DE102013007295B4

DE102013007295B4 - Elektrophysiologische Messanordnung und elektrophysiologisches Messverfahren

Info

Publication number: DE102013007295B4
Application number: DE102013007295.6A
Authority: DE
Inventors: Oliver Klink; Philipp Julian Köster; Carsten Tautorat; Uwe Scheffler
Original assignee: Universitaet Rostock
Current assignee: Universitaet Rostock
Priority date: 2013-04-26
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2015-06-25
Anticipated expiration: 2033-04-27
Also published as: JP2016517012A; DE102013007295A1; WO2014173488A1; EP2989456A1; US20160103116A1

Abstract

Elektrophysiologische Messanordnung (100), mit einem Träger (12), welcher zumindest in seinem Inneren (12i) aus einem Trägermaterial (12') mit einer gegebenen Zusammensetzung besteht, und mit einem Aperturbereich (10) im Bereich des Trägers (12) zum gesteuerten abdichtenden Anlagern eines biologischen Objekts (O), wobei der Aperturbereich (10) mit mindestens einer Apertur (14) sowie mit einem Wandbereich (11) ausgebildet ist, welcher als Aperturinnenwand (11i) die Apertur (14) bildend umgibt, wobei zumindest der Wandbereich (11) mit einem Bereich (20) aus einem Material (12'') ausgebildet ist, welches dem Material des Trägers (12) außerhalb des Aperturbereichs (10) oder dem Material im Inneren (12i) des Trägers (12) zumindest in seiner Zusammensetzung im Mittel im Wesentlichen entspricht, gegenüber diesem jedoch hinsichtlich mindestens einer materiellen Spezies oder Ionenspezies eine erhöhte Konzentration aufweist, so dass durch diese erhöhte Konzentration an oder in zumindest der Aperturinnenwand (11i) der Apertur (14) das abdichtende Anlagern eines biologischen Objekts (O) am Aperturbereich (10) förderbar ist, und wobei die Konzentration der mindestens einen materiellen Spezies oder Ionenspezies bis zu einer vorgegebenen Tiefe 10 nm von der Oberfläche des Trägers (12) von der Aperturinnenwand (11i) her modifiziert ist und wobei die mindestens eine materielle Spezies oder Ionenspezies Protonen (H+) aufweist.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine elektrophysiologische Messanordnung sowie ein elektrophysiologisches Messverfahren, insbesondere unter Verwendung der erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messanordnung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es sind verschiedene Verfahren und Einrichtungen bekannt, die im Bereich der Elektrophysiologie eingesetzt werden, um biologische Objekte – insbesondere also Zellen im weitesten Sinne, Zellorganellen, Oozyten und deren Fragmente – im Hinblick auf in jeweilige Membranen integrierte und/oder dort angelagerte Proteine und deren Transporteigenschaften hin zu untersuchen, wobei auch Vesikel, Liposomen oder andere mehr oder weniger künstliche Systeme zum Einsatz kommen können.
Dabei werden häufig zwischen einer Messelektrode und einer Gegenelektrode, welche zwischen dem biologischen Objekt angeordnet werden, elektrische Ströme und/oder elektrische Spannungen aufgeprägt und/oder gemessen. Die gemessenen Ströme und/oder Spannungen sollen Aufschluss geben über die zu Grunde liegenden physiologischen Prozesse, insbesondere Transportprozesse, Konformationsänderungen und dergleichen.
Häufig liegen dabei vergleichsweise sehr geringe Signalstärken vor. Zum Erzielen eines geeigneten Signal-zu-Rausch-Verhältnisses sind daher hohe Abdichtwiderstände, das heißt also möglichst geringe elektrische Restleitfähigkeiten, über die Membran selbst oder im Berührungs- oder Kontaktbereich zwischen der Membran des zu untersuchenden biologischen Objekts und der Aperturwand nötig.
Bei bekannten elektrophysiologischen Messverfahren und Messanordnungen lassen sich der Abdichtwiderstand oder die elektrische Restleitfähigkeit zwischen Zellinnerem und Zelläußerem – oder allgemeiner zwischen Membraninnenseite und Membranaußenseite – des zu vermessenden biologischen Objekts bisher nicht in ausreichendem Maße steuern.
Dies führt dazu, dass die Abdichtwiderstände ganz allgemein häufig zu gering sind, so dass sich ungünstige Signal-zu-Rausch-Verhältnisse einstellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine elektrophysiologische Messanordnung sowie ein elektrophysiologisches Messverfahren zu schaffen, bei welchen es möglich ist, das Anlagern eines zu vermessenden biologischen Objekts sowie das Ausbilden und die Qualität eines Abdichtwiderstands bei der Anlagerung zwischen dem zu vermessenden biologischen Objekt und dem Messsystem möglichst zuverlässig zu fördern, insbesondere zur Erreichung eines Gigaseals, also einer Anlagerung mit einem Abdichtwiderstand im Gigaohmbereich.
Die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe wird bei einer elektrophysiologischen Messanordnung erfindungsgemäß mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 gelöst. Des Weiteren wird die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe bei einem elektrophysiologischen Messverfahren erfindungsgemäß mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 10 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.
Einerseits schafft die vorliegende Erfindung eine elektrophysiologische Messanordnung mit einem Träger, welcher zumindest in seinem Inneren mit oder aus einem Trägermaterial mit einer bestimmten Zusammensetzung – z. B. bestimmten Konzentrationen an materiellen oder Ionenspezies – und mit einem Aperturbereich im Bereich des Trägers – also mit einem Bereich, der mindestens eine Apertur oder Messapertur aufweist oder bildet – zum gesteuerten abdichtenden oder sealenden Anlagern eines biologischen Objekts, z. B. einer Zelle, einer Zellorganelle, eines Vesikels, eines Liposoms, einer natürlichen oder künstlichen Membran, z. B. einer Lipiddoppelschicht, oder dergleichen oder eines Fragments davon. Der Aperturbereich ist mit mindestens einer Apertur ausgebildet sowie mit einem Wandbereich, welcher als Aperturinnenwand die Apertur bildet und diese umgibt. Zumindest der Wandbereich ist mit einem Bereich aus einem Material ausgebildet, welches dem Material des Trägers außerhalb des Aperturbereichs, insbesondere im Mittel des Trägers oder im Inneren des Trägers, zumindest in seiner Zusammensetzung im Wesentlichen entspricht, gegenüber diesem jedoch hinsichtlich mindestens einer Materialspezies, insbesondere Ionenspezies eine modifizierte, insbesondere erhöhte Konzentration aufweist. Durch diese modifizierte, insbesondere lokal erhöhte Konzentration der Material- oder Ionenspezies an oder in zumindest der Aperturinnenwand der Apertur ist das abdichtende Anlagern eines biologischen Objekts am Aperturbereich förderbar. Dabei ist die Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies bis zu einer vorgegebenen von der Oberseite oder Oberfläche des Trägers und insbesondere von der Aperturinnenwand her oder aus modifiziert, insbesondere bis zu einer Tiefe von etwa 10 nm.
Es ist somit eine Kernidee der vorliegenden Erfindung, bei einer elektrophysiologischen Messanordnung mit einem Aperturbereich, welcher zum abdichtenden oder sealenden Anlagern, also zum Anlagern mit hohem Abdichtwiderstand in Bezug auf ein zu untersuchendes biologisches Objekt ausgebildet ist, an oder in zumindest einem Wandbereich, welcher eine Apertur eines Aperturbereichs bildet und umgibt, die Konzentration mindestens einer Material- oder Ionenspezies zu modifizieren und insbesondere zu erhöhen, und zwar verglichen mit der Konzentration der Material- oder Ionenspezies außerhalb des modifizierten Bereichs, also im zu Grunde liegenden Material des Trägers außerhalb des Aperturbereichs, insbesondere im Mittel des Trägers und/oder im Inneren des Trägers.
