DE102010013555A1

DE102010013555A1 - Use of biomarkers sFlt and PIGF in the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension

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Publication number: DE102010013555A1
Application number: DE102010013555A
Authority: DE
Inventors: Dr. Nef Holger; Prof. Dr. Ghofrani Ardeshir; Prof. Dr. Hamm Christian; Prof. Dr. Grimminger Friedrich; Dr. Möllmann Helge; Prof. Dr. Schermuly Ralf; Prof. Dr. Zeiher Andreas; Prof. Dr. Dimmeler Stefanie
Original assignee: Justus Liebig Universitaet Giessen; Goethe Universitaet Frankfurt am Main
Current assignee: Justus Liebig Universitaet Giessen; Goethe Universitaet Frankfurt am Main
Priority date: 2010-03-31
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2011-10-06
Also published as: WO2011121075A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose, Früherkennung und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt und/oder Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung bei einem Subjekt, umfassend das Quantifizieren mindestens einer Komponente des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor(VEGF)-Signalwegs als Biomarker, insbesondere das Quantifizieren der Biomarker soluble Fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt) und/oder placental growth factor (PlGF). Weiterhin betrifft die Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, und seine Verwendung.The present invention relates to a method for diagnosing, early detection and / or risk stratification of pulmonary hypertension in a subject and / or monitoring therapy for such a disease in a subject, comprising quantifying at least one component of the vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway as a biomarker , especially the quantification of the biomarkers soluble Fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt) and / or placental growth factor (PlGF). The invention also relates to a diagnostic kit for carrying out the method according to the invention and its use.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose, Früherkennung und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt und/oder Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung bei einem Subjekt, umfassend das Quantifizieren mindestens einer Komponente des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor(VEGF)-Signalwegs als Biomarker, insbesondere das Quantifizieren der Biomarker soluble Fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt) und/oder placental growth factor (PlGF). Weiterhin betrifft die Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, und seine Verwendung.The present invention relates to a method for the diagnosis, early detection and / or risk stratification of a subject's hypertension and / or monitoring of a therapy of such a disorder, comprising quantifying at least one component of the vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway as a biomarker , in particular quantifying the biomarker soluble Fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt) and / or placental growth factor (PlGF). Furthermore, the invention relates to a diagnostic kit for carrying out the method according to the invention, and its use.

Beschreibungdescription

Die pulmonale Hypertonie (PH), ist eine schwerwiegende progressive Erkrankung, die unbehandelt innerhalb weniger Jahre zum Tode führt. Klinische Merkmale umfassen einen zunehmenden Anstieg des Blutdrucks im Lungenkreislauf, mit einer darauf folgenden Rechtsherzinsuffizienz. Eine Diagnose einer pulmonalen Hypertonie wird klassisch durch direkte Messung des pulmonal-arteriellen Drucks gestellt. Eine pulmonal-arterielle Druckerhöhung liegt vor, wenn der pulmonal-arterielle Mitteldruck 20 mmHg („Borderlinehypertonie”) bzw. 25 mmHg überschreitet (manifeste pulmonale Hypertonie). Unter dem zunehmenden Gefäßwiderstand nimmt die Leistung des Herzens kontinuierlich ab.Pulmonary hypertension (PH) is a serious progressive disease that, if untreated, causes death within a few years. Clinical features include an increasing increase in blood pressure in the pulmonary circulation, with consequent right heart failure. A diagnosis of pulmonary hypertension is classically made by direct measurement of pulmonary arterial pressure. A pulmonary artery pressure increase occurs when the pulmonary-arterial mean pressure exceeds 20 mmHg (borderline hypertension) or 25 mmHg (manifest pulmonary hypertension). Under the increasing vascular resistance, the performance of the heart continuously decreases.

Pathophysiologisch führt bei einer pulmonal-arteriellen Hypertonie (PAH) die Kombination aus muskulärer Gefäßengstellung (Vasokonstriktion), Hypertrophie und Hyperplasie der Gefäßwandzellen (Gefäßremodelling) und in-situ Thrombosierung zu einer Verengung der Lungenstrombahn. Als früheste Störung wird eine endotheliale Dysfunktion in den Gefäßen vermutet. Auslöser dieser pathophysiologischen Prozesse können inflammatorische Stimuli, ein Ungleichgewicht vasoaktiver Mediatoren (z. B. verminderte Produktion von vasodilatierenden und antiproliferativen Mediatoren wie Prostacyclin und Stickstoffmonoxid (NO) sowie eine Erhöhung des Endothelin-1 Spiegels), (auto)-immunologische Prozesse oder chronischer Sauerstoffmangel sein. Von der Gruppe der PAH abzugrenzen sind pulmonalvenöse Hypertonien aufgrund von Linksherzerkrankungen, pulmonale Hypertonien assoziiert mit Lungenerkrankungen und/oder Hypoxie, sowie chronisch thrombo-embolische pulmonale Hypertonien.Pathophysiologically, in pulmonary arterial hypertension (PAH), the combination of muscular vasoconstriction, hypertrophy and hyperplasia of the vessel wall cells (vascular remodeling) and in-situ thrombosis leads to a constriction of the pulmonary circulation. The earliest disorder suspected is endothelial dysfunction in the vessels. These pathophysiological processes can trigger inflammatory stimuli, an imbalance of vasoactive mediators (eg diminished production of vasodilating and antiproliferative mediators such as prostacyclin and nitric oxide (NO) and endothelin-1 level elevation), (auto) immunological processes or chronic hypoxia be. To be distinguished from the group of PAH are pulmonary venous hypertension due to left heart disease, pulmonary hypertension associated with lung disease and / or hypoxia, as well as chronic thrombo-embolic pulmonary hypertension.

Die einleitenden Symptome der PH sind unspezifisch. Zunehmende Belastungsdyspnoe, Leistungsabfall, Müdigkeit und Abgeschlagenheit sind typisch. Später kommen Zeichen der Rechtsherzinsuffizienz, wie Halsvenenstauung und periphere Ödeme, aber auch Zyanose und Angina pectoris hinzu. Hochverdächtig sind Synkopen bei oder nach körperlicher Belastung. Bei unklarer Dyspnoe und Leistungsabfall sollte eine latente oder manifeste PH ausgeschlossen werden. Die Patienten leiden unter stark reduzierter körperlicher Leistungsfähigkeit und Kreislaufstörungen, bis hin zum Versagen der rechten Herzseite, welches schließlich zum Tode des Patienten führt.The initial symptoms of PH are nonspecific. Increasing exertional dyspnea, performance decline, fatigue and fatigue are typical. Later signs of right ventricular failure, such as cervical congestion and peripheral edema, but also cyanosis and angina pectoris are added. Highly suspicious are syncope during or after exercise. In case of unclear dyspnea and loss of performance, a latent or manifest PH should be excluded. The patients suffer from greatly reduced physical performance and circulatory disorders, up to the failure of the right side of the heart, which ultimately leads to the death of the patient.

Therapeutische Maßnahmen umfassen derzeit zum einen die schnellstmögliche Beseitigung der zur pulmonalen Hypertonie führenden Vorerkrankung. Geschieht dies zu spät, so dass sich bereits eine fixierte Gefäßverengung eingestellt hat, ist nur noch eine palliative Behandlung, oder eine Herz-Lungen Transplantation möglich. Im Rahmen der PAH bestehen derzeit beschränkte therapeutische Optionen, welche nicht kurativ sind. Neben allgemeinen Massnahmen, wie einer Langzeitsauerstofftherapie oder Antikoagulation, wurden in den letzten Jahren verschiedene neue therapeutische Ansätze verwirklicht (Gabe von Endothelinrezeptorantagonisten, Phosphodiesterase-5 Inhibitoren oder Prostazyklin-Analoga), die eine Verbesserung der Leistungsfähigkeit, der Lebensqualität und des Überlebens ermöglichen.Therapeutic measures currently include, on the one hand, the fastest possible elimination of the previous disease leading to pulmonary hypertension. If this happens too late, so that a fixed vasoconstriction has already set, only a palliative treatment, or a heart-lung transplantation is possible. PAH currently has limited therapeutic options that are not curative. In addition to general measures, such as long-term oxygen therapy or anticoagulation, various new therapeutic approaches have been realized in recent years (administration of endothelin receptor antagonists, phosphodiesterase-5 inhibitors or prostacyclin analogs), which enable an improvement in performance, quality of life and survival.

Die retrospektiven Daten der letzten 5 Jahre aus den französischen und irischen Patientenregistern zeigen allerdings, dass die mittlere Überlebenszeit aller neu diagnostizierten PAH Patienten, auch bei Verfügbarkeit spezifischer Medikamente, 4 Jahre nicht übersteigt. Das stellt etwa eine Verdoppelung der mittleren Überlebenszeit im Vergleich zum historischen US-amerikanischen Register aus Zeiten fehlender spezifischer Therapien dar. Die Mortalität der Patienten in den Nachbeobachtungsphasen randomisierter Zulassungsstudien lag innerhalb der ersten 2 Jahre fortgesetzter Therapie meist unter 10%. Diese Diskrepanz spiegelt offensichtlich eine Selektion stabiler Patienten bei der Studienrekrutierung wider.However, the retrospective data from the French and Irish patient records for the last 5 years shows that the median survival of all newly diagnosed PAH patients does not exceed 4 years, even if specific drugs are available. This represents approximately a doubling of the mean survival time compared to the historical US registry for times of lacking specific therapies. The mortality of the patients in the follow-up phases of randomized approval studies was mostly below 10% within the first 2 years of continued therapy. This discrepancy apparently reflects a selection of stable patients in study recruitment.

Die Diagnosestellung in einem frühen Krankheitsstadium führt zu einer längeren Überlebenszeit unter Therapie im Vergleich zu einer Erstdiagnose in fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung. Selbst Patienten in funktionellem NYHA Stadium II (Klassifikation der New York Heart Association) haben, wie die kürzlich durchgeführte EARLY Studie zeigte, bereits meist eine mittelschwere pulmonale Hypertonie, die ohne Therapie rasch in NYHA Stadien III–IV übergeht. Eine frühzeitige Therapie führte hier zur Stabilisierung der Patienten. Voraussetzung hierfür ist eine rechtzeitige Erkennung früher Krankheitssignale.Diagnosis at an early stage of disease leads to a longer survival time under therapy compared to a first diagnosis in advanced stages of the disease. Even patients in functional NYHA stage II (Classification of the New York Heart Association) have, as the recent EARLY study showed, already usually a moderate pulmonary hypertension without therapy passes quickly into NYHA stadiums III-IV. An early therapy led to the stabilization of the patients. This requires a timely detection of early disease signals.

