DE102020102143B3

DE102020102143B3 - Verfahren zur Bestimmung, ob eine Behandlung einer Krebserkrankung begonnen oder fortgesetzt werden soll, ein Biomarker, der mindestens einem Markergen entspricht, und eine Verwendung des Biomarkers in dem erfindungsgemäßen Verfahren

Info

Publication number: DE102020102143B3
Application number: DE102020102143.7A
Authority: DE
Inventors: Christian Regenbrecht; Ulrike Pfohl; Jürgen Loskutov
Original assignee: Cellphenomics GmbH
Current assignee: Cellphenomics GmbH
Priority date: 2020-01-29
Filing date: 2020-01-29
Publication date: 2021-03-04
Anticipated expiration: 2040-01-30
Also published as: EP4097259A1; AU2021212310A1; WO2021152117A1; US20240076742A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Behandlung von Krebs, insbesondere die Behandlung mit MEK-Inhibitoren, die in der Onkologie weit verbreitet sind, begonnen oder fortgesetzt werden soll. Das erfindungsgemäße Verfahren offenbart a) Messen mindestens eines Merkmals mindestens eines Biomarkers in mindestens einer biologischen Probe, die Tumorzellen von mindestens einer tumorösen Struktur eines Tumors umfasst; b) Bestimmen eines Verlusts oder einer Mutation von mindestens einem Markergen in der mindestens einen biologischen Probe unter Verwendung des mindestens einen Biomarkers; c) Bestimmen, ob eine Behandlung mit dem mindestens einen Inhibitor zu beginnen oder fortzusetzen ist, wenn die Messung anzeigt, dass die Tumorzellen in der mindestens einen biologischen Probe das mindestens eine Markergen umfassen, dessen Mutationsstatus einen vorhersehbaren Ausgang anzeigt, wobei der mindestens eine Inhibitor eigens im Hinblick auf die Bestimmung des Mutationsstatus des mindestens einen Markergens ausgewählt wird; wobei das mindestens eine Markergen ein Tumorsuppressor ist, welcher mit der Aktivität des Transforming Growth Factor- β / Bone Morphogenetic Protein (TGF-ß/BMP)-Signalwegs in Verbindung steht. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Biomarker, der mindestens ein Markergen, insbesondere das SMAD4-Gen, aufweist, und eine Verwendung des Biomarkers im erfindungsgemäßen Verfahren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Behandlung von Krebs, insbesondere die Behandlung mit MEK-Inhibitoren, die in der Onkologie weit verbreitet sind, begonnen oder fortgesetzt werden soll. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Biomarker, der mindestens einem Markergen, insbesondere dem SMAD4-Gen, entspricht, und eine Verwendung des Biomarkers in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Krebs ist ein Begriff für eine Gruppe von Krankheiten, bei denen sich abnorme Zellen unkontrolliert teilen und in nahegelegene Gewebe eindringen können. Krebszellen können sich auch über das Blut- und Lymphsystem in andere Teile des Körpers ausbreiten. Es gibt mehrere Haupttypen von Krebs. Ein Karzinom ist ein Krebs, der in der Haut oder in Geweben beginnt, die innere Organe auskleiden oder bedecken. Ein Sarkom ist ein Krebs, der in Knochen, Knorpel, Fett, Muskeln, Blutgefäßen oder anderem Binde- oder Stützgewebe beginnt. Leukämie ist eine Krebserkrankung, die in blutbildendem Gewebe, wie z. B. dem Knochenmark, beginnt und dazu führt, dass eine große Anzahl abnormaler Blutzellen produziert wird und ins Blut gelangt. Ein Lymphom und ein Multiples Myelom sind Krebsarten, die in den Zellen des Immunsystems beginnen. Krebserkrankungen des zentralen Nervensystems sind Krebsarten, die in den Geweben des Gehirns und des Rückenmarks beginnen. Zum Beispiel ist Darmkrebs (CRC) die dritthäufigste Krebsart weltweit (WHO 2018). Als kolorektales Karzinom werden im Allgemeinen Krebserkrankungen des Dickdarms, bekannt als Kolonkarzinom, und des Enddarms, bekannt als Rektumkarzinom, bezeichnet. Zusammengefasst werden beide Krebsarten als kolorektales Karzinom bezeichnet. Tumore werden nach ihrer Lokalisation und Morphologie in solide und nichtsolide Tumore eingeteilt. Solide Tumore sind eine abnorme Gewebemasse, die normalerweise keine Zysten oder flüssige Bereiche enthält. Sarkome sind solide Tumore und Karzinome können ebenfalls solide Tumore sein. Solide Tumore können gutartig oder maligne (bösartig) sein.
Krebs ist eine genetische Erkrankung und wird durch Veränderungen an Genen verursacht, die die Funktionsweise der Zellen steuern, insbesondere wie die Zellen wachsen und sich teilen. Genetische Veränderungen, die Krebs verursachen, können vererbt oder über einen Zeitraum von Jahrzehnten erworben werden. Man weiß heute, dass sich mehrere genetische Veränderungen einschließlich Mutationen in Onkogenen, Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen, wie p53, KRAS und KLF6, anhäufen müssen, um eine normale Zelle in eine maligne Tumorzelle zu verwandeln. Insbesondere Mutationen in den Genen, die die Zellteilung, Differenzierung und Gewebehomöostase steuern, führen zu malignen Tumorzellen. Diese malignen Tumorzellen verfügen über ein verstärktes Zellwachstum, auch Proliferation genannt, und die Fähigkeit, in umliegendes Gewebe einzudringen. Diese Eigenschaften definieren in erster Linie den malignen Status eines Tumors. Die Haupttodesursache bei Krebs ist eine metastasierende Erkrankung. Ein metastasierendes kolorektales Karzinom (mCRC) tritt beispielsweise bei 20 % der Patienten auf und entwickelt sich schließlich bei mehr als 30 % der Patienten im Frühstadium. Leider ist das metastasierte kolorektale Karzinom in der Regel refraktär gegenüber den Mitteln der Erstlinientherapie, trotz des signifikanten Anstiegs der medianen Überlebenszeit, z. B. auf mehr als 30 Monate, mit der Entwicklung von zytotoxischen Wirkstoffen, und der Einführung der zielgerichteten Therapie.