Die Konzentrationsänderung und insbesondere Konzentrationserhöhung führen dann über eine entsprechende chemische und/oder elektrische Wechselwirkung dazu, dass auch das abdichtende oder sealende Anlagern eines zu untersuchenden biologischen Objekts gesteuert und insbesondere gefördert werden kann, wobei insbesondere die Wahrscheinlichkeit der Anlagerung des zu untersuchenden biologischen Objekts an der Messapertur und/oder der Abdichtwiderstand zwischen dem zu untersuchenden biologischen Objekt und der Messapertur gesteigert werden, und zwar verglichen mit der Situation, bei welcher in einer ansonsten identischen elektrophysiologischen Messanordnung die erfindungsgemäße Modifikation der Konzentration nicht vorliegt, oder verglichen mit dem Sonderfall- eines vollständig dotierten Wafers, bei dem die Funktion des Förderns oder Stabilisierens des Gigaseals gegeben ist, jedoch die Eigenschaften des Chips hinsichtlich der Eignung zum Messen schlechter ist.
Es ist somit erfindungsgemäß möglich, das gewünschte biologische Objekt in seiner Anlagerung und bei der Ausbildung eines Seals mit der Apertur und dem Wandbereich der Apertur zu unterstützen und die Stärke des Seals im Sinne eines erhöhten Abdichtwiderstands oder einer stark erniedrigten Restleitfähigkeit sowie einer verstärkten mechanischen Stabilität des Seals zu verbessern.
Biologische Objekte, die einer Untersuchung zugeführt werden, können dabei Zellen, Zellorganellen, Oozyten, Bakterien oder deren Kombinationen oder Fragmente, jeweils im weitesten Sinne, sein. Auch sind künstliche oder teilweise künstliche im Wesentlichen biologische Strukturen denkbar, zum Beispiel in Form von Vesikeln, Liposomen, Mizellen, Membranfragmente oder dergleichen, in welche in natürlicher oder künstlicher Art und Weise Proteine ein- und/oder angelagert sind.
Die zu untersuchenden Objekte können ganz allgemein natürliche oder teilweise oder vollständig künstliche biologische Objekte sein. Auch sind nicht-biologische Objekte untersuchbar, um z. B. reine Lipidstrukturen und deren Modifikationen zu untersuchen. Im Folgenden wird ausschließlich von biologischen Objekten gesprochen, wobei jedoch sämtliche, in diesem Sinne beschriebenen Variationen als Messobjekte mit umfasst sein sollen.
Erfindungsgemäß wird mit anderen Worten erreicht, dass ausgewählte zu untersuchende biologische Objekte mit einem verbesserten Abdichtwiderstand angelagert und danach vermessen werden, so dass sich ein besseres Signal-zu-Rausch-Verhältnis einstellt und die Anlagerung mechanisch stabilisiert wird, z. B. mit der Folge einer verlängerten Messzeitspanne und einer verbesserten Zuverlässigkeit in Bezug auf die Messergebnisse.
Durch die Wahl der Spezies und/oder der Höhe der Konzentrationsmodifikation können Art und Stärke die Wechselwirkung in Abhängigkeit von der Ladung und/oder vom Aufbau der Membran der biologischen Objekte auf deren Außen- und Innenseite und damit die Qualität und Dauer der Anlagerung beeinflusst werden.
Die mindestens eine Materialspezies oder Ionenspezies kann aus der Gruppe ausgewählt sein oder werden, die Protonen (H⁺), Halogenidionen, insbesondere Fluoridionen (F^–), zweifach geladene Ionen, insbesondere zweifach geladene Metallkationen, vorzugsweise Be²⁺, Sr²⁺, Ca²⁺ und Mg²⁺ aufweist. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Spezies beschränkt, grundsätzlich sind nämlich sämtliche materiellen Spezies denkbar, um z. B. bestimmten speziellen Oberflächensituationen eines zu vermessenden biologischen Objekts gerecht zu werden, um z. B. auch beim Vorliegen von Glykokalyxstrukturen oder bei anderen Situationen hohe Abdichtwiderstände und mechanisch stabile Anlagerungen zu erzielen.
Die Erhöhung der Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies kann räumlich lokal derart auf den Bereich des Wandbereichs beschränkt sein, dass das Material des Trägers zumindest in einem Bereich außerhalb des Aperturbereichs keine erhöhte Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies aufweist.
Die Konzentration der mindestens einen Material- oder Ionenspezies kann mittels einer Implantation erhöht ausgebildet sein oder werden, insbesondere vermittelt über einen Plasmaprozess, über einen Sputterprozess oder über einen Ionenstrahlprozess. Denkbar sind aber auch andere Implantations- oder Dotierungsverfahren.
Bei einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Messanordnung ist der Aperturbereich im Bereich eines Trägers, der eine Oberseite und eine Unterseite aufweist, ausgebildet. Dabei kann dann ein jeweiliger eine Apertur bildender Wandbereich in Bezug auf die Oberseite und/oder in Bezug auf die Unterseite des Trägers teilweise oder vollständig hervorstehen.
Der vorzusehende Träger kann auch als Basis, Substrat oder Grundsubstrat bezeichnet werden. Das Vorsehen eines derartigen Substrats oder eines derartigen Trägers stabilisiert die Messanordnung und insbesondere die Anordnung des angeordneten zu untersuchenden biologischen Objekts als solche mechanisch und ermöglicht eine makroskopische Unterteilung der Messanordnung in Bezug auf das der Messung zu Grunde zu legende Elektrolytbad im Sinne der Unterteilung einer Messküvette oder Nasszelle in Kompartimente mit Mess- und Gegenelektrode.
Ein jeweiliger eine Apertur bildender Wandbereich kann auch in der Innenwand des Loches in Kombination mit der Elektrodenanordnung integriert ausgebildet sein.
Auf der Grundlage des Substrats oder des Trägers können dann ein oder mehrere Aperturen mit entsprechenden Wandbereichen in Bezug auf die Oberseite herausragend oder sich hervorhebend ausgebildet werden.
Alternativ dazu können diese auch an der Oberseite planar abschließend nach innen ausgestülpt sein, um auf der Unterseite des Trägers oder des Substrats hervorzustehen; dies ist jedoch nicht zwingend und kann bei entsprechender Dicke der Membran entfallen.
Das Ausmaß des jeweiligen Einstülpens oder Hervortretens beeinflusst die Innenwand des jeweiligen Wandbereichs und damit die zur Verfügung stehende Wechselwirkungsfläche mit der Membran des biologischen Objekts. Die Wahl des Ausmaßes des Hervorragens oder Einstülpens ermöglicht darüber hinaus eine Anpassung an die jeweilig zur Verfügung stehenden Messobjekte, zum Beispiel im Hinblick auf deren Form oder Anzahl in der Messlösung.
Der Träger kann als – insbesondere planares – Plattenelement mit Vorder- oder Oberseite und mit Rück- oder Unterseite ausgebildet sein. Auch andere Geometrien sind denkbar.
Alternativ dazu kann von der Plattenform abgewichen werden, in dem z. B. die Form einer Pipette, z. B. im Sinne einer klassischen Patchpipette aufgegriffen wird.
Der Wandbereich, der eine Apertur bildet, kann nach Art einer Mantelfläche oder als eine Kombination von Mantelflächen ausgebildet sein. Dabei kann jeweils auf den Mantel eines Zylinders, eines Prismas, eines Kegelstumpfs und/oder eines Pyramidenstumpfs zurück gegriffen werden, mit entsprechender Wandstärke.
Bezüglich der Form des Wandbereichs zur Ausbildung der Apertur stehen also vielfältige Möglichkeiten zur Verfügung. Diese können ausgewählt werden in Abhängigkeit von der Form und den weiteren – z. B. mechanischen, geometrischen und/oder elektrischen – Eigenschaften der zu untersuchenden biologischen Objekte.
Des Weiteren kann der eine Apertur bildende Wandbereich von einem Rand oder Randbereich gebildet werden, so dass die Apertur quasi als planares Loch in dem zu Grunde liegenden Substrat ausgebildet ist und dabei der konzentrationsmodifizierte Bereich mit oder aus dem Material mit modifizierter Konzentration in den Randbereich des planaren Lochs eingebettet ist, um das Anlagern und Sealen zu fördern und damit den Abdichtwiderstand zu erhöhen.
Ein eine Apertur bildender Wandbereich kann mit oder aus einem Material aus der Gruppe von Materialien ausgebildet sein, welche Glas, Quarzglas, Silizium, Kohlenstoff und deren Kombinationen und Derivate aufweist. Auch in Bezug auf die Materialwahl können die Eigenschaften der zu Grunde liegenden biologischen Objekte berücksichtigt werden, zum Beispiel im Hinblick auf die Oberflächenstruktur oder Oberflächenladung der Membranaußenseite und/oder der Membraninnenseite der biologischen Objekte, zum Beispiel auch, um ein besonders inniges Anhaften und damit die Steigerung des Abdichtwiderstands beim Seal weiter zu unterstützen.