Eine frühzeitige Diagnose ist folglich für eine erfolgreiche Behandlung der Erkrankung unerlässlich. Die genaueste Messung des pulmonal-arteriellen Druckes ist nur über die invasive Messung mittels eines Rechtsherzkatheters möglich. Allerdings sind hiermit nicht unerhebliche Risiken verbunden. Eine nicht-invasive Möglichkeit der Messung des pulmonalarteriellen Druckes ist durch eine echokardiographische Untersuchung zu erreichen. Jedoch ist die Echokardiographie gerade in den Niedergelassenen-Bereichen der ärztlichen Versorgung nur beschränkt verfügbar. Zusätzlich liefert ein Röntgenbild des Thorax weitere Hinweise auf die Erkrankung. Der „6-Minuten-Gehtest” (6-MGT) wird bei Patienten angewendet, um Informationen über die körperliche Leistungsfähigkeit zu erhalten. Gemessen wird die in 6 Minuten gehend zurück gelegte Strecke.Early diagnosis is therefore essential for successful treatment of the disease. The most accurate measurement of pulmonary arterial pressure is only possible via invasive measurement using a right-heart catheter. However, this involves considerable risks. A non-invasive way of measuring pulmonary artery pressure can be achieved by echocardiographic examination. However, echocardiography is only limitedly available in the established areas of medical care. In addition, an X-ray of the thorax provides further evidence of the disease. The "6-Minute Walking Test" (6-MGT) is used in patients to obtain information about physical performance. The measured in 6 minutes walking distance is measured.

Von besonderem Wert sind deshalb sog. Biomarker, die mögliche Hinweise auf das Vorliegen einer PH liefern können. Allerdings kann derzeit nur auf die Bestimmung des B-type natriuretic peptide (BNP) zurückgegriffen werden. BNP ist ein sehr früh beschriebener Marker in der PH, für den hinsichtlich diagnostischer und prognostischer Wertigkeit signifikante Daten dokumentiert werden konnten ( Munagala VK, Burnett JC, Jr., and Redfield MM, The natriuretic peptides in cardiovascular medicine. Curr Probl Cardiol, 2004. 29(12): 707–69 ). Allerdings ist die Expression und Bildung von BNP auf das Myokard beschränkt, so dass eine Erkennung der pulmonal-arteriellen Umgestaltung nur nach nachfolgender Schädigung des Myokards, vor allem des rechten Ventrikels möglich ist.Of particular value are therefore so-called biomarkers, which can provide possible indications of the presence of a PH. However, currently only the determination of the B-type natriuretic peptide (BNP) can be used. BNP is a very early described marker in PH, for which significant data could be documented in terms of diagnostic and prognostic value ( Munagala VK, Burnett JC, Jr., and Redfield MM, The natriuretic peptides in cardiovascular medicine. Curr Probl Cardiol, 2004. 29 (12): 707-69 ). However, the expression and formation of BNP is limited to the myocardium, so that detection of pulmonary-arterial remodeling is possible only after subsequent damage to the myocardium, especially the right ventricle.

Frühere Untersuchungen konnten zeigen, dass der VEGF-Signalweg im Pathomechanismus von hypoxischen Zuständen, beispielsweise in einer Präeklampsie eine wichtige diagnostische und prognostische Rolle spielt. Aus der Patentanmeldung US 2004/126828 (Karumanchi et al.) ist ein Verfahren zur Diagnose von Präeklampsie oder Eklampsie bekannt, welches die Messung der Konzentration von sFlt-1, VEGF oder PlGF umfasst, wobei die für die drei Marker erhaltenen Ergebnisse miteinander in Beziehung gesetzt werden, um einen so genannten „angiogenen Index” zu ermitteln. Allerdings liegt dem Krankheitsbild Präeklampsie bzw. Eklampsie eine völlig andere Ätiologie als der pulmonalen Hypertonie zugrunde.Previous studies have shown that the VEGF signaling pathway plays an important diagnostic and prognostic role in the pathomechanism of hypoxic conditions, for example in pre-eclampsia. From the patent application US 2004/126828 (Karumanchi et al.) A method for the diagnosis of pre-eclampsia or eclampsia is known, which comprises the measurement of the concentration of sFlt-1, VEGF or PlGF, wherein the results obtained for the three markers are related be set to determine a so-called "angiogenic index". However, the clinical picture preeclampsia or eclampsia is based on a completely different etiology than pulmonary hypertension.

Bei vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren handelt es sich um eine Familie von sekretierten Polypeptiden, die durch eine Gruppe von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen in Endothelzellen die Bildung von Blutgefäßen fördern. Die Familie umfasst eine Reihe von verschiedenen VEGF Varianten, insbesondere VEGF-A bis D und den plazentalen Wachstumsfaktor (PlGF). Zur Signalweiterleitung binden unterschiedliche VEGFs an unterschiedliche VEGF-Rezeptoren, beispielsweise bindet VEGF-A an VEGFR-1 (Flt-1) und VEGFR-2.Vascular endothelial growth factors are a family of secreted polypeptides that promote the formation of blood vessels by a group of receptor tyrosine kinases in endothelial cells. The family comprises a number of different VEGF variants, in particular VEGF-A to D and placental growth factor (PlGF). For signaling, different VEGFs bind to different VEGF receptors, for example, VEGF-A binds to VEGFR-1 (Flt-1) and VEGFR-2.

Flt-1 bindet außer VEGF auch dessen homologen Faktor PlGF und tritt in zwei Formen auf: einerseits als membrangebundene Rezeptortyrosinkinase (Flt-1), welche die angiogenen Signale ins Zellinnere überträgt, und andererseits als eine lösliche Ektodomäne (soluble Flt-1, sFlt-1), deren Aufgabe es ist, die freien Faktoren PlGF oder VEGF in der Zirkulation abzufangen. Da der löslichen Form von Flt-1 eine zytosolische Domäne fehlt, ist die Funktion von sFlt-1 darauf beschränkt, die Menge an zirkulierendem PlGF oder VEGF, die als freie Faktoren zur Aktivierung der membrangebundenen Rezeptoren Flt-1 und Flk-1 (fötale Leberkinase-1) verfügbar sind, zu regulieren.In addition to VEGF, Flt-1 also binds its homologous factor PlGF and occurs in two forms: on the one hand as membrane-bound receptor tyrosine kinase (Flt-1), which transfers the angiogenic signals into the cell interior, and on the other hand as a soluble ectodomain (soluble Flt-1, sFltF). 1), whose task is to intercept the free factors PlGF or VEGF in the circulation. Because the soluble form of Flt-1 lacks a cytosolic domain, the function of sFlt-1 is limited to the amount of circulating PlGF or VEGF used as free factors to activate the membrane-bound receptors Flt-1 and Flk-1 (fetal liver kinase -1) are available to regulate.

Aus dem Dokument US 2004/126828 geht hervor, dass eine erhöhte Konzentration von sFlt-1 und eine erniedrigte Konzentration von VEGF als diagnostischer Indikator einer Präeklampsie dienen. Eine bestehende Präeklampsie oder ein erhebliches Risiko, eine solche zu entwickeln, ist festzustellen, wenn der angiogene Index, bestimmt nach der Formel [sFlt-1/VEGF + PlGF] > 20 beträgt, d. h. wenn die Konzentration von s-Flt-1 mehr als 20-mal so hoch ist, wie die von VEGF und PlGF zusammen. Ein sFlt-1-Serumspiegel > 2 ng/ml wird als positiver Indikator einer Präeklampsie angesehen.From the document US 2004/126828 shows that an increased concentration of sFlt-1 and a decreased concentration of VEGF serve as a diagnostic indicator of pre-eclampsia. Existing pre-eclampsia or a significant risk of developing such is found when the angiogenic index determined by the formula [sFlt-1 / VEGF + PlGF]> 20, ie when the concentration of s-Flt-1 exceeds 20 times as high as that of VEGF and PlGF together. An sFlt-1 serum level> 2 ng / ml is considered a positive indicator of preeclampsia.

Levine et al. befassen sich mit einer Studie an schwangeren Frauen mit Präeklampsie, die eine Messung der Konzentration von angiogenen Faktoren, nämlich sFlt-1, VEGF und PlGF, im Serum von Patientinnen im Vergleich zu Gesunden Frauen umfasst. Interessanterweise konnte festgestellt werden, dass in späteren Schwangerschaftsmonaten die Konzentrationen von sFlt-1 bei Präeklampsie zunahm, bei gleichzeitiger Abnahme der Konzentration von PlGF ( Levine et al., 2004, N Engl J Med. ).Levine et al. are studying a study in pregnant women with pre-eclampsia, which includes a measurement of the concentration of angiogenic factors, namely sFlt-1, VEGF and PlGF, in the serum of patients compared to healthy women. Interestingly, it was found that in later pregnancy months, the levels of sFlt-1 increased with pre-eclampsia, while the concentration of PlGF ( Levine et al., 2004, N Engl J Med. ).

Widmer et al. beschreibt eine Übersicht der Studien über Präeklampsie und sFlt und kommt zu dem Ergebnis, dass erhöhte Werte von sFlt bei niedrigen PlGF Konzentrationen im dritten Trimester der Schwangerschaft mit Präeklampsie, insbesondere mit schweren Fällen assoziiert sind ( Widmer et al., Obstet Gynecol. 2007 Jan. )Widmer et al. describes a review of the studies on preeclampsia and sFlt and concludes that elevated levels of sFlt at low PlGF concentrations in the third trimester of pregnancy are associated with preeclampsia, especially with severe cases ( Widmer et al., Obstet Gynecol. 2007 Jan )

In der WO 01/85796 werden Inhibitoren von PlGF sowie ein Verfahren zur Auffindung dieser Substanzen beschrieben. Die Erfindung basiert auf der Wirkung von PlGF als Faktor in der Angiogenese und Arteriogenese sowie auf der negativen Wirkung des Wachstumsfaktors in verschiedenen Erkrankungen, z. B. in der Tumorentstehung, bei inflammatorischen Erkrankungen und auch bei pulmonalem Bluthochdruck. Zwar beschreibt das Dokument die Verwendung der Inhibitoren, insbesondere eines Antikörpers, von PlGF zur Behandlung von pulmonalen Bluthochdruck bei unter Sauerstoffmangel gehaltenen Mäusen, die Verwendung von PlGF als Biomarker in der PH ist jedoch nicht beschrieben. In the WO 01/85796 are described inhibitors of PlGF and a method for finding these substances. The invention is based on the action of PlGF as a factor in angiogenesis and arteriogenesis as well as on the negative effect of the growth factor in various diseases, e.g. B. in tumorigenesis, in inflammatory diseases and also in pulmonary hypertension. Although the document describes the use of the inhibitors, in particular an antibody, of PlGF for the treatment of pulmonary hypertension in hypoxia-restricted mice, the use of PlGF as a biomarker in the PH is not described.

