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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Betrachtungseinheit zur Analyse von Zellen und auf ein Verfahren zur Beobachtung von Zellen an einer Probenoberfläche und insbesondere auf eine biologische Betrachtungseinheit für Zellanalysen an Oberflächen unter physiologischen Bedingungen.
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HINTERGRUND
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Bei der Entwicklung von Implantaten stellt sich regelmäßig die Frage, wie das Implantatmaterial bzw. die Implantatoberfläche mit dem biologischen System, insbesondere humane Zellen, wechselwirkt. Dazu werden (in vitro) Zellkulturen von tierischen und humanen Zellen eingesetzt, um erste Einsichten in die Wirkung von Materialeigenschaften auf ein reales biologisches System (vorzugsweise menschlich) zu erhalten. Dazu werden Zellkulturen von humanen Zellen häufig in Studien eingesetzt, um Ergebnisse an realem menschlichem Gewebe zu erlangen. Hierbei wird untersucht, wie die Materialien oder die Oberfläche von Materialien auf biologische Komponenten (z. B. auf das Zellverhalten, auf das Gewebe aber auch auf von Zellen produzierten Komponenten wie beispielsweise extra zelluläre Matrix) wirken. Diese Zellkulturuntersuchungen sind zumeist auf 2D-Untersuchungen ausgelegt und lassen eine zeitlich uneingeschränkte Betrachtung, welche die Analyse von Phänomen wie beispielsweise der Zellmigration oder 3D-Interaktion verschiedener Zellkulturen ermöglicht, bei intransparenten Proben nicht zu. Sie können den komplexen physiologischen Zustand nicht abbilden.
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Solche Zellkulturuntersuchungen liefern zwar erste Ergebnisse, können jedoch durch fehlende Komplexität das Verhaltens, wie es im Tierversuch abgeprüft wird, nicht abbilden. Daher werden Zellkulturexperimente häufig nur zu einer ersten Prüfung (bspw. auf Toxizität) von Materialeigenschaften vor dem Tierversuch und vor der klinischen Phase eingesetzt. Problematisch für eine Übertragung der im Tierversuch gewonnen Ergebnisse ist jedoch der physiologische Unterschied zwischen Versuchstier und Mensch. Neben ethischen Grundsatzfragen sind Tierversuche zudem erheblich teurer als in vitro Untersuchungen und lassen eine zeitlich fein aufgelöste Studie nicht zu. Durch die große Anzahl von Fehlversuchen (u. a. im Tierexperiment) sind die derzeitigen Entwicklungskosten neuer Implantate sehr hoch.
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Für die Analysen der Wirkungsweise eines Implantats sind insbesondere die ersten Stunden und Tage des Anwachsens am Wichtigsten und sollten daher genau überwacht werden, um ein Verständnis für die Prozesse beim Anwachsen zu entwickeln. Dies ist mittels Tierversuche bisher nicht möglich, da dort die Zugänglichkeit für eine Beobachtung fehlt.
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Daher besteht ein Bedarf nach Betrachtungseinheiten und Verfahren zum Beobachten von Zellkulturen, die die oben genannten Probleme überwinden und insbesondere eine Überwachung eines Anwachsverhaltens der Zellkulturen an Probenoberflächen erlauben.
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KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Zumindest ein Teil der obengenannten Probleme wird durch eine Betrachtungseinheit nach Anspruch 1 und ein Verfahren nach Anspruch 6 gelöst. Die abhängigen Ansprüche beziehen sich auf vorteilhafte Weiterbildungen der Gegenstände der unabhängigen Ansprüche.
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Ausführungsbeispiele beziehen sich auf eine Betrachtungseinheit zur Beobachtung und Analyse von Zellen oder Zellkulturen an einer Probenoberfläche. Die Zellen können dazu in einer Matrix eingebettet sein, die sich an der Probenoberfläche befindet. Die Betrachtungseinheit umfasst: ein erstes Gehäuseteil mit einem Fenster, ein zweites Gehäuseteil, eine Probenhalterung zum Aufnehmen einer Probe mit der Probenoberfläche, und ein Zwischenteil zum Bereitstellen eines Hohlraumes für die Zellanalyse, wenn das Zwischenteil zusammen mit der Probenhalterung zwischen dem ersten Gehäuseteile und den zweiten Gehäuseteile angeordnet ist. Die Probenoberfläche und das Fenster sind derart angeordnet, dass eine Wechselwirkung zwischen einer in dem Hohlraum eingebrachten Zellkultur mit der Probenoberfläche über das Fenster beobachtbar ist.
