DE102010007281A1 - Neue Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide und ihre Anwendung zur Stimulation der endogenen situ Regeneration von Haarsinneszellen im Corti'schen Organ des Innenohres beim Säuger - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide, die in der Lage sind, die endogene Regeneration von terminal differenzierten Zellen in hochspezialisierten Organen und Geweben beim Säuger in situ zu stimulieren. Im Besonderen betrifft die Erfindung Verbindungen, mit denen durch eine Induktion der Zellteilung von Stützzellen eine de novo Bildung von Haarsinneszellen im Corti’schen Organ stimuliert und das Hörvermögen nach Haarzellverlust beispielsweise durch Lärm, Alter, ototoxische Substanzen oder genetische Ursachen wiederhergestellt werden kann. Die beanspruchten niedermolekularen Verbindungen, die in der Lage sind, entsprechende zellbiologische Veränderungen wie die Dedifferenzierung, die Proliferation und die nachfolgende terminale Redifferenzierung von Zellen des normalerweise postmitotischen Gewebes zu induzieren, stellen eine neue Form von Wirkstoffen dar. Erstmals konnten Verbindungen identifiziert werden, die die Regeneration von terminal differenzierten Sinnesepithelien auch beim Säuger bewirken und damit eine kausale Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit auf regenerationsbiologischer Grundlage ermöglichen. Das beschriebene, völlig neue Therapiekonzept ist allen bisher diskutierten Verfahren wie Gentherapie oder Stammzelltransplantation grundsätzlich überlegen. Weitere regenerationsbiologisch relevante Verbindungen, die eine Haarsinneszellregeneration im Innenohr bewirken könnten, sind bisher nicht bekannt. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, zu deren Formulierung als pharmazeutische Präparate sowie zu ihrer Anwendung zur Herstellung von Arzneimitteln.X = O, S