Eine Studie an Sichelzellenanämiepatienten hat gezeigt, dass eine erhöhte Konzentration von PlGF mit dem Auftreten der pulmonalen Hypertonie – hier eine Komplikation in Folge der Sichelzellenanämie – korreliert ( Brittain et al. Blond 2010 ). Diese Korrelation konnte allerdings ausschließlich in Sichelzellenanämiepatienten nachgewiesen werden. Zudem liegt die Ursache der verstärkten Expression von PlGF in diesem speziellen Fall bei der Hämolyse, die verstärkt bei Sichelzellenanämie auftritt. Durch die Hämolyse wird eine erhöhte Erythropoietin Produktion ausgelöst, die erwiesenermaßen PlGF Expression fördert ( Perelman et al, Blond 2003 ). Demnach handelt es sich hierbei um einen sehr speziellen Zusammenhang des Markers mit Sichelzellenanämie, der sich keinesfalls auf die pulmonale Hypertonie verallgemeinern lässt.A study on sickle cell anemia patients has shown that an increased concentration of PlGF correlates with the occurrence of pulmonary hypertension - here a complication due to sickle cell anemia ( Brittain et al. Blond 2010 ). However, this correlation could only be detected in sickle cell anemia patients. In addition, the cause of increased expression of PlGF in this particular case is hemolysis, which is more prevalent in sickle cell anemia. Hemolysis triggers increased erythropoietin production, which has been shown to promote PlGF expression ( Perelman et al., Blond 2003 ). Accordingly, this is a very specific context of the sickle cell anemia marker, which can by no means be generalized to pulmonary hypertension.

WO 06/045593 beschreibt die Verwendung von sFlt und PlGF als Marker bei der Diagnose und Risikostratifizierung koronarer Herzerkrankungen. Das Verfahren umfasst die Berechnung des Verhältnisses beider Marker, wobei ein Verhältnis von PlGF = hoch und sFlt = niedrig ein negatives Ereignis, zum Beispiel einen Myokardinfarkt und/oder Schlaganfall anzeigt. WO 06/045593 describes the use of sFlt and PlGF as markers in the diagnosis and risk stratification of coronary heart disease. The method involves calculating the ratio of both markers, where a ratio of PlGF = high and sFlt = low indicates a negative event, for example myocardial infarction and / or stroke.

Ausgehend vom Stand der Technik war es deshalb die Aufgabe der Erfindung, ein neues Verfahren zur Diagnose, Risikostratifizierung und insbesondere zur Früherkennung einer pulmonalen Hypotonie und zur Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung zur Verfügung zu stellen, wobei das Verfahren auf einfach bestimmbare Biomarker basiert, um die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Diagnoseverfahren, zum Beispiel der Rechtsherzechokardiographie, auszugleichen.Based on the prior art, it was therefore the object of the invention to provide a new method for diagnosis, risk stratification and in particular for the early detection of pulmonary hypotension and for monitoring a therapy of such a disease, the method being based on easily determinable biomarkers to compensate for the disadvantages of the diagnostic methods known in the art, for example right echocardiography.

Gelöst wird die oben gestellte Aufgabe in einem ersten Aspekt durch ein Verfahren zur Diagnose, Früherkennung und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt und/oder Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung bei einem Subjekt, umfassend der Schritte

(a) zur Verfügung stellen einer Probe aus einem Subjekt,
(b) Quantifizieren mindestens eines Markers in genannter Probe, wobei der Marker ausgewählt wird aus einer Komponente des VEGF(vaskulär endotheler Wachstumsfaktor)-Signalwegs,
(c) gegebenenfalls Quantifizieren mindestens eines weiteren Markers, und
(d) Vergleich des/der für die zu untersuchende Probe erhaltenen Ergebnisse/s mit Referenzwerten und/oder den Werten aus einer Referenzprobe.

The above object is achieved in a first aspect by a method for diagnosis, early detection and / or risk stratification of pulmonary hypertension in a subject and / or monitoring a therapy of such a disorder in a subject comprising the steps

(a) provide a sample from a subject,
(b) quantifying at least one marker in said sample, wherein the marker is selected from a component of the VEGF (vascular endothelial growth factor) signaling pathway;
(c) optionally quantifying at least one further marker, and
(d) comparison of the results obtained for the sample to be tested / s with reference values and / or the values from a reference sample.

Bevorzugt ist hierbei das oben genannte Verfahren, wobei die zu untersuchende Probe in-vitro oder ex-vivo zur Verfügung gestellt wird. Insbesondere ist ein erfindungsgemäßes Verfahren ein in-vitro oder ex-vivo Verfahren.Preference is given here to the abovementioned method, the sample to be examined being made available in vitro or ex vivo. In particular, a method according to the invention is an in vitro or ex vivo method.

Die Schritte (b) und (c) können nacheinander in dieser Reihenfolge, in umgekehrter Reihenfolge oder zeitgleich durchgeführt werden.Steps (b) and (c) may be performed sequentially in this order, in reverse order, or simultaneously.

Der Begriff „zur Verfügung stellen” einer zu untersuchenden Probe, wie hier verwendet, umfasst ein Bereitstellen einer Probe, in der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann. Dazu gehört beispielsweise die weitere Verarbeitung von durch Venenpunktion gewonnenem und mit Gerinnungshemmern, insbesondere EDTA, Heparin oder Citrat, behandeltem peripherem Blut zu Serum oder Plasma.The term "providing" a sample to be tested, as used herein, includes providing a sample in which the method of the invention can be performed. This includes, for example, the further processing of venipuncture-derived and anticoagulant, in particular EDTA, heparin or citrate, treated peripheral blood to serum or plasma.

Die Begriffe „Biomarker” und „Marker” bezeichnen endogene Substanzen, z. B. Proteine oder mRNA Moleküle, die beispielsweise das Auftreten eines pathophysiologischen Ereignisses im einem Organismus anzeigen. Als Biomarker werden auch Protein/mRNA kodierende Gensequenzen verstanden. So kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung durch Bestimmung der Gensequenz eines Markers in einer Probe, oder der epigenetischen Veränderungen dieser Sequenz, auf die Menge und/oder Funktionalität von Proteinen/mRNA geschlossen werden.The terms "biomarkers" and "markers" refer to endogenous substances, e.g. For example, proteins or mRNA molecules that indicate, for example, the occurrence of a pathophysiological event in an organism. Biomarkers are also understood to be protein / mRNA-encoding gene sequences. Thus, in the context of the present invention, by determining the gene sequence of a marker in a sample, or of the epigenetic changes of this sequence, it is possible to deduce the amount and / or functionality of proteins / mRNA.

Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft ”Diagnose” die Überprüfung, ob ein Subjekt an einer pulmonalen Hypertonie leidet. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft ”Prognose” die Vorhersage der Wahrscheinlichkeit (in %) ob ein an einer pulmonalen Hypertonie leidendes Subjekt im Beobachtungszeitraum eine Verschlechterung des Krankheitsbildes oder Tod erleiden wird. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft ”Stratifizierung der Therapie” die Ermittlung der geeigneten therapeutischen Behandlung für die pulmonale Hypertonie, die auftreten wird oder aufgetreten ist. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft ”Überwachung der Therapie” die Kontrolle und, gegebenenfalls, ein Einstellen der therapeutischen Behandlung eines Subjekts. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft ”Therapeutische Behandlung” jede Behandlung, die möglicherweise den pathophysiologischen Zustand eines Individuums verbessert z. B. die Verabreichung von Pharmazeutika, insbesondere Endothelinrezeptorantagonisten, Phosphodiesterase-5 Inhibitoren oder Prostazyklin-Analoga, sowie chirurgische Behandlung (z. B. Herz-Lungen-Transplantation).In the context of the present invention, "diagnosis" refers to the verification of whether a subject is suffering from pulmonary hypertension. In the context of the present invention, "prognosis" refers to the prediction of the probability (in%) of a subject suffering from pulmonary hypertension during the observation period worsening of the condition or death. In the context of the present invention, "stratification of therapy" refers to the determination of the appropriate therapeutic treatment for pulmonary hypertension that will occur or has occurred. In the context of the present invention, "monitoring therapy" refers to the control and, optionally, discontinuation of the therapeutic treatment of a subject. In the context of the present invention, "therapeutic treatment" refers to any treatment which may possibly improve the pathophysiological condition of an individual, e.g. The administration of pharmaceuticals, particularly endothelin receptor antagonists, phosphodiesterase-5 inhibitors or prostacyclin analogs, as well as surgical treatment (eg, heart-lung transplantation).

Weiter bevorzugt ist eine Ausführungsform des Verfahrens, wobei die zu untersuchende Probe ausgewählt wird aus der Gruppe beinhaltend Blut oder Fraktionen davon, insbesondere Blutplasma und Blutserum; und Gewebeproben, insbesondere histologische Gewebeproben wie histologische Schnitte, eine Suspension von Gewebezellen oder ein Gewebehomogenat.Further preferred is an embodiment of the method, wherein the sample to be examined is selected from the group comprising blood or fractions thereof, in particular blood plasma and blood serum; and tissue specimens, in particular histological tissue specimens such as histological sections, a suspension of tissue cells or a tissue homogenate.

Dabei muss davon ausgegangen werden, dass bei unterschiedlichen Probenspezies unterschiedliche Referenzwerte der Biomarker zur Feststellung einer pulmonalen Hypertonie verwendet werden. Es wird daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere bei Blutproben, Blutplasma oder Serum unterschieden ob die Probe zentral venöser Herkunft, beispielsweise gemischt venöses Blut aus der Lungenarterie, ist oder aus dem peripheren Blutkreislauf, beispielsweise der Cubitalvene entstammt. Bevorzugte Ausführungsformen des erfinderischen Verfahrens umfassen daher eine zu untersuchende Probe, wobei die Probe zentral venöses Blut ist oder peripheres Blut, insbesondere Blut aus der Cubitalvene, ist.It must be assumed that different reference values of the biomarkers are used to determine pulmonary hypertension in different sample species. It is therefore within the scope of the present invention, in particular for blood samples, blood plasma or serum, to distinguish whether the sample is of central venous origin, for example mixed venous blood from the pulmonary artery, or originates from the peripheral blood circulation, for example the cubital vein. Preferred embodiments of the inventive method therefore comprise a sample to be examined, the sample being central venous blood or peripheral blood, in particular blood from the cubital vein.

Erfindungsgemäß weiter bevorzugt ist das Subjekt des vorliegenden Verfahrens ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch.According to the invention, the subject of the present method is preferably a mammal, preferably a human.

Bevorzugt ist gemäß einer speziellen Ausführungsform ein Verfahren zur Diagnose, Früherkennung und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt und/oder Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung bei einem Subjekt der vorliegenden Erfindung, wobei die pulmonale Hypertonie eine pulmonal-arterielle Hypertonie (PAH) ist, aus der Gruppe bestehend aus idiopathische pulmonal-arterielle Hypertonie (IPAH), familiäre pulmonal-arterielle Hypertonie, assoziierte pulmonal-arterielle Hypertonie (APAH) und pulmonale veno-okklusive Erkrankung (PVO) und/oder pulmonal kapilläre Hämangiomatose (PCH); die pulmonale Hypertonie eine pulmonalvenöse Hypertonie in Verbindung mit einer Linksherzerkrankung ist; die pulmonale Hypertonie eine pulmonale Hypertonie in Assoziation mit Lungenerkrankungen und/oder Hypoxämie ist; oder die pulmonale Hypertonie eine chronisch thromboemlisch pulmonale Hypertonie (CTEPH) oder eine pulmonale Hypertonie mit unklaren und/oder multifaktoriellen Mechanismen ist.According to a specific embodiment, a method is preferred for the diagnosis, early detection and / or risk stratification of pulmonary hypertension in a subject and / or monitoring of a therapy of such a disorder in a subject of the present invention, wherein the pulmonary hypertension is pulmonary arterial hypertension (PAH). is, from the group consisting of idiopathic pulmonary arterial hypertension (IPAH), familial pulmonary arterial hypertension, associated pulmonary arterial hypertension (APAH) and pulmonary veno-occlusive disease (PVO) and / or pulmonary capillary hemangiomatosis (PCH); pulmonary hypertension is pulmonary venous hypertension associated with left heart disease; pulmonary hypertension is pulmonary hypertension associated with lung disease and / or hypoxemia; or pulmonary hypertension is a chronic thromboembolic pulmonary hypertension (CTEPH) or pulmonary hypertension with unclear and / or multifactorial mechanisms.