Die größte klinische Herausforderung liegt darin, dass sich der Tumor von gutartig über maligne bis hin zu metastasierend als heterogene Einheit entwickelt, mit einer großen intratumoralen Diversität. Diese intratumorale Diversität ist auf eine Vielzahl unterschiedlicher Mutationen zurückzuführen, die sich separat in den Tumorzellen anreichern. In der Regel korreliert die intratumorale Diversität mit dem Tumorgrad.
Nach der Veröffentlichung Schumacher D, Andrieux G, Boehnke K, Keil M, Silvestri A, Silvestrov M, et al. (2019) „Heterogeneous pathway activation and drug response modelled in colorectal-tumorderived 3D cultures“ PLoS Genet 15(3), im Folgenden Schumacher et al. genannt, deckt die intratumorale Heterogenität als zugrundeliegender Mechanismus für das unterschiedliche Ansprechen auf Medikamente zwischen parallelen „Geschwister“-3D-Kulturen auf, die aus einem einzigen kolorektalen Tumor extrahiert wurden. Vier von fünf Geschwisterkulturen zeigten Resistenz gegenüber der Inhibition des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und nur eine Geschwisterkultur war empfindlich gegenüber der Inhibition des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR), der Phos-phoinositid-3-Kinase (P13K)-α und mTORC1/2. Bei der Sequenzierung des Exoms und der RNA wurden 646 unterschiedlich exprimierter Gene identifiziert. Aufgrund des heterogenen Mutationsstatus der Geschwisterkulturen aus demselben Tumor zeigten sich beim Ansprechen auf Medikamente erhebliche Unterschiede von bis zu 1.000-fach in den IC50-Werten für Chemotherapeutika und zielgerichtete Inhibitoren.
Aufgrund dieser Erkenntnisse ist es nicht verwunderlich, dass bereits im ersten Behandlungszyklus einer Chemotherapie oder einer zielgerichteten Therapie eine große Anzahl von Tumoren eine Resistenz gegen die Wirkstoffe der Erstlinientherapie aufweisen oder diese während der Behandlung entwickeln.
Die medikamentöse Behandlung von Krebs kann aus einer Chemotherapie und/oder einer zielgerichteten Therapie bestehen. Bei der zielgerichteten Therapie werden Vorgänge innerhalb der Zelle gezielt beeinflusst. Die beiden zielgerichteten Therapien, die bei der Behandlung von Darmkrebs zum Einsatz kommen, sind die Angiogenese-Hemmung und die Blockierung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), im Folgenden als EFGR bezeichnet. Alle diese Therapien haben erhebliche Nebenwirkungen wie Müdigkeit und Erschöpfung (Fatigue), Übelkeit bis hin zum Erbrechen, Durchfall und Schleimhautentzündungen, Blutbildveränderungen und Fieber. Da die Erstlinientherapie in den letzten zehn Jahren unverändert geblieben ist, müssen alle Darmkrebspatienten diese Nebenwirkungen ertragen, auch wenn der Tumor gegen diese Erstlinientherapeutika resistent ist. Die unerwünschten Nebenwirkungen stellen eine zusätzliche Belastung für den Patienten dar, der an einer schweren und oft tödlichen Krankheit leidet. Es wäre sehr wünschenswert im Voraus zu wissen, ob die Behandlung eines bestimmten Patienten mit der Chemotherapie und/oder der zielgerichteten Therapie seinen Zustand wirklich verbessern oder sogar heilen kann. Weiterhin müssen die Kosten für die Erstlinientherapie vom Gesundheitssystem übernommen werden, gleich ob die Behandlung erfolgreich ist oder nicht.
EP 2 443 252 B1 offenbart ein Verfahren zur Vorhersage der Wahrscheinlichkeit, dass ein Patient, der an KRAS-Wildtyp-Epidermal-Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)-exprimierendem kolorektalen Krebs leidet, auf die Behandlung mit einem Anti-EGFR-Antikörper ansprechen wird, umfassend die Bestimmung des Expressionsniveaus von prognostischen Genen oder Genexpressionsprodukten davon in einer Gewebeprobe als Biomarker.
Zum Beispiel ist ein bestimmtes Medikament oder eine bestimmte Behandlung, die den klinischen Zustand eines ersten Patienten verbessern kann, bei einem zweiten Patienten, der an der gleichen Krebsart leidet, weniger oder gar nicht wirksam. So kann es sein, dass Patienten, die an Darmkrebs erkrankt sind, aufgrund des unterschiedlichen Mutationsmusters ihrer Tumorzellen unterschiedlich auf ein bestimmtes spezifisches Medikament ansprechen. Obwohl die moderne Molekularbiologie und Biochemie Hunderte von Genen entschlüsselt hat, deren Aktivitäten das Verhalten von Tumorzellen, den Zustand ihrer Differenzierung und ihre Empfindlichkeit oder Resistenz gegenüber bestimmten therapeutischen Medikamenten beeinflussen, wird der Status dieser Gene in der Regel noch nicht für klinische Routineentscheidungen über medikamentöse Behandlungen genutzt. Daher besteht ein Bedarf an diagnostischen Tests, Methoden und Werkzeugen, die Biomarker verwenden, die gleichzeitig prädiktive Informationen über das Ansprechen des Patienten auf verschiedene Behandlungsoptionen liefern können.
So wäre es von Vorteil, die Erfolgswahrscheinlichkeit der Behandlung mittels eines diagnostischen Verfahrens vor der Erstlinienbehandlung abschätzen zu können und die Medikation individuell auf jeden Patienten abzustimmen. Dies würde nicht nur die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Behandlung erhöhen, sondern auch die Anzahl der erfolglosen Behandlungen reduzieren und damit dem Patienten eine höhere Lebensqualität garantieren und dem Gesundheitssystem Kosten ersparen. Darüber hinaus kann eine konkretere Kohortenstratifizierung in der Forschung vorgenommen werden, die auch zu einer gezielteren Entwicklung neuer Medikamente führt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Behandlung von Darmkrebs begonnen oder fortgesetzt werden soll, bereitzustellen, das durch einfache Gensequenzierung von Darmtumorzellen unter Verwendung mindestens eines Biomarkers durchgeführt werden kann, um die vorgenannten Nachteile zu überwinden. Der mindestens eine Biomarker ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung wie auch eine Verwendung des mindestens einen Biomarkers in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Behandlung von Krebs zu beginnen oder fortzusetzen ist, die die Bereitstellung von mindestens einem Inhibitor umfasst, wobei das Verfahren umfasst