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Ausführungsbeispiele können insbesondere nicht-transparent Proben nutzen, da die Beobachtung von der gegenüberliegenden Seite erfolgen kann (kann aber auch von der Seite erfolgen). Die Betrachtungseinheit ist nicht auf bestimmte Analysen an Zellen oder Zellkulturen eingeschränkt, sondern erlaubt das Erfassen von allen Änderungen, die in dem Hohlraum geschehen. Dies umfasst nicht nur Analysen der Zellen, sondern auch Beobachtungen zu deren Verhalten (z. B. Segregation von Substanzen, Veränderung der Umgebung durch die Zellen beispielsweise Umbau einer Matrix, in der sich die Zellen befinden). Außerdem wird auch eine Beobachtung und Analyse in der Tiefe der Matrix ermöglicht. Es werden somit auch Zell- oder Matrixveränderungen in Gebieten erfasst, die nicht in direktem Kontakt zur Probenoberfläche stehen.
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Optional ist die Probenhalterung Teil des ersten Gehäuseteils oder des zweiten Gehäuseteils und ist ausgebildet, um verschiedene Proben auswechselbar aufzunehmen oder zu halten.
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Optional stellt das erste Gehäuseteil und/oder das zweite Gehäuseteil zumindest einen Verbindungskanal bereit, um ein Medium, insbesondere eine Nährstofflösung, von außen in den Hohlraum einzuführen und/oder ein weiteres Medium abzuführen. Es können beispielswiese 2, 3, 4, ... Verbindungskanäle für verschiedenen Zwecke/Untersuchungen vorgesehen sein. So kann ein Verbindungskanal für die Zufuhr von biologischem Material (z. B. Zellen) oder einer biologischen Komponente genutzt werden, ein anderer Verbindungskanal kann für die Zuleitung eines Analysestoffes genutzt werden und ein Weiterer als Ableitungskanal genutzt werden. Die Verbindungkanäle können alle an oder in einem Gehäuseteil ausgebildet sein oder auf verschiedene Gehäuseteile verteilt werden.
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Optional weist der Hohlraum in dem Zwischenteil eine Höhe (in Richtung senkrecht zum Fenster) in einem Bereich von 100 µm bis 700 µm (oder zwischen 150 µm bis 400 µm oder ca. 200 µm oder noch mehr, z. B. bis zu 3 mm oder 10 mm) auf und ist ausgebildet, um zweidimensionale (2-D) oder dreidimensionale (3-D) Zellanalysen zu ermöglichen.
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Optional umfasst die Betrachtungseinheit zumindest ein Dichtelement auf zumindest einer Seite des Zwischenteils, um den Hohlraum abzudichten.
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Optional umfasst die Betrachtungseinheit weiter zumindest eine Halterung für zumindest einen Sensor oder Aktuator, um weitere Untersuchungen an den Zellen oder der Zellkultur zu ermöglichen. Die weiteren Untersuchungen können beispielsweise den pH-Wert bestimmen oder ändern oder einen Strom oder ein Magnetfeld erzeugen oder mechanische Anregung ausführen und die Reaktion der Zellen oder Zellmatrix darauf erfassen.
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Ausführungsbeispiele beziehen sich auch auf ein Betrachtungssystem mit zumindest zwei Betrachtungseinheiten, wie sie zuvor beschrieben wurden. Die zumindest zwei Betrachtungseinheiten können nebeneinander angeordnet sein oder miteinander verschaltetet sein (z.B. parallel oder seriell). Das Betrachtungssystem ist daher ausgebildet, um verschiedene Proben oder verschiedene Zellen oder verschiedene Zellkulturen aufzunehmen. Die einzelnen Betrachtungseinheiten können auch identische Kammern mit identischen Proben aufweisen, um parallel unter gleichen Bedingungen verschiedene Zellkulturen zu untersuchen. Das Betrachtungssystem kann auch integral in einem Gesamtgehäuse integriert sein, wobei das erste und zweite Gehäuseteil Teile des Gesamtgehäuses sein können.