Der Durchmesser der Apertur und insbesondere der Innendurchmesser eines oder des die Apertur bildenden Wandbereichs können einen Wert im Bereich von etwa 0 μm bis etwa 50 μm, vorzugsweise im Bereich im Bereich von etwa 1 μm bis etwa 50 μm aufweisen. Ein oder der eine Apertur bildende Wandbereich kann über der Oberseite oder der Unterseite des Trägers oder des Substrats eine Höhe oder Tiefe im Bereich von etwa 0 μm bis etwa 20 μm aufweisen.
Die angegebenen Maße in Bezug auf Höhe und Tiefe der Wandbereiche und deren Durchmesser können sich weiter an den geometrischen Gegebenheiten der zu untersuchenden biologischen Objekte orientieren, insbesondere also an deren Größe und an den mechanischen Eigenschaften ihrer Membranen, und folglich entsprechend andere Werte als die konkret angegebenen aufweisen.
Zur Ausbildung eines Messkreises können eine Messelektrode im Bereich oder innerhalb der Apertur oder in einem Bereich auf der Rück- oder Unterseite des Trägers oder Substrats vorgesehen sein.
Es kann eine Gegenelektrode außerhalb der Apertur und im Bereich auf der Vorder- oder Oberseite des Trägers vorgesehen sein.
Messelektrode und Gegenelektrode sind vorzugsweise auf gegenüberliegenden Seiten des Trägers oder Substrats oder der Messapertur angeordnet, jedenfalls so, dass bei Anlagerung eines zu vermessenden vorzugsweise biologischen Objekts dieses zwischen den Elektroden angeordnet ist und bei Ausbildung eines geeigneten Seals diese praktisch elektrisch trennt, vorzugsweise mit einem sehr hohen Widerstand, idealerweise größer als 1 GΩ.
Der grundlegende Aufbau für die erfindungsgemäße elektrophysiologische Messanordnung gemäß dieser Ausführungsform beinhaltet also insbesondere das Vorsehen einer Messelektrodenanordnung und einer Gegenelektrodenanordnung, zwischen welchen ein elektrischer Strom und/oder eine elektrische Spannung gemessen werden kann, wobei zwischen der Messelektrodenanordnung und der Gegenelektrodenanordnung gerade das zu vermessende biologische Objekt im Bereich der Apertur und deren Wandbereich derart angeordnet ist oder wird, dass durch die abdichtende oder sealende Anlagerung die Restleitfähigkeit, also die Leitfähigkeit zwischen der Membran des biologischen Objekts und dem Wandbereich der Apertur, möglichst gering ist, so dass die tatsächlich gemessenen elektrischen Ströme und/oder elektrischen Spannungen als von den Eigenschaften der Membran des biologischen Objekts hervorgerufen angesehen werden können, zum Beispiel durch Transportprozesse, Ladungsverschiebungen innerhalb oder über die Membran, durch Substratbindung oder Abgabe oder dergleichen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein elektrophysiologisches Messverfahren geschaffen. Dieses wird insbesondere unter Verwendung einer elektrophysiologischen Messanordnung gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt. Zum Steuern und insbesondere zum Fördern des abdichtenden oder sealenden Anlagerns eines zu vermessenden biologischen Objekts an einer Apertur eines Aperturbereichs ist oder wird zumindest ein Bereich eines die Innenwand eines die Apertur bildenden Wandbereichs bezüglich mindestens einer materiellen oder Ionenspezies gesteuert mit einer entsprechend geeigneten und gegenüber der Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies im Träger außerhalb des Aperturbereichs und insbesondere im Mittel des Trägers und/oder im Inneren des Trägers erhöhten Konzentration ausgebildet.
Beim erfindungsgemäßen Messverfahren kann also auch eine direkte oder auch indirekte Beeinflussung von Molekülen – der Elektrolytumgebung und/oder der anzulagernden Membran – in Wandnähe durch die modifizierte Konzentration zum Tragen kommen.
Entsprechend ist also ein Kernaspekt, welcher dem erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messverfahren zu Grunde liegt, das gesteuerte Modifizieren und insbesondere Erhöhen der Konzentration mindestens einer materiellen oder Ionenspezies zumindest am oder im die Apertur bildenden Wandbereich, wobei dadurch über Wechselwirkung mit dem biologischen Objekt und/oder der Elektrolytumgebung ein abdichtendes oder sealendes Anlagern gefördert und der Abdichtwiderstand gesteigert wird.
Gemäß einer alternativen Sichtweise der vorliegenden Erfindung wird der Fokus auf die – insbesondere laterale – Lokalität der Modifikation der Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies auf den Bereich der Apertur gelegt.
Dabei wird einerseits wieder eine elektrophysiologische Messanordnung geschaffen mit einem Träger aus einem Trägermaterial und mit einem Aperturbereich im Bereich des Trägers – also mit einem Bereich, der mindestens eine Apertur oder Messapertur aufweist oder bildet – zum gesteuerten abdichtenden oder sealenden Anlagern eines biologischen Objekts, z. B. einer Zelle, einer Zellorganelle, eines Vesikels, eines Liposoms, einer natürlichen oder künstlichen Membran, z. B. einer Lipiddoppelschicht, oder dergleichen oder eines Fragments davon. Der Aperturbereich ist mit mindestens einer Apertur ausgebildet sowie mit einem Wandbereich, welcher als Aperturinnenwand die Apertur bildet und diese umgibt. Der Wandbereich ist mit einem Bereich aus einem Material ausgebildet, welches dem Trägermaterial außerhalb des Aperturbereichs zumindest in seiner Zusammensetzung im Wesentlichen entspricht, gegenüber diesem jedoch hinsichtlich mindestens einer Materialspezies, insbesondere Ionenspezies eine lokal modifizierte, insbesondere lokal erhöhte Konzentration aufweist. Durch diese lokal modifizierte, insbesondere lokal erhöhte Konzentration der Material- oder Ionenspezies an oder in der Aperturinnenwand der Apertur ist das abdichtende Anlagern eines biologischen Objekts am Aperturbereich förderbar.
Es ist somit eine Kernidee dieser alternativen Sichtweise der vorliegenden Erfindung, bei einer elektrophysiologischen Messanordnung mit einem Aperturbereich, welcher zum abdichtenden oder sealenden Anlagern, also zum Anlagern mit hohem Abdichtwiderstand in Bezug auf ein zu untersuchendes biologisches Objekt ausgebildet ist, an oder in einem Wandbereich, welcher eine Apertur eines Aperturbereichs bildet und umgibt, lokal die Konzentration mindestens einer Material- oder Ionenspezies zu modifizieren und insbesondere zu erhöhen, und zwar verglichen mit der Konzentration der Material- oder Ionenspezies im zu Grunde liegenden Trägermaterial außerhalb des Aperturbereichs.
Die lokale Konzentrationsänderung und insbesondere Konzentrationserhöhung führt dann über eine entsprechende chemische und/oder elektrische Wechselwirkung dazu, dass auch das abdichtende oder sealende Anlagern eines zu untersuchenden biologischen Objekts gesteuert und insbesondere gefördert werden kann, wobei insbesondere die Wahrscheinlichkeit der Anlagerung des zu untersuchenden biologischen Objekts an der Messapertur und/oder der Abdichtwiderstand zwischen dem zu untersuchenden biologischen Objekt und der Messapertur gesteigert werden, und zwar verglichen mit der Situation bei welcher in einer ansonsten identischen elektrophysiologischen Messanordnung die erfindungsgemäße lokale Modifikation der Konzentration nicht vorliegt.
Die Konzentration der mindestens einen Material- oder Ionenspezies kann auch bei dieser alternativen Sichtweise der vorliegenden Erfindung bis zu einer bestimmten Tiefe, z. B. von etwa 10 nm von der Oberfläche der Aperturinnenwand her oder aus modifiziert sein. Es sind aber auch andere lokale begrenzte Schichttiefen oder – insbesondere bei lateraler Lokalität – auch eine durchgehende Implantation der Aperturwand denkbar.