a) Messen mindestens eines Merkmals mindestens eines Biomarkers in mindestens einer biologischen Probe, die Tumorzellen von mindestens einer tumorösen Struktur eines Tumors umfasst;
b) Bestimmen eines Verlusts oder einer Mutation von mindestens einem Markergen in der mindestens einen biologischen Probe unter Verwendung des mindestens einen Biomarkers;
c) Bestimmen, ob eine Behandlung mit dem mindestens einen Inhibitor zu beginnen oder fortzusetzen ist, wenn die Messung anzeigt, dass die Tumorzellen in der mindestens einen biologischen Probe das mindestens eine Markergen umfassen, dessen Mutationsstatus einen vorhersehbaren Ausgang anzeigt, wobei der mindestens eine Inhibitor eigens im Hinblick auf die Bestimmung des Mutationsstatus des mindestens einen Markergens ausgewählt wird;

Der Begriff Krebs bezieht sich auf eine Behandlung von soliden Tumoren. Zu den soliden Tumoren zählen Sarkome und Karzinome. Bevorzugt ist eine Behandlung von Kopf-, Hals-, Bauchspeicheldrüsen- und/oder kolorektalem Krebs. Besonders bevorzugt ist eine Behandlung von kolorektalem Krebs.
Die beschriebene Behandlung bezieht sich auf eine Medikation von Krebs durch eine zielgerichtete Therapie. Die zielgerichtete Therapie ist eine Art der Behandlung, bei der Medikamente oder andere Substanzen verwendet werden, um bestimmte Arten von Krebszellen zu identifizieren und anzugreifen, ohne dabei normale Zellen zu schädigen. Einige zielgerichtete Therapien blockieren die Wirkung bestimmter Enzyme, Proteine oder anderer Moleküle, die am Wachstum und der Ausbreitung von Krebszellen beteiligt sind. Andere Arten von zielgerichteten Therapien unterstützen das Immunsystem bei der Abtötung von Krebszellen oder geben giftige Substanzen direkt an Krebszellen ab. Zielgerichtete Therapien können weniger Nebenwirkungen haben als andere Arten der Krebsbehandlung. Die meisten zielgerichteten Therapien sind entweder niedermolekulare Medikamente oder monoklonale Antikörper. Die Behandlung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zielt auf den Transforming Growth Factor- β / Bone Morphogenetic Protein (TGF-β/BMP) Signalweg, der auch als TGF-β/BMP-Signalweg bezeichnet wird, ab. Der TGF-ß/BMP-Signalweg beeinflusst das adhäsionsabhängige Wachstumsverhalten von Zellen, was einen Einfluss auf Wundheilungs- und Entzündungsprozesse, Zelldifferenzierung und Zelltod, aber auch auf Zellmotilität und Zelladhäsion hat. Die Übertragung des Signals über den TGF-β-Signalweg erfolgt zwischen der Plasmamembran und dem Zellkern durch Proteine der SMAD-Familie. Es gibt jedoch zahlreiche andere Signalkaskaden, die auch SMADunabhängig sein können, wie z. B. der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) / AKT-Signalweg. Mutationen dieser Signalwege können harmlos sein oder sogar die Fähigkeit einer Tumorzelle erhöhen, ohne natürliche Regulation zu wachsen. Nicht nur die Proliferation wird über diesen Weg reguliert, sondern es wird auch die Zelladhäsion beeinflusst, indem beispielsweise die natürliche Adhäsion der Tumorzelle ausgeschaltet wird, was zur Bildung von Metastasen führt. Das Zusammenspiel dieser Signalwege und verschiedene Mutationen können nicht nur zur Bildung von Tumorzellen führen, sondern auch, wie in Schumacher et al. offengelegt, zu einer vollständigen oder teilweisen Resistenz gegenüber der zielgerichteten Therapie.
Die mindestens eine biologische Probe umfasst Tumorzellen, vorzugsweise Darmkrebs-Tumorzellen, von mindestens einer Tumorstelle eines Darmkrebstumors. Bevorzugt umfasst die mindestens eine biologische Probe Tumorzellen von mindestens zwei Tumorstellen eines Tumors. Somit erhöht die Auswahl von mindestens zwei Tumorstellen eines Tumors die Möglichkeit, eine vollständigere Probe der intratumoralen Diversität von Krebsmutationen zu erhalten. Eine vollständigere Probe der intratumoralen Diversität stellt sicher, dass mindestens ein Biomarker einen zuverlässigeren Hinweis auf die Empfindlichkeit gegenüber einer Krebsbehandlung liefert. Vorzugsweise umfasst die biologische Probe eine Mutation in der kodierenden Sequenz mindestens eines Markergens, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Gen für Mothers Against Decapentaplegic Homolog 4 (SMAD4), dem MEK-Gen und Kombinationen davon.
Das mindestens eine Markergen ist ein Tumorsuppressor. Das mindestens eine Markergen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mothers Against Decapentaplegic Homolog 4 (SMAD4)-Gen, MEK-Gen und Kombinationen davon. Vorzugsweise ist mindestens ein Markergen ein Mothers Against Decapentaplegic Homolog 4 (SMAD4)-Gen. Das Mothers Against Decapentaplegic Homolog 4-Gen, kurz als SMAD4 bezeichnet, befindet sich auf dem Chromosom 18q. Das SMAD4-Gen gehört zu den Top 10 der am häufigsten mutierten Gene bei kolorektalem Karzinom (CRC). Das SMAD4-Protein ist ein essentieller Mediator im TGF-β-Signalweg, der eine zentrale Position in den Signalnetzwerken einnimmt, die Zellwachstum und -differenzierung kontrollieren. Das SMAD4-Protein bildet einen Heterokomplex mit den rezeptor-regulierten SMADs, akkumuliert im Zellkern und wird dann von relevanten SMAD-bindenden Transkriptionsfaktoren an die DNA gebunden. Vorzugsweise weist das mindestens eine Markergen entweder eine Mutation auf oder ist durch eine Mutation verloren gegangen. Ein Mutationsstatus ist das Vorhandensein einer Mutation in dem mindestens einen Markergen. Der Mutationsstatus eines Markergens kann durch Sequenzierung einer Nukleinsäure einer DNA, RNA, cDNA oder eines Proteins, das mit dem mindestens einen Markergen korreliert, identifiziert werden. Es gibt mehrere in der Technik bekannte Sequenzierungsmethoden, um Nukleinsäuren zu sequenzieren. Ein Nukleinsäure-Primer kann so konzipiert sein, dass er an eine Region bindet, die eine potenzielle Mutationsstelle umfasst, oder er kann so konzipiert sein, dass er die mutierte Sequenz anstelle der Wildtyp-Sequenz ergänzt. Primerpaare können so entworfen werden, dass sie eine Region klammern, die eine potenzielle Mutation in einem Markergen umfasst. Ein Primer oder Primerpaar kann zur Sequenzierung eines oder beider DNA-Stränge verwendet werden, die mit dem mindestens einen Markergen korrelieren. Ein Primer kann in Verbindung mit mindestens einem Reagenz, z. B. einer Nukleinsäuresonde oder einer Hybridisierungssonde, verwendet werden, um eine interessierende Region vor der Sequenzierung zu amplifizieren, um die Sequenzmengen zum Nachweis einer Mutation in mindestens einem Markergen zu erhöhen. Beispiele für Regionen, die sequenziert werden können, umfassen ein ganzes Gen, Transkripte des Gens und ein Fragment des Gens oder des Transkripts, wie ein oder mehrere Exons oder nicht-translatierte Regionen. Beispiele für Mutationen, die für die Primerauswahl und die Sequenz- oder Zusammensetzungsanalyse in Blick genommen werden können, finden sich in öffentlichen Datenbanken, die Mutationsinformationen sammeln, wie COSMIC und dbGaP. Einige Mutationen des mindestens einen Markergens, die mit der Empfindlichkeit gegenüber MEK-Inhibition assoziiert sein können, wie z. B. SMAD4, sind in Tabelle 2 in den Beispielen aufgeführt. Besonders bevorzugt ist, dass der Mutationsstatus des mindestens einen Markergens eine Mutation ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Deletionsmutation, Insertionsmutation, Frameshift-Mutante, Nonsense-Mutante, Missense-Mutante und Spleißmutante. Noch bevorzugter ist eine Loss-of-Function-Mutation des mindestens einen Marker-Gens. Insbesondere ist bekannt, dass die Mutation SMAD4^R361H zu einem Verlust der Heterokomplexbildung führt, was eine Anreicherung im Zellkern verhindert. Ein Signalnetzwerk kontrolliert die Aktivität des TGF-ß/SMAD-Signalwegs auf mehreren Ebenen. Die ERK-MAP-Kinase-Phosphorylierung schwächt die nukleäre Akkumulation der SMADs ab. Der MAPK/ERK-Signalweg ist in SMAD4-mutierten Zellen