Weiter bevorzugt ist ein Verfahren zur Diagnose, Früherkennung und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt, wobei die pulmonale Hypertonie keine Komplikation ist, die in Zusammenhang mit einer Sichelzellenanämie auftritt.More preferred is a method for the diagnosis, early detection and / or risk stratification of pulmonary hypertension in a subject, wherein pulmonary hypertension is not a complication associated with sickle cell anemia.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt eine Komponente des VEGF(vaskulär endothelialer Wachstumsfaktor)-Signalwegs ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus VEGF, VEGFR, sFlt und PlGF, insbesondere ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Komponente des VEGF-Signalweg sFlt oder PlGF ist, vorzugsweise sFlt ist.The method according to the invention preferably comprises a component of the VEGF (vascular endothelial growth factor) signaling pathway selected from the group consisting of VEGF, VEGFR, sFlt and PlGF, in particular a method according to the invention, wherein the component of the VEGF signaling pathway is sFlt or PlGF, preferably sFlt is.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren das Quantifizieren eines weiteren Markers in Verfahrensschritt (c) der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus BNP, VEGF, VEGFR, sFlt und PlGF. Insbesondere bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren, wobei die Markerkombination das Quantifizieren von sFlt und BNP, oder PlGF und BNP, oder weiter bevorzugt sFlt und PlGF umfasst. Darüber hinaus betrifft eine spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, umfassend Quantifizieren der Marker sFlt und PlGF in Kombination mit dem Quantifizieren des Markers BNP.In a further preferred embodiment, the method according to the invention comprises quantitating a further marker in method step (c) which is selected from the group consisting of BNP, VEGF, VEGFR, sFlt and PlGF. Especially preferred is the method according to the invention, wherein the marker combination comprises the quantification of sFlt and BNP, or PlGF and BNP, or more preferably sFlt and PlGF. Moreover, a specific embodiment of the present invention relates to a method comprising quantifying the sFlt and PlGF markers in combination with quantifying the BNP marker.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Quantifizieren des Markers mittels Bestimmung der Proteinkonzentration, der mRNA Konzentration, der DNA-Methylierung und/oder der Bestimmung des Vorhandenseins von „single nucleotide polymorphisms” (SNPs) durchgeführt, insbesondere bevorzugt ist dabei ein Verfahren gemäß der Erfindung, wobei das Bestimmen der Konzentration mittels eines immunologischen Verfahrens mittels an die Marker bindender Moleküle erfolgt.According to the present invention, the quantification of the marker is carried out by determining the protein concentration, the mRNA concentration, the DNA methylation and / or the determination of the presence of "single nucleotide polymorphisms" (SNPs), particularly preferred is a method according to the invention, wherein the concentration is determined by means of an immunological method using molecules binding to the marker.

Unter „Quantifizieren” soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Bestimmung der Expression eines Biomarkers/Markers in einer Probe verstanden werden. Erfindungsgemäß kann dies sowohl direkt über den Nachweis der in der Probe vorhandenen Marker-mRNA oder Marker-Proteine erfolgen, aber auch indirekt über die Analyse der für den Marker kodierenden DNA. So können Mutationen nachgewiesen werden, die innerhalb des Markergens die Expression eines funktionsunfähigen Proteins zur Folge haben, oder auch innerhalb der Promoter Region des Markers, mit der Folge einer Veränderten Kinetik seiner Transkription. Auch epigenetische Veränderungen innerhalb des Genlokus des Markers, insbesondere der nicht-translatierten Regionen (UTRs), haben Einfluss auf die Expression von Markergenen und können mittels des Fachmanns bekannten Techniken überprüft werden. Epigenetische Veränderungen umfassen zum Beispiel DNA Methylierung oder Histonmodifizierung; Nachweistechniken sind dem Fachmann zur Genüge bekannt und können ohne erfinderischen Aufwand für das vorliegende Verfahren angewandt werden. For the purposes of the present invention, "quantification" is understood to mean the determination of the expression of a biomarker / marker in a sample. According to the invention, this can be done either directly via the detection of the marker mRNA or marker proteins present in the sample, but also indirectly via the analysis of the DNA coding for the marker. Thus, mutations can be detected which result in the expression of an inoperable protein within the marker gene, or even within the promoter region of the marker, with the consequence of an altered kinetics of its transcription. Also epigenetic changes within the gene locus of the marker, in particular the untranslated regions (UTRs), have an influence on the expression of marker genes and can be checked by techniques known to those skilled in the art. Epigenetic alterations include, for example, DNA methylation or histone modification; Detection techniques are well known to those skilled in the art and can be applied without inventive effort for the present method.

Das „Quantifizieren” von PlGF und/oder sFlt-1 kann außer in einer Konzentrationsbestimmung, z. B. in Blutplasma oder -serum, auch in einer Bestimmung der Anzahl der Moleküle, z. B. in einem histologischen Gewebeschnitt, bestehen.The "quantification" of PlGF and / or sFlt-1 may be other than in a concentration determination, e.g. In blood plasma or serum, also in a determination of the number of molecules, e.g. B. in a histological tissue section exist.

Das „Quantifizieren” kann erfindungsgemäß mittels Nachweis der transkribierten mRNA des zu bestimmenden Markers durchgeführt werden. Der Anteil der vorhandenen mRNA Moleküle des Markers wird dabei relativ zu einem internen Standart überprüft, der üblicherweise aus einem in allen Geweben gleichmäßig exprimierten „Housekeeping”-Gens ausgewählt wird. Alle dem Fachmann bekannten Methoden zur mRNA-Quantifizierung können für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann die Bestimmung der relativen Anzahl an mRNA Molekülen in einer Probe in einer quantitativen Echtzeit PCR nachgewiesen werden. Weitere Verfahren zum Quantifizieren der mRNA-Expression der Marker des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen Microarray Expressionsanalysen, Northern Blots, „deep” Sequenzierung oder auch In-Situ Hybridisierung. Neben der relativen mRNA Konzentration des Markers kann auch die absolute Anzahl der Molekühle in einer Probe nachgewiesen werden.The "quantification" can be carried out according to the invention by means of detection of the transcribed mRNA of the marker to be determined. The proportion of the existing mRNA molecules of the marker is checked relative to an internal standard, which is usually selected from a uniformly expressed in all tissues "housekeeping" gene. All methods of mRNA quantification known to those skilled in the art can be used for the present invention. For example, the determination of the relative number of mRNA molecules in a sample can be detected in a quantitative real-time PCR. Further methods for quantifying the mRNA expression of the markers of the method according to the invention include microarray expression analyzes, Northern blots, deep sequencing or in situ hybridization. In addition to the relative mRNA concentration of the marker, the absolute number of molecules in a sample can be detected.

Erfindungsgemäß umfasst das Verfahren ein „Quantifizieren” der analysierten Marker des vorliegenden Verfahrens in einem weiteren Aspekt alle dem Fachmann zum Nachweis von Proteinen in biologischen Proben bekannte geeignete Verfahren. Das spezifische Verfahren ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung solange nicht wichtig, wie das Verfahren empfindlich genug ist, um die für eine genaue Bestimmung der Konzentrationen der Marker erforderliche Nachweisgrenze zu unterschreiten. Geeignete Verfahren beruhen normalerweise auf der Bindung einer Markierung an den nachzuweisenden Marker und den anschließenden Nachweis dieser Markierung. Die Bindung kann dabei kovalent oder nicht-kovalent sein und/oder direkt oder indirekt erfolgen. Geeignete Messverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung schließen z. B. die Elektrochemilumineszenz ein. Turbidimetrie, Nephelometrie und Latexverstärkte Turbidimetrie oder Nephelometrie können ebenfalls verwendet werden.According to the invention, the method comprises a "quantification" of the analyzed markers of the present method in a further aspect all suitable methods known to those skilled in the art for the detection of proteins in biological samples. The specific method is not important in the context of the present invention as long as the method is sensitive enough to undercut the detection limit required for an accurate determination of the concentrations of the markers. Suitable methods are usually based on the binding of a label to the label to be detected and the subsequent detection of this label. The bond may be covalent or noncovalent and / or directly or indirectly. Suitable measuring methods according to the present invention include e.g. For example, electrochemiluminescence. Turbidimetry, nephelometry and latex enhanced turbidimetry or nephelometry may also be used.

Auf Grund ihrer hohen Sensitivität und der Tatsache, dass sich diese Verfahren auch auf Hoch-Durchsatz-Umgebungen anpassen lassen, sind erfindungsgemäß Verfahren bevorzugt, wobei das Bestimmen der Konzentration mittels eines immunologischen Verfahrens mittels an die Marker bindenden Moleküle erfolgt. Beispiele für solche Verfahren sind ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), Sandwich Enzymimmuntests oder Festphasen Immuntests. Bevorzugt ist somit, dass die an die Marker bindenden Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus anti-Marker-Antikörpern oder Teilen davon und Marker-Rezeptoren oder Teilen davon.Due to their high sensitivity and the fact that these methods can also be adapted to high-throughput environments, methods according to the invention are preferred, wherein the determination of the concentration by means of an immunological method by means of molecules binding to the marker. Examples of such methods are enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), sandwich enzyme immunoassay or solid phase immunoassay. Thus, it is preferred that the molecules that bind to the markers are selected from the group consisting of anti-marker antibodies or parts thereof and marker receptors or parts thereof.

Diese Moleküle können aus einer sehr großen Vielzahl von für die Marker spezifischen Molekülen ausgewählt sein. Bevorzugt ist, dass die an die Marker bindenden Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, die spezifisch gegen Marker oder gegen Teile davon gerichtet sind, oder Teilen oder Fragmenten davon und einem Marker-Rezeptor oder Teilen davon oder einem Integrin, z. B. dem Plättchen-Integrin IIb3, oder Teilen davon. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Antikörper, Teile oder Fragmente davon polyklonale Antikörpern, monoklonale Antikörpern, Fab-Fragmente, scFv-Antikörper und Diabodies umfassen.These molecules can be selected from a very wide variety of molecules specific for the markers. It is preferred that the molecules which bind to the markers are selected from the group consisting of antibodies directed specifically against markers or against parts thereof, or parts or fragments thereof and a marker receptor or parts thereof or an integrin, e.g. B. the platelet integrin IIb3, or parts thereof. Particularly preferred is a method according to the invention, wherein the antibodies, parts or fragments thereof include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, Fab fragments, scFv antibodies and diabodies.