Gemäß einem weiteren Aspekt der alternativen Sichtweise der vorliegenden Erfindung wird andererseits wieder ein elektrophysiologisches Messverfahren geschaffen. Dieses wird insbesondere unter Verwendung einer elektrophysiologischen Messanordnung gemäß der alternativen Sichtweise der vorliegenden Erfindung ausgeführt. Zum Steuern und insbesondere Fördern des abdichtenden oder sealenden Anlagerns eines zu vermessenden biologischen Objekts an einer Apertur eines Aperturbereichs ist oder wird die Innenwand eines die Apertur bildenden Wandbereichs bezüglich mindestens einer materiellen oder Ionenspezies gesteuert mit einer entsprechend geeigneten und gegenüber der Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies im Träger außerhalb des Aperturbereichs lokal erhöhten Konzentration ausgebildet.
Bei diesem erfindungsgemäßen Messverfahren kann also auch eine direkte oder auch indirekte Beeinflussung von Molekülen – der Elektrolytumgebung und/oder der anzulagernden Membran – in Wandnähe durch die lokal modifizierte Konzentration zum Tragen kommen.
Entsprechend ist also ein Kernaspekt, welcher diesem erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messverfahren zu Grunde liegt, das gesteuerte lokale Modifizieren und insbesondere Erhöhen der Konzentration mindestens einer materiellen oder Ionenspezies am oder im die Apertur bildenden Wandbereich, wobei dadurch über Wechselwirkung mit dem biologischen Objekt und/oder der Elektrolytumgebung ein abdichtendes oder sealendes Anlagern gefördert und der Abdichtwiderstand gesteigert wird.
Bei den erfindungsgemäßen Messverfahren und mit den erfindungsgemäßen Messanordnungen können Messsignale insbesondere auch in kapazitiver Art und Weise gemessen werden, um z. B. Einzelkanalaktivitäten zu ermitteln.
Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden auf der Grundlage der beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A, 1E zeigen in geschnittener Seitenansicht eine erste bzw. eine alternative zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messanordnung, bei welcher der Wandbereich einer Apertur sich über der Oberseite eines zu Grunde liegenden Trägers erhebt.
1B–1D zeigen in schematischer und geschnittener Draufsicht verschiedene Querschnittsformen einer Apertur und des jeweils zu Grunde liegenden Wandbereichs.
2A–2D zeigen in schematischer und geschnittener Seitenansicht Details verschiedener Ausführungsformen der Ausbildung der modifizierten Konzentration am oder im Wandbereich einer Apertur.
3–7 zeigen in analoger Art und Weise wie in 1A in schematischer und geschnittener Seitenansicht verschiedene Ausführungsformen für eine elektrophysiologische Messanordnung gemäß der vorliegenden Erfindung, bei welchen eine jeweilige Apertur durch Wandbereiche gebildet werden, die Mantelflächen unterschiedlicher geometrischer Körper entsprechen.
8 zeigt eine elektrophysiologische Messanordnung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche nach Art einer so genannten Patchpipette ausgebildet ist.
9A–9E zeigen in schematischer und geschnittener Seitenansicht verschiedene Aspekte des Einsatzes der erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messanordnung.
10–12 zeigen in schematischer und geschnittener Seitenansicht Details bei der Anlagerung eines biologischen Objekt an einer jeweiligen Ausführungsform der elektrophysiologischen Messanordnung.
DETAILBESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es werden im Folgenden im Detail Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben. Sämtliche Ausführungsformen der Erfindung und auch ihre technischen Merkmale und Eigenschaften können einzeln isoliert und wahlfrei zusammengestellt und miteinander beliebig und ohne Einschränkung kombiniert werden.
Es werden nachfolgend – soweit nichts anderes gesagt ist – strukturell und/oder funktionell gleiche, ähnliche oder gleich wirkende Merkmale oder Elemente im Zusammenhang mit den Figuren mit denselben Bezugszeichen bezeichnet. Nicht in jedem Fall ihres Auftretens wird eine detaillierte Beschreibung dieser Merkmale oder Elemente wiederholt.
Zunächst wird auf Zeichnungen im Allgemeinen Bezug genommen.
In der Elektrophysiologie wird unter anderem die Patch-Clamp-Technologie angewandt, um z. B. Ionenkanalanalysen für die Medikamententestung durchzuführen. Beim manuellen Patch-Clamp-Verfahren und dessen Verfeinerungen können – z. B. an Einzelzellen – elektrische Ströme und Spannungen gemessen werden, die – z. B. von Ionenkanälen – in den Membranen biologischer Zellen hervorgerufen werden.
Auf Grund der wachsenden Bedeutung elektrophysiologischer Untersuchungen und des personellen und zeitlichen Aufwandes bei deren Durchführung ist eine große Nachfrage nach automatisierten elektrophysiologischen Messtechniken und insbesondere nach planaren Patch-Clamp- und weiteren automatisierten Patch-Clamp- oder APC-Systemen entstanden.
Die Funktionsweisen beim manuellen Patch-Clamp-Verfahren und bei APC-Systemen sind grundlegend gleich. Problematisch ist bei beiden Systemtypen die Notwendigkeit der Ausbildung eines hochohmigen Abdichtwiderstandes zwischen der dem Messobjekt O, z. B. einer Zelle O, und der Messanordnung 100. Man spricht auch von der Notwendigkeit eines so genannten Gigaseals, also eines Abdichtwiderstands im Gigaohmbereich. Damit wird die elektrische Isolierung – z. B. des Zellinneren zum Zelläußeren – z. B. durch eine Patchpipette beschrieben, wie dies z. B. in 10 gezeigt ist, oder bei einer flächigen Zellanordnung, wie bei einem APC-Schema gemäß 11 und 12.
Mittels einer Patchpipette wird eine Zelle als biologisches Objekt O ggf. angesaugt. Ein kleiner, begrenzter Teil der Zellmembran M, der als Patch bezeichnet wird, wird dabei mit einem leichten Unterdruck eingesogen. Dadurch wird bei der Cell-Attached-Messung gemäß 9B die Messfläche bzw. bei einer Whole-Cell-Messung gemäß 9D das Zellinnere im Mega- bis Gigaohmbereich zum Zelläußeren hin elektrisch abgedichtet. Die Cell-Attached-Konfiguration ermöglicht eine Strommessung auch an einzelnen Ionenkanälen in der Zellmembran.
Die Gigasealrate sowie der Abdichtwiderstand sind beim manuellen Patch-Clamp sowie bei den APC-Systemen ein Maß für die Qualität der möglichen Ionenkanalmessungen. Bis heute ist eine 100%-ige Gigasealrate nicht möglich.
Die Ausbildung des Gigaseals hängt von vielen Faktoren ab, die einer aktiven Beeinflussung bisher nicht zugänglich sind. Es fehlt also eine echte Steuerung des Gigaseals im Anlagerungs- und im Messprozess.
Beim manuellen Patch-Clamp-Verfahren kann bisher nur mit frisch hergestellten Glaspipetten eine ausreichend hohe Gigasealrate erreicht werden. Bei der Entwicklung von Chips für APC-Systeme muss auf eine Reduktion der Oberflächenrauhigkeit und auf eine Vermeidung scharfer Kanten geachtet werden. Weiter kann eine sorgfältige Kombination der intra- und extrazellulären Puffer zu einer Verbesserung des Gigaseals führen. Dies bietet jedoch durch die Notwendigkeit, physiologische Puffer verwenden zu müssen, nur begrenzte Möglichkeiten der Steuerung und Beeinflussung.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass negative oder positive Ladungen am oder im Träger 12 und insbesondere an oder in der Innenwand 11i einer Messapertur 14, z. B. auch einer Patchpipette, die Ausbildung eines Gigaseals unterstützen und den Gigaseal selbst verbessern können. Durch eine gezielte und z. B. auch ortsaufgelöste Modifikation und insbesondere Erhöhung der Konzentration bestimmter materieller Spezies und insbesondere von Ionen wird die lokale Ladungsdichte – mittels positiver bzw. negativer Ladungen – an oder in der Innenwand 11i der Messapertur 14 entsprechend modifiziert, also insbesondere erhöht und es werden die Prozesse zur Etablierung und/oder zur Stabilisierung eines Gigaseals beeinflussbar, und zwar durch direkte und ggf. lokale Modifikation an oder in der Oberfläche, z. B. durch eine Materialimplantation in die Aperturwand, z. B. mittels eines Plasmas.