hochreguliert. Dadurch ist mindestens ein Markergen mit der Aktivität des TGF-ß/BMP-Signalwegs verbunden. Weiterhin kann die heterogene Umgebung des mutierten SMAD4-Gens innerhalb desselben Tumors vor diesem Hintergrund ein sehr hohes Maß an Flexibilität in der Reaktion des Tumors auf die Chemotherapie und/oder gezielte Therapie bewirken und zu einer multiresistenten Erkrankung führen. Daher besteht ein dringender Bedarf an therapeutischen Wirkstoffen, die in der Lage sind, spezifisch auf SMAD4-mutierte Tumore zu wirken. Es ist bekannt, dass SMAD4^R361H mit einem differenzierten Ansprechen auf epidermale Wachstumsfaktorrezeptor- (EGFR), MEK- und Phosphoi-nositid-3-Kinase (P13K)-Inhibitoren assoziiert ist. Insbesondere der Funktionsverlust von SMAD4 und damit der Verlust der SMDA5-Signalisierung macht die SMAD4-Mutation von Tumorzellen, vor allem von kolorektalen Tumorzellen, empfindlicher gegenüber MEK-Inhibitoren. Die direkte Assoziation der SMAD4^R361H-Mutation mit der Sensitivität gegenüber den derzeit verwendeten MEK-Inhibitoren in der zielgerichteten Therapie lässt den Schluss zu, dass das SMAD4-Gen als mindestens ein Biomarker geeignet ist, um eine begründete Aussage über die Erfolgsaussichten einer Behandlung mit MEK-Inhibitoren bei Krebserkrankungen, wie z.B. Kopf-, Hals-, Bauchspeicheldrüsen- und/oder Dickdarmkrebs, zu treffen.
Ein mindestens ein Biomarker ist ein charakteristisches biologisches Merkmal, das als Hinweis auf Prozesse und Krankheitszustände im Körper verwendet werden kann. Ein solcher mindestens ein Biomarker kann genetisch, anatomisch und physiologisch oder biochemisch sein. Biomarker müssen objektiv messbare Größen sein. Der mindestens eine Biomarker ist der Mutationsstatus des mindestens einen Markergens. Bevorzugt ist der mindestens eine Biomarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren. Besonders bevorzugt ist, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, mRNA und cDNA oder einem beliebigen Teil dieser, wobei der Teil mit mindestens einer Mutationsstelle des mindestens einen Markergens korreliert. Der mindestens eine Biomarker entspricht bevorzugt mindestens einer Mutationsstelle des Mothers Against Decapentaplegic homolog 4 (SMAD4)-Gens als dem mindestens einen Biomarker.
Ein mindestens ein Merkmal ist der Mutationsstatus des mindestens einen Markergens oder das funktionale und aktive Markergen selbst und wird für den mindestens einen Biomarker verwendet. Das mindestens eine Merkmal wird ausgewählt, um das mindestens eine Markergen und/oder die Mutation des mindestens einen Markergens spezifisch zu identifizieren. Das mindestens eine Merkmal ist also eine Sequenz des mindestens einen Biomarkers. Bevorzugt wird das mindestens eine Merkmal ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Größe, Sequenz, Zusammensetzung und/oder Menge des mindestens einen Biomarkers. Ein mögliches mindestens ein Merkmal für das bevorzugte SMAD4-Gen ist eine Mutation wie Deletion, Insertion, Substitution. Besonders bevorzugt umfasst das mindestens eine Merkmal SMAD4^R361H, identifiziert durch Sequenzierung als SEQ-ID NO: 2 für die Verwendung des mindestens einen Biomarkers.
Die Expression des mindestens einen Biomarkers wird durch die Herstellung von mRNA und/oder cDNA, z. B. eines transkribierten Polynukleotids, aus Zellen in mindestens einer biologischen Probe und durch Hybridisierung der mRNA und/oder cDNA mit einem Referenzpolynukleotid als isolierte Nukleinsäuresonde, z. B. einer Hybridisierungssonde, die ein Komplement einer mindestens einen Biomarker-Nukleinsäure oder eines Fragments davon ist, bestimmt. Die cDNA kann optional mit einer beliebigen, dem Stand der Technik entsprechenden Polymerase-Kettenreaktionsmethode zur Hybridisierung mit dem Referenz-Polynukleotid amplifiziert werden. Die Expression des mindestens einen Biomarkers kann ebenfalls mit Hilfe der quantitativen PCR nachgewiesen werden, um das Ausmaß der Expression des mindestens einen Biomarkers zu bestimmen. Ein Beispiel für die Verwendung der Messung von mRNA-Spiegeln ist, dass eine inaktivierende Mutation in einem mindestens einen Markergen zu einem veränderten Spiegel von mRNA in einer Zelle führen kann. Der Pegel kann aufgrund einer rückkoppelnden Signalproteinproduktion angesichts eines nicht funktionierenden oder fehlenden Proteins hochreguliert oder aufgrund der Instabilität einer veränderten mRNA-Sequenz herunterreguliert sein. Alternativ kann jede der vielen bekannten Methoden zum Nachweis von Mutationen oder Varianten, z. B. Einzelnukleotid-Polymorphismen, Deletionen, Insertionen und Substitutionen eines mindestens einen Biomarkers verwendet werden, um das Auftreten einer Mutation in einem mindestens einen Markergen in mindestens einer biologischen Probe eines Darmkrebstumors nachzuweisen. Der mindestens eine Biomarker wird durch mindestens ein Reagenz identifiziert.
Der mindestens eine Biomarker kann in Kombination mit dem KRAS-Mutationsstatus untersucht werden. Statistische Methoden können bei der Bestimmung des Behandlungsergebnisses nach Messung der Menge des mindestens einen Biomarkers durch Messung von DNA oder RNA helfen. Die Menge des mindestens einen Biomarkers kann zu mehreren Zeitpunkten gemessen werden, z. B. vor der Behandlung, während der Behandlung, nach der Behandlung mit dem mindestens einen Inhibitor, vorzugsweise einem MEK-Inhibitor. Ein Unterschied in der Menge von einem Zeitpunkt zum nächsten oder von der mindestens einen biologischen Probe zur Vergleichsprobe ohne Tumorzellen kann einen Hinweis auf die Prognose des Behandlungsergebnisses geben.
Ein mindestens ein Reagenz bezieht sich auf ein beliebiges Molekül, das in der Lage ist, selektiv an ein spezifisch gekennzeichnetes Zielmolekül, vorzugsweise den mindestens einen Biomarker, zu binden. Das mindestens eine Reagenz kann aus geeigneten biologischen Präparaten gewonnen werden. Zum Zwecke des Nachweises des Zielmoleküls kann das mindestens eine Reagenz spezifisch für die Markierung durch Radioisotope, chemilumineszente Moleküle oder andere Markierungen nach dem Stand der Technik ausgelegt sein. Moleküle, die als mindestens ein Reagenz verwendet werden können, sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus RNA, DNA oder Nukleinsäuresequenzen von RNA und DNA, Primer, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugt ist das mindestens eine Reagenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuresequenz und Primer. Weiter bevorzugt ist, dass das mindestens eine Reagenz mindestens ein Primer ist, der komplementär zu dem mindestens einen Markergen und/oder der mindestens einen Mutationsstelle des mindestens einen Markergens ist. Komplementär ist der allgemeine Begriff der Sequenzkomplementarität zwischen Regionen zweier Nukleinsäurestränge oder zwischen zwei Regionen desselben Nukleinsäurestrangs. Das mindestens eine Reagenz hat eine ausreichende Länge, um selektiv mit dem mindestens einen Markergen oder der mit dem mindestens einen Markergen assoziierten Nukleinsäure zu hybridisieren, bevorzugt kann das mindestens eine Reagenz mit Basensequenzspezifität an die Nukleinsäure des mindestens einen Markergens binden und nach dem Waschen gebunden bleiben. Das mindestens eine Reagenz kann zur Unterstützung der Isolierung und Sequenzierung der Nukleinsäuresequenz des mindestens einen Markergens verwendet werden. Das mindestens eine Reagenz, das auf der Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls des mindestens einen Markergens oder der mindestens einen Mutationsstelle des mindestens einen Markergens basiert, kann zum Nachweis von Transkripten oder genomischen Sequenzen verwendet werden, die dem mindestens einen Biomarker entsprechen. Bevorzugt umfasst das mindestens eine Reagenz eine daran gebundene Markierungsgruppe. Noch mehr bevorzugt ist die Markierungsgruppe des mindestens einen Reagenzes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Radioisotop, fluoreszierender Verbindung, Chemolumineszenzmolekülen, Enzym und Enzym-Cofaktor.