Gemäß eines weiteren Aspekts des Verfahrens der vorliegenden Erfindung können Komponenten des Verfahrens an eine feste Phase gebunden vorliegen, somit können die an einen Marker bindenden Moleküle in Lösung oder Matrix-immobilisiert vorliegen. Als Matrices können eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Materialien verwendet werden, wie zum Beispiel Harz-Matrices und/oder herkömmliche Säulenmatrices. Besonders bevorzugt ist weiterhin ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die an einen Marker bindenden Moleküle an eines oder mehrere Detektionsmoleküle aus der Gruppe bestehend aus Fluoresceinthioisocyanat, Phycoerythrin, Enzymen (zum Beispiel Meerrettich-Peroxidase) und magnetisches Bead gekoppelt sind.According to another aspect of the method of the present invention, components of the method may be bound to a solid phase, thus, the molecules that bind to a marker may be in solution or matrix immobilized. As matrices, a variety of materials known to those skilled in the art may be used, such as resin matrices and / or conventional column matrices. Also particularly preferred is a method according to the invention, in which the binding to a marker Molecules are coupled to one or more detection molecules selected from the group consisting of fluorescein thioisocyanate, phycoerythrin, enzymes (for example horseradish peroxidase) and magnetic bead.

Gemäß einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens können die an die Marker bindenden Moleküle mit einem Antikörper, an den eine oder mehrere Detektionsmoleküle gekoppelt sind, nachgewiesen werden. Es handelt sich somit um einen indirekten Nachweis der Bindung des Moleküls. Solche zwei-stufigen Nachweise sind dem Fachmann zum Beispiel aus der anti-Antikörper-Nachweistechnik bestens bekannt.According to a further aspect of the method according to the invention, the molecules binding to the markers can be detected with an antibody to which one or more detection molecules are coupled. It is thus an indirect proof of the binding of the molecule. Such two-step detection is well known to those skilled in the art, for example, from the anti-antibody detection technique.

Gemäß einem weiteren Aspekt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung können zur Analyse der Probe immunzytologische Verfahren angewandt werden. Dabei sind alle Verfahren geeignet, die eine spezifische Bestimmung anhand der Marker/Molekül-Interaktion erlauben. Bevorzugt sind Verfahren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sandwich-Enzym-Immuntest, ELISA und Festphasen-Immuntests.In another aspect of the method of the present invention, immunocytological methods may be used to analyze the sample. All methods are suitable which allow a specific determination based on the marker / molecule interaction. Preferred are methods selected from the group consisting of sandwich enzyme immunoassay, ELISA and solid phase immunoassays.

Die für die zu untersuchende Probe ermittelten Ergebnisse werden üblicherweise mit einer Referenzprobe verglichen. Welche Probe als Referenzprobe dienen kann, wird insbesondere von der Art der untersuchten Probe und der Krankengeschichte des Subjekts, aus dem die zu untersuchende Probe stammt, abhängen. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Referenzprobe aus einem oder dem Mittelwert mehrerer Säugetiere stammt, in dem/in denen eine pulmonale Hypertonie ausgeschlossen wurde. Dies muss aber nicht zwangsläufig so sein. Wenn z. B. das Fortschreiten einer Erkrankung bestimmt werden soll, kann auch eine ”alte” Probe desselben Patienten als Referenzprobe verwendet werden. Dem Fachmann ist offensichtlich, welche Proben als Referenzprobe für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind.The results obtained for the sample to be examined are usually compared with a reference sample. Which sample can serve as a reference sample will depend, in particular, on the type of sample being tested and the medical history of the subject from which the sample to be tested is derived. Preferred is a method according to the invention, in which the reference sample originates from one or the mean of several mammals in which pulmonary hypertension has been excluded. But this does not necessarily have to be this way. If z. B. the progression of a disease is to be determined, an "old" sample of the same patient can be used as a reference sample. It is obvious to the person skilled in the art which samples are suitable as a reference sample for the method according to the invention.

Eine Referenzprobe kann von Gesunden oder von Patienten mit oder ohne pulmonale Hypertonie bzw. pulmonale arterielle Hypertonie stammen. Es kann sich auch um eine Probe handeln, der PlGF und/oder sFlt-1 und/oder BNP und/oder ein weiterer Marker der vorliegenden Erfindung in Konzentrationen zugesetzt wurde, die bei Gesunden oder bei Patienten mit einer pulmonalen Hypertonie früher gemessen wurde. Üblicherweise werden verschiedene Referenzproben eingesetzt, welche die verschiedenen möglichen Prognosen, z. B. „nachteiliges Ereignis unwahrscheinlich” bis „nachteiliges Ereignis hoch wahrscheinlich”, angeben. Ein zur Verfügung stellen von Referenzproben erfolgt vorzugsweise auf die gleiche Weise, wie das zur Verfügung stellen der zu untersuchenden Probe. Anstatt des Einsatzes von Referenzproben können auch festgelegte Referenzwerte, die beispielsweise aus einer Tabelle abzulesen sind, verwendet werden. Derartige Referenzwerte können beispielsweise verschiedene Bereiche festlegen, welche die Wahrscheinlichkeit eines Ereignisses oder einer bestimmten Diagnose angeben. Dabei können die Referenzwerte je nach Herkunft der untersuchten Probe von einander abweichen. So sind die Referenzwerte der hier genannten Marker in gemischt venösem Blut aus der Lungenarterie (A. pulmonaris) höher als in peripherem Blut aus der Cubitalvene.A reference sample may be from healthy subjects or from patients with or without pulmonary hypertension or pulmonary arterial hypertension. It may also be a sample added to PlGF and / or sFlt-1 and / or BNP and / or another marker of the present invention in concentrations previously measured in healthy subjects or in patients with pulmonary hypertension. Usually, various reference samples are used, which the various possible forecasts, z. For example, "adverse event unlikely" to "highly likely event". Providing reference samples is preferably done in the same way as providing the sample to be examined. Instead of using reference samples, it is also possible to use fixed reference values, which can be read from a table, for example. For example, such reference values may define different ranges that indicate the likelihood of an event or a particular diagnosis. The reference values may vary depending on the origin of the sample being examined. Thus, the reference levels of the markers mentioned here are higher in mixed venous blood from the pulmonary artery (A. pulmonaris) than in peripheral blood from the cubital vein.

Erfindungsgemäß ist daher eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Verfahren, wenn die Ergebnisse der in der Probe bestimmten Proteinkonzentrationen mit einem Referenzwert verglichen werden, wobei eine Konzentration von sFlt > 73 pg/ml in einer Probe peripher abgenommen Blutes eine pulmonale Hypertonie anzeigt. Hierbei ist weiter bevorzugt, dass das periphere Blut aus der Cubitalvene entnommen wurde.Therefore, according to the invention, a particularly preferred embodiment of the method is when the results of the protein concentrations determined in the sample are compared with a reference value, wherein a concentration of sFlt> 73 pg / ml in a peripheral blood sample indicates pulmonary hypertension. It is further preferred that the peripheral blood was removed from the cubital vein.

Als Cubitalvenen werden Venen im Bereich der Elle verstanden. Jedoch soll das erfindungsgemäße Verfahren nicht als auf diese Venen beschränkt verstanden werden. Vielmehr sind ganz allgemein Proben bevorzugt, die Blut aus peripheren Körperregionen enthalten, da diese in der klinischen Praxis leicht zugänglich sind und keinen übermäßig invasiven Aufwand für den Patienten bedeuten.Cubital veins are understood to mean veins in the area of the ulna. However, the method according to the invention should not be understood as being restricted to these veins. Rather, in general, samples containing blood from peripheral body regions are preferred because they are readily available in clinical practice and do not impose an unduly invasive burden on the patient.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein oben beschriebenes Verfahren, wobei eine Konzentration von sFlt > 2800 pg/ml und/oder eine Konzentration von PlGF > 30 pg/ml in einer Probe gemischt venösen Blutes, insbesondere Blut aus der Lungenarterie, eine pulmonale Hypertonie anzeigt.Another embodiment of the invention is a method as described above, wherein a concentration of sFlt> 2800 pg / ml and / or a concentration of PlGF> 30 pg / ml in a sample of mixed venous blood, especially blood from the pulmonary artery, indicates pulmonary hypertension.

Gelöst wird die oben gestellte Aufgabe in einem neuen Aspekt durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Überwachung einer Therapie einer pulmonalen Hypertonie, insbesondere zur Überwachung der Wahrscheinlichkeit des Auftretens eines negativen Ereignisses bei einem Subjekt, wobei das negative Ereignis eine Verschlechterung des Krankheitsbildes, ein Fortschreiten in ein höheres NYHA Stadium, Therapieeskalation oder Tod ist.The above object is achieved in a new aspect by the use of the method according to the invention for monitoring a therapy of pulmonary hypertension, in particular for monitoring the probability of the occurrence of a negative event in a subject, wherein the negative event, a deterioration of the disease, a progression in a higher NYHA stage, therapy escalation or death is.

Überraschend konnte im Rahmen der vorliegender Erfindung gefunden werden, dass die Konzentration der Marker sFlt und PlGF in einer zu untersuchenden Probe mit der New York Heart Association(NYHA)-Klassifikation korreliert. Die NYHA-Klassifikation wird zur Einteilung der Stadien einer Herzinsuffizienz entsprechend der Leistungsfähigkeit des Patienten angewendet. Somit erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine Überwachung einer Therapie und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt anhand der Feststellung der Konzentrationswerte von einer oder mehreren Komponenten des VEGF-Signalwegs, vorzugsweise durch Bestimmung von sFlt und/oder PlGF.Surprisingly, it was found in the context of the present invention that the concentration of the markers sFlt and PlGF in a sample to be examined correlated with the New York Heart Association (NYHA) classification. The NYHA classification is used to classify the stages of heart failure according to the patient's capacity. Thus, the inventive method allows a Monitoring therapy and / or risk stratification of pulmonary hypertension in a subject by determining the concentration levels of one or more components of the VEGF pathway, preferably by determining sFlt and / or PlGF.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch einen diagnostisches Kit gelöst, umfassend mindestens ein Mittel zum Quantifizieren der Marker der vorliegenden Erfindung in einer zu untersuchen Probe. Solche Mittel sind vorzugsweise mindestens ein Antikörper zum Nachweis von Marker und Mittel zum anschließenden Quantifizieren der Marker. Der Kit kann außerdem andere Komponenten und/oder Enzyme zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, z. B. Gebrauchsanweisungen zur Interpretation der Ergebnisse des Tests im Hinblick auf das Risikoprofil des Patienten und entsprechende Gegenmaßnahmen und Therapievorschläge enthalten.In a further aspect, the object of the present invention is achieved by a diagnostic kit comprising at least one means for quantifying the markers of the present invention in a sample to be examined. Such agents are preferably at least one antibody for detection of marker and means for subsequent quantification of the markers. The kit may also contain other components and / or enzymes for carrying out the methods of the present invention, e.g. B. Instructions for use for interpreting the results of the test with regard to the risk profile of the patient and appropriate countermeasures and therapy suggestions.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft einen erfindungsgemäßen diagnostischen Kit, umfassend mindestens ein Mittel zum Quantifizieren von sFlt-1 und/oder mindestens ein Mittel zum Quantifizieren von PlGF in einer zu untersuchen Probe, wobei das Kit weiterhin ein Mittel zur Information umfasst, wonach eine Konzentration von sFlt > 73 pg/ml in einer Probe peripher abgenommen Blutes, vorzugsweise abgenommenen Blutes aus der Cubitalvene, eine pulmonale Hypertonie anzeigt, oder wonach eine Konzentration von sFlt > 2800 pg/ml und/oder eine Konzentration von PIGF > 30 pg/ml in einer Probe gemischt venösen Blutes, insbesondere Blutes aus der Lungenarterie, eine pulmonale Hypertonie anzeigt.A particularly preferred embodiment relates to a diagnostic kit according to the invention comprising at least one means for quantifying sFlt-1 and / or at least one means for quantifying PlGF in a sample to be examined, the kit further comprising means for information, according to which a concentration of sFlt> 73 pg / ml in a sample of peripherally withdrawn blood, preferably taken from the cubital vein, indicates pulmonary hypertension, or after which a concentration of sFlt> 2800 pg / ml and / or a concentration of PIGF> 30 pg / ml in one Sample mixed venous blood, especially blood from the pulmonary artery, indicating pulmonary hypertension.