Die Kontrolle der Ladungsdichte an oder in der Pipettenwand oder Aperturwand 11 wird erfindungsgemäß durch die Modifikation und insbesondere durch Erhöhung der Konzentration einer materiellen oder Ionenspezies zumindest in einem Bereich 20 des Wandbereichs 11 des Aperturbereichs 10 bewirkt, so dass zumindest in der Messaperturwand 11 und dort lokal im Bereich 20 das Material 12'' des Trägers 12 bezüglich mindestens einer materiellen oder Ionenspezies eine modifizierte und insbesondere erhöhte Konzentration aufweist, und zwar verglichen mit der Konzentration der entsprechenden Spezies im Material 12' des Trägers 12 außerhalb des Bereichs 20 und somit außerhalb des Aperturbereichs 10 insbesondere verglichen mit der Konzentration im Inneren des Trägers 12 und/oder des Trägers 12 im Mittel. Insbesondere im Zusammenwirken mit dem Anlegen bestimmter Spannungen an Mess- und Gegenelektrode 30, 50 werden erfindungsgemäß die beschriebenen Wirkungen und Vorteile erreicht.
Diese betreffen insbesondere und unter anderem:

• die Verbesserung des Gigaseals hinsichtlich der zeitlichen Ausbildung und Höhe des Gigaseals, also des Abdichtwiderstands,
• die ortsaufgelöste Erhöhung der Konzentration, insbesondere von zweiwertigen Ionen oder von Protonen, und
• die Verwendung für ein gerichtetes Adhärieren und für Wachstum von Zellen,

Im Zusammenhang mit der Entwicklung eines APC-Systems für Zellnetzwerke ist diese Erfindung besonders vorteilhaft, da auf Grund der Verwendung von nicht optimalen Materialien, die Ausbildung eines guten Gigaseals vermindert wird. Eine Verbesserung des Gigaseals bzw. Erhöhung der Gigasealwahrscheinlichkeit bietet einen grundlegenden Vorteil, wenn Zellen Patch-Pipetten z. B. von APC-Systemen über eine längere Zeit überwachsen.
Die vorliegende Erfindung fußt unter anderem auch auf der Erkenntnis, dass zweiwertige Ionen und/oder Protonen eine konzentrationsabhängige Wirkung auf die zeitliche Ausbildung, die Höhe und die Stabilität des Gigaseals und auf den Abdichtwiderstand haben. Dies gilt situationsabhängig ggf. auch für andere implantierte Spezies, die erfindungsgemäß Anwendung finden können.
Gegenstand der Erfindung ist demnach unter anderem die gezielte und ggf. ortsaufgelöste oder lokale Modifikation oder Erhöhung der Konzentration von Ionen bzw. Protonen zumindest in oder an der Innenwand der Messapertur, um dadurch Prozesse zur Etablierung des Gigaseals positiv zu beeinflussen. Dies kann bei der Verwendung von herkömmlichen physiologischen Messpuffern nicht gewährleistet werden.
Die materielle Spezies und insbesondere die Ionen und/oder Protonen können z. B. durch einen speziellen physikalischen Plasmaprozess an oder in die Oberfläche des Materials – Innenwand der Messapertur – implantiert werden. Denkbar ist auch die Implantierung eines Materials, das darauf folgend zweiwertige Ionen und/oder Protonen an der Oberfläche konzentriert.
Die Erfindung dient mithin unter anderem auch der Verbesserung der Materialeigenschaften der durch die Chiptechnologie bedingten Materialien – z. B. von Glas oder Silizium und deren Varianten – bezüglich der Ausbildung eines Gigaseals.
Die durch die Erfindung ermöglichte – insbesondere lokale – Konzentrationsänderung und insbesondere -steigerung z. B. von Ionen bzw. Protonen ist bisher nicht bekannt und äußert sich in einer Erhöhung der Gigasealwahrscheinlichkeit sowie in der Erhöhung der gemessenen Abdichtwiderstandswerte am Ort der Konzentrationsmodifikation also z. B. am Ort der Implantation sowie einer Steigerung der mechanischen Stabilität des Seals.
Die durch die Erfindung ermöglichte vergleichsweise hohe lokale Konzentrationsänderung und mithin ggf. die einhergehende lokale Ladungsdichte, sei diese negativ oder positiv, ist konventionell nicht zu erzielen.
Die vorliegende Erfindung betrifft demzufolge eine elektrophysiologische Messanordnung 100 sowie ein elektrophysiologisches Messverfahren, bei welchen das abdichtende oder sealende Anlagern eines zu untersuchenden biologischen Objekts O an einen Träger 12 der Messanordnung 100 gesteuert und insbesondere gefördert werden kann, indem zumindest an oder in einem Bereich 20 eines Wandbereichs 11, welcher eine Apertur 14 eines Aperturbereichs 10 bildet, ein Material 12'' vorgesehen wird, welches dem Material 12' des Trägers außerhalb des Aperturbereichs 10 und insbesondere dem Material des Trägers 12 in dessen Inneren 12i oder in dessen räumlichen Mittel zumindest in seiner Zusammensetzung im Wesentlichen entspricht, gegenüber diesem jedoch hinsichtlich mindestens einer materiellen oder Ionenspezies eine – ggf. lokal – erhöhte Konzentration aufweist, so dass durch diese – ggf. lokal – erhöhte Konzentration an oder in der Aperturinnenwand 11i der Apertur 14 das abdichtende Anlagern eines biologischen Objekts O am Aperturbereich 10 förderbar ist, um also über Wechselwirkung mit der Membran des zu untersuchenden biologischen Objekts O das abdichtende oder sealende Anlagern steuernd zu fördern. Dabei liegt die Tiefe oder Schichtdicke Δ, bis zu welchen die Konzentrationsmodifikation der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies, gemessen von der Oberfläche oder Oberseite 12a des Trägers 12 aus, reicht, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 nm.
Nun wird im Detail auf die Zeichnungen Bezug genommen.
1A zeigt in schematischer und geschnittener Seitenansicht eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messanordnung 100.
Ein grundlegendes Element dieser Ausführungsform ist der Träger 12, der auch als Basis 12 oder Substrat 12 bezeichnet werden kann. Dieser Träger 12 unterteilt ein während der Messung vorgesehenes Elektrolytbad 40, 60, 70 in mindestens zwei Kompartimente, wobei das erste Kompartiment 60 der Unterseite 12b des Trägers 12 oder Substrats 12 zugewandt ist und wobei das zweite Kompartiment 40 der Oberseite 12a des Trägers 12 oder Substrats 12 zugewandt ist.
In den Träger 12 ist der so genannte Aperturbereich 10 eingearbeitet. Dieser weist mindestens eine Apertur 14 auf, nämlich z. B. nach Art eines Durchgangslochs, welches den Träger 12 in seiner Dicken- oder Schichtstärkenrichtung, nämlich in der Richtung von der Oberseite 12a zur Unterseite 12b, lokal vollständig durchdringt. Im Bereich der Apertur 14 ist ebenfalls ein Teil 70 des Elektrolytbads 40, 60, 70 vorgesehen.
Insgesamt gesehen besteht also zwischen der Oberseite 12a und der Unterseite 12b über die Apertur 14 des Aperturbereichs 10 eine fluidmechanische Verbindung und entsprechend über die gegebenenfalls vorgesehene Leitfähigkeit des Elektrolytbads, häufig handelt es sich dabei in der Anwendung um eine physiologische Lösung, auch eine elektrische Verbindung.
Bei der Ausführungsform gemäß 1A ist im oberseitigen Kompartiment 40 eine mit einer Leitung 51 angeschlossene Gegenelektrode 50 zu einer auf der Unterseite 12b des Trägers 12 vorgesehenen Messelektrode 30 angeordnet. Die Messelektrode 30 befindet sich also im unterseitigen Kompartiment 60 des Elektrolytbades 40, 60, 70 und ist mit einer Leitung 31 angeschlossen. Die Leitungen 51 und 31 zur Gegenelektrode 50 bzw. zur Messelektrode 30 sind an sich isoliert und führen zu einem entsprechenden Steuer- und Messkreis, der hier nicht dargestellt ist.