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft neue Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide, die in der Lage sind, die endogene Regeneration von terminal differenzierten Zellen in hochspezialisierten Organen und Geweben beim Säuger in situ zu stimulieren. Im Besonderen betrifft die Erfindung Verbindungen, mit denen durch eine Induktion der Zellteilung von Stützzellen eine de novo Bildung von Haarsinneszellen im Corti’schen Organ stimuliert und das Hörvermögen nach Haarzellverlust beispielsweise durch Lärm, Alter, ototoxische Substanzen oder genetische Ursachen wiederhergestellt werden kann.
• Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen, zu deren Formulierung als pharmazeutische Präparate sowie ihre Anwendung zur Herstellung von Arzneimitteln für die kausale therapeutische Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit.
• Stand der Technik
• Einschränkungen in der Fähigkeit zu hören und somit zu kommunizieren, haben erhebliche Auswirkungen auf die Lebensqualität in nahezu allen beruflichen und sozialen Bereichen. Damit ist die Sinneserkrankung Schwerhörigkeit eines der vordringlichen gesundheitlichen Probleme in einer von Kommunikation abhängigen Gesellschaft. Die volkswirtschaftlichen Kosten durch Produktivitätsverluste, die aufgrund von unbehandelter Schwerhörigkeit verursacht werden, belaufen sich Schätzungen zufolge auf 75 Milliarden EUR pro Jahr allein in Europa.
• Schwerhörigkeit betrifft im Durchschnitt etwa 10% der Bevölkerung in den Industrienationen. In Deutschland geht man heute von 16 Millionen Schwerhörigen, nahezu einem Fünftel der Gesamtbevölkerung, aus (ifo-Institut, 1986). Damit ist Schwerhörigkeit nicht nur die häufigste Erkrankung eines Sinnesorgans, sondern auch eine der häufigsten chronischen Erkrankungen überhaupt.
• Betrachtet man die Ursachen für die Schwerhörigkeit, so leiden die Betroffenen in etwa 80% der Fälle an einer Schallempfindungsschwerhörigkeit. Einer der häufigsten Gründe hierfür ist der Verlust von sensorischen Haarsinneszellen im Corti’schen Organ, dem auditorischen Sinnesepithel, die aufgrund von Lärmexposition, Nebenwirkungen von ototoxischen Medikamenten, altersbedingter Degeneration oder genetische Ursachen irreversibel durch Zelltod verloren gehen (Nadol, 1993).
• Für diese weitaus häufigste Form der Schwerhörigkeit kann bisher nur die prothetische Versorgung mit Hörgeräten angeboten werden. Das Ergebnis dieser Versorgung ist jedoch für die Betroffenen aufgrund der mangelnden Sprachverständlichkeit häufig unbefriedigend. Entsprechend werden Hörgeräte nur von einem relativ geringen Anteil der Schwerhörigen auch tatsächlich genutzt.
• Zum gegenwärtigen Zeitpunkt existiert keine kurative medizinische Behandlungsmöglichkeit für die Hauptursache der Schallempfindungsschwerhörigkeit. Eine solche kausale Behandlung wäre nur durch den Ersatz bzw. die Regeneration der verlorenen Haarsinneszellen des Corti’schen Organs möglich.
• In den meisten Geweben und Organen des Säugers ist die Fähigkeit zur Regeneration nach einer Schädigung eingeschränkt oder gar nicht vorhanden. Nur einige wenige Organe und Gewebe, wie beispielsweise die Leber, der Knochen oder die Haut besitzen über die gesamte Lebenszeit des Organismus die Fähigkeit zur spontanen Regeneration durch Neubildung von Zellen. In vielen Fällen verlassen die entsprechenden Zellen in den hochspezialisierten Organen und Geweben (z. B. Herz, Gehirn, Skelettmuskel oder die Sinnesepithelien von Auge und Innenohr) den Zellzyklus irreversibel, um in einem terminal differenzierten Zustand zu verharren. Als Konsequenz haben diese Gewebe auch ihre Fähigkeit zu einer spontanen Regeneration beim Eintreten von schädigenden Ereignissen verloren. Dies führt entsprechend zu irreversiblen funktionellen Defiziten. So bedeuten beispielsweise ein Herzinfarkt für das Herz oder ein Schlaganfall für das Gehirn die häufig irreversible Schädigung der betroffenen Gewebeanteile mit entsprechend dauerhaften Funktionsverlusten.
• Es gibt jedoch beispielsweise bei Amphibien, Gewebe und Organe, wie die Beispiele von Retina oder Gliedmaßen zeigen, bei denen zwar eine terminale Differenzierung vorliegt, die aber trotzdem zu einer spontanen in vivo Regeneration befähigt sind (Tsonis, 2000; Tsonis, 2002). Das zentrale zellbiologische Ereignis in diesen Beispielen besteht in der zellulären Dedifferenzierung, die die Entstehung von multipotenten Vorläuferzellen erlaubt, aus denen durch Proliferation und Redifferenzierung regenerierte Zellen entstehen können.
• Die Dedifferenzierung spielt also die entscheidende Rolle bei der Regeneration der terminal differenzierten Gewebe der Amphibien. Im Unterschied dazu zeigen andere Vertebraten geringere Fähigkeiten zur Regeneration.
• Für das Hörorgan der Säuger und der Vögel ging man bis vor etwa 20 Jahren davon aus, dass die Haarsinneszellen im Innenohr nur während einer kurzen kritischen Phase der Embryonalentwicklung entstehen können (Ruben, 1967). Danach galten die Sinnesepithelien als postmitotisch und damit nicht zur Regeneration ihrer Sinneszellen befähigt. Überraschenderweise wurde jedoch die Fähigkeit der Vogel-Cochlea zu spontaner Regeneration von Haarsinneszellen nach akustischem Trauma und ototoxischer Schädigung entdeckt (Cotanche 1987; Cruz et al., 1987).
• Als grundlegender biologischer Mechanismus für die Haarsinneszellregeneration in der Vogel-Cochlea wurde die Zellteilung von direkt zu den zerstörten Haarsinneszellen benachbarten Stützzellen beschrieben (Corwin und Cotanche, 1988; Ryals und Rubel, 1988), wobei eine Population aus undifferenzierten Zellen entsteht, die in der Lage sind, sich zu neu gebildeten Haarsinneszellen und Stützzellen zu redifferenzieren. Hieraus resultiert die nahezu vollständige morphologische und funktionelle Erholung des Sinnesepithels beim Vogel (Cotanche, 1999; Smolders, 1999).
• Obwohl zunächst nahe liegend, ist es bis jetzt aufgrund grundsätzlicher zellbiologischer Unterschiede noch nicht gelungen, Erkenntnisse aus anderen Modellen auf den Säuger zu übertragen.
• Entsprechende Experimente zur Haarsinneszellregeneration bei Säugern gaben keine (Roberson und Rubel, 1994; Vago et al., 1998; Daudet et al., 1998; Daudet et al., 2002; Yamasoba et al., 2003) oder nur sehr geringe (Yamasoba und Kondo, 2006) Hinweise auf eine Fähigkeit zur spontanen Zellteilung von Stützzellen im Corti’schen Organ. Insbesondere gibt es auch, selbst nach der Anwendung von Wachstumsfaktoren, keinerlei Hinweise auf eine induzierbare Proliferation von Stützzellen im Corti’schen Organ (Staecker et al., 1995; Daudet et al., 2002). Verschiedene Experimente an Kulturen von frühen Entwicklungsstadien des Corti’schen Organs embryonaler Mäuse zeigten nach definierter Laserschädigung ebenfalls nur einzelne proliferative Ereignisse (Kelley et al., 1995).
• Dieses völlige Fehlen von Zellteilungen deutet darauf hin, dass die hochspezialisierten Stützzellpopulationen im normalen adulten Corti’schen Organ einen terminal differenzierten Zustand erreicht haben und nicht zum Wiedereintritt in den Zellzyklus befähigt sind. Damit kann im Fall des Innenohres bereits ein einmaliges Schalltrauma zum Untergang von Haarsinneszellen führen und den unausweichlichen sowie irreversiblen Verlust der Hörfunktion nach sich ziehen.
• Seit kurzem ist bekannt, dass sich aus den in Regeneration befindlichen Geweben der Amphibien (z. B. Gliedmaßen) ein Extrakt gewinnen lässt, das in der Lage ist, auch bei Säugerzellen eine Dedifferenzierung zu induzieren (McGann et al., 2001). Damit lässt sich bei entsprechender Stimulation eine auf dem Mechanismus der Dedifferenzierung basierende Regeneration terminal differenzierter Zellen von den Amphibien auf den Säuger übertragen (Odelberg, 2002). Bei den genannten Regenerationsextrakten handelt es sich jedoch um „Protein-Cocktails”, deren Zusammensetzung nicht näher bekannt ist.
• Inzwischen ist es jedoch auch gelungen, mit einer definierten niedermolekularen Verbindung eine entsprechende Wirkung bei Muskelzellen des Säugers zu erzielen (Chen et al., 2004). Durch Screening-Untersuchungen konnten mehrere niedermolekulare Verbindungen mit regenerationsbiologisch relevanten Effekten für verschiedene Zelltypen einschließlich Gliazellen identifiziert werden (Übersichten in Xu et al., 2008; Schugar et al., 2008; Feng et al., 2009; Li und Ding, 2009). Dieser Effekt deutet darauf hin, dass durch entsprechende niedermolekulare Verbindungen eine auf Dedifferenzierung basierende Regeneration auch bei weiteren Zelltypen induziert werden kann (Tsonis, 2004; Kim et al., 2004; Odelberg, 2002).
• Die Übertragung dieses Konzepts auf regenerationsbiologische Untersuchungen im Innenohr ist bisher einzigartig. Es sind keine niedermolekularen Verbindungen bekannt oder patentiert, die eine Haarsinneszellregeneration im Innenohr bewirken könnten.
• Auch andere Konzepte zur Regeneration von Haarsinneszellen im Corti’schen Organ, die nach dem heutigen Stand der Technik verfolgt werden, sind im Hinblick auf eine klinische Anwendung noch wenig Erfolg versprechend.
• Bei der Beeinflussung der Zellzyklusregulation von Stützzellen konnten durch Ausschaltung des Zellzyklusinhibitors p27^Kip1 in vivo zwar Zellteilungen erreicht werden ( WO 99/42088 ). Die Differenzierung zu Haarsinneszellen wurde bisher jedoch nur unter in vitro Bedingungen außerhalb des Gewebekontextes beobachtet (White et al., 2006).
• Die gentherapeutisch induzierte Transdifferenzierung von Stützzellen mit dem für die Haarsinneszelldifferenzierung entscheidenden Transkriptionsfaktor Math1 führte in einem in vivo Modell mit induziertem Haarsinneszellverlust zur Konversion von Stützzellen zu Haarsinneszellen, sogar mit einer teilweisen funktionellen Erholung der Organfunktion (Izumikawa et al., 2005; Kawamoto et al., 2003). Allerdings resultierte die Reduzierung der Stützstellen in funktionellen Einschränkungen für das Corti’sche Organ, da ohne Stützzellen ein normaler Ablauf der komplexen Mikromechanik im Transduktionsprozess nicht denkbar ist.
• Bei der Aktivierung endogener, im Organ residenter Progenitorstammzellen oder der exogenen Applikation heterologer Stammzellen in das Innenohr konnten viel versprechende Ergebnisse erzielt werden (Tateya et al., 2003; Naito et al., 2004; Martinez-Monedero et al., 2007a, b; Li et al., 2003). Eine gezielte oder funktionell relevante Transplantation von Stammzellen in das Innenohr konnte jedoch bisher noch nicht realisiert werden.
• Aufgabenstellung
• Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, niedermolekulare Verbindungen zu identifizieren, die eine Regeneration von Haarsinneszellen zur Wiederherstellung des Hörvermögens beim Säuger durch eine de novo Bildung von Haarsinneszellen im adulten Corti’schen Organ ermöglichen. Auf der Basis dieser Verbindungen sollte erstmalig eine kausale Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit auf regenerationsbiologischer Grundlage mit einem Arzneimittel ermöglicht werden.
• Die Aufgabe wird gelöst durch die Bekanntmachung neuer niedermolekularer Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide mit regenerationsfördernden Eigenschaften, wie sie im Anspruch 1 dargestellt sind. Bevorzugte Ausführungsformen dieser Verbindungen sind in Anspruch 2 deklariert. Die Ansprüche 3 bis 5 betreffen die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in der medizinischen Therapie. Anspruch 6 betrifft Herstellungsverfahren für die erfindungsgemäßen Verbindungen, und die Ansprüche 7 bis 9 betreffen pharmazeutische Präparate, enthaltend die erfindungsgemäßen Verbindungen sowie deren Herstellung. In den Ansprüchen 10 und 11 ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen und pharmazeutischen Präparate zur Behandlung bestimmter Erkrankungen beim Säuger und in den Ansprüchen 12 und 13 die entsprechenden Therapieverfahren offenbart.
• Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
• Das wesentliche Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass mit den erfindungsgemäßen Verbindungen erstmals strukturell definierte chemische Wirkstoffe vorliegen, die eine Regeneration von terminal differenzierten Zellen beim Säuger, insbesondere von Haarsinneszellen im Innenohr des Säugers, bewirken können. Aus diesen Gründen hat die vorliegende Erfindung mit der Identifizierung von neuen, bisher nicht bekannten niedermolekularen Verbindungen, die in der Lage sind, regenerationsbiologisch relevante Vorgänge wie die Dedifferenzierung, Proliferation und die daraus resultierende Regeneration von Zellen aus normalerweise postmitotischen Geweben zu stimulieren, ein Alleinstellungsmerkmal.
• Die Erfindung beinhaltet weiterhin die Nutzung der regenerationsfördernden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen zur ursächlichen Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit nach Schädigung und Verlust der Haarsinneszellen im Corti’schen Organ bis hin zur vollständigen Wiederherstellung des Hörvermögens bei Mensch und Tier.
• Detaillierte Beschreibung
• Unter den verschiedenen Verfahren der Regenerativen Medizin erscheint aufgrund der komplexen Gewebestruktur im Innenohr nur eine endogene Regeneration als Regeneration in situ denkbar. Voraussetzung für die Induktion dieser Regeneration der Haarsinneszellen ist die geeignete Stimulation des normalerweise hochdifferenzierten postmitotischen auditorischen Sinnesepithels. Zielzellen sind die Stützzellen, die den geschädigten Zellen direkt benachbart sind und als potentielle Vorläufer für eine Neubildung von Haarsinneszellen dienen können.
• Obwohl aufgrund des aktuellen Standes der Technik anzunehmen ist, dass der regenerationsbiologische Mechanismus der Dedifferenzierung von Zellen durch bestimmte Wirkstoffe hervorgerufen werden kann, ist es bisher nicht gelungen, entsprechende Verbindungen für die Regeneration im Innenohr zu identifizieren.
• Die Fähigkeit organischer Verbindungen, eine regenerationsbiologisch relevante Wirkung im Innenohr auszulösen, ist zielstrukturabhängig und konnte nicht präzise vorhergesagt werden. Ein entscheidender Faktor für die Erfolgsaussichten bei der biologischen Prüfung war neben den potentiell wirksamen Strukturmerkmalen die Auswahl eines geeigneten Scaffolds mit Wirkstoffpotential in Abhängigkeit vom und mit Bezug zum Zielsystem.
• Mittels umfangreicher Screening-Untersuchungen von Verbindungen aus verschiedenen Verbindungsklassen mit potentiell regenerationsfördernden Eigenschaften konnten überraschenderweise einige niedermolekulare Verbindungen identifiziert werden, die in der Lage sind, in vitro und in vivo entsprechende zellbiologische Veränderungen wie die Dedifferenzierung und die nachfolgende Proliferation otischer Stützzellen bis hin zur Regeneration von Haarsinneszellen zu induzieren. Mit einer Leitstrukturoptimierung konnten Strukturanaloga dieser Verbindungen entwickelt werden, die eine überragende regenerationsfördernde Wirksamkeit beim Säuger aufweisen.
• Die vorliegende Erfindung betrifft daher Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide nach den Formeln

  