Ein mindestens ein Inhibitor ist ein Hemmstoff, also eine Substanz, die eine oder mehrere Reaktionen, chemische, biologische oder physikalische, so beeinflusst, dass die Reaktionen verlangsamt, gehemmt oder verhindert werden. Bei den gehemmten Reaktionen handelt es sich meist um Enzymreaktionen. Insbesondere ist der mindestens eine Inhibitor bevorzugt ein Signaltransduktionsinhibitor, der in wichtige zelluläre Signaltransduktionswege eingreifen oder diese hemmen kann. Unter Signaltransduktion versteht man in diesem Zusammenhang die biochemische Übertragung von Informationen von der Zellmembran in das Zellinnere oder von einem Zellkompartment in ein anderes. Der mindestens eine Inhibitor wird bei der Behandlung von Krebs, bevorzugt Darmkrebs, in der zielgerichteten Therapie eingesetzt und ist der medikamentöse Wirkstoff zur Beeinflussung der Proliferation der Tumorzellen, um zur Apoptose der Tumorzellen zu führen. Bevorzugt ist als der mindestens eine Inhibitor ein MEK-Inhibitor. MEK-Inhibitoren sind antineoplastische Wirkstoffe, die die Funktion der MAP-Kinasen MEK1 (MAP2K1) und MEK2 (MAP2K2) hemmen. Die Klassifizierung der MEK-Inhibitoren entspricht der der Proteinkinase-Inhibitoren. Da MEK-Inhibitoren bispezifische Proteinkinasen sind, können sie sowohl den Tyrosinkinase-Inhibitoren als auch den Serin/Threonin-Kinase-Inhibitoren zugeordnet werden. Weiterhin greifen MEK-Inhibitoren in den Signalweg ein, indem sie an MEK1 und MEK2 binden und dadurch die Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren verhindern, die von diesem Schritt abhängig sind. Dies führt zum Abbruch der Transkription und zur Hemmung der Proliferation von Tumorzellen. MEK-Inhibitoren können insbesondere zur Therapie des malignen Melanoms, aber auch bei anderen Tumoren mit BRAF-Mutationen eingesetzt werden. MEK-Inhibitoren sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Binimetinib, Cobimetinib, Selumetinib und Trametinib. N-(3-{3-Cyclopropyl-5-[(2-fluor-4-iodphenyl)amino]-6,8-dimethyl-2,4,7-trioxo-3,4,6,7-tetrahydropyrido[4,3-d]pyrimidin-1(2H)-yl}phenyl)acetamid ist der IUPAC-Name von Trametinib. Weiter bevorzugt ist, dass der MEK-Inhibitor N-(3-{3-Cyclopropyl-5-[(2-fluor-4-iodphenyl)amino]-6,8-dimethyl-2,4,7-trioxo-3,4,6,7-tetrahydropyrido[4,3-d]pyrimidin-1(2H)-yl}phenyl)acetamid ist.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass eine Loss-of-Function-Mutation des SMAD4-Gens die Empfindlichkeit gegenüber der MEK-Inhibitor-Therapie erhöht. Wie in den nachfolgenden Abbildungen, insbesondere in 3, dargestellt, nimmt die Zellviabilität von Darmkrebszellen während einer Behandlung mit einem MEK-Inhibitor, bevorzugt Trametinib, ab, wenn das SMAD4-Gen inaktiv ist, wie durch eine Loss-of-Function-Mutation wie die SMAD4^R361H-Mutation SEQ-ID NO: 2. Dies basiert auf der Interaktion des epidermalen Growth-Factor-Rezeptor- (EGFR) Signalwegs und des Transforming Growth Factor- β / Bone Morphoge-netic Protein (TGF-β/BMP) Signalwegs. Wie nachfolgend in gezeigt, steuern beide Signalwege, der EGFR-Signalweg und der TGF-ß/BMP-Signalweg, die Zellproliferation. Wenn beide Signalwege aktiv sind und die Aktivität des Zellwachstums durch eine Mutation erhöht wird, wirkt eine Behandlung mit MEK-Inhibitoren nur auf den EGFR-Signalweg. Daher kann die unkontrolliert gesteigerte Proliferation weiterhin über den TGF-β/BMP-Signalweg erfolgen.
Dann kann die MEK-Inhibitor-Therapie nur zu einem verlangsamten Tumorwachstum führen, was aber nicht zwangsläufig bedeutet, dass der Tumor vollständig zu wachsen aufhört oder abstirbt. Wenn der TGF-β/BMP-Signalweg z. B. durch eine Loss-of-Function-Mutation, bevorzugt durch eine SMAD4^R361H-Mutation SEQ-ID NO: 2, ausgeschaltet ist und eine MEK-Inhibitor-Therapie auf die Proliferation über den EGFR-Signalweg abzielt, ist die Sensitivität gegenüber dem MEK-Inhibitor wesentlich höher. Weiterhin führt die intratumorale Diversität zu unterschiedlichen Mutationsmustern bei ein und demselben Patienten und an ein und derselben Tumorstelle. Daher kann derselbe Tumor Tumorzellen mit mindestens einer Mutationsstelle in dem mindestens einen Markergen, bevorzugt dem SMAD4-Gen, und ein voll funktionsfähiges mindestens eine Markergen aufweisen. Je nach Art der Mutation wirkt eine MEK-Inhibitor-Therapie unterschiedlich auf die unterschiedlich mutierten Tumorzellen. Einerseits reagieren Tumorzellen mit einem inaktiven SMAD4-Gen empfindlicher auf die Therapie und werden ausgelöscht, andererseits können Tumorzellen mit einem voll aktiven SMAD4-Gen zwar das Zellwachstum verlangsamen, sind aber resistent gegen die MEK-Inhibitor-Therapie. Aufgrund dieser Tatsache kann ein Tumor, z. B. ein Darmkrebstumor, der zunächst gut auf die MEK-Inhibitor-Therapie anspricht, resistent gegen die MEK-Inhibitor-Therapie werden. Zu diesem Zweck kann das erfindungsgemäße Verfahren ein sinnvolles Werkzeug zur Beurteilung der Wahrscheinlichkeit eines positiven Ausgangs der MEK-Inhibitor-Therapie bieten. Darüber hinaus können basierend auf dem Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens auch neue Therapien implementiert werden, die auf die Interaktion des EGFR-Signalwegs und des TGF-ß/BMP-Signalwegs abzielen. Dies muss jedoch vorerst das Ziel weiterer Forschung bleiben.
Der Behandlungserfolg kann durch Messung der Konzentration des mindestens einen Biomarkers bestimmt werden, entweder wenn das mindestens eine Markergen noch aktiv ist, verloren gegangen ist oder eine Mutation aufweist. Im Folgenden werden die drei verschiedenen möglichen alternativen Ausführungsformen des beanspruchten Verfahrens offenbart.
Eine erste Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Reagenz an das noch aktive mindestens eine Markergen des mindestens einen Biomarkers bindet. Einerseits bindet das mindestens eine Reagenz an das mindestens eine Merkmal des mindestens einen Biomarkers, wodurch die Wahrscheinlichkeit eines positiven Behandlungsergebnisses verringert wird. Auf der anderen Seite, wenn das mindestens eine Reagenz nicht an das mindestens eine Markergen des mindestens einen Biomarkers bindet, ist die Wahrscheinlichkeit eines positiven Behandlungsergebnisses höher, da das mindestens eine Markergen nicht die Sequenz hat, um eine normale Aktivität zu gewährleisten.
Eine zweite Ausführungsform der Erfindung ist gekennzeichnet durch das mindestens eine Reagenz, das zu mindestens einer Mutationsstelle des mindestens einen Biomarkers komplementär ist, wobei die Schlussfolgerung für die Wahrscheinlichkeit des positiven Ausgangs der Behandlung von der Mutation abhängig ist. Entspricht die Mutation einer Loss-of-function-Mutation, wie z. B. der SMAD4^R361H-Mutation, steigt die Sensitivität gegenüber dem mindestens einen MEK-Inhibitor und die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Behandlung des kolorektalen Karzinoms mit dem MEK-Inhibitor ist sehr hoch.
Eine dritte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch definiert, dass für das erfindungsgemäße Verfahren mindestens zwei Reagenzien verwendet werden. Eines der mindestens zwei Reagenzien ist komplementär zu dem noch aktiven mindestens einen Markergen des mindestens einen Biomarkers. Das andere der mindestens zwei Reagenzien ist komplementär zu mindestens einer Mutationsstelle des mindestens einen Biomarkers, vorzugsweise zu einer Loss-of-function-Mutation, wie der SMAD4^R361H-Mutation. Die mindestens zwei Reagenzien haben unterschiedliche Markierungsgruppen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Radioisotop, fluoreszierender Verbindung, chemilumineszenten Molekülen, Enzym oder Enzym-Cofaktor. Aufgrund der unterschiedlichen Markierungsgruppen der mindestens zwei Reagenzien kann gezeigt werden, dass