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Ausführungsbeispiele beziehen sich auch auf ein Verfahren zur Analyse und Beobachtung von Zellen an einer Probenoberfläche. Das Verfahren umfasst die Schritte:
- - Bereitstellen einer Probe in einer Betrachtungseinheit, wie sie zuvor definiert wurde;
- - Einbringen einer Zellkultur in den Hohlraum der Betrachtungseinheit (z. B. in einem geeigneten Medium oder einer 3D-Matrix); und
- - Beobachten eines Zellwachstums oder einer Wechselwirkung zwischen der Zellkultur und der Probenoberfläche. (Wechselwirkung mit der Matrix, in der die Zellen eingebunden sind und die ebenfalls mit der Oberfläche interagiert);
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Optional umfasst das Einbringen der Zellkultur zumindest einen der folgenden Schritte:
- - zumindest teilweises Zuführen von Zellen über zumindest einen Verbindungskanal der Betrachtungseinheit;
- - Aufbringen der Zellkultur (z. B. Monokultur oder Kokultursysteme) auf die Probenoberfläche und Einbringen der Zellkultur zusammen mit der Probe in die Betrachtungseinheit;
- - Einbringen einer Suspension oder einer biologischen Probe oder 3-D Zellkulturmatrix (z. B. Kollagenmatrix), die die zu analysierenden Zellen aufweist.
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Optional umfasst das Beobachten zumindest einen der folgenden Schritte:
- - Zeitliches Verfolgen des Zellwachstums oder des Anwachsens der Zellen an der Probenoberfläche (z. B. zeitliches Verfolgen des Zellverhaltens wie Formänderungen, Änderungen des Phänotyps, Wachstum, Migrationen, Zellmorphologie, Differenzierungen usw. in Gegenwart der Probe);
- - Zuführen von Nährstoffen, biologisch wirksamen Komponenten, Arzneimittel oder die Zellen beeinflussende Substanzen bzw. Komponenten über den zumindest einen Verbindungskanal;
- - Ermitteln einer Sterberate oder einer Teilungsrate oder einer Differenzierungsrate für die Zellen in der Zellkultur;
- - Wiederholen von Beobachtungen und Analysen für verschiedene Proben oder Probenoberflächen;
- - eine pH-Wertanalyse;
- - Untersuchung eines Zellverhaltens oder Zellmatrixverhaltens gegenüber Strom, Magnetfeld, mechanische Belastung etc.
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Das Beobachten/Analysieren soll sich auch auf biologische Komponenten beziehen. Beispielsweise soll das Zellverhalten und Zellwachstum sowie die Wechselwirkung zwischen den biologischen Komponenten (z.B. Zellen, Metabolite, sekretierte Komponenten, extrazellulärer Matrix, u.a.) und der Probe, insbesondere der Probenoberfläche, untersucht werden.
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Ausführungsbeispiele lösen zumindest einen Teil der eingangs erwähnten Probleme durch eine Kammer (Hohlraum) mit einer Probenoberfläche und mit notwendigen Anschlüsse, Dichtungen sowie der Möglichkeit der exakten Positionierung, sodass Zellanalysen unter physiologischen Bedingungen - vergleichbar zu Tierversuchen im Labormaßstab - durchführbar sind.
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Ausführungsbeispiele erlauben insbesondere Analysen hinsichtlich des Einflusses von Oberflächen auf biologische Systeme wie beispielsweise Zellen, extrazelluläre Matrix, Proteine etc., da ein direkter Kontakt einer Proteinoberfläche unter physiologischen Bedingungen möglich ist. Durch eine Betrachtung von verschiedenen Oberflächen und deren Einfluss auf komplexe, zeitabhängige biologische Prozesse können relevante Oberflächenmerkmale bestimmt werden. Zu den Oberflächenmerkmalen gehören beispielsweise die Topographie, Physikochemie, Steifigkeit und anderes mehr.