  sowie deren Verwendung als Wirkstoffe für die Stimulation der endogenen in situ Regeneration von terminal differenzierten Zellen in hochspezialisierten Organen und Geweben, bevorzugt im Gehirn, im Herz, der Skelettmuskulatur, und besonders bevorzugt von Sinnesepithelien.
• Dabei stehen
  X für O oder S,
  Y für C oder N, wobei beide Atome verschieden sein müssen,
  R2 für Wasserstoff oder Acyl und
  R1 und R3, die gleich oder verschieden sein können, für einen Substituenten aus den folgenden Gruppen:
  verzweigte oder unverzweigte, substituierte oder unsubstituierte, optional Heteroatome enthaltende Alkylgruppen, Alkylcycloalkylgruppen, Alkylarylgruppen, Cycloalkylgruppen, Cycloalkylarylgruppen, Arylgruppen und Arylcycloalkylgruppen,
  wobei für R1 bevorzugt (1H-Indol-3-yl)-ethyl und für R3 bevorzugt Cyclohexyl steht.
• Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft erfindungsgemäße Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide entsprechend den folgenden Formeln (3) bis (8).
• 
• Diese Definitionen schließen pharmazeutisch akzeptable Salze (vorzugsweise nicht toxische und physiologisch verträgliche Salze), die Stereoisomere, Stereoisomeren-Gemische, alle Tautomere, Prodrug-Verbindungen, bevorzugt Prodrug-Ester oder Prodrug-Peptide, und Gemische der erfindungsgemäßen Verbindungen nach den Formeln (1) bis (8) ein.
• Das Potential der erfindungsgemäßen niedermolekularen Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkylthiazolcarbonsäureamide, bereits differenzierte Zellen zu dedifferenzieren, wurde in einem Zellkultur-Assay an aus dem Innenohr der Maus isolierten Stammzellen mit otischem Entwicklungspotential, die in Zellkultur zu, dem ursprünglichen Sinnesepithel möglichst ähnlichen Epithelinseln, differenziert wurden, nachgewiesen. Gegenüber der Kontrolle konnte durch Applikation der erfindungsgemäßen Verbindungen der Anteil Sox2-exprimierender Zellen, ein Stammzellmarker der auch während der Ontogenese des Corti’schen Organs exprimiert wird und als Zeichen zellulärer Dedifferenzierung gilt, mehr als verdoppelt werden. Mit einem Anteil von bis zu 7,4% BrdU (Bromdesoxyuridin)-positiven Zellen, als Zeichen für zelluläre Proliferation, unterscheidet sich die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen signifikant von der der Differenzierungs- und DMSO-Kontrollen, bei denen kein BrdU inkorporiert wird. Somit konnte die überraschende biologische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, im Sinne der Stimulation von Dedifferenzierung und nachfolgender Proliferation differenzierter otischer Zellen, im in vitro Modell nachgewiesen werden.
• Die immuncytochemische Analyse der Stammzellmarker auf dedifferenziertem Epithel bestätigte die Annahme, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen nach ihrer Anreicherung im Zellkern zuerst eine Dedifferenzierung von differenzierten Zellen im Sinne einer Reprogrammierung induzieren, um anschließend deren Proliferation zu ermöglichen.
• In den Zellkulturmodellen wurde durch eine Dosis-Wirkungs-Analyse für die erfindungsgemäßen Verbindungen der Konzentrationsbereich für eine effektive Wirksamkeit bezüglich der Proliferation im Rahmen von 0,1 μM bis 100 μM, bevorzugt von 1 μM bis 3 μM, Substanz im Zellkulturmedium definiert.
• Vergleichbare Effekte wie im Zellkultur-Assay konnten auch in der in vitro Organkultur eines nativen Organs der Maus, d. h. im komplexen, zellulären Verband des Corti’schen Organs, erzielt werden. Nach ototoxischer Haarsinneszellschädigung durch das Aminoglykosid-Antibiotikum Neomycin führte die Applikation der erfindungsgemäßen Verbindungen zur in situ Proliferation von verschiedenen Stützzellen im Corti’schen Organ, wie den im Bereich der äußeren Haarzellen liegenden lateral orientierten Deiterszellen (äußere Phalangenzellen) und äußeren Grenzzellen, den im Bereich der inneren Haarzellen liegenden inneren Phalangenzellen und inneren Grenzzellen sowie anderen Stützzellen, die als potentielle Vorläuferzellen für die Regeneration innerer Haarsinneszellen gelten. Im Detail konnten einzeln markierte Zellkerne in verschiedenen Stadien der Mitose bis hin zur vollständig durchlaufenen Zellteilung mit doppelt vorliegenden Zellkernen nachgewiesen werden.
• Im in vivo Modell des adulten Meerschweinchens zeigten die immunhistochemischen Befunde darüber hinaus eine durch die erfindungsgemäßen Verbindungen induzierte Regeneration von Haarsinneszellen auf der Basis von Zellteilungen von Stützzellen, vorzugsweise in den durch Lärmtraumata geschädigten Bereichen des Corti’schen Organs. In entsprechend Kontrolltieren ohne Applikation der Verbindungen zeigten sich keine spontan regenerierten Haarzellen.
• Toxische Effekte oder Unverträglichkeiten der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden bei den bisherigen in vitro und in vivo Tests in den relevanten Konzentrationsbereichen nicht beobachtet.
• Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung der erfindungsgemäßen Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide, die erfindungsgemäß als Wirkstoffe für die Stimulation der endogenen in situ Regeneration von terminal differenzierten Zellen in hochspezialisierten Organen und Geweben, bevorzugt im Gehirn, im Herz, der Skelettmuskulatur, und besonders bevorzugt von Sinnesepithelien eingesetzt werden können.
• Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt in mehreren Stufen. Detaillierte Synthesevorschriften können dem Anwendungsbeispiel A entnommen werden. Die Ausgangsstoffe zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen sind bekannt und können im Fachhandel bezogen oder nach bekannten Vorschriften hergestellt werden.
• Ein möglicher Weg ist die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen an einer festen Phase ausgehend von einem Aminosäureamid. Dazu wird die Aminosäure, deren Seitenkette den Substituenten R2 repräsentiert, an einem polymeren Träger mit aktivierter Kohlensäureester-Gruppe immobilisiert und anschließend ihre Säuregruppe amidiert. Die Cyclisierung des Aminosäureamides zum Oxazol bzw. des Aminosäurethioamides zum Thiazol erfolgt mit Brombrenztraubensäure und N,N-Dimethylanilin. Bei Verwendung von Brombrenztraubensäureethylester muss die entstandene Ester-Gruppe nachträglich verseift werden. Für die Synthese der Thiazole werden die Aminosäureamide vor der Cyclisierung mit Lawessons Reagenz in die entsprechenden Thioamide überführt. Die erhaltenen Aminosäure-oxazol-/Thiazolcarbonsäuren werden anschließend mit einem Amin, welches den Substituenten R3 repräsentiert, umgesetzt. Abschließend erfolgen die saure Abspaltung der Aminosäure-oxazol-/Thiazolcarbonsäureamide vom Syntheseharz und die nachfolgende chromatographische Aufreinigung.
• Bei einer weiteren Herstellungsvariante wird die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen in Lösung durchgeführt. Die Synthese erfolgt unter Anwendung der Schutzgruppen-Chemie ausgehend von einer Boc-geschützen Aminosäure mit der Seitenkette R2. Die Synthesestufen sind prinzipiell zu den für die feste Phase beschriebenen adäquat. Am Ende der Synthese erfolgen die saure Abspaltung der Boc-Schutzgruppe und die nachfolgende chromatographische Aufreinigung.
• Beide Herstellungsverfahren erlauben sowohl die Synthese von racemischen als auch von enantiomerenreinen Verbindungen. Die Verbindungen werden entweder in freier Form oder als Salz, sofern salzbildende Gruppen enthalten sind, erhalten. Als Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen sind pharmazeutisch akzeptable Salze bevorzugt. Beispiel solcher Salze sind Salze anorganischer oder organischer Säuren, Salze anorganischer oder organischer Basen, Salze basischer oder saurer Aminosäuren.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch als Prodrug-Verbindungen, vorzugsweise als Prodrug-Ester oder Prodrug-Peptide, oder ähnliches modifiziert werden. In bestimmten Fällen kann durch die Kupplung von die Zellpenetration fördernden Molekülen wie z. B. Biotin oder Maleimidopropionsäure optional über geeignete Spacermoleküle an die primäre Aminogruppe oder die Acylierung der Aminogruppe die Bioverfügbarkeit und damit die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen verbessert werden.
• Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide zur Herstellung pharmazeutischer Präparate für die Behandlung der durch Schädigung und Verlust der Haarsinneszellen im Corti’schen Organ bedingten Innenohrschwerhörigkeit beim Säuger. Diese Präparate, enthaltend wenigstens einen erfindungsgemäßen Wirkstoff allein oder in Kombination, enthalten optional weitere pharmazeutisch geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe wie z. B. Trägersubstanzen, Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Emulgatoren, Detergentien, Lösemittel, Lösevermittler, Salze zur Regulation des osmotischen Druckes und Puffersalze. Zusätzlich können sie weitere therapeutisch relevante Wirkstoffe, Adjuvantien sowie regenerationsfördernde Substanzen wie z. B. Wachstumsfaktoren oder Entzündungshemmer enthalten.
• Pharmazeutisch geeignete Materialien sind die im Bereich der Pharmazie und Lebensmitteltechnologie sowie in angrenzenden Gebieten bekanntermaßen verwendbaren Stoffe, insbesondere die in den einschlägigen Arzneibüchern gelisteten, deren Eigenschaften einer physiologischen Anwendung nicht entgegenstehen.
• Die Effekte, die durch die erfindungsgemäßen Verbindungen hervorgerufen werden, sind auch abhängig von deren Formulierung. Entsprechende pharmazeutische Präparate sollten die direkte Applikation des Arzneimittels in die Cochlea des Säugers ermöglichen. Geeignete Applikationsformen für die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate, enthaltend mindestens einen Wirkstoff nach den Formeln (1) und (2), können beispielsweise Lösungen, Suspensionen, Sprays, Gele, Hydrogele, Lotionen, Emulsionen, Pasten, Salben oder Cremes sein.
• Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate erfolgt in üblicher Weise nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie in den einschlägigen Arzneibüchern beschrieben, z. B. durch Mischen, Granulieren oder Beschichtungsmethoden. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate können zusätzlich sterilisiert werden.
• Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide als regenerationsfördernde Wirkstoffe zur Behandlung von Erkrankungen von Menschen und Tieren, die mit geschädigten postmitotischen Geweben in Zusammenhang stehen, bevorzugt zur Wiederherstellung des Hörvermögens nach Verlust oder Schädigung der Haarsinneszellen im Innenohr. Hierzu verabreicht man einer Person oder einem Tier, die oder das einer derartigen Behandlung bedarf, eine therapeutisch effektive Menge eines erfindungsgemäßen regenerationsfördernd wirkenden Präparates, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung nach den Formeln (1) und (2). Der Wirkstoff oder das erfindungsgemäße pharmazeutische Präparat werden dabei direkt oder indirekt (einschließlich systemisch), vorzugsweise lokal, unmittelbar auf/an die geschädigten Gewebestrukturen aufgetragen. Die Applikation an oder in das Innenohr erfolgt beispielsweise transtympanal durch Injektion in das Mittelohr, durch Auftragen an das runde oder ovale Fenster des Innenohres oder durch Injektion in das Innenohr. Hierbei können verschiedene Systeme zur Wirkstoffapplikation (Gelformulierungen, Pumpen) verwendet werden.
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen und pharmazeutischen Präparate können allein, in Kombination mit anderen in der vorliegenden Erfindung enthaltenen Verbindungen oder in Kombination mit einem oder mehreren Wirkstoffen, die für die jeweilige beschriebene therapeutische Indikation der erfindungsgemäßen Verbindungen relevant sind, angewendet werden. Die zeitliche Abfolge der Applikation ist dabei nicht eingeschränkt. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann entweder zeitgleich, vor oder nach den anderen Wirkstoffen, als separates Arzneimittel oder Kombinationspräparat und auf demselben oder unterschiedlichen Applikationswegen verabreicht werden.
• Die exakte therapeutisch effektive Menge für die Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit bei einem Subjekt hängt von verschiedenen Faktoren, unter anderem vom Umfang der Schädigung der Haarsinneszellen, von Größe, Statur, Alter und Gesundheitszustand des Patienten, von Applikationsweg und -form, der angewandten konkreten Verbindung und gegebenenfalls weiteren verwendeten Arzneimitteln ab. Somit ist es zum jetzigen Zeitpunkt nicht sinnvoll, die exakte Menge zu spezifizieren. Jedoch kann man prinzipiell von einer mehrfachen Applikation der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate über einen Zeitraum von bis zu 8 Wochen in Abständen von einem bis sieben Tagen bis hin zu einer kontinuierlichen Applikation über Systeme zur Wirkstoffapplikation, die über einen Mechanismus zur dauerhafte Abgabe verfügen „sustained release”, ausgehen. Die eingesetzte Wirkstoffmenge sollte im Bereich von 0,5 μg bis 1,0 mg pro Innenohr und Applikation liegen.
• Regenerationsbiologisch relevante Verbindungen, die in der Lage sind, entsprechende zellbiologische Veränderungen wie Dedifferenzierung, Proliferation oder terminale Redifferenzierung zu induzieren, sowie deren Formulierungen stellen eine neue Form von Wirkstoffen dar, da es sich um ein völlig neues Therapiekonzept handelt.
• Mit den erfindungsgemäßen Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamiden ist es erstmals gelungen, eine durch niedermolekulare Verbindungen induzierte Zellteilung von otischen Stützzellen und die daraus resultierende Regeneration von Haarsinneszellen im hochdifferenzierten postmitotischen Gewebe des Corti’schen Organs beim Säuger nachzuweisen. Bisher sind keine vergleichbaren Verfahren zur in vivo Regeneration von Haarsinneszellen auf der Basis von pharmazeutischen Wirkstoffen beschrieben.
• Aufgrund der beobachteten Wirkprofile der erfindungsgemäßen Verbindungen sind diese als pharmazeutische Wirkstoffe zur kausalen therapeutischen Behandlung der Schallempfindungs-Schwerhörigkeit auf regenerationsbiologischer Grundlage geeignet. Dieser Behandlungsansatz ist allen anderen bisher diskutierten Verfahren wie Gentherapie oder Stammzelltransplantation grundsätzlich überlegen. Negative Einflüsse wurden in den bisherigen in vitro und in vivo Modelle nicht beobachtet.
• Näheres zu besonders bevorzugten Ausführungsformen sowie weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen, wobei die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden individuellen Merkmale jeweils für sich und in beliebigen Kombinationen miteinander beansprucht sind.
• Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein.
• Ausführungsbeispiele
• Beispiel A – Synthese von 2-[1-Amino-alkyl]-oxazol-4-carbonsäureamiden und der entsprechenden 2-[1-Amino-alkyl]-thiazol-4-carbonsäureamide
• Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgte unter Nutzung relevanter Publikationen zur Synthese ähnlicher Verbindungen (Vidcnov et al., 1996; Stanchev et al., 1999; Stankova et al., 1999; Kaiser et al; 2000), wie im folgenden beschrieben.
• Sowohl die Zwischenstufen als auch die Endprodukte wurden mit HPLC und Massenspektrometrie bezüglich ihrer Reinheit und Identität überprüft. Zusätzlich erfolgte die Charakterisierung der Endprodukte mit Hilfe der NMR-Spektroskopie. Alle Ausgangsstoffe und Reagenzien sind kommerziell erhältlich.
• Im Folgenden ist ein Syntheseweg an einer festen Polymer-Phase, ausgehend von einem Aminosäureamid, beschrieben. Da ein Großteil der Synthesevorschriften identisch ist, wurden für die Oxazole und die Thiazole keine separaten Syntheseverfahren verwendet. Vorangestellt wurde exemplarisch die Synthese des Tryptophanamides als Ausgangsstoff für die besonders bevorzugten Verbindungen (3) und (4).
• Ein alternativer Syntheseweg in Lösung wurde lediglich für die Thiazole beschrieben. Für den geübten Fachmann stellt es jedoch keine Schwierigkeit dar, die Synthesebedingungen auf die Oxazole zu übertragen.
• Für die variablen Substituenten wurden in den Versuchsbeschreibungen die Abkürzungen X, R1 und R3, die die gleiche Bedeutung wie in den Patentansprüchen haben, verwendet.
• Die beschriebenen Synthesen ermöglichen die Darstellung der Verbindungen in stereochemisch reiner Form. Sie werden entweder in freier Form oder als Salz, sofern salzbildende Gruppen enthalten sind, erhalten. Darstellung von D-Tryptophanamid (11)