Dabei ist ein besonders bevorzugter erfindungsgemäßer diagnostischer Kit, ein Kit wobei das mindestens ein Mittel zum Quantifizieren von PlGF und/oder sFlt einen Sandwich-Enzym Immuntest, ELISA oder Festphasen-Immuntest umfasst.A particularly preferred diagnostic kit according to the invention is a kit wherein the at least one means for quantifying PlGF and / or sFlt comprises a sandwich enzyme immunoassay, ELISA or solid phase immunoassay.

Noch ein weiterer Aspekt betrifft einen erfindungsgemäßen diagnostischen Kit, umfassend mindestens eines weiteren Mittels zum Quantifizieren eines weiteren Markers, insbesondere BNP.Yet another aspect relates to a diagnostic kit according to the invention, comprising at least one further means for quantifying a further marker, in particular BNP.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann der diagnostische Kit der Erfindung ferner eine oder mehrere vorbereitete Referenzproben umfassen, wobei eine Referenzprobe sFlt und/oder PlGF und/oder BNP in einer Konzentration enthält, die bei Gesunden oder bei Patienten mit einer pulmonalen Hypertonie früher gemessen wurde.In a preferred embodiment, the diagnostic kit of the invention may further comprise one or more prepared reference samples, wherein a reference sample contains sFlt and / or PlGF and / or BNP at a concentration previously measured in healthy subjects or in patients with pulmonary hypertension.

Ein diagnostischer Kit kann weitere Komponenten und/oder Hilfsstoffe umfassen. Beispielsweise kann der Kit weitere Erläuterungen zur Interpretation der Ergebnisse des Tests sowie Therapievorschläge enthalten.A diagnostic kit may include other components and / or adjuvants. For example, the kit may contain further explanations for interpreting the results of the test as well as therapy suggestions.

Das gestellte Problem wird außerdem durch die Verwendung eines diagnostischen Kits der vorliegenden Erfindung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gelöst.The stated problem is also solved by the use of a diagnostic kit of the present invention for carrying out the method according to the invention.

Im Folgenden sollen der kurzen Darstellung nähere Erläuterungen und weitere Ausführungen der Erfindung hinzugefügt werden.In the following, further explanations and further embodiments of the invention are to be added to the brief description.

Die vorliegende Erfindung soll im Folgenden anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen näher erläutert werden, ohne dass die Erfindung dadurch eingeschränkt wird.The present invention will be explained in more detail below by way of example with reference to the accompanying drawings, without limiting the invention thereby.

: Verteilung der klinischen Zustände der Patienten (in %) nach einem Beobachtungszeitraum von 1 Jahr : Distribution of the clinical status of the patients (in%) after a follow-up period of 1 year

: Gemessene sFlt-Konzentration im Serum aus gemischt venösem Blut (in pg/ml) aus Patienten gruppiert nach Ätiologie. : Measured sFlt concentration in serum from mixed venous blood (in pg / ml) from patients grouped by etiology.

: Gemessene PlGF-Konzentration im Serum aus gemischt venösem Blut (in pg/ml) aus Patienten gruppiert nach Ätiologie : Measured PlGF concentration in serum from mixed venous blood (in pg / ml) from patients grouped by etiology

: Gemessene VEGF-Konzentration im Serum aus gemischt venösem Blut (in pg/ml) aus Patienten gruppiert nach Ätiologie : Measured VEGF concentration in serum from mixed venous blood (in pg / ml) from patients grouped by etiology

: Korrelation zwischen der sFlt-Konzentration und gemessener hämodynamischer Parameter : Correlation between sFlt concentration and measured hemodynamic parameters

: Korrelation zwischen den Stadien der NYHA-Klassifikation und sFlt-Konzentration (n. Spearman-Rank) : Correlation between the stadiums of the NYHA classification and sFlt concentration (n. Spearman rank)

: Korrelation zwischen der PlGF-Konzentration und gemessener hämodynamischer Parameter : Correlation between PlGF concentration and measured hemodynamic parameters

: Korrelation zwischen den Stadien der NYHA-Klassifikation und der PlGF-Konzentration : Correlation between the stages of the NYHA classification and the PlGF concentration

: ROC(Receiver Operating Characteristic)-Analyse für sFlt und PlGF als diagnostische Marker (sFlt: AUC (area under the curve) 0.861, p < 0.001, 95% CI 0.832–0.889; PlGF: AUC 0.787, p < 0.001; 95% CI 0.755–0.819). : ROC (receiver operating characteristic) analysis for sFlt and PlGF as diagnostic markers (sFlt: area under the curve AUC 0.861, p <0.001, 95% CI 0.832-0.889, PlGF: AUC 0.787, p <0.001, 95% CI 0.755-0.819).

: Anteil der Patienten mit normalem BNP aber erhöhtem sFLT bzw. PlGF Konzentrationen : Proportion of patients with normal BNP but elevated sFLT or PlGF concentrations

: Verteilung der Stadien der NYHA-Klassifikation im Patientenkollektiv der Studie aus Beispiel 2 (BIOSPHERE II) : Distribution of NYHA Classifications in the Patient Collective of Study Example 2 (BIOSPHERE II)

: sFlt-Konzentrationswerte aus gemischtvenösem Blut (zentral) oder Blut aus der Cubitalvene (peripher) bei Gesunden und bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie. : sFlt concentration values from mixed venous blood (central) or blood from the cubital vein (peripheral) in healthy subjects and in patients with pulmonary hypertension.

: sFLT-Serumwerte (aus peripherem Blut) der Patienten mit Dyspnoe. : sFLT serum levels (from peripheral blood) of patients with dyspnea.

: PlGF-Serumwerte (aus peripherem Blut) der Patienten mit Dyspnoe : PlGF serum levels (from peripheral blood) of patients with dyspnea

: ROC-Analyse für sFlt als diagnostischer Marker bei Patienten mit Dyspnoe (sFlt: AUC 0.79, p < 0.001, 95% CI 0.715–0.860). : ROC analysis for sFlt as a diagnostic marker in patients with dyspnea (sFlt: AUC 0.79, p <0.001, 95% CI 0.715-0.860).

: ROC-Analyse für PlGF als diagnostischer Marker bei Patienten mit Dyspnoe (sFlt: AUC 0.62, p = 0.0273, 95% CI 0.521–0.712). : ROC analysis for PlGF as a diagnostic marker in patients with dyspnoea (sFlt: AUC 0.62, p = 0.0273, 95% CI 0.521-0.712).

BeispieleExamples

Beispiel 1: Studie sFlt- und PlGF-Konzentration in gemischt venösem Blut aus der Lungenarterie von Patienten mit pulmonaler Hypertonie (BIOSPHERE-I)Example 1: Study sFlt and PlGF concentration in mixed venous blood from the pulmonary artery of patients with pulmonary hypertension (BIOSPHERE-I)