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Ein besonderer Vorteil von Ausführungsbeispielen besteht darin, dass die Betrachtungseinheit das Ermitteln von Daten über die Wirkung von Oberflächen ermöglicht, die sonst nur in aufwändigen Tierexperimenten oder während klinischer Studien ermittelt werden konnten. Durch die direkte Verwertbarkeit der Resultate hinsichtlich der Wechselwirkung zwischen den Zellen und der Oberfläche, die fortlaufend über einen längeren Zeitraum ermittelt werden können, besteht außerdem die Möglichkeit, die Implantattechnik sowie die gezielte Funktionalisierung erheblich zu erweitern oder zu optimieren. Außerdem ist es gemäß Ausführungsbeispielen möglich, die Kammer für 2-D als auch für 3-D Zellkulturen und Kokulturen zu nutzen.
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Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung erreichen diese Vorteile durch den Hohlraum (Kammer oder Kavität), der einen Zufluss (Verbindungskanal) für ein Medium aufweist. Der vorhandene Zufluss kann auch dazu genutzt werden, um die biologischen Systeme in der Kammer mit Nährstoffen, Wirkstoffen oder Analysesubstanzen zu versorgen/zuzuführen. Auf diese Weise können für das zu betrachtende biologische System physiologische Bedingungen geschaffen werden.
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KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Die Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden besser verstanden anhand der folgenden detaillierten Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung der unterschiedlichen Ausführungsbeispiele, die jedoch nicht so verstanden werden sollten, dass sie die Offenbarung auf die spezifischen Ausführungsformen einschränken, sondern lediglich der Erklärung und dem Verständnis dienen.
- 1 zeigt eine Betrachtungseinheit gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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1 zeigt ein Ausführungsbeispiel für die Betrachtungseinheit für Zellanalysen an einer Oberfläche 25 einer Probe 20. Die Betrachtungseinheit umfasst ein erstes Gehäuseteil 110, ein zweites Gehäuseteil 120, eine Probenhalterung 125 ein Zwischenteil 130 und ein optionales Dichtelement 140. Die Probe 20 mit der Probenoberfläche 25 wird durch die Probenhalterung 125 beispielhaft zwischen dem ersten Gehäuseteil 110 und dem Zwischenteil 130 gehalten. Die Probe 20 selbst braucht nicht Teil der Betrachtungseinheit zu sein, sondern ist durch die Probenhalterung nur entsprechend platzierbar. Beispielsweise kann die Probenhalterung 125 - wie in der 1 dargestellt - ein integraler Bestandteil des zweiten Gehäuseteils 120 sein (muss es aber nicht). Sie kann auch Bestandteil des ersten Gehäuseteils 110 sein, wobei das zweite Gehäuseteil 120 dann nur einen Deckel als Abschluss oder Dichtung bildet.
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Das erste Gehäuseteil 110 umfasst ein oder mehrere Fenster 115, das in dem gezeigten Ausführungsbeispiel als eine transparente Scheibe ausgebildet ist und in eine Öffnung des ersten Gehäuseteils 110 einsetzbar ist. Auf der transparenten Scheibe 115 wird das Zwischenteil 130 aufgesetzt, wobei das Zwischenteil 130 einen Hohlraum 135 durch eine längliche Öffnung definiert. Auf das Zwischenteil 130 ist ein ringförmiges Dichtelement 140 angeordnet, welches mittig die Probe 20 aufnimmt bzw. diese umschließt. Die Probenoberfläche 25 ist auf der Seite der Probe 20 angeordnet, die dem Fenster 115 zugewandt ist, um z. B. ein Anwachsen der Zellkultur auf der Probenoberfläche 25 zusammen mit dem Wachstum der Zellkultur beobachten zu können.