  
• N-Boc-D-Tryptophan (9) (1 Äquiv.; 2,75 mmol; 1 g), Hydroxybenzotriazolammoniumsalz (2 Äquiv.; 5,50 mmol; 924 mg) und Diisopropylcarbodiimid (DIC) (1,1 Äquiv.; 3,03 mmol; 370 mg; 454 μL) wurden in trockenem Dimethylformamid (DMF) gelöst und 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde anschließend am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen. Nach Abfiltrieren von unlöslichem Feststoff wurde die organische Phase gewaschen (1 × 1 M KHSO₄-Lösung, 2 × gesättigte wässrige Natriumcarbonat-Lösung, 1 × gesättigte wässrige Natriumchlorid-Lösung), über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
• Zur Abspaltung der Boc-Schutzgruppe wurde das Rohprodukt (10) in einer Lösung von 50% Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) aufgenommen und 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdampfen der Lösungsmittel erfolgte die Reinigung des Produktes (11) durch Umkristallisation.
• Beladung von Chloro-(2'-chloro)trityl-Polystyrol-Harz (12) mit Aminosäureamid (13)

  
• Chloro-(2'-chloro)trityl-Polystyrol-Harz (12) (Rapp Polymere H10033; Beladung 1,31 mmol/g) (1 Äquiv.; 655 μmol; 500 mg) wurde zweimal mit DMF (über Molsieb) gewaschen, mit einer Lösung des Aminosäureamid Hydrochlorids (13) (2 Äquiv.; 1,31 mmol) und von Diisopropylethylamin (DIPEA) (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 424 mg) in DMF versetzt und 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Zum Capping des Harzes wurde anschließend Methanol (MeOH) zu der Suspension gegeben und nochmals 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Reaktionslösung wurde abgesaugt, das beladene Harz (14) gewaschen (5 × DMF, je 3 × MeOH, Tetrahydrofuran (THF), Diethylether) und im Ölpumpenvakuum getrocknet.
• Cyclisierung des immobilisierten Aminosäureamides (14) zum Oxazol (15)

  
• Brombrenztraubensäureethylester (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 640 mg; 412 μL) und N,N-Dimethylanilin (10 Äquiv.; 6,55 mmol; 794 mg; 832 μL) wurden in Dioxan (5 mL) gelöst und zu dem Aminosäureamid-Harz (14) (1 Äquiv.; 655 μmol; 500 mg) gegeben. Die Suspension wurde 16 h bei Raumtemperatur geschüttelt und dann 2 h auf 60°C erwärmt. Die Reaktionslösung wurde abgesaugt und das Harz mit trockenen Lösungsmitteln gewaschen (5 × DMF, 5 × DCM). Eine auf –20°C gekühlte Lösung von Pyridin (10 Äquiv.; 6,55 mmol; 520 mg; 530 μL) in trockenem DCM (5 mL) wurde mit Trifluoressigsäureanhydrid (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 688 mg; 456 μL) gemischt. Diese Lösung wurde zu dem gewaschenen Harz (1 Äquiv.; 655 μmol; 500 mg) gegeben. Nach 30 min bei –20°C wurde die Suspension auf Raumtemperatur erwärmt und weitere 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Reaktionslösung wurde abgesaugt, das Harz (15) gewaschen (je 3 × DMF, MeOH, THF, DCM, Diethylether) und im evakuierten Exsikkator getrocknet.
• Darstellung von immobilisierten Thioamiden (16) mit Lawessons Reagenz

  
• Das Aminosäureamid-Harz (14) (1 Äquiv.; 655 μmol; 500 mg) wurde mit einer Lösung von Lawessons Reagenz (3 Äquiv.; 1,97 mmol; 797 mg) in Dimethoxyethan (DME) (10 mL) versetzt und 18 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Reaktionslösung wurde abgesaugt, das Harz (16) gewaschen (6 × DMF, je 3 × MeOH, THF, DCM, Diethylether) und im evakuierten Exsikkator getrocknet.
• Cyclisierung des immobilisierten Thioamides (16) zum Thiazol (17)

  
• Brombrenztraubensäureethylester (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 640 mg; 412 μL) und N,N-Dimethylanilin (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 397 mg; 416 μL) wurden in DMF (4 mL) gelöst und zu dem Aminosäure-Thioamid-Harz (16) (1 Äquiv.; 655 μmol; 500 mg) gegeben. Die Suspension wurde 16 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Reaktionslösung wurde abgesaugt, das Harz (17) gewaschen (je 3 × DMF, MeOH, THF, DCM, Diethylether) und im evakuierten Exsikkator getrocknet. Die Identität und Reinheit des Reaktionsproduktes (17) wurden nach einer Testabspaltung mit 5% TFA in DCM über 1 h bei Raumtemperatur chromatographisch und massenspektrometrisch überprüft.
• Verseifung der immobilisierten Ethylester (15) und (17)