Das Substrat 12 oder der Träger 12 wird von einem Trägermaterial 12' gebildet, das zumindest im Inneren 12i oder im Bulk des Trägers 12 einer bestimmten Zusammensetzung entspricht. Zumindest am oder im Wandbereich 11 des Aperturbereichs 10 ist ein Bereich 20 vorgesehen, der mit oder aus einem Material 12'' gebildet ist, welches dem Trägermaterial 12' außerhalb des Aperturbereichs 10 und mithin außerhalb des Bereichs 20 und insbesondere dem Material im Inneren 12i des Trägers oder dem Material des Trägers 12 im räumlichen Mittel zumindest in seiner Zusammensetzung im Wesentlichen entspricht, gegenüber diesem jedoch hinsichtlich der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies eine – ggf. lokal oder lateral lokal – modifizierte oder erhöhte Konzentration aufweist.
Das Vorsehen und Ausbilden eines solchen Bereichs 20 – der im Folgenden auch als konzentrationsmodifizierter Bereich 20 bezeichnet wird und in den Figuren durch gestrichelt umrandete und mit Punktierung gefüllt dargestellt ist – mit gegenüber dem sonstigen Trägermaterial 12' oder Substratmaterial 12' modifizierter Konzentration zur Förderung der abdichtenden oder sealenden Anlagerung eines zu untersuchenden biologischen Objekts O an die Apertur 14 und zur Steigerung des Rest- oder Abdichtwiderstands ist ein Kernaspekt der vorliegenden Erfindung, Ein zusätzlicher oder alternativer Kernaspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies bis zu einer Tiefe Δ von etwa 10 nm von der Oberseite 12a oder Oberfläche des Trägers 12 und insbesondere von der Aperturinnenwand 11i her oder aus modifiziert sein kann.
Die erfindungsgemäßen Aspekte der lateralen Lokalität – z. B. auf den Aperturbereich 10 oder aus einen Bereich 20 des Aperturbereichs 10 – und der Tiefe Δ von etwa 10 nm in Bezug auf die Konzentrationsmodifikation können getrennt oder gemeinsam realisiert sein oder werden.
Der Wandbereich 11 als solcher bildet bei der Ausführungsform der 1A und 1B eine nach Art einer inneren Mantelfläche verlaufende geschlossene Wand mit einer Innenseite 10i, 11i oder Innenwand 10i, 11i und einer Außenseite 10a, 11a oder Außenwand 10a, 11a. Auf diese Art und Weise wird eine Apertur 14 des Aperturbereichs 10 der erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messanordnung 100 gebildet, wobei die Innenseite oder die Innenwand 10i, 11i des Wandbereichs 11 der Apertur 14 zugewandt, die Außenwand oder Außenseite 10a, 11a des Wandbereichs 11 dagegen der Apertur 14 abgewandt, jedoch dem Kompartiment 40 des Elektrolytbades 40, 60, 70 zugewandt ist.
Bei der Ausführungsform der 1A erhebt sich der Wandbereich 11 ausschließlich oberhalb der Oberseite 12a des Trägers oder Substrats 12. Auf der Unterseite 12b des Substrats oder Trägers 12 ist der Aperturbereich 10 quasi planar ausgebildet. Eine derartige Struktur ist jedoch nicht zwingend und die 3 bis 7 zeigen diesbezüglich abgewandelte Ausführungsformen, die später im Detail beschrieben werden.
Wie oben erwähnt wurde, ist der Wandbereich 11, welcher die Apertur 14 bildet, nach Art einer Mantelfläche eines geometrischen Körpers ausgebildet. Gemäß 1B kann in Zusammenschau mit der 1A diese Mantelfläche von einem senkrechten Kreiszylinder als Grundform stammen.
In 1A und 1B sind der Wandbereich 11 oder die Aperturwand 11 hinsichtlich der Konzentration nicht vollständig modifiziert ausgebildet. Der konzentrationsmodifizierte Bereich 20 und die Aperturwand 11 oder der Wandbereich 11 fallen bei dieser Ausführungsform nicht vollständig zusammen. Vielmehr erstrecken sich die Konzentrationsmodifikation der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies und also der konzentrationsmodifizierte Bereich 20 nur bis zu einer Tiefe Δ von etwa 10 nm, und zwar von der Innenwand 11i der Aperturwand 11 aus betrachtet.
Weitere Alternativen werden im Zusammenhang mit den 2A bis 2D unten beschrieben.
Die Ausbildung als Mantelfläche eines senkrechten Kreiszylinders als grundlegender Form ist nicht zwingend. Die 1C und 1D zeigen anstelle einer Zylinderform in schematischer Draufsicht als Grundfläche ein Quadrat, so dass sich räumlich ein senkrechtes quadratisches Prisma ergibt bzw. ein Prisma mit einer Grundfläche nach Art eines Ovals, quasi eines Quadrats oder Rechtecks mit abgerundeten Ecken, wie dies in 1D dargestellt ist. Auch hier erstrecken sich die Konzentrationsmodifikation der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies und also der konzentrationsmodifizierte Bereich 20 nur bis zu einer Tiefe Δ von etwa 10 nm, und zwar wieder von der Innenwand 11i der Aperturwand 11 aus betrachtet.
Es sind grundsätzlich beliebige Grundflächenformen denkbar. Jedoch bieten sich auf Grund der oben beschriebenen Umstände, bei welchen Oberflächenrauhigkeiten und scharfe Kanten vermieden werden sollten, gerade Formen mit abgerundeten Strukturen an, also zum Beispiel die Ausgestaltung gemäß der 1B, welche als geometrische Grundform einen senkrechten Kreiszylinder besitzt.
Bei der Ausführungsform der 1E sind die laterale Lokalität des konzentrationsmodifizierten Bereichs 20 und damit Beschränkung auf den Aperturbereich 10 und insbesondere auf die Aperturwand 11 aufgehoben. Vielmehr sind hier die gesamte Oberseite 12a des Trägers 12 und die Aperturinnenwand 11i bis zu einer Tiefe Δ von etwa 10 nm in ihrer Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies konzentrationsmodifiziert.
Die 3 und 4 zeigen analog zu 1A und ebenfalls in schematischer und geschnittener Seitenansicht andere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Messanordnung, bei welchen ein Unterschied dahingehend besteht, dass nämlich gemäß der 3 der Wandbereich 11 für die Apertur 14 bündig mit der Oberseite 12a des Substrats 12 abschließt und ausschließlich über die Unterseite 12b des Substrats 12 hinaus hervorsteht, so dass insgesamt eine Art Einstülpung von der Oberseite 12a nach innen zum Kompartiment 60 für die Apertur 14 entsteht.
Bei der 4 erhebt sich ein Teil des Wandbereichs 11 der Apertur 14 von der Oberseite 12a des Substrats 12 aus in das Kompartiment 40, andererseits jedoch auch ein Teil des Wandbereichs 11 von der Unterseite 12b des Substrats 12 aus in das Kompartiment 60 hinein.
Die Höhen über der Oberseite 12a und über der Unterseite 12b, um welche sich der Wandbereich 11 für die Apertur 14 jeweils erhebt, können identisch sein. Dies ist aber nicht zwingend. In 4 sind sie unterschiedlich gestaltet.
Bei den Ausführungsformen der 1A sowie 3 und 4 ist der Querschnitt oder Durchmesser entlang der Erstreckungsrichtung des Wandbereichs 11 senkrecht zur Oberseite 12a bzw. senkrecht zur Unterseite 12b des Substrats 12 konstant in seinem Verlauf.
Alternativ können sich verjüngende oder erweiternde Querschnittsverläufe vorgesehen werden. Dies ist in der Abfolge der 5 bis 7 dargestellt, wobei die 5 eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Messanordnung zeigt, welche der Ausführungsform der 1 entspricht, jedoch mit einem Querschnittsverlauf für die Apertur 14, der sich mit zunehmendem Abstand von der Oberseite 12a verengt.
Bei der Ausführungsform der 6 ist dagegen analog dazu und im Vergleich zur Ausführungsform der 3 die Apertur 14 so ausgebildet, dass sich der Querschnittsverlauf mit Abstand von der Unterseite 12b des Substrats 12 verjüngt.