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Abschließend wird das zweite Gehäuseteil 120 aufgebracht. Das zweite Gehäuseteil 120 kann beispielsweise mit dem ersten Gehäuseteile 110 fest verschlossen werden, wozu beispielsweise Schraubverbindungen o. ä. vorgesehen sein können. Ein oder mehr optional vorhandene Stifte können ein Verdrehen des ersten Gehäuseteils 110 relativ zu dem zweiten Gehäuseteile 120 verhindern. Das zweite Gehäuseteil 120 umfasst beispielhaft eine Haltestruktur für die Probe 20, sodass mehrere oder verschiedene Proben innerhalb des zweiten Gehäuseteils 120 nacheinander platzierbar sind. Außerdem umfasst beispielhaft das zweite Gehäuseteile 120 beispielhaft einen ersten und einen zweiten Verbindungskanal 121,122, über den beispielsweise ein Medium in den Hohlraum 135 nach dem Zusammensetzen der Betrachtungseinheit eingeführt bzw. herausgeleitet werden kann. Es können auch mehr als zwei Verbindungskanäle vorhanden sein. Ebenso können zumindest einige der Verbindungskanäle als Teil des ersten Gehäuseteils 110 ausgebildet sein. Das Medium kann beispielsweise eine Nährlösung, Arzneimittel, die Zellkultur selbst oder Teile davon oder andere Substanzen umfassen.
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Die Probe 20 ist dabei beispielsweise aus einem Implantatmaterial und kann verschiedene Oberflächenstrukturen aufweisen, die das Zellwachstum oder Anwachsen der Zellkulturen erleichtern. Die Zellkulturen können beispielhaft vor dem Zusammensetzen der Betrachtungseinheit auf die Probenoberfläche aufgebracht werden. Optional ist es ebenfalls möglich, dass die Probe 20 mehrere Probenabschnitte aus verschiedenen Materialien oder mit verschiedenen Oberflächenstrukturen aufweist, um parallel an verschiedenartigen Proben Untersuchungen anzustellen.
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Der Hohlraum 135 in dem Zwischenteil 130 ist beispielhaft derart ausgebildet, dass die Probenoberfläche 25 eine vollständige Begrenzung oberhalb bzw. auf einer Seite des Hohlraumes 135 bildet. Der Hohlraum 135 kann sich seitlich in Form von zwei länglich gestalteten Hohlraumerweiterungen 136, 137 über die Probenoberfläche 25 hinaus erstrecken, um darüber Kontakt mit dem ersten und/oder dem zweiter Verbindungskanal 121,122 herzustellen. Das Dichtelement 140 kann dazu beispielhaft zwei Durchgangsöffnungen 141, 142 aufweisen, durch die die Verbindungskanäle 121,122 hindurchgeführt werden, um nach dem Zusammensetzen der Betrachtungseinheit einen fluiden Kontakt zu dem Hohlraum 135 herzustellen.
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Die gezeigte Betrachtungseinheit ist insbesondere zur Beobachtung und Analyse von Zellkulturen und deren Wechselwirkung mit der Probenoberfläche 25 während des Zellwachstums geeignet. Das Fenster 115 an der beispielhaften Unterseite der Betrachtungseinheit erlaubt eine fortlaufende Beobachtung das Wachstum der Zellkulturen. Der zumindest eine Verbindungskanal 121, 122 ermöglicht die Zufuhr/Abfuhr einer Nährstofflösung, von Arzneimittel oder anderer Substanzen. Damit kann/können beispielsweise der pH-Wert oder eine Sättigung geändert werden oder auch Entzündungsreaktionen ausgelöst werden bzw. entsprechend abgebildet/simuliert werden. Der Durchmesser der Verbindungskanäle 121,122 ist dabei insbesondere so gewählt, dass keine Spannungen in dem zugeführten Medium - insbesondere, wenn (weitere) Zellkulturen zugeführt werden sollen. Solche Spannungen können ansonsten einen negativen Einfluss auf das resultierende Ergebnis haben.
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Ein mögliches Schema für die Zellanalysen, um eine Eignung einer Oberfläche einschätzen zu können, kann beispielsweise hinsichtlich der folgenden Parameter ausgeführt:
- a) wie oft teilen sich die Zellen (Ermittlung der Zellteilungsrate);
- b) wie oft sterben die Zellen (Ermittlung der Sterberate);
- c) wie gut differenzieren sich die Zellen (Ermittlung der Differenzierungsrate);
- d) wie ist das Migrationsverhalten von Zellen.