  
• Das Aminosäure-oxazol- (15) bzw. Aminosäure-thiazolcarbonsäureethylester-Harz (17) (1 Äquiv.; 655 μmol; 500 mg) wurde in THF (2,5 mL) vorgequollen und mit einer Lösung von Lithiumhydroxid Monohydrat (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 137 mg) in Wasser (1,25 mL) und MeOH (1,25 mL) versetzt. Nach 3 h bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung abgesaugt, das Harz (18) bzw. (19) gewaschen (je 3 × Wasser, Wasser/DMF 1:1, DMF, Dioxan, THF, DCM, Diethylether) und im evakuierten Exsikkator getrocknet.
• Amidierung der Carbonsäuren (18) und (19) und Abspaltung vom Harz

  
• Zu dem Aminosäure-oxazol- (18) bzw. Aminosäure-thiazolcarbonsäure-Harz (19) (1 Äquiv.; 655 μmol; 500 mg) wurde eine Lösung von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 443 mg) und DIC (5 Äquiv.; 3,28 mmol; 413 mg) in trockenem DMF (5 mL) gegeben. Nach 30 min Schütteln bei Raumtemperatur wurde das Amin zugegeben (10 Äquiv.; 6,55 mmol) und die Suspension 16 h bei Raumtemperatur weiter geschüttelt. Nach Absaugen der Reaktionslösung wurde das Harz gewaschen (je 3 × DMF, MeOH, THF, DCM, Diethylether) und im Luftstrom trocken gesaugt.
• Anschließend wurde das Produkt (20) bzw. (21) mit einer Lösung von 5% TFA in DCM über 1 h bei Raumtemperatur vom Harz abgespalten.
• Nach dem Eindampfen der Abspaltlösungen wurde das Rohprodukt aus tBuOH/Wasser 4:1 lyophilisiert und über Kieselgel mit einem DCM-MeOH-Gradienten chromatographiert.
• Darstellung der Thioamide (23) mit Lawessons Reagenz in Lösung

  
• Zu einer Lösung des Boc-Aminosäureamides (22) (1 Äquiv.; 1,00 mmol) in trockenem DME (7,5 mL) wurde unter Rühren Lawessons Reagenz (0,75 Äquiv.; 750 μmol; 305 mg) gegeben. Die Reaktionslösung wurde 16 h bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel nachfolgend am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (30 mL) aufgenommen und mit 10%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung (15 mL) 30 min kräftig gerührt. Nach Trennung der Phasen wurde die wässrige Phase zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden dreimal mit 10%iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration wurde das Lösungsmittel abdestilliert und das Produkt (23) im Ölpumpenvakuum getrocknet.
• Die Rohprodukte können aus Ethylacetat bzw. Ethylacetat/Petrolether umkristallisiert oder per Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt werden.
• Cyclisierung der Thioamide (23) zum Thiazol (24) in Lösung

  
• Zu einer Lösung des Boc-Aminosäurethioamides (23) (1 Äquiv.; 0,80 mmol) in wasserfreiem Ethanol (6 mL) wurde Calciumcarbonat (2 Äquiv.; 1,60 mmol; 161 mg) gegeben und die Suspension 10 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde Brombrenztraubensäure (1,5 Äquiv.; 1,20 mmol; 201 mg) zugegeben. Nach 4 h Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung filtriert und der Rückstand mit Ethanol nachgewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck eingeengt, der Rückstand in Ethylacetat (10 mL) aufgenommen und dreimal mit 10 mL 5%iger Kaliumhydrogensulfat-Lösung sowie einmal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung extrahiert. Anschließend wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Nach Filtration wurde das Lösungsmittel abdestilliert und das Produkt (24) im Ölpumpenvakuum getrocknet.
• Die Rohprodukte wurden per Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt.
• Amidierung des Thiazols (24) und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe in Lösung

  
• Die Boc-Aminosäure-thiazolcarbonsäure (24) (1 Äquiv.; 0,80 mmol) wurde mit (Benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphat (PyBOP) (1,05 Äquiv.; 0,84 mmol; 437 mg) und Triethylamin (TEA) (3 Äquiv.; 2,40 mmol; 242 mg; 330 μL) in THF versetzt und 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Amin (1,3 Äquiv.; 1,04 mmol) zugegeben und 18 h bei Raumtemperatur gerührt.
• Die Reaktionslösungen wurden eingedampft und das Rohprodukt mit einem DCM-MeOH-Gradienten über Kiesegel chromatographiert.
• Zur Abspaltung der Boc-Schutzgruppe wurden das Amid in 25% TFA in DCM über 1 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend eingedampft. Zu dem Rohprodukt wurde mehrfach Heptan zugegeben und am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck wieder abdestilliert. Das Produkt (25) wurde anschließend aus tBuOH/Wasser 4:1 lyophilisiert.
• N-Acetylierung von 2-[1-Amino-2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3)