In Kombination der Ausführungsformen der 5 und 6 und in analoger Sichtweise zur Ausführungsform der 4 zeigt die 7 eine Apertur 14, bei welcher auf der Höhe des Substrats 12 der Durchmesser der Apertur 14 maximal ist und sich mit zunehmendem Abstand sowohl von der Oberseite 12a des Substrats 12 als auch von der Unterseite 12b des Substrats 12 aus verjüngt.
Gemäß der Ausführungsform der 1A ist die Messelektrode 30 mit dem Anschluss oder Leitung 31 stark benachbart und teilweise in den Aperturbereich 10 mit der Apertur 14 eingeführt ausgebildet. Die Position der Messelektrode 30 kann variiert sein, sie kann zum Beispiel stärker in den Elektrolytbereich 70 in der Apertur 14 hineingeführt sein oder weiter davon entfernt werden.
8 zeigt in schematischer und geschnittener Seitenansicht eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messanordnung 100, bei welcher der Aperturbereich 10 von einem Wandbereich 11 gebildet, welcher insgesamt nach Art einer Patchpipette ausgebildet ist.
Auch hier liegen ein Innenwandbereich 10i, 11i, welcher der Apertur 14 zugewandt ist, sowie ein Außenwandbereich 10a, 11a vor, wobei der Außenwandbereich 10a, 11a in der Anwendung einem außen liegenden Elektrolytkompartiment 40 des Bades 40, 60, 70 zugewandt ist und wobei der Innenwandbereich 10i, 11i dem in der Apertur 14 vorgesehenen Elektrolytkompartiment 70 des Bades 40, 60, 70 zugewandt ist. Am äußersten Bereich ist der die Apertur 14 bildende Wandbereich 11 ausgebildet, welcher den modifizierten Bereich 20 mit dem Material 12'' mit der modifizierten oder erhöhten Konzentration an der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies trägt somit die abdichtende oder sealende Anlagerung eines zu untersuchenden biologischen Objekts O unterstützen kann.
Die 2A bis 2D zeigen in größerem Detail den Ausschnitt X aus der 1A und verschiedene Abwandlungen hinsichtlich der Ausgestaltung des modifizierten Bereichs 20 mit dem Material 12'' mit der modifizierten oder erhöhten Konzentration an der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies.
Bei der 2A erstreckt sich der konzentrationsmodifizierte Bereich 20 mit dem konzentrationsmodifizierten Material 12'' über den gesamten obersten Abschnitt des Wandbereichs 11, die Konzentrationsänderung betrifft dort eine Schicht bis zur Tiefe Δ von etwa 10 nm und dabei die Innenwand 11i der Aperturwand 11 und deren Außenwand 11a.
Bei der Ausführungsform gemäß 2B liegt die Konzentrationsmodifikation mit der Schichttiefe Δ nur bis zu einem bestimmten Abstand oder Höhe δ von der Oberkante 11o oder vom oberen Rand 11o der Aperturwand 11 vor.
Bei der 2C sind nur der oberste Bereich der Innenseite 10i, 11i und der oberste Abschnitt bis zur Schichttiefe Δ betroffen und in der Konzentration modifiziert.
Bei der Ausführungsform gemäß 2D ist dagegen nur die Innenseite 10i, 11i bis zur Schichttiefe Δ betroffen und in der Konzentration modifiziert.
Die 9A bis 9E zeigen in schematischer und geschnittener Seitenansicht verschiedene Messprinzipien, die bei der erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messanordnung 100 und dem entsprechenden erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messverfahren zum Tragen kommen können.
Ausgehend von der in 9A dargestellten Situation, bei welcher durch ein leichtes Ansaugen des Elektrolytbades 40, 60, 70 durch die Messapertur 14, also mit einem Sog vom Kompartiment 40 über das Kompartiment 70 in der Apertur 14 zum Kompartiment 60 hin, wird ein biologisches Objekt O, in diesem Fall zum Beispiel eine Zelle, angesaugt und an die Apertur 14 angenähert.
Der Mechanismus des Annäherns kann auch auf eine andere manipulative Art und Weise erfolgen, zum Beispiel mittels einer separaten Pipette, einer Laserpinzette oder dergleichen.
Über einen leichten Unterdruck wird gemäß 9B die Zelle ohne jegliche Zerstörung und komplett an die Messapertur 14 angelagert. Wird in diesem Zustand eine Messung durchgeführt, so spricht man vom so genannten Cell-Attached-Modus.
Durch einen mechanischen Zug kann, ausgehend von der in 9B beschriebenen Situation ein Membranfleck aus der Membran des biologischen Objekts O herausgerissen werden, so dass gemäß 9C der herausgerissene Membranfleck, ein so genannter Patch, im abgedichteten oder gesealten Zustand in der Messapertur 14 verbleibt und das eigentlich Messobjekt O bildet. Dabei zeigt durch das Herausreißen die vorher im Inneren angeordnete Seite des Membranflecks nach außen, also zum Kompartiment 40 hin. Aus diesem Grund heißt dieser Messmodus auch Inside-Out-Modus.
Andererseits kann, ausgehend von der in 9B dargestellten Situation durch einen erneuten Unterdruck, nämlich z. B. nach Art eines Druckstoßes die Zelle O insgesamt geöffnet werden, so dass ein Übergang stattfindet vom so genannten Cell-Attached-Modus zum Whole-Cell-Modus gemäß 9D, bei dem die Messelektrode 30 direkten Zugriff auf das gesamte Zellinnere hat. Das heißt, das Zellinnere ist zu den Kompartimenten 70 und 60 hin geöffnet, gegenüber dem Kompartiment 40 jedoch im Wesentlichen isoliert.
Von der Situation gemäß der 9D, nämlich dem Whole-Cell-Modus kann durch mechanischen Zug erreicht werden, dass wiederum ein Membranfragment aus der Membran des biologischen Objekts herausgerissen wird. Da vorher der Whole-Cell-Modus vorlag, besteht eine gewisse Wahrscheinlichkeit dafür, dass dabei der herausgerissene Membranfleck derart in der Messapertur 14 verbleibt, dass er als eigentliches Messobjekt O dienen kann und dabei gemäß 9E die Außenseite der Zellmembran oder der Membran des biologischen Objekts auch außen verbleibt. In diesem Fall spricht man vom Outside-Out-Modus der Messanordnung 100.
10 zeigt im Detail die geometrische Situation, die bei einem abgedichteten oder sealenden Anlagern eines zu vermessenen biologischen Objekts O zwischen dessen Membran M und der Messapertur 14 und insbesondere der Innenwand 10i, 11i des Wandbereichs 11 vorliegt. Der vorderste Abschnitt des Wandbereich 11 wird vom konzentrationsmodifizierten Bereich 20 mit oder aus dem Material 12'' mit modifizierter Konzentration gebildet.
Bei der 10 handelt es sich erneut um einen Whole-Cell-Modus, bei welchem die gesamte Zelle O mit ihrem Inneren zur Messelektrode 30 und zu den Elektrolytkompartimenten 60 und 70 hin geöffnet ist. Diese Ausführungsform der erfindungsgemäßen elektrophysiolgischen Messanordnung 100 ist hier nach Art einer Patchpipette ausgestaltet.
Erfindungsgemäß wird der Abdichtwiderstand zwischen der Zellmembran M des zu vermessenden biologischen Objekts O und der Innenwand 10i, 11i des Wandbereichs 11 der Messapertur 14 dadurch verbessert, dass der konzentrationsmodifizierte Bereich 20 mit oder aus dem Material 12'' mit modifizierter Konzentration vorgesehen ist und in Wechselwirkung tritt mit der Außenseite Zellmembran M des biologischen Objekts O.
Erfindungsgemäß ist es somit durch Wahl der Modifikation der Konzentration im konzentrationsmodifizierten Bereich 20 nach Art und Stärke möglich, den verschiedenen Situationen an unterschiedlichen Oberflächen von Membranen M, seien dies Zellmembran, Membranen von Organellen oder Membranen von künstlichen Objekten, Rechnung zu tragen. Dies war bisher so nicht möglich und bietet eine Möglichkeit, ein Anlagern und einen Seal gesteuert zu fördern bzw., ist ein Seal erst einmal hergestellt, zu stabilisieren.