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Vor oder während der Untersuchung kann der Hohlraum 135 beispielsweise (mehr oder weniger) vollständig mit einer geeigneten Zellkulturmatrix (z. B. Kollagenen) bzw. einer geeigneten Probe oder Suspensionsmedium gefüllt werden, in die die Zellen eingemischt sind bzw. auf eine Kollagenoberfläche aufgebracht sind. Somit wird es möglich, dass sowohl 2-D Zellanalysen als auch das 3-D Wachstum untersucht werden kann. Hierzu kann der Hohlraum 135 beispielsweise eine Höhe in einem Bereich von 100 ... 700 µm oder ca. 200 µm (oder bis zu 10 mm oder bis zu 3mm) aufweisen. Die Zellkulturmatrix kann beispielhaft ein Kollagen 1A-umfassen. Es kann aber auch eine andere Zellkulturmatrix umfasst sein, wie sie beispielsweise bei der Blutgerinnung erzeugt wird.
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Die Erfindung soll jedoch nicht auf eine spezifische Zellkulturmatrix (z. B. Kollagen oder eine kollagenfreie Matrix) oder auf eine spezifische Anwendung eingeschränkt werden. Die Zellkulturmatrix wird vielmehr nur zur Kultivierung der Zellen genutzt und sollte dafür geeignet sein (d. h. eine geeignete 3D-Zellkulturmatrix umfassen). Der Hohlraum 135 soll nur insoweit eingeschränkt sein, dass er einen direkten Kontakt einer Probenoberfläche 25 mit den Zellen oder extrazellulären Bestandteilen ermöglicht und außerdem einen optischen Zugang über das Fenster 115 zur mikroskopischen Betrachtung der Zellreaktionen an der Oberfläche 25 in Abhängigkeit der Zeit zulässt.
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Ausführungsbeispiele bieten insbesondere die folgenden Vorteile:
- - Die Betrachtungseinheit erlaubt eine Zellanalysen, ohne dafür Tierversuche einzusetzen oder andere klinische Studien durchzuführen, da bereits im Vorfeld die Wirkung von Implantaten besser ermittelt werden kann. Um beispielsweise die Wirkungsweise von Implantaten mittels Tierversuche nachzuweisen, ist eine Bewertung zu mehreren Zeitpunkten unerlässlich, woraus sich eine erhebliche Anzahl von Versuchstieren ergibt.
- - Neben den Kosten für die Tierhaltung sowie der Durchführung der Versuche können Kosten für die histologische Aufbereitung der gewonnenen Präparate und deren Auswertung vermieden werden.
- - Da sowohl Tierversuche als auch klinische Studien bei der Neuentwicklung von Implantaten vorgeschrieben sind, besteht durch deren Substitution oder Verringerung oder durch eine gezielte Vorauswahl der nur vielversprechenden Implantate ein erhebliches Einsparpotenzial.
- - Im Gegensatz zu derzeit genutzten Betrachtungseinheiten, ermöglichen Ausführungsbeispiele die Betrachtung von Zellkulturen während die Zellkultur(en) mit einer Oberfläche 25 einer Probe 20 interagieren. Insbesondere kann ein Eindringen oder ein Anwachsen an Oberflächen unmittelbar beobachtet werden.
- - In der Kammer (Hohlraum 135) ist ausreichend Platz verfügbar, um Zellen gegenüber Medien oder Substanzen zu testen.
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Die in der Beschreibung, den Ansprüchen und den Figuren offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung wesentlich sein.
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BEZUGSZEICHENLISTE
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- 20
- Probe
- 25
- Probenoberfläche
- 110
- erstes Gehäuseteil
- 115
- Fenster
- 120
- zweites Gehäuseteil
- 121,122
- ein oder mehrere Verbindungskanäle
- 125
- Probenhalterung
- 130
- Zwischenteil
- 135
- Hohlraum
- 136,137
- Hohlraumerweiterungen für die Verbindungskanäle
- 140
- zumindest ein Dichtelement
- 141, 142
- Durchgangsöffnungen für die Verbindungskanäle