  
• Das Aminoalkyl-oxazolcarbonsäureamid (3) (1 Äquiv.; 28 μmol; 10 mg) wurde mit Acetanhydrid (5 Äquiv.; 140 μmol; 14 mg; 13 μL) und TEA (2 Äquiv.; 56 μmol; 6 mg; 8 μL) in DCM (0,5 mL) versetzt und 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde anschließend eingedampft und das Rohprodukt (4) aus tBuOH/Wasser 4:1 lyophilisiert.
• Beispiel B – Nachweis von regenerativen Eigenschaften im in vitro Zellkultur-Assay
• Zunächst wurden in einer Suspensionskultur von aus dem postnatalen Corti’schen Organ der Maus isolierten Stammzellen mit otischem Entwicklungspotential als typische zelluläre Cluster „Sphären” gezüchtet. Unter im Vergleich zu bekannten Verfahren (Oshima et al., 2007; Senn et al., 2007) optimierten Kulturbedingungen in einem mit B27 und N2 supplementierten DMEM/F12-Medium (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) konnten aus der Stammzellkultur unter Zugabe von FGF (fibroblast growth factor) und IGF (insulin-like growth factor) ca. 1600 solide Sphären pro Corti’sches Organ generiert werden ( ).
• Durch Markierungen auf Proteinebene ( ) und den Nachweis von mehreren Stammzellmarkern auf mRNA-Ebene ( ) wurde gezeigt, dass sich die unter diesen Kulturbedingungen gebildeten Otosphären in einem dedifferenzierten Zustand befinden, der einem früheren Zustand während der Ontogenese im Corti’schen Organ entspricht. Darüber hinaus können Zellteilungen in den Otosphären nachgewiesen werden.
• Stützzellen sind in situ die potentiellen Vorläufer für eine Regeneration von Haarsinneszellen und damit die eigentlichen Zielzellen für die Induktion einer Haarsinneszellregeneration. Zu diesem Zweck war es erforderlich, in vitro eine gemeinsame Kultur von Haar- und Stützzell-ähnlichen Zellen zu etablieren, die das Corti’sche Organ in seiner zellulären Zusammensetzung möglichst gut repräsentiert.
• Dazu wurden die kultivierten Otosphären in einem zweiten Schritt unter adhärenten Kulturbedingungen auf einer Ornithin/Fibronektin Oberfläche zu, dem ursprünglichen Sinnesepithel möglichst ähnlichen, einschichtigen Epithelinseln differenziert.
• Durch immuncytochemischen Nachweis konnten auf Proteinebene je drei Stütz- und Haarsinneszellmarker zum Vergleich sowohl im nativen Organ (in situ) als auch in den differenzierten Epithelinseln der Zellkultur (in vitro) dargestellt werden ( ).
• Die Voruntersuchungen zeigten, dass die kultivierten otischen Epithelinseln als zelluläre Basis für den Nachweis des regenerativen Potentials der erfindungsgemäßen Verbindungen bei Stützzell-ähnlichen Zellen des Innenohrs geeignet sind. Zum Nachweis der Effekte, die durch die applizierten Substanzen vermittelt werden, kann die Veränderung der Protein-Expression von Stütz-, Haar-, und Stammzellmarkern herangezogen werden.
• Für das Screening wurde zum einen der Anteil Sox2-positiver Zellen in der in vitro Kultur bestimmt. Sox2 ist ein Stammzellmarker, der auch während der Ontogenese des Corti’schen Organs exprimiert wird. Ihm wird eine tragende Rolle in der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen und bei der Induktion von pluripotenten Stammzellen aus differenzierten Zellen zugeschrieben (Takahashi und Yamanaka, 2006). Dies macht Sox2, insbesondere im Kontext einer induzierten Dedifferenzierung/Reprogrammierung von Zellen, zu einem wichtigen Marker.
• Durch Zugabe der erfindungsgemäßen Verbindung 2-[1-Amino-2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) zu der Zellkultur konnte der Anteil Sox2-exprimierender Zellen gegenüber der Differenzierungs-Kontrolle mehr als verdoppelt werden ( ).
• Ob die durch die Verbindungen induzierte Expression von Stammzellmarkern letztlich auch mit einer erhöhten Proliferation der Zellen in Kultur einhergeht, wurde durch die Quantifizierung der BrdU-positiven Zellen geprüft. Dabei wurde die Kultur während der Substanzapplikation für 5 h mit dem Thymidin-Analogon BrdU inkubiert. Zellteilung führt während der S-Phase des Zellzyklus zur Inkorporation von BrdU. Regt eine der Substanzen zu Zellteilungen an, lässt sich dies mit einem gegen BrdU gerichteten Antikörper detektieren und visualisieren.
• Durch Zugabe der erfindungsgemäßen Verbindung 2-[1-Amino-2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) zu der Zellkultur konnte bei 4,8% der zuvor differenzierten Zellen eine Proliferation induziert werden ( ).
• Die erfindungsgemäße Verbindung 2-[1-Amino-2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäurecyclohexylamid (3) erzielte sowohl bezüglich der Sox2-Expression als auch der BrdU-Inkorporation signifikant positive Ergebnisse. Damit wurde der Nachweis erbracht, dass sie in der Lage ist, die Dedifferenzierung und nachfolgende Proliferation von otischen Stützzellen zu induzieren.
• In einer Dosis-Wirkungs-Analyse wurde der optimale Konzentrationsbereich ermittelt, in dem diese Verbindung ihre maximale regenerationsbiologische Wirkung in der Zellkultur entfaltet.
• Hierzu wurde die BrdU-Inkorporation in dem Stammzell-basierten in vitro Zellkultur-Assay bei 4 Konzentrationen zwischen 0,3 μM und 10 μM im Kulturmedium erfasst. Es zeigte sich, dass für die Konzentration 0,3 μM und 1 μM kein signifikanter Effekt erzielt werden kann, obgleich der Mittelwert bei einer Konzentration von 1 μM bereits erhöht ist. Ab einer Konzentration von 3 μM wird bereits das Sättigungsniveau von ca. 9% BrdU-positiven Zellen erreicht ( ).
• Beispiel C – Nachweis von regenerativen Eigenschaften im in vitro Organkulturmodell
• Zur Bestätigung der im Zellkultur-Assay beobachteten Effekte im nativen Organ, d. h. in situ im komplexen zellulären Verband des Corti’schen Organs, wurde eine Form der Organkultur genutzt, bei der sich das zu kultivierende Gewebe, in diesem Fall das gesamte Innenohr der Maus, in einem rotierenden, mit Kulturmedium gefüllten Zylinder befindet (Hahn et al., 2008). Die Cochlea wurde zuvor basal und apikal im Bereich der scala tympani eröffnet. Dadurch konnte der Einfluss der Schwerkraft minimiert und gleichzeitig ein optimaler Gas- und Nährstoffaustausch zwischen dem Gewebe des Corti’schen Organs und dem Kulturmedium erreicht werden.
• Unter diesen Bedingungen konnte das Explantat im Vergleich zu einer stationären Kultur länger in Kultur erhalten werden.
• Zum Nachweis, dass durch die Applikation der erfindungsgemäßen Verbindungen die nach Haarsinneszellverlust im Corti’schen Organ verbleibenden Stützzellen zu Vorläuferzellen dedifferenzieren und nachfolgend proliferieren, wurde eine Situation analog einem schwerhörigen Ohr geschaffen. Nach Applikation des Aminoglykosid-Antibiotikums Neomycin (1 mM) fanden innerhalb von 24 Stunden 2/3 aller Haarsinneszellen den Zelltod. Lediglich in den apikalen Bereichen der Cochlea überlebten einige Haarsinneszellen, deren Anzahl im Versuchsverlauf durch die initiale Schädigung weiter abnahm. Nach Entfernung des Neomycins aus dem Medium, konnten die verbliebenen Stützzellen weiter kultiviert werden.
• Anschließend wurde BrdU gleichzeitig mit den erfindungsgemäßen Verbindungen (5 μM) in das Kulturmedium appliziert und die Proliferation durch die BrdU-Inkorporation nach 4 Tagen quantifiziert.
• Nach Zugabe der erfindungsgemäßen Verbindung 2-[1-Amino-2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) zu der Organkultur konnte in den am weitesten lateral orientierten Deiterszellen eine BrdU-Inkorporation nachgewiesen werden ( ). Dies traf auch für einzelne innere Phalangen- und Grenzzellen zu ( ), die mit der inneren Haarsinneszelle assoziiert sind und als potentielle Vorläuferzellen für deren Regeneration angesehen werden können. In Kontrollexperimenten ohne Substanzapplikation erfolgte keine spontane Inkorporation von BrdU innerhalb der Deiters-, inneren Phalangen- und inneren Grenzzellen ( ).
• Die unterschiedliche Morphologie der BrdU-positiven Zellkerne deutet auf verschiedene Stadien der Mitose, bis hin zur vollständig durchlaufenen Zellteilung, hin. An verschiedenen Kernen konnte eine Chromatin-Kondensation beobachtet werden ( , E). Gleichzeitig wurden BrdU-positive Kerne in unmittelbarer, relativer Nähe zueinander nachgewiesen ( , F).
• Dies bedeutet, dass im Sinnesepithel des Corti’schen Organs durch die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung 2-[1-Amino-2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) neue Zellen im Sinne einer Regeneration durch Zellteilung von Stützzellen entstanden sind.
• Beispiel D – Nachweis von regenerativen Eigenschaften nach in vivo Applikation
• Die regenerationsbiologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde ebenfalls im in vivo Modell des adulten Meerschweinchens nachgewiesen. Durch Impulslärm wurde eine akute Lärmschädigung verursacht, die in einem Verlust von Haarsinneszellen des Corti’schen Organs, insbesondere im Bereich der äußeren Haarsinneszellen resultierte. Anschließend erfolgte die kontinuierliche lokale Applikation der erfindungsgemäßen Verbindung 2-[1-Amino-2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) aus einer subkutan implantierten miniosmotischen Pumpen (Alzet^®) via Choleostomie direkt in die scala tympani der Cochlea. Die Substanz in der Pumpe wurde mit 200 μM entsprechend höher dosiert, da ein Verdünnungseffekt in der Perilymphe zu erwarten war.
• Die Applikation erfolgte über einen Zeitraum von 6 Wochen mit einem sich anschließenden Warteintervall von 2 Wochen. Parallel wurde BrdU über das Trinkwasser oder die miniosmotische Pumpe verabreicht, um proliferierende Zellen im Corti’schen Organ zu markieren.
• Nach Entnahme des Corti’schen Organs erfolgte die immunhistochemische Vierfach-Markierung mit BrdU (Zellteilung), Sox2 (Stützzelle), Myosin VI (Haarsinneszelle) und DAPI (Kernfärbung) ( ).
• BrdU-markierte Stützzellen und Haarsinneszellen konnten vorzugsweise in den durch das Lärmtrauma geschädigten Bereichen des Corti’schen Organs nachgewiesen werden. In Kontrollorganen der Gegenseite mit/ohne Lärmschädigung und ohne Substanzapplikation waren keine BrdU-markierten Haarsinneszellen und insgesamt, entsprechend den bekannten Befunden zur Spontanproliferation, nur wenige BrdU-markierte Zellen nachweisbar.
• Die in vivo Befunde zeigen eindeutig, dass durch die Applikation der erfindungsgemäßen Verbindung 2-[1-Amino-2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) im adulten Tier eine Regeneration von Haarsinneszellen auf der Basis von Zellteilungen induziert werden kann. Dies unterstreicht das überraschend große Potential der erfindungsgemäßen Verbindungen als Wirkstoff zur kausalen Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit durch Regeneration von Haarsinneszellen.
• Beispiel E – Toxizität
• In den Zellkultur-, Organkultur- und in vivo Untersuchungen ergaben sich, für den untersuchten Konzentrationsbereich von 0,3 μM bis 10 μM, keine Hinweise auf eine toxische Wirkung der erfindungsgemäßen Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide.
• Abbildungen
• Isolation und Kultivierung von Stammzellen aus dem Corti’schen Organ der Maus.
• (A) Stammzellen aus dem Innenohr lassen sich gewinnen, indem man die Zellen des postnatalen Corti’schen Organs vereinzelt, die noch enthaltenen Stammzellen isoliert und unter selektiven Bedingungen in einer Suspensionskultur kultiviert. Unter diesen Bedingungen bilden sich Sphären aus, die den Stammzellmarker Sox2 exprimieren (A'), dem eine tragende Rolle in der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen und bei der Induktion von pluripotenten Stammzellen aus differenzierten Zellen zugeschrieben wird (Takahashi und Yamanaka, 2006). Außerdem inkorporieren die Zellkerne in den Sphären BrdU (A''), das die Proliferation der Zellen anzeigt.
• (B) In den Sphären werden mehrere Stammzellmarker exprimiert, die sich auch während der Ontogenese im Corti’schen Organ nachweisen lassen. Als Positiv-Kontrolle (pos) wurde die mRNA aus einem Corti’schen Organ vom embryonalen Entwicklungstag 14,5 aufgetragen. Normiert auf das Haushaltsgen GAPDH konnte gezeigt werden, dass sowohl im entstehenden Innenohr als auch in den daraus isolierten Stammzellen Jag1, Nestin, Sox2 und Nanog exprimiert werden.
• (C) Mit optimierten Methoden konnte, im Vergleich zur aktuell publizierten Literatur (Oshima et al., 2007; Senn et al., 2007), der Anteil der aus der Primärkultur gebildeten Sphären verdoppelt werden.
• In vivo und in vitro Protein-Expressionsprofil von Haar- und Stützzellmarkern.