In einer ersten Studie wurden 256 Patienten mit der Diagnose einer pulmonalen Hypertonie jedweder Genese (IPAH, APAH, PAH mit COPD oder Fibrose, CTEPH, PVH) eingeschlossen. Zum Zeitpunkt des Einschlusses erfolgten bei allen Patienten die Abnahme gemischt venösen Blutes aus der Lungenarterie und die Messung von sFlt und PlGF mittels eines ELISA-Kits (R&D Quantikine), sowie eine zeitgleiche Erfassung der hämodynamischen Parameter der Patienten. Die Charakteristika der in der Studie eingeschlossen Patienten sind in Tabelle 1 zusammengefasst: Tabelle 1: Patientencharakteristika IPAH APAH LDPAH CTEPH PVH n 70 41 64 59 27 Alter (Jahre) 50.3 [37.1–63.0] 60.8 [49.7-66.4] 67.2 [60.6–72.6] 67.2 [53.8–73.5] 65.6 [56.9–73.3] p = n. s. Geschlecht (männlich, n/%) 25/35 15/37 46/71* 31/52 14/51 *p < 0.05 Serum Kreatinin 1.1 [1.0–1.4] 1.2 [1.0–1.5] 1.1 [1.1–1.3] 1.2 [1.0–1.4] 1.2 [1.1–1.6) p = n. s. 6 MGT Entfernungs (Meter) 378[321–443] 268 [222–424] 251 [150–317] 319 [220–400] 313 [186–410] p = n. s. WHO, Klassitikation (NYHA) NYHA I [n/%] 0/0 0/0 0/0 0/0 1/3.7 NYHA II [n/%] 13/16.9 8/19.5 5/7.8 9/15.2 4/14.8 NYHA III [n/%] 47/61.0 27/65.8% 38/59.3 42/71.9 14/51.9 NYHA IV [n/%] 10/14.2 6/14.6 21/34.4 8/13.5 8/29.6 BNP (pg/ml] 103 [34–169] 118 [51–252] 90 [47–320] 112 [41–322] 150 [102–226) p = n. s. PAP Mittel (mmHg) 54.5 [44.0–66.0] 43.0 [39.0–51.0] 32.0 [25.0–44.0] 41.5 [31.0–52.0] 39.0 [35.0–46.0] p = n. s. SAP Mittel (mmHg) 86.0 [76.0–98.0] 86.0 [78.0–87.0] 88.5 [82.0–100.0] 87.5 [78.0–97.0] 81.5 [74.0–96.0] p = n. s. CVP (mmHG) 6.5 [3.0–11.0] 8.0 [6.0–15.0] 6.0 [2.0–9.0] 6.5 [3.0–10.0] 13.0 [7.0–18.0] *p < 0.05 PCWP (mmHg) 80 [60–10.0] 8.0 [6.0–11.0] 8.0 [5.0–10.0] 9.0 [7.0–12.0] 17.0 [14.0–25.0]* *p < 0.05 PVR (dyn × sek/cm^–5) 965 [673–1538] 717 [514–1117] 442 [301–698] 626 [404–951] 282 [201–454) *p < 0.05 SvO₂ 62.2 [53.6–67.9] 61.7 [52.7–64.7] 65.9 [61.2–70.7] 63.6 [58.2–67.4] 64.3 [56.7–71.3] p = n. s. SaO₂ 91.8 [89.5–93.9] 91.9 [89.9–93.9] 90.9 [87.8–93.7] 91.3 [89.1–93.2] 93.1 [90.7–94.2] p =n. s. (IPAH: idiopathische pulmonalarterielle Hypertonie; APAH: mit PAH assoziierten Erkrankungen; LDPAH: mit Lungenerkrankungen assoziierten pulmonalen Hypertonien; CTEPH: chronisch thrombemolische pulmonale Hypertonie; PVH: pulmonalvenöse Hypertonie; PCWP (Pulmonary capillary wedge pressure); PAP („Pulmonary Arterial Pressure”); SAP („Systolic Arterial Pressure”); CVP („Central Venous Pressure”); PVR („Pulmonary Vascular Resistance”); SvO2 („Venouos Oxygen Saturation”); SaO2 („Arterial Oxygen Saturation”)) In a first study, 256 patients were included with the diagnosis of pulmonary hypertension of any genesis (IPAH, APAH, PAH with COPD or fibrosis, CTEPH, PVH). At the time of enrollment, all patients had mixed pulmonary artery venous blood collection, sFlt and PlGF measurements using an ELISA kit (R & D Quantikine), and a simultaneous assessment of patients' hemodynamic parameters. The characteristics of the patients included in the study are summarized in Table 1: Table 1: Patient characteristics IPAH APAH LDPAH CTEPH PVH n 70 41 64 59 27 Age (years) 50.3 [37.1-63.0] 60.8 [49.7-66.4] 67.2 [60.6-72.6] 67.2 [53.8-73.5] 65.6 [56.9-73.3] p = ns Gender (male, n /%) 25/35 15/37 46/71 * 31/52 14/51 * p <0.05 Serum creatinine 1.1 [1.0-1.4] 1.2 [1.0-1.5] 1.1 [1.1-1.3] 1.2 [1.0-1.4] 1.2 [1.1-1.6] p = ns 6 MGT distance (meters) 378 [321-443] 268 [222-424] 251 [150-317] 319 [220-400] 313 [186-410] p = ns WHO, Classification (NYHA) NYHA I [n /%] 0/0 0/0 0/0 0/0 1 / 3.7 NYHA II [n /%] 13 / 16.9 8 / 19.5 5 / 7.8 9 / 15.2 4 / 14.8 NYHA III [n /%] 47 / 61.0 27 / 65.8% 38 / 59.3 42 / 71.9 14 / 51.9 NYHA IV [n /%] 10 / 14.2 6 / 14.6 21 / 34.4 8 / 13.5 8 / 29.6 BNP (pg / ml) 103 [34-169] 118 [51-252] 90 [47-320] 112 [41-322] 150 [102-226] p = ns PAP average (mmHg) 54.5 [44.0-66.0] 43.0 [39.0-51.0] 32.0 [25.0-44.0] 41.5 [31.0-52.0] 39.0 [35.0-46.0] p = ns SAP means (mmHg) 86.0 [76.0-98.0] 86.0 [78.0-87.0] 88.5 [82.0-100.0] 87.5 [78.0-97.0] 81.5 [74.0-96.0] p = ns CVP (mmHG) 6.5 [3.0-11.0] 8.0 [6.0-15.0] 6.0 [2.0-9.0] 6.5 [3.0-10.0] 13.0 [7.0-18.0] * p <0.05 PCWP (mmHg) 80 [60-10.0] 8.0 [6.0-11.0] 8.0 [5.0-10.0] 9.0 [7.0-12.0] 17.0 [14.0-25.0] * * p <0.05 PVR (dyn x sec / cm ^-5 ) 965 [673-1538] 717 [514-1117] 442 [301-698] 626 [404-951] 282 [201-454] * p <0.05 SvO ₂ 62.2 [53.6-67.9] 61.7 [52.7-64.7] 65.9 [61.2-70.7] 63.6 [58.2-67.4] 64.3 [56.7-71.3] p = ns SaO ₂ 91.8 [89.5-93.9] 91.9 [89.9-93.9] 90.9 [87.8-93.7] 91.3 [89.1-93.2] 93.1 [90.7-94.2] p = ns (IPAH: idiopathic pulmonary arterial hypertension; APAH: PAH-associated diseases; LDPAH: pulmonary hypertension associated with lung disease; CTEPH: chronic thrombemolic pulmonary hypertension; PVH: pulmonary venous hypertension; pulmonary artery pressure (PWCP); pulmonary arterial pressure (PAP)) "Systolic Arterial Pressure" (CVP), "Pulmonary Vascular Resistance" (PVR), "Venouos Oxygen Saturation" (SvO2), "Arterial Oxygen Saturation" (SaO2)

Alle Patienten wurden über ein Jahr beobachtet. Der klinische Zustand der Patienten nach dem Beobachtungszeitraum ist in zusammengefasst. Die bis zeigen die Ergebnisse der Messungen. Sowohl die Werte für sFlt als auch für PlGF sind daher in gemischt venösem Blut bei PH Patienten signifikant (p < 0.05) erhöht ( und ). Zudem konnte mittels Regressionsanalysen gezeigt werden, dass eine schwache Korrelation zwischen der sFlt- und PlGF-Werte zur NYHA-Klassfikation besteht. So ist sowohl die Konzentration von sFlt als auch von PlGF in gemischt venösem Blut bei Patienten im Stadium NYHA IV signifikant höher als bei Patienten in den Stadien II und III ( und ).All patients were followed for over a year. The clinical status of the patients after the observation period is in summarized. The to show the results of the measurements. Both the values for sFlt and for PlGF are therefore significantly (p <0.05) increased in mixed venous blood in PH patients ( and ). In addition, regression analyzes have shown that there is a weak correlation between the sFlt and PlGF values for NYHA classification. Thus, both the concentration of sFlt and of PlGF in mixed venous blood is significantly higher in NYHA IV patients than in stage II and III patients ( and ).

Des Weiteren wurde die Testgenauigkeit der hier gefundenen neuen Biomarker für PH durch Berechnung der „receiver operating characteristic” (ROC)-Fläche unter der Kurve überprüft ( ). Überraschend zeigte sich eine besonders hohe Testgenauigkeit für die Diagnose der pulmonalen Hypertonie durch die Marker sFlt und PlGF. Hierdurch wurde ein „Cutoff”-Wert (Referenzwert) für sFlt von 2800 pg/ml und für PlGF von 30 pg/ml errechnet. Überraschend konnte festgestellt werden, dass die errechneten Grenzwerte für beide Marker in gemischt venösem Blut 100% Spezifisch waren, also nahezu keine falsch positiven Diagnosen bei den Grenzwerten auftreten (Tabelle 2). Die Sensitivität – das Maß für die Anzahl an falsch negativ gestellten Diagnosen – belief sich bei sFlt auf 68,5% und bei PlGF auf 64,3%. Eine Kombination beider Marker erhöht die Sensitivität des Tests auf 78,5%. Somit muss bei Patienten mit sFlt-Werten > 2800 pg/ml und PlGF-Werten > 30 pg/ml immer von einer pulmonalen Hypertonie ausgegangen werden. Tabelle 2: Sensitivität und Spezifität von sFlt und PlGF als diagnostischer Marker in gemischt venösem Blut aus der Lungenarterie PPV [%] Sensitivität [%] Spezifität [%] NPV [%] sFlt Referenzwert: 2800 pg/ml 100 68.5 100 49.7 PlGF Referenzwert: 30 pg/ml 100 64.3 100 48.8 sFlt + PlGF 100 78.5 100 61.3 (PPV: positiver Vorhersagewert, NPV: neganver Vorhersagewert) Furthermore, the test accuracy of the new biomarkers for PH found here was checked by calculating the receiver operating characteristic (ROC) area under the curve ( ). Surprisingly, a particularly high test accuracy for the diagnosis of pulmonary hypertension by the markers sFlt and PlGF was found. This resulted in a cutoff value (reference value) for sFlt of 2800 pg / ml and for PlGF of 30 pg / ml. Surprisingly, it could be stated that the calculated limit values for both markers in mixed venous blood were 100% specific, ie virtually no false positive diagnoses occur at the limit values (Table 2). Sensitivity - the measure of false-negative diagnoses - was 68.5% for sFlt and 64.3% for PlGF. A combination of both markers increases the sensitivity of the test to 78.5%. Thus, in patients with sFlt values> 2800 pg / ml and PlGF values> 30 pg / ml, pulmonary hypertension must always be assumed. Table 2: Sensitivity and specificity of sFlt and PlGF as a diagnostic marker in mixed venous blood from the pulmonary artery PPV [%] Sensitivity [%] Specificity [%] NPV [%] sFlt reference value: 2800 pg / ml 100 68.5 100 49.7 PlGF reference value: 30 pg / ml 100 64.3 100 48.8 sFlt + PlGF 100 78.5 100 61.3 (PPV: positive predictive value, NPV: negative predictive value)

Dies war insgesamt ein überraschendes Ergebnis, da in ca. 40% der Patienten mit einem negativen BNP immerhin sFlt und PlGF als relevant erhöht gemessen werden konnte und somit das Vorliegen einer pulmonalen Hypertonie erkannt werden konnte ( ). Dies zeigt insbesondere den Vorteil der hier beschriebenen Biomarker gegenüber bekannten Diagnoseverfahren im Stand der Technik.All in all, this was a surprising result, as in about 40% of patients with a negative BNP, sFlt and PlGF could be measured as being of relevance and thus the presence of pulmonary hypertension could be detected ( ). This shows in particular the advantage of the biomarkers described here over known diagnostic methods in the prior art.