a) nur eines der mindestens zwei Reagenzien an das mindestens eine Merkmal des mindestens einen Biomarkers bindet; oder
b) beide der mindestens zwei Reagenzien an das mindestens eine Merkmal des mindestens einen Biomarkers binden; oder
c) keines der mindestens zwei Reagenzien bindet an das mindestens eine Merkmal des mindestens einen Biomarkers.

Im Fall a) ist das Behandlungsergebnis der Krebserkrankung davon abhängig, welches der mindestens zwei Reagenzien an das mindestens eine Merkmal des mindestens einen Biomarkers bindet. Die Schlussfolgerung entspricht der ersten und zweiten Anwendung wie oben beschrieben. Wenn b) eintritt, kann keine Aussage über die Wahrscheinlichkeit einer Krebsbehandlung getroffen werden. Es könnte jedoch eine Therapie begonnen und überwacht werden, um zu sehen, wie stark sich die intratumorale Diversität während der Therapie verändert, um eine Aussage über die Fortführung der Therapie treffen zu können. Im Falle c) ist das mindestens eine Markergen des mindestens einen Biomarkers entweder verloren oder weist eine andere mindestens eine Mutationsstelle des mindestens einen Biomarkers auf. In diesem Fall sollte das erfindungsgemäße Verfahren mit einem anderen mindestens einen Reagenz wiederholt werden, um eine gesicherte Entscheidung über den Beginn oder die Fortführung der Therapie treffen zu können.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die Identifikation einer einfachen Genmutation vor und während der Anwendung der MEK-Inhibitor-Therapie ein günstiges Ergebnis vorhersagen kann. Wenn das erfindungsgemäße Verfahren ein negatives Ergebnis über den Ausgang der MEK-Inhibitor-Therapie liefert, kann die Therapie individuell an den jeweiligen Patienten angepasst werden, ohne den Patienten einer nicht wirksamen Therapie und den unerwünschten Nebenwirkungen auszusetzen. Darüber hinaus ist die Gensequenzierung des mindestens einen Biomarkers innerhalb weniger Tage möglich und kann bereits zu geringen Kosten durchgeführt werden. Somit kann nicht nur Zeit gespart, insbesondere die Lebenszeit des Patienten verbessert werden, sondern auch die Kosten einer unwirksamen MEK-Inhibitor-Therapie für das Gesundheitssystem eingespart werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Biomarker, um mindestens ein Merkmal des mindestens einen Markergens in einer biologischen Probe zu bestimmen, wobei der mindestens eine Biomarker mindestens einem Markergen entspricht, welches ein Tumorsuppressor ist, der mit der Aktivität des Transforming Growth Factor- β / Bone Morphogenetic Protein (TGF-ß/BMP)-Signalwegs in Verbindung steht. Der erfindungsgemäße Biomarker wurde vorstehend explizit beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung mindestens einen Biomarkers in einem Verfahren zum Bestimmen, ob eine Behandlung einer Krebserkrankung mit mindestens einem Inhibitor, wie oben beschrieben, begonnen oder fortgesetzt werden soll. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Verwendung des mindestens einen Markergens und des Mutationsstatus des mindestens einen Markergens wie oben beschrieben als mindestens einen Biomarker.
Im Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die 1 bis 3 näher beschrieben:

1: eine Bulk-Sequenzierung einer Tumorstelle, welche die intratumorale Diversität nicht darstellt, während mindestens zwei biologische Proben derselben Tumorstelle zwei unterschiedliche Sequenzen desselben mindestens einen Markergens, hier des SMAD4-Gens, aufweisen können.
2: unterschiedliche Wirkmechanismen des SMAD4^wt-Gens und des mutierten SMAD4^R361H-Proteins im TGF-β/BMP-Signalweg sind im Vergleich zum EGFR-Signalweg dargestellt. Das „wt“ in SMAD4^wt wird als „Wildtyp“ verwendet, um einen nicht-mutierten Status des SMAD4-Gens anzuzeigen.
3: experimentelle Ergebnisse der Lebensfähigkeit von Darmkrebs-Tumorzellen mit der SMAD4^wt oder der SMAD4^R361H-Mutation bei Behandlung mit steigender Konzentration von Trametinib, einem MEK-Inhibitor.

1 zeigt schematisch die intratumorale Diversität einer Tumorstelle durch Sequenzierung des SMAD4-Gens. Die Entnahme von mehreren biologischen Proben, bevorzugt Einzelzellproben, erhöht die Wahrscheinlichkeit, die intratumorale Diversität des Tumors zu erkennen und gezielt analysieren zu können. Die Massensequenzierung des SMAD4-Gens einer biologischen Probe zeigt die SMAD4^R361H-Mutation nicht, während die Einzelzellproben die SMAD4^R361H-Mutation deutlich zeigen. Eine differenzierte Einschätzung der Wahrscheinlichkeit eines positiven Ausgangs einer zielgerichteten Therapie, insbesondere einer MEK-Inhibitor-Therapie, ist daher nur möglich, wenn die intratumorale Diversität berücksichtigt wird.
2 zeigt den TGF-β/BMP-Signalweg und den EGFR-Signalweg, die beide die Zellproliferation regulieren. Wenn also beide Signalwege funktionieren, wird eine gezielte Therapie, die nur einen der beiden Signalwege beeinflusst, nicht zur Apoptose der Tumorzellen führen. Mit dem Wissen, welcher Signalweg noch aktiv ist oder ob beide aktiv sind, kann die gezielte Therapie angepasst werden. Allerdings ist der Mutationsstatus der Tumorzellen patientenindividuell, was eine sehr genaue Diagnose erfordert, bevor eine individuelle Anpassung der zielgerichteten Therapie erfolgen kann.
3 zeigt, dass die Lebensfähigkeit der Tumorzellen mit funktionellem SMAD4^wt-Gen durch eine steigende Konzentrationen von Trametinib stetig über der mittleren Hemmkonzentration (IC₅₀) liegt, was zeigt, dass die Proliferation der Tumorzellen mit funktionellem SMAD4-Gen nicht vollständigauf eine MEK-Inhibitortherapie anspricht. Die mittlere Hemmkonzentration, im Folgenden als IC₅₀ bezeichnet, ist die Konzentration eines Inhibitors, bei der eine halbmaximale Hemmung beobachtet wird. Bei der Loss-of-Function SMAD4^R361H-Mutation sinkt die Lebensfähigkeit der Tumorzellen bereits bei einer Trametinib-Konzentration von 0,006 µg/ml unter den IC₅₀, was zeigt, dass die Empfindlichkeit gegenüber einer MEK-Inhibitor-Therapie, insbesondere Trametinib, mit dem Verlust der Funktion des SMAD4-Markergens zunimmt. Für das Experiment wurden die biologischen Tumorproben durch Inkubation mit TrypLE Express Lösung (ThermoFisher Scientific, Deutschland) dissoziiert und 1,5x103 Zellen pro Well in vier Replikaten in Matri-Gel ausgebracht und mit Kulturmedium überzogen. Nach 3-tägiger Inkubation bei 37 °C in 5 % CO₂ wurde das Medium entfernt und frisches Medium mit Trametinib zugegeben. Trametinib wurde in vier 1:5-Verdünnungskonzentrationen getestet. Folgende Konzentrationen wurden getestet: 0,1 µg/ml, 0,02 µg/ml, 0,004 µg/ml und 0,0008 µg/ml. Zellen, die mit DMSO behandelt wurden, wurden als Kontrolle verwendet, während nur Matrigel für die Hintergrundauslesung verwendet wurde. Staurosporin wurde als interne Positivkontrolle verwendet. Nach 4-tägiger Behandlung wurde die Durchlässigkeit der Zellen mit dem CellTiterGIo^®-Assay bestimmt. Zellausstriche, Behandlung und Tests wurden mit dem Biomek FXP Liquid Handler (Beckman Coulter) durchgeführt.
Soweit der Begriff „Gewichtsprozent“ oder „Gew.-%“ in Bezug auf die in dem beanspruchten Verfahren enthaltenen Komponenten verwendet wird, bezieht sich der Begriff „Gew.-%“ in der gesamten vorliegenden Erfindung auf die Menge einer oder mehrerer Komponenten im Verhältnis zur Gesamtmenge der Zusammensetzung, sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist. Der Ausdruck „wt-%“ wird in der gesamten vorliegenden Erfindung als Abkürzung für Gewichtsprozent verwendet, wenn nicht anders angegeben.
Die Begriffe „etwa“ und „ungefähr“ im Zusammenhang mit Zahlenwerten oder -bereichen sind im Rahmen der Erfindung als ein Toleranzbereich zu verstehen, den ein Fachmann aufgrund seiner allgemeinen Kenntnisse und im Hinblick auf die gesamte Erfindung als üblich bzw. sinnvoll erachten würde. Insbesondere beziehen sich die Ausdrücke „etwa“ und „ungefähr“ auf einen Toleranzbereich von ±20 %, bevorzugt ±10 % und weiter bevorzugt ±5 % in Bezug auf den bezeichneten Wert. Die unteren Endwerte und die oberen Endwerte der verschiedenen in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Bereiche, insbesondere der Gewichtsprozentbereiche, aber nicht darauf beschränkt, können miteinander kombiniert werden, um neue Bereiche zu definieren.
Ferner sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Verweise auf Standards, Normen oder Standardisierungsprotokolle, z. B. ISO, ASTM usw., im Zusammenhang mit Eigenschaften, Zahlenwerten oder Bereichen, auf die Bezug genommen wird, so zu verstehen, dass die neueste aktualisierte Version des besagten Standards, der besagten Norm oder des besagten Standardisierungsprotokolls zum Zeitpunkt der Erfindung in Kraft ist.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand eines nicht beschränkenden Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Biomarkers, der Verwendung des Biomarkers im erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung, ob eine Behandlung des kolorektalen Karzinoms begonnen oder fortgesetzt werden soll, und der Verwendung des mindestens einen Markergens und des Mutationsstatus des mindestens einen Markergens als mindestens ein Biomarker näher beschrieben.
Nukleinsäure-Präparation
Genomische DNA aus der biologischen Probe BE1 und der Vergleichsprobe C1 wurde mit dem QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) gemäß den Herstellerprotokollen präpariert. Die Gesamt-DNA wurde in 30 µl DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser (Thermo Fisher Scientific) eluiert. Die isolierte DNA wurde mit einem NanoDrop^® ND-1000 Spektralphotometer (NanoDrop Technologies) quantifiziert und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
Die Kombinationen von Primern, die für die Diagnose verwendet werden können, sind Vorwärts- und Rückwärtsprimer des Gens SMAD4. Da die Gene SMAD4R361H, in SEQ-ID NO: 2 dargestellt, in einer zusammenhängenden Sequenz liegen, wird erwartet, dass der Vorwärtsprimer SMAD4 fw2, in SEQ-ID NO: 3 dargestellt, und der Rückwärtsprimer SMAD4 rev2, in SEQ-ID NO: 4 dargestellt, ein Produkt amplifizieren können.
PCR
Die PCR-Reaktionsmischung (25 µl) enthielt 100ng isolierte DNA, 1x Phusion GC-Puffer (ThermoFisher Scientific, Deutschland), 3 % DMSO, 200 µM dNTPs, etwa 0,5 µM jedes Primer und etwa 0,02 U/µl Phusion DNA-Polymerase (ThermoFisher Scientific, Deutschland). Die Amplifikation beginnt mit einer initialen Denaturierung bei 95 0C für 5 min. Das Amplifikationsprotokoll besteht aus einer Denaturierung bei 95 0C für 30 Sekunden, einem Primer-Annealing bei 58 0C für 30 Sekunden und einer Extension bei 72 0C für 30 Sekunden. Die Schritte des Amplifikationsprotokolls werden 34 Mal in einem automatischen DNA-Thermocycler (Biometra TRIO Thermal Cycler Series, Analytik Jena AG, Deutschland) wiederholt. Die finale Extension wird bei 72 0C für 5 min durchgeführt. Die PCR-Produkte werden auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten 2 %igen Agarosegel aufgelöst. Die PCR-Produkte werden unter dem UV-Transiluminator visualisiert und haben eine erwartete Länge von 688 bp. Molekulare Größenmarker (GeneRulerTM100bp DNA Ladder, ThermoFisher Scientific, Deutschland) werden parallel dazu eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden mit SMAD4 fw2 SEQ-ID NO: 3 und SMAD4 rev2 Primer SEQ-ID NO: 4 sequenziert (LGCgenomics, Berlin, Deutschland). Die Sequenzierergebnisse wurden mit CLC genomic workbench (Qiagen Bioinformatics) analysiert.
Beispiel 1
Erfindungsgemäß wurden folgende Schritte durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine Behandlung des kolorektalen Karzinoms, die die Bereitstellung mindestens eines Inhibitors, vorzugsweise eines MEK-Inhibitors, umfasst, begonnen werden soll:

a) Information über die biologische Probe BE1 und die Vergleichsprobe C1 Die biologische Probe BE1 und die Vergleichsprobe C1 wurden aus dem Kolonkarzinom einer kaukasischen Frau gewonnen. Zum Zeitpunkt der Operation war die Patientin 47 Jahre alt. Der chemo-naive Tumor wurde als pT3, pN0 (0/22), M1(HEP), L0, V0, R0 eingestuft und inszeniert.

Histopathologie:	G2 UICC IV
Molekulare Pathologie:	K-ras mutiert
Lokalisation:	Colon sigmoideum (60 cm ab ano)
Tumormarker:	EA 1,0 ng/ml, CA-19-9 13,5 U/ml
Keine Familienanamnese kein HNPCC

b) Sequenzierung der Tumorzellen und Verwendung des SMAD4-Gens als mindestens einen Biomarker Die Sequenzierung der BE1 und einer Vergleichsprobe C1 wurde nach den zuvor genannten Methoden der Nukleinsäurepräparation und PCR unter Verwendung der Primer P1 und P2 durchgeführt, um festzustellen, ob die biologische Probe BE1 und C1 eine Mutation des Markergens SMAD4 aufweisen oder nicht.

^R361H

c) Empfehlung, ob eine Behandlung begonnen werden soll Die Probe BE1 wies eine SMAD4R361H-Mutation auf, bei der es sich um eine Loss-of-Function-Mutation des SMAD4-Gens handelt. Daher kann eine MEK-Inhibitor-Therapie, insbesondere mit Trametinib, erfolgreich sein. Die MEK-Inhibitor-Therapie sollte eingeleitet und der Verlauf der MEK-Inhibitor-Therapie in regelmäßigen Zeitschritten überwacht werden.

Claims

Verfahren zum Bestimmen, ob eine Behandlung von Krebs, die die Bereitstellung von mindestens einem Inhibitor umfasst, begonnen oder fortgesetzt werden soll, wobei das Verfahren umfasst: a) Messen mindestens eines Merkmals mindestens eines Biomarkers in mindestens einer biologischen Probe, die Tumorzellen von mindestens einer tumorösen Struktur eines Tumors umfasst; b) Bestimmen eines Verlusts oder einer Mutation von mindestens einem Markergen in der mindestens einen biologischen Probe unter Verwendung des mindestens einen Biomarkers; c) Bestimmen, ob eine Behandlung mit dem mindestens einen Inhibitor zu beginnen oder fortzusetzen ist, wenn die Messung anzeigt, dass die Tumorzellen in der mindestens einen biologischen Probe das mindestens eine Markergen umfassen, dessen Mutationsstatus einen vorhersehbaren Ausgang anzeigt, wobei der mindestens eine Inhibitor eigens im Hinblick auf die Bestimmung des Mutationsstatus des mindestens einen Markergens ausgewählt wird; wobei das mindestens eine Markergen ein Tumorsuppressor ist, der mit der Aktivität des Transforming Growth Factor- β / Bone Morphogenetic Protein (TGF-ß/BMP)-Signalwegs in Verbindung steht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das mindestens eine Merkmal ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Größe, Sequenz, Zusammensetzung und/oder Menge des mindestens einen Biomarkers.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der mindestens eine Biomarker ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Nukleinsäure.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, mRNA und cDNA oder einem beliebigen Teil dieser, wobei der Teil mit mindestens einer Mutationsstelle des mindestens einen Markergens korreliert.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der mindestens eine Inhibitor ein MEK-Inhibitor ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der MEK-Inhibitor N-(3-{3-Cyclopropyl-5-[(2-fluor-4-iodphenyl)amino]-6,8-dimethyl-2,4,7-trioxo-3,4,6,7-tetrahydropyrido[4,3-d]pyrimidin-1(2H)-yl}phenyl)acetamid ist.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine biologische Probe Tumorzellen von mindestens zwei tumorösen Struktur eines Tumors umfasst.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Mutationsstatus des mindestens einen Markergens eine Mutation ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Deletionsmutation, Insertionsmutation, Frameshift-Mutante, Nonsense-Mutante, Missense-Mutante und Spleißmutante.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine Markergen ein Mothers Against Decapentaplegic Homolog 4 (SMAD4)-Gen ist.
Biomarker zur Messung mindestens eines Merkmals des mindestens einen Markergens in einer biologischen Probe, wobei der mindestens eine Biomarker mindestens einem Markergen entspricht, welches ein Tumorsuppressor ist, der mit der Aktivität des Transforming Growth Factor- β / Bone Morphogenetic Protein (TGF-ß/BMP)-Signalwegs zusammenhängt.
Biomarker gemäß Anspruch 10, wobei die biologische Probe Tumorzellen von mindestens einer tumorösen Struktur umfasst.
Biomarker gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine Merkmal ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Größe, Sequenz, Zusammensetzung und/oder Menge.
Biomarker gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der mindestens eine Biomarker aus einer Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Nukleinsäure , die mit dem mindestens einen Markergen assoziiert ist.
Biomarker gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem mindestens einen Markergen um ein Mothers Against Decapentaplegic Homolog 4 (SMAD4)-Gen handelt.
Verwendung mindestens eines Biomarkers gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14 in einem Verfahren zum Bestimmen, ob eine Behandlung von Krebs mit mindestens einem Inhibitor begonnen oder fortgesetzt werden soll, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
Verwendung des mindestens einen Markergens und des Mutationsstatus des mindestens einen Markergens gemäß einem der Ansprüche 8 bis 9 als mindestens ein Biomarker.