• (A) p27^Kip1 wird in allen Stützzellen des Corti’schen Organs exprimiert. Weder innere noch äußere Haarsinneszellen sind p27^Kip1-positiv. Innerhalb der epithelialen Inseln konnte eine p27^Kip1-Expression nachgewiesen werden (A').
• (B) GFAP-Markierung bei Stützzellen im Corti’schen Organ unmittelbar unter den Kernen der Deiterszellen sowie im Bereich der inneren Phalangenzellen. Auch in vitro wurde das Muster der Filamente nachgewiesen (B'').
• (C) E-Cadherin markiert alle Stützzellen, die lateral zu den Pfeilerzellen orientiert sind. E-Cadherin befindet sich auch in den Membranen der epithelialen Inseln (C'). Haarsinneszellmarker wie Myosin VIIA (D), Myosin VI (E) und Calretinin (F) markieren in vivo zuverlässig innere und äußere Haarsinneszellen. Alle Marker sind auch in einzelnen Zellen innerhalb der in vitro Kultur nachweisbar (D', E', F'). Die Sterne markieren im nativen Organ jeweils die 3 äußeren Haarsinneszellen und die innere Haarsinneszelle (immer rechts). Skalierung: 20 μm in den Bildern des Corti’schen Organs (A–F), 10 μm in der Zellkultur (A'–F').
• Relative Anzahl von Zellen mit Sox2-Expression im Screening-Assay.
  Es wurde untersucht, welche der niedermolekularen Verbindungen eine Erhöhung des Anteils Sox2-positiver Zellen (normiert auf das Niveau der Differenzierungs-Kontrolle) induzieren konnten.
  Sieben Verbindungen unterscheiden sich signifikant von der Kontrolle (p < 0,05, n = 10).
• Relative Anzahl BrdU-positiver Zellen im Screening-Assay.
  Durch den Nachweis von BrdU kann quantifiziert werden, wie viele Zellen innerhalb eines bestimmten Zeitraums in die S-Phase des Zellzyklus eingetreten sind. Im Screening wurden die Zellen für fünf Stunden mit BrdU inkubiert.
  Dargestellt ist der Anteil von Zellen in der Gesamtpopulation, die durch Substanzapplikation zur Proliferation angeregt wurden.
  Acht Verbindungen konnten eine signifikante Proliferation induzieren (p < 0,05, n = 10).
• Dosis-Wirkungs-Analyse von 2-[1-Amino-2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) (Substanz 33).
  In der Adhäsionskultur wurde überprüft, wie der induzierte BrdU-Effekt von der Dosis abhängt. Zwischen 0,3 μM und 3 μM Substanzkonzentration im Kulturmedium stieg die BrdU-Inkorporation auf ein signifikant höheres Niveau (p < 0,05, n = 10). Mit höherer Konzentration konnte die BrdU-Inkorporation nicht weiter gesteigert werden. Die Kontrolle, eine Population von Zellen aus der in vitro Kultur mit einer vergleichbaren Menge DMSO ohne Substanzapplikation, vermittelte keinen Effekt.
• Durch 2-[1-Amino-2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) induzierte BrdU-Inkorporation im Organkultur-Modell.
  Durch BrdU-Inkorporation wurde der Umfang der induzierten Proliferation von Stützzellen nachgewiesen.
  In der Kontrolle ohne Substanzapplikation wurde in den Deiters-, den inneren Phalangen- und den Grenzzellen keine BrdU-Inkorporation festgestellt (A). Nach Applikation der erfindungsgemäßen Verbindung (3) (Substanz 33, 5 μM) wurde in lateral orientierten Deiterszellen (B) sowie in einzelnen inneren Phalangen- sowie inneren Grenzzellen (C) BrdU inkorporiert.
  Die BrdU-positiven Zellkerne befanden sich in verschiedenen Stadien der Mitose bzw. hatten die Zellteilung vollständig durchlaufen (D, E, F). Skalierung: 20 μm.
• Dreifach-Markierung nach intracochleärer Applikation von 2-[1-Amino-2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-oxazol-4-carbonsäure-cyclohexylamid (3) in vivo.
  Im in vivo Experiment am adulten Meerschweinchen wurde die regenerative Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen unter realen Bedingungen nachgewiesen (Applikation über 6 Wochen durch Alzet^®-Pumpe (200 μM) parallel mit BrdU (100 mg/mL), Organentnahme und Färbung nach 8,5 Wochen).
  Dargestellt sind mit Myosin VI (Marker für Haarsinneszellen) und BrdU (Marker für Zellteilung) markierte innere Haarsinneszellen. Der Zellkern ist mit DAPI (Kernfärbung) markiert.
  Die Markierung mit BrdU zeigt eine Regeneration auf Basis einer Zellteilung an.
• Literatur
• 1. Chen S, Zhang Q, Wu X, Schultz PG, Ding S (2004) Dedifferentiation of lineage-committed cells by a small molecule. J Am Chem Soc 126(2): 410–411
• 2. Corwin JT, Cotanche DA (1988) Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science 240: 1772–1774
• 3. Cotanche DA (1987) Regeneration of hair cell stereocilia bundles in the chick cochlea following severe acoustic trauma. Hear Res 30: 181–196
• 4. Cotanche DA (1999) Structural recovery from sound and aminoglycoside damage in the avian cochlea. Audiol Neurootol 4: 271–285
• 5. Cruz RM, Lambert PM, Rubel EW (1987) Light microscopic evidence of hair cell regeneration after gentamicin toxicity in chick cochlea. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 113: 1058–1062
• 6. Daudet N, Vago P, Ripoll C, Humbert G, Pujol R, Lenoir M (1998) Characterization of atypical cells in the juvenil rat organ of Corti after aminoglycoside ototoxicity. J Comp Neurol 401: 145–162
• 7. Daudet N, Ripoll C, Lenoir M (2002) Transforming growth factor induced cellular changes in organotypic cultures of juvenile, amikacin-treated rat organ of Corti. J Comp Neurol 442: 6–22
• 8. Feng B, Ng JH, Heng JC, Ng HH (2009) Molecules that promote or enhance reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 4(4): 301–312
• 9. Hahn H, Müller M, Löwenheim H (2008) Whole organ culture of the postnatal sensory inner ear in simulated microgravity. J Neurosci Meth (in Druck)
• 10. ifo-Institut für Wirtschaftsforschung in Zusammenarbeit mit Infratest Gesundheitsforschung im Auftrag des Deutschen Grünen Kreuzes, Marburg „Hörtest 1985", Sektion „Gutes Hören" (1986)
• 11. Izumikawa M, Minoda R, Kawamoto K, Abrashkin KA, Swiderski DL, Dolan DF, Brough DE, Raphael Y (2005) Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med 11: 271–276
• 12. Kaiser D, Videnov G, Maichle-Mössmer C, Strähle J, Jung G (2000) X-ray structures and ab initio study of the conformational properties of novel oxazole and thiazole containing di- and tripeptide mimetics. J Chem Soc Perkin Trans 2: 1081–1085
• 13. Kawamoto K, Ishimoto SI, Minoda R, Brough DE, Raphael Y (2003) Math1 gene transfer generates new cochlear hair cells in mature guinea pigs in vivo. J Neurosci 23: 4395–4400
• 14. Kelley MW, Talreja DR, Corwin JT (1995) Replacement of hair cells after laser microbeam irradiation in cultured organs of Corti from embryonic and neonatal mice. J Neurosci 15: 3013–3026
• 15. Kim S, Rosania GR, Chang YT (2004) Dedifferentiation? What’s next? Mol Interv 4: 83–85
• 16. Li H, Liu H, Heller S (2003) Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear. Nat Med 9: 1293–1299
• 17. Li W, Ding S (2009) Small molecules that modulate embryonic stem cell fate and somatic cell reprogramming. Trends Pharmacol Sci Nov 4
• 18. Martinez-Monedero R, Edge AS (2007) Stem cells for the replacement of inner ear neurons and hair cells. Int J Dev Biol 51: 655–661
• 19. Martinez-Monedero R, Oshima K, Heller S, Edge AS (2007) The potential role of endogenous stem cells in regeneration of the inner ear. Hear Res 227: 48–52
• 20. McGann CJ, Odelberg SJ, Keating MT (2001) Mammalian myotube dedifferentiation induced by new regeneration extract. Proc Natl Acad Sci USA 98(24): 13699–13704
• 21. Nadol JB Jr (1993) Hearing Loss. N Engl J Med 329: 1092–1102
• 22. Naito Y, Nakamura T Nakagawa T, Iguchi F, Endo T, Fujino K, Kim PS, Hiratsuka Y, Tamura T, Kanemaru S, Shimizu Y, Ito J (2004) Transplantation of bone marrow stromal cells into the cochlea of chinchillas. Neuroreport 15: 1–4
• 23. Odelberg SJ (2002) Inducing cellular dedifferentiation: a potential method for enhancing endogenous regeneration in mammals. Semin Cell Dev Biol 13(5): 335–343
• 24. Oshima K, Grimm CM, Corrales CE, Senn P, Martinez-Monedero R, Géléoc GS, Edge A, Holt JR, Heller S (2007) Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear. J Assoc Res Otolaryngol 8: 18–31
• 25. Roberson DW, Rubel EW (1994) Cell devision in the gerbil cochlea after acoustic trauma. Am J Otol 15: 28–34
• 26. Ruben RJ (1967) Development of the inner ear of the mouse. A autoradiographic study of terminal mitosis. Acta Otolaryngol (Stockh) [Suppl] 220: 1–44
• 27. Ryals BM, Rubel EW (1988) Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix Quail. Science 240: 1774–1776
• 28. Schugar RC, Robbins PD, Deasy BM (2008) Small molecules in stem cell self-renewal and differentiation. Gene Ther 15(2): 126–135
• 29. Senn P, Oshima K, Teo D, Grimm C, Heller S (2007) Robust postmortem survival of murine vestibular and cochlear stem cells. J Assoc Res Otolaryngol 8(2): 194–204
• 30. Smolders JWT (1999) Functional recovery in the avian ear after hair cell regeneration. Audiol Neurootol 4: 286–302
• 31. Staecker H, Lefebvre PP, Malgrange B, Moonen G, Van De Water TR (1995) Technical comments: Regeneration and mammalian auditory hair cells. Science 267(5198): 709–711
• 32. Stanchev M, Tabakova S, Videnov G, Golovinsky E, Jung G (1999) Synthesis and antimicrobial activity in vitro of new amino acids and peptides containing thiazole and oxazole moieties. Arch Pharm 332: 297–304
• 33. Stankova IG, Videnov GI, Golovinsky EV, Jung G (1999) Synthesis of thiazole, imidazole and oxazole containing amino acids for peptide backbone modification. J Peptide Sci 5: 392–398
• 34. Takahashi K, Yamanaka S (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126(4): 663–76
• 35. Tateya I, Nakagawa T, Iguchi F, Kim TS, Endo T, Yamada S, Kageyama R, Anito Y, Ito J (2003) Fate of neural stem cells grafted into injured inner ears of mice. Neuroreport 14: 1677–1681
• 36. Tsonis PA (2000) Regeneration in vertebrates. Dev Biol 221(2): 273–284
• 37. Tsonis PA (2002) Regenerative biology: the emerging field of tissue repair and restoration. Differentiation 70(8): 397–409
• 38. Tsonis PA (2004) Stem cells from differentiated cells. Mol Interv 4(2): 81–83
• 39. Vago P, Humbert G, Lenoir M (1998) Amikacin intoxication induces apoptosis and cell proliferation in rat organ of Corti. Neuroreport 9: 431–436
• 40. Videnov G, Kaiser D, Kempter, C, Jung G (1996) Synthesis of naturally occuring, conformationally restricted oxazole- and thiazole containing di- and tripeptide mimetics. Angew Chem Int Ed Engl 35(13/14): 1503–
• 41. White PM, Doetzlhofer A, Lee YS, Groves AK, Segil N (2006) Mammalian cochlear supporting cells can divide and trans-differentiate into hair cells. Nature 441: 984–987
• 42. Xu Y, Shi Y, Ding S (2008) A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature 453(7193): 338–344
• 43. Yamasoba T, Kondo K, Miyajima C, Suzuki M (2003) Changes in cell proliferation in rat and guinea pig cochlea after aminoglycoside-induced damage. Neurosci Lett 347: 171–174
• 44. Yamasoba T, Kondo K (2006) Supporting cell proliferation after hair cell injury in mature guinea pig cochlea in vivo. Cell Tissue Res 325: 23–31
• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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• Zitierte Patentliteratur
• WO 99/42088 [0020]
• Zitierte Nicht-Patentliteratur
• ifo-Institut, 1986 [0004]
• (Nadol, 1993 [0005]
• Tsonis, 2000 [0009]
• Tsonis, 2002 [0009]
• Ruben, 1967 [0011]
• Cotanche 1987 [0011]
• Cruz et al., 1987 [0011]
• Corwin und Cotanche, 1988 [0012]
• Ryals und Rubel, 1988 [0012]
• Cotanche, 1999 [0012]
• Smolders, 1999 [0012]
• Roberson und Rubel, 1994 [0014]
• Vago et al., 1998 [0014]
• Daudet et al., 1998 [0014]
• Daudet et al., 2002 [0014]
• Yamasoba et al., 2003 [0014]
• Yamasoba und Kondo, 2006 [0014]
• Staecker et al., 1995 [0014]
• Kelley et al., 1995 [0014]
• McGann et al., 2001 [0016]
• Odelberg, 2002 [0016]
• Chen et al., 2004 [0017]
• Xu et al., 2008 [0017]
• Schugar et al., 2008 [0017]
• Feng et al., 2009 [0017]
• Li und Ding, 2009 [0017]
• Tsonis, 2004 [0017]
• Kim et al., 2004 [0017]
• Odelberg, 2002 [0017]
• White et al., 2006 [0020]
• Izumikawa et al., 2005 [0021]
• Kawamoto et al., 2003 [0021]
• Tateya et al., 2003 [0022]
• Naito et al., 2004 [0022]
• Martinez-Monedero et al., 2007a, b [0022]
• Li et al., 2003 [0022]
• Vidcnov et al., 1996 [0060]
• Stanchev et al., 1999 [0060]
• Stankova et al., 1999 [0060]
• Kaiser et al; 2000 [0060]
• Oshima et al., 2007 [0084]
• Senn et al., 2007 [0084]
• Takahashi und Yamanaka, 2006 [0090]
• Hahn et al., 2008 [0097]
• Takahashi und Yamanaka, 2006 [0110]
• Oshima et al., 2007 [0110]
• Senn et al., 2007 [0110]

