Verfahren zur Expansion von Zellen, wie nicht adhärent wachsenden Zellen, invarianten T- Lymphozyten, nicht adhärent wachsende T- Lymphozyten, NK-Zellen, tumorinfiltrierte NK-Zellen (TINK), schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT) oder weitere Immunzellen mit einem hohen Anteil an CD8+ und CD56+ Antikörper und mit einem geringen Anteil an CD3+ Antikörper in einem Perfusion- Plattenmäander- Bioreaktor mit im Gegenstrom zueinander geführten Kulturmedium und Overlay- Medien- Strömen, wobei aus zerkleinerten, aus OP-Gewebeteilen oder aus Biopsien anfallenden, Gewebestücken, Zellen in einem geschlossenen Perfusions-Mäander -Verfahren in einer ersten Stufe auswachsen und nach Erreichen einer bestimmten Dichte an ausgewachsenen und expandierten Zellen von den Gewebeteilen separiert, in geeignetem Kulturmedium supplementiert und in einen, aus mehreren senkrecht übereinanderliegenden und gegenseitig um 180° gedreht angeordneten Kultivierungsträger (7) bestehenden, Perfusion- Plattenmäander- Bioreaktor, verbracht , expandiert, aktiviert und geerntet werden, wobei auf den Kultivierungsträger (7) Gerinne (10), Überläufe (14) und Überlaufstege (33) angeordnet sind und das Kulturmedium aus üblichen Basismedium mit einem Gemisch aus AB- Humanserum , Antikörper, Cytokinen, Lymphozytenwachstumsfaktoren und humanen Feederzellen mit supplementierten Glycol sowie im Bioreaktorgefäß (1) in den Gerinnen (10) auf den Kultivierungsträgern (7) des Bioreaktorgefäßes (1) horizontal und durch die Überläufe (14) in den Kultivierungsträger (7) und über die Überlaufstege (33) mäanderförmig vertikal von Kultivierungsplatte (7) zu Kultivierungsplatte (7) bis zum Abfluss (23) für das Kulturmedium fließt und die Overlay- Medien overflow gegensinnig zur Strömung des Kulturmediums in den Gerinnen (10) zur Gasdiffusion der Overlay- Medien in das Kulturmedium und zur Konstanthaltung der Konzentration der gelösten Overlay- Medien in dem Kulturmedium oberhalb der Oberfläche des Kulturmediums in den Gerinnen (10) geführt werden, dadurch gekennzeichnet, dass • das Kulturmedium mit AB Humanserum in einer Menge von 2% an der Gesamtmenge und mit Membrananteilen aus lysierten humanen, autologen Feederzellen supplementiert wird und • dem Kulturmedium Indikatorkügelchen in einer Größe von 10 -100 µm, die mit Fluoreszensmarker beschichtet sind, beigemischt und durch eine Lichtquelle mit einer Wellenlänge von zwischen 750 nm und 950 nm angestrahlt werden, wobei sich die Fuoreszenshelligkeit des Fluoreszensmarker durch die Änderung der O₂ -Konzentration in den Overlay- Medien verändert
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen über die Overlay- Medien während der Expansion normoxämisch mit O₂ oder hyperoxämisch mit einer O₂- Konzentration von 23 - 25 % versorgt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Indikatorkügelchen aus Polystyrol oder aus Sprühgranulat hergestellte Keramikhohlkugeln bestehen.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die, die aus Sprühgranulat hergestellte Keramikhohlkugeln bestehenden beschichteten Indikatorkügelchen, aus Gemischen aus ZrO₂ und Al2O₃ bestehen.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dass das Kulturmedium, das in parallellaufenden, hydraulisch getrennten, Gerinnen (10) auf dem Kultivierungsträger (7) durch die Gerinne (10) geführt wird und am Ende der Kultivierungsplatte (7) durch die Überläufe (14) auf die darunterliegende Kultivierungsplatte (7) und dann gegensinnig durch die Gerinne (10) strömt, eine Strömungsgeschwindigkeit von 1 cm/min aufweist und vertikal mäandriert, wobei auf die gesamte Gerinne- Fläche bezogen, sich eine Reynoldszahl zwischen 10<Re<50 <<2320 =Re_krit. und eine laminare Strömung bei einer Bodensteinzahl Bo nahe null einstellt.
Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszensmarker aus Indocyaningrün besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium mit den beigemischen Partikeln mit einer Lichtquelle mit einer Wellenlänge im Fluoreszenzspektrum für Blut von 830 nm bestrahlt wird.
Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil der Zellen mit den CD 8+ und CD 56+ Antikörpern 70 bis 80 % beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyphozytenwachstumsfaktoren aus Interleukin 12 allein oder aus einem Gemisch aus Interleukin 2 und Interleukin 12 oder aus einem Gemisch von IL12, IL15 bestehen und alle Gemische zusätzlich den Antikörper 4-1 BB enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass die Membrananteile aus lysierten humanen, autologen Feederzellen 4 - 5 Tagen nach Beginn der Expansion der Zellen dem Kulturmedium zugesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung der Glukosezufuhr über das Kulturmedium in Abhängigkeit der O₂- Konzentration in dem Kulturmedium erfolgt, wobei die Konzentration an O₂ an der Fluoreszenshelligkeit des Fluoreszensmarkers ermittelt und geregelt wird.
Verfahren nach Anspruch1 - 11, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Kulturmedium während der mäanderförmigen Durchströmung durch den Perfusion- Mäander- Platten- Bioreaktor durch einen oder mehrerer Rucke von außen auf den Perfusions- Plattenmäander- Bioreaktor in dem Kulturmedium, das durch die Gerinne (10) der Kultivierungsträger (7) strömen, ruckartige Flüssigkeitsverwirbelungen erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass die Plattenebene der Kultivierungsträger (7) auf einer (nicht dargestellten) Rüttelvorrichtung angeordneten Perfusion- Plattenmäander- Bioreaktor horizontal liegen und mechanisch in Richtung der Schwerkraft in Zeitintervallen gerüttelt wird, wobei der eingebrachte Ruck- Impuls zwischen 2-5 m/s³ beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass der Ruckimpuls in einem Zeitintervall von 1- bis 3-mal /d in das Kulturmedium eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass die Plattenebene der Kultivierungsträger (7) elektromechanisch geruckt wird.
Verfahren nach Anspruch 1-15, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium über einen Luer- Lock- Verbinder (29) und einen Dreiwegekükenhahn (28) über einen Bypass (26) durch eine elektromagnetische Schlauchklemme (27) einem definiertem Scherstress unterzogen wird.