Beispiel 2: Studie sFlt- und PlGF-Konzentration in peripherem Blut aus Patienten mit pulmonaler Hypertonie (BIOSPHERE-II)Example 2 Study sFlt and PlGF Concentration in Peripheral Blood from Patients with Pulmonary Hypertension (BIOSPHERE-II)

In einer Weiteren Validierungskohorte sollte der diagnostische Vorhersagewert von sFlt und PlGF in peripherem Blut bestätigt werden. Hierzu wurden konsekutiv 179 Patienten mit erschwerter Atemtätigkeit (Dyspnoe, NYHA I–IV) in die Studie eingeschlossen. Im Gegensatz zu Beispiel 1 wurde bei allen Patienten Blut aus der Cubitalvene, also peripher anstatt gemischt venös aus der Lungenarterie, entnommen Das Durchschnittsalter der Teilnehmer der Studie lag bei 61.1 ± 17.4 Jahren. 27 Patienten (15%) waren dem NYHA Stadium I zuzuordnen, 35 Patienten (20%) waren formal im NYHA Stadium II und 55 Patienten (32%) im NYHA Stadium III. Dem NYHA-Stadium IV waren schließlich 62 Patienten (36%) zuzuordnen ( ). Alle Patienten wurden eine echokardiographischen Untersuchung unterzogen. Um sicher und nicht-invasiv eine pulmonale Hypertonie zu erfassen, wurde entsprechend der Kriterien des Symposiums für pulmonale Hypertonie in Dana Point 2008 ab einem systolischen pulmonal-arteriellen Druck > 45 mmHg eine pulmonale Hypertonie festgestellt. Zudem wurden ein Lungenfunktionstest und ein 6-Minuten-Gehtest (6 MGT) bei allen Teilnehmern der Studie durchgeführt.In another validation cohort, the diagnostic predictive value of sFlt and PlGF in peripheral blood should be confirmed. For this purpose, 179 patients with severe respiratory activity (dyspnoea, NYHA I-IV) were consecutively included in the study. In contrast to example 1, blood was taken from the cubital vein in all patients, ie peripheral instead of mixed venous from the pulmonary artery. The mean age of the study participants was 61.1 ± 17.4 years. Twenty-seven patients (15%) were in NYHA stage I, 35 patients (20%) were formally in NYHA stage II and 55 patients (32%) in NYHA stage III. Finally, NYHA stage IV was assigned to 62 patients (36%) ( ). All patients underwent echocardiographic examination. In order to assess pulmonary hypertension safely and non-invasively, pulmonary hypertension was assessed in 2008 according to the criteria of the symposium for pulmonary hypertension at Dana Point, starting with a systolic pulmonary arterial pressure> 45 mmHg. In addition, a lung function test and a 6-minute walking test (6 MGT) were performed in all participants of the study.

Nach echokardiographischen Kriterien zeigten 41 Patienten eine pulmonale Hypertonie (sPAP 65,7 ± 19,0 mmHg). Bei 138 Patienten lag eine Dyspnoe ohne begleitende pulmonale Hypertonie (sPAP 27,1 ± 6,9 mmHg) vor.According to echocardiographic criteria, 41 patients had pulmonary hypertension (sPAP 65.7 ± 19.0 mmHg). Dyspnoea without concomitant pulmonary hypertension (sPAP 27.1 ± 6.9 mmHg) was present in 138 patients.

Bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie lagen sowohl die sFlt- als auch die PlGF Serumwerte in Blut aus der Cubitalvene signifikant höher als bei Patienten mit Dyspnoe ohne pulmonale Hypertonie (sFlt: 259,4 ± 84,7 pg/ml vs 67,2 ± 1,7 pg/ml; PlGF: 21,9 ± 5,1 pg/ml vs 12,8 ± 0,5 pg/ml; und ). Interessanterweise lagen die gemessenen Werte weit unter den Werten, wie sie in Beispiel 1 (der BIOSPHERE-I Studie) gemessen wurden. Weiterführende Untersuchungen ergaben, dass im auch gleichen Patient sFlt und PlGF in zentralvenösem Blut bestimmt höhere Werte ergeben als in peripherem Blut ( ). Die Tatsache, dass in der BIOSPHERE-I Studie nur gemischt venöses Blut und in der BIOSPHERE-II nur peripheres Blut analysiert wurde erklärt die wesentlichen Unterschiede der gemessenen sFlt und PlGF-Werte.In patients with pulmonary hypertension, both sFlt and PlGF serum levels were significantly higher in cubital vein blood than in patients with dyspnea without pulmonary hypertension (sFlt: 259.4 ± 84.7 pg / mL vs 67.2 ± 1, 7 pg / ml; PlGF: 21.9 ± 5.1 pg / ml vs 12.8 ± 0.5 pg / ml; and ). Interestingly, the measured values were well below the values measured in Example 1 (the BIOSPHERE-I study). Further examinations showed that in the same patient sFlt and PlGF give higher values in central venous blood than in peripheral blood ( ). The fact that only mixed venous blood was analyzed in the BIOSPHERE-I study and only peripheral blood in the BIOSPHERE-II explains the significant differences in the measured sFlt and PlGF values.

Die statistische Auswertung der gemessenen Daten zeigte eine starke Korrelation zwischen sFlt ( ) bzw. PlGF-Werten ( ) und dem systolisch pulmonalarteriellen Druck (sPAP). Die „receiver operating characteristic”-Fläche unter der Kurve konnte insbesondere für den sFlt eine gute Testgenauigkeit für die Diagnose der pulmonalen Hypertonie nachweisen ( ).The statistical analysis of the measured data showed a strong correlation between sFlt ( ) or PlGF values ( ) and systolic pulmonary artery pressure (sPAP). The "receiver operating characteristic" area under the curve was able to demonstrate a good test accuracy for the diagnosis of pulmonary hypertension, especially for the sFlt ( ).

Für sFlt wurde ein optimaler „Cut-off”-Wert (Referenzwert) von 73 pg/ml ermittelt. Im Rahmen dieser Untersuchung konnte somit eine Sensitivität von 78,0% und eine Spezifität von 71.1% kalkuliert werden (Tabelle 3). Hieraus ergab sich ein negativer Vorhersagewert von 91.1%. Der positive Vorhersagewert lag bei 45,1%. Somit kann man schlussfolgern, dass mit einer hohen Wahrscheinlichkeit ein negatives Ereignis (keine pulmonale Hypertonie) bei einem sFlt < 73 pg/ml in peripherem Blut vorausgesagt werden kann. Interessanterweise war bei Patienten mit gesicherter pulmonaler Hypertonie BNP als diagnostischer Marker nur in 55% der Fälle > 80 pg/ml. Dafür war entsprechend in 45% aller Patienten mit gesicherter pulmonaler Hypertonie und BNP < 80 pg/ml sFlt positiv, d. h. > 73 pg/ml. Damit konnte gezeigt werden, dass sFlt in fast der Hälfte aller Fälle eine pulmonale Hypertonie genauer vorhersagen konnte als BNP. Demgemäß stellt sFlt auch bei Messung in peripheren Blutproben einen überraschend vorteilhaften Biomarker zur Verfügung, der eine wertvolle diagnostische Ergänzung zu dem bisherig verwendeten Marker BNP darstellt. Tabelle 3: Sensitivität und Spezifität von sFlt als diagnostischer Marker der pulmonale Hypertonie in peripherem Blut von Patienten mit Dyspnoe PPV [%] Sensitivität [%] Spezifität [%] NPV [%] sFlt Referenzwert: 73 pg/ml 45,1 78.0 71.1 91.7 (PPV: positiver Vorhersagewert, NPV: negativer Vorhersagewert)For sFlt an optimal "cut-off" value (reference value) of 73 pg / ml was determined. In this study, a sensitivity of 78.0% and a specificity of 71.1% could be calculated (Table 3). This resulted in a negative predictive value of 91.1%. The positive predictive value was 45.1%. Thus it can be concluded that with a high probability a negative event (no pulmonary hypertension) can be predicted at an sFlt <73 pg / ml in peripheral blood. Interestingly, BNP as a diagnostic marker was> 80 pg / ml in 55% of patients with confirmed pulmonary hypertension. Accordingly, in 45% of patients with confirmed pulmonary hypertension and BNP <80 pg / ml sFlt was positive, ie> 73 pg / ml. It was thus shown that sFlt was able to predict a pulmonary hypertension more accurately than BNP in almost half of all cases. Accordingly, sFlt, even when measured in peripheral blood samples, provides a surprisingly advantageous biomarker that is a valuable diagnostic supplement to the previously used BNP marker. Table 3: Sensitivity and specificity of sFlt as a diagnostic marker of pulmonary hypertension in peripheral blood of patients with dyspnea PPV [%] Sensitivity [%] Specificity [%] NPV [%] sFlt reference value: 73 pg / ml 45.1 78.0 71.1 91.7 (PPV: positive predictive value, NPV: negative predictive value)

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Perelman et al, Blond 2003 [0017]

Claims

A method of diagnosis, early detection and / or risk stratification of pulmonary hypertension in a subject and / or monitoring therapy of such disorder in a subject comprising the steps (a) provide a sample from a subject, (b) quantifying at least one marker in said sample, wherein the marker is selected from a component of the VEGF (vascular endothelial growth factor) signaling pathway; (c) optionally quantifying at least one further marker, and (d) comparison of the results obtained for the sample to be tested / s with reference values and / or the values from a reference sample.

The method of claim 1, wherein the sample to be tested is provided in vitro.

The method of claim 1 or 2, wherein the sample to be examined is selected from the group comprising blood, blood plasma, blood serum, wherein the sample to be examined has been removed peripherally, preferably from the cubital vein, and tissue samples, in particular histological tissue samples.

A method according to any one of claims 1 to 3, wherein the subject is a mammal, preferably a human.

The method of any one of claims 1 to 4, wherein pulmonary hypertension is pulmonary arterial hypertension (PAH), from the group consisting of idiopathic pulmonary arterial hypertension (IPAH), familial pulmonary arterial hypertension, associated pulmonary arterial hypertension (APAH ) and pulmonary veno-occlusive disease (PVO) and / or pulmonary capillary hemangiomatosis (PCH); pulmonary hypertension is pulmonary venous hypertension associated with left heart disease; pulmonary hypertension is pulmonary hypertension associated with lung disease and / or hypoxemia; or pulmonary hypertension is a chronic thromboembolic pulmonary hypertension (CTEPH) or pulmonary hypertension with unclear and / or multifactorial mechanisms.

The method of any one of claims 1 to 5, wherein a component of the VEGF (vascular endothelial growth factor) signaling pathway is selected from the group consisting of sFlt, PlGF, VEGF and VEGFR.

The method of claim 6, wherein the component of the VEGF signaling pathway is sFlt or PlGF.

The method of any one of claims 1 to 7, wherein the further label in step (c) is selected from the group consisting of sFlt, PlGF, BNP, VEGF and VEGFR, which method preferably comprises quantitating sFlt and / or PlGF.

The method of any one of claims 1 to 8, wherein the quantification of the marker is performed by determining the protein concentration, the mRNA concentration, the DNA methylation and / or the determination of the presence of SNPs.

Method according to one of claims 1 to 9, wherein the determination of the concentration by means of an immunological method by means of binding to the marker molecules.

The method of claim 10, wherein the immunological methods are selected from the group consisting of sandwich enzyme immunoassay, ELISA and solid phase immunoassays.

A method according to any one of claims 1 to 11, wherein a concentration of sFlt> 73 pg / ml in a sample of peripheral blood, preferably blood from the cubital vein, indicates pulmonary hypertension.

Use of the method of any of claims 1-12 for monitoring a therapy of pulmonary hypertension, in particular for monitoring the likelihood of a negative event occurring in a subject, the negative event being a worsening of the disease, progression to a higher NYHA stage, therapy escalation or death is.

A diagnostic kit comprising at least one means for quantifying sFlt-1 and / or at least one means for quantifying PlGF in a sample to be tested, the kit further comprising a means for Information, according to which a concentration of sFlt> 73 pg / ml in a sample peripherally withdrawn blood, preferably withdrawn blood from the cubital vein, indicating pulmonary hypertension.

The diagnostic kit of claim 14, wherein said at least one means for quantifying PlGF and / or sFlt comprises a sandwich enzyme immunoassay, ELISA or solid phase immunoassay.