Claims (13)

1. Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide nach den Formeln

   

   wobei X für O oder S, Y für C oder N, wobei beide Atome verschieden sein müssen, R2 für Wasserstoff oder Acyl und R1 und R3, die gleich oder verschieden sein können, für einen Substituenten aus den folgenden Gruppen stehen: verzweigte oder unverzweigte, substituierte oder unsubstituierte, optional Heteroatome enthaltende Alkylgruppen, Alkylcycloalkylgruppen, Alkylarylgruppen, Cycloalkylgruppen, Cycloalkylarylgruppen, Arylgruppen und Arylcycloalkylgruppen, wobei für R1 bevorzugt (1H-Indol-3-yl)-ethyl und für R3 bevorzugt Cyclohexyl steht, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz, ein Tautomer, ein Stereoisomer, ein Stereoisomeren-Gemisch oder eine Prodrug-Verbindung, bevorzugt ein Prodrug-Ester oder ein Prodrug-Peptid, davon.
2. Verbindungen nach Anspruch 1 ausgewählt aus der Gruppe

   

   oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz, ein Tautomer, ein Stereoisomer, ein Stereoisomeren-Gemisch oder eine Prodrug-Verbindung, bevorzugt ein Prodrug-Ester oder ein Prodrug-Peptid, davon.
3. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 zur Verwendung für jedweden medizinischen Zweck, bevorzugt als Medikament für verschiedene medizinische Indikationen.
4. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 als regenerationsfördernder Wirkstoff, dadurch gekennzeichnet, dass sie bei Einwirkung einer therapeutisch effektiven Menge auf das geschädigte Gewebe die endogene in situ Regeneration von terminal differenzierten Zellen in hochspezialisierten Organen und Geweben, bevorzugt im Gehirn, im Herz, der Skelettmuskulatur, und besonders bevorzugt von Sinnesepithelien, durch regenerationsbiologische Wirkungen wie Dedifferenzierung, Proliferation und nachfolgende Redifferenzierung von Zellen des normalerweise postmitotischen Gewebes stimuliert.
5. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 als regenerationsfördernder Wirkstoff zur Regeneration der otischen Sinnesepithelien beim Säuger, dadurch gekennzeichnet, dass sie bei Einwirkung einer therapeutisch effektiven Menge auf das geschädigte Gewebe die endogene in situ Regeneration geschädigter und verlorener Haarsinneszellen im Corti’schen Organ durch regenerationsbiologische Wirkungen wie Dedifferenzierung, Proliferation und nachfolgende Redifferenzierung von Stützzellen stimuliert.
6. Verfahren zur Herstellung der Aminoalkyl-oxazol- und Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamide nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Cyclisierung zum Oxazol bzw. Thiazol und deren nachfolgende Amidierung ausgehend von einer natürlichen oder unnatürlichen zu amidierenden Aminosäure an fester Phase oder unter Verwendung der Boc-Schutzgruppen-Chemie in Lösung erfolgt.
7. Pharmazeutisches Präparat, enthaltend eine therapeutisch effektive Menge mindestens eines Aminoalkyl-oxazol- oder Aminoalkyl-thiazolcarbonsäureamides nach einem der Ansprüche 1 und 2 allein oder in Kombination und optional weitere pharmazeutisch geeignete Inhaltsstoffe wie Trägersubstanzen, Hilfs- und Zusatzstoffe, Detergentien, Adjuvantien sowie weitere regenerationsfördernde oder anderweitig therapierelevante Wirkstoffe.
8. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bestandteile vermischt und/oder in Lösung bringt und/oder mit einem physikalischen oder biologischen Träger assoziiert.
9. Pharmazeutisches Präparat nach den Ansprüchen 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass es in einer für die direkte (lokale) oder indirekte (einschließlich der systemischen) Applikation auf/an das geschädigte Gewebe bzw. auf/in die Cochlea des Säugers geeigneten Formulierung, bevorzugt als Lösung, Suspension, Spray, Gel, Hydrogel, Lotion, Emulsion, Paste, Salbe oder Creme vorliegt.
10. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 oder eines pharmazeutischen Präparates nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen beim Säuger, die mit geschädigten postmitotischen Geweben in Zusammenhang stehen, auf regenerationsbiologischer Grundlage durch unmittelbare oder mittelbare Applikation einer therapeutisch effektiven Menge auf/an die geschädigten Gewebestrukturen.
11. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 oder eines pharmazeutischen Präparates nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur kausalen Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit beim Säuger nach Schädigung und Verlust der Haarsinneszellen im Corti’schen Organ auf regenerationsbiologischer Grundlage durch unmittelbare oder mittelbare Applikation einer therapeutisch effektiven Menge auf/an die geschädigten Gewebestrukturen in der Cochlea.
12. Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen von Menschen und Tieren, die mit geschädigten postmitotischen Geweben in Zusammenhang stehen, auf regenerationsbiologischer Grundlage, dadurch gekennzeichnet, dass eine therapeutisch effektive Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 oder eines pharmazeutischen Präparates nach einem der Ansprüche 7 bis 9 unmittelbar, vorzugsweise lokal, auf/an die geschädigten Gewebestrukturen aufgetragen oder mittelbar, vorzugsweise systemisch, verabreicht wird.
13. Verfahren zur kausalen Behandlung der Innenohrschwerhörigkeit von Menschen und Tieren nach Schädigung und Verlust der Haarsinneszellen im Corti’schen Organ und zur Wiederherstellung des Hörvermögens auf regenerationsbiologischer Grundlage, dadurch gekennzeichnet, dass eine therapeutisch effektive Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2 oder eines pharmazeutischen Präparates nach einem der Ansprüche 7 bis 9 unmittelbar oder mittelbar auf/an die geschädigten Gewebestrukturen in der Cochlea, vorzugsweise transtympanal durch Injektion in das Mittelohr, durch Auftragen an das runde oder ovale Fenster des Innenohres oder durch Injektion in das Innenohr appliziert wird.

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