Bei der Ausführungsform gemäß 11 ist das Substrat quasi von einer Schicht von Zellen O' belegt. Über die mechanische und/oder elektrische Wechselwirkung unter Einsatz des erfindungsgemäß in der Aperturwand 11 vorgesehenen konzentrationsmodifizierten Bereich 20 mit oder aus dem Material 12'' mit modifizierter Konzentration ist eine einzelne Zelle O des Ensembles von Zellen O' als Messobjekt im Whole-Cell-Modus analog zur Situation gemäß 9D bei verbesserter abdichtender oder sealender Anlagerung einer elektrophysiologischen Messung zugänglich.
12 zeigt eine Anordnung der erfindungsgemäßen Messanordnung 100, bei der der eine Apertur 14 bildende Wandbereich 11 von einem Rand oder Randbereich gebildet wird, so dass die Apertur 14 quasi als planares Loch in dem zu Grunde liegenden Substrat 12 ausgebildet ist und dabei der konzentrationsmodifizierte Bereich 20 mit oder aus dem Material 12'' den Randbereich mit einer entsprechend abgewandelten Konzentration mindestens einer materiellen oder Ionenspezies bildet, um das Anlagern zu fördern und den Abdichtwiderstand zu steigern.
Bezugszeichenliste

10: Aperturbereich
10a: Außenwand, Außenwandbereich, Außenseite des Aperturbereichs 10
10i: Innenwand, Innenwandbereich, Innenseite des Aperturbereichs 10
11: Wandbereich, Wand, Aperturwand
11a: Außenwand, Außenwandbereich, Außenseite des Wandbereichs 11
11i: Innenwand, Aperturinnenwand, Innenwandbereich, Innenseite des Wandbereichs 11
11o: oberer Rand/Oberkante Außenwand, Außenwandbereich, Außenseite der Aperturwand 11
11u: unterer Rand/Unterkante Außenwand, Außenwandbereich, Außenseite der Aperturwand 11
12: Substrat, Träger, Basis, Grundsubstrat
12': Trägermaterial oder Substratmaterial (mit normaler Konzentration)
12'': Material, Trägermaterial oder Substratmaterial mit modifizierter, insbesondere erhöhter Konzentration einer materiellen oder Ionenspezies
12a: Oberseite, Vorderseite
12b: Unterseite, Rückseite
12i: Inneres oder innerer Bereich des Trägers 12, Bulk des Trägers 12
14: Apertur, Messapertur
20: Bereich mit modifizierter, insbesondere erhöhter Konzentration; konzentrationsmodifizierter Bereich
30: Messelektrode, Messelektrodenanordnung
31: Messleitung, Leitung
40: Elektrolytkompartiment, Elektrolytbad
50: Gegenelektrode, Gegenelektrodenanordnung
51: Leitung
40: Elektrolytkompartiment, Elektrolytbad zur Oberseite 12a des Trägers 12
60: Elektrolytkompartiment, Elektrolytbad zur Rückseite 12b des Trägers 12
70: Elektrolytkompartiment, Elektrolytbad im Lumen der Apertur 14
100: elektrophysiologische Messanordnung
M: Membran des biologischen Objekts O
O: biologisches Objekt, Zelle, Liposom, Vesikel, Mizelle, Oozyt, Messobjekt
O': biologisches Objekt, Zelle, Liposom, Vesikel, Mizelle, Oozyt
δ: Höhe des konzentrationsmodifizierten Bereichs 20 in der Aperturwand 11
Δ: Tiefe oder Schichtstärke des konzentrationsmodifizierten Bereichs 20

Claims

Elektrophysiologische Messanordnung (100), mit einem Träger (12), welcher zumindest in seinem Inneren (12i) aus einem Trägermaterial (12') mit einer gegebenen Zusammensetzung besteht, und mit einem Aperturbereich (10) im Bereich des Trägers (12) zum gesteuerten abdichtenden Anlagern eines biologischen Objekts (O), wobei der Aperturbereich (10) mit mindestens einer Apertur (14) sowie mit einem Wandbereich (11) ausgebildet ist, welcher als Aperturinnenwand (11i) die Apertur (14) bildend umgibt, wobei zumindest der Wandbereich (11) mit einem Bereich (20) aus einem Material (12'') ausgebildet ist, welches dem Material des Trägers (12) außerhalb des Aperturbereichs (10) oder dem Material im Inneren (12i) des Trägers (12) zumindest in seiner Zusammensetzung im Mittel im Wesentlichen entspricht, gegenüber diesem jedoch hinsichtlich mindestens einer materiellen Spezies oder Ionenspezies eine erhöhte Konzentration aufweist, so dass durch diese erhöhte Konzentration an oder in zumindest der Aperturinnenwand (11i) der Apertur (14) das abdichtende Anlagern eines biologischen Objekts (O) am Aperturbereich (10) förderbar ist, und wobei die Konzentration der mindestens einen materiellen Spezies oder Ionenspezies bis zu einer vorgegebenen Tiefe 10 nm von der Oberfläche des Trägers (12) von der Aperturinnenwand (11i) her modifiziert ist und wobei die mindestens eine materielle Spezies oder Ionenspezies Protonen (H⁺) aufweist.
Messanordnung (100) nach Anspruch 1, wobei die Erhöhung der Konzentration der mindestens einen materiellen Spezies oder Ionenspezies räumlich lokal auf den Bereich (20) des Wandbereichs (11) derart beschränkt ist, dass das Material des Trägers (12) zumindest in einem Bereich außerhalb des Aperturbereichs (10) keine erhöhte Konzentration der mindestens einen materiellen Spezies oder Ionenspezies aufweist.
Messanordnung (100) nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Konzentration der mindestens einen materiellen Spezies oder Ionenspezies mittels einer Implantation erhöht ausgebildet ist, insbesondere vermittelt über einen Plasmaprozess, über einen Sputterprozess oder über einen Ionenstrahlprozess.
Messanordnung (100) nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher der Aperturbereich (10) im Bereich des Trägers (12), der eine Oberseite (12a) und eine Unterseite (12b) aufweist, ausgebildet ist und bei welcher ein jeweiliger eine Apertur (14) bildender Wandbereich (11) in Bezug auf die Oberseite (12a) und/oder in Bezug auf die Unterseite (12b) des Trägers (12) teilweise oder vollständig hervorsteht.
Messanordnung (100) nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher ein eine Apertur (14) bildender Wandbereich (11) nach Art einer Mantelfläche oder als Kombination von Mantelflächen ausgebildet ist, insbesondere jeweils auf der Grundlage eines Mantels eines Zylinders, eines Prismas, eines Kegelstumpfs und/oder eines Pyramidenstumpfs.
Messanordnung (100) nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher ein eine Apertur (14) bildender Wandbereich (11) mit oder aus einem Material aus der Gruppe von Materialien ausgebildet ist, welche Glas, Quarzglas, Silizium, Kohlenstoff und deren aufweist.
Messanordnung (100) nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher der Durchmesser der Apertur (14) und insbesondere der Innendurchmesser des die Apertur (14) bildenden Wandbereichs (11) einen Wert im Bereich von 1 μm bis 50 μm aufweist und/oder bei welcher der eine Apertur (14) bildende Wandbereich (11) über der Oberseite (12a) oder der Unterseite (12b) des Trägers (12) eine Höhe oder Tiefe im Bereich von 0 μm bis 20 μm aufweist.
Messanordnung (100) nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher eine Messelektrode (30) im Bereich (70) oder innerhalb der Apertur (14) oder in einem Bereich (60) auf der Unterseite (12b) des Trägers (12) vorgesehen ist und bei welcher eine Gegenelektrode (50) außerhalb der Apertur (14) und im Bereich (40) auf der Oberseite (12a) des Trägers (12) vorgesehen ist.
Elektrophysiologisches Messverfahren unter Verwendung einer elektrophysiologischen Messanordnung (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei welchem zum Steuern des abdichtenden Anlagerns eines zu vermessenden biologischen Objekts (O) an einer Apertur (14) eines Aperturbereichs (10) zumindest ein Bereich (20) eines die Innenwand (11i) eines die Apertur (14) bildenden Wandbereichs (11) bezüglich mindestens einer materiellen Spezies oder Ionenspezies gesteuert mit einer entsprechend geeigneten und gegenüber der Konzentration der mindestens einen materiellen Spezies oder Ionenspezies im Träger (12) in einem Bereich außerhalb des Aperturbereichs (10) erhöhten Konzentration ausgebildet ist oder wird.