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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Myofibroblasten für die Herstellung von zur Transplantation geeignetem Gewebe.
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Durch die veränderten Lebensbedingungen, sowie durch den Fortschritt der Transplantationsmedizin steigt der Bedarf an zur Transplantation geeigneten Organen bzw. Gewebe. Da Transplantationen von fremden Spendern normalerweise zu einer starken, immun vermittelten Abstoßungsreaktion führen, muss bei Empfängern solcher Transplantate das Immunsystem unterdrückt oder zumindest gedrosselt werden, um eine derartige, unerwünschte Abstoßungsreaktion zu verhindern. Es ist bereits vielfach versucht worden, derartige Abstoßungsreaktionen zu vermeiden. Deshalb wird versucht, möglichst Organe von solchen Spendern zu transplantieren, welche die gleichen oder möglichst ähnliche Oberflächenantigene, insbesonders Histokompatibilitäts-Antigene aufweisen. Dies ist üblicherweise bei nahen Verwandten der Fall. Eine hundertprozentige Sicherheit für identische verträgliche Organe ist jedoch nur bei sogenannten autologen, also Eigenorganspenden möglich, wie dies beispielsweise bei Hauttransplantationen durchgeführt wird. Ist eine derartige Transplantation nicht möglich, dann werden üblicherweise synthetische nicht-biologische Organe bzw. Prothesen transplantiert. Derartige Transplantationen bei Kindern, insbesonders bei Neugeborenen haben den Nachteil, dass sie nicht mitwachsen und daher in periodischen Abständen immer wieder operativ entfernt und dem Wachstum angepasste, größere Prothesen neu eingesetzt werden müssen. Es ist daher bereits versucht worden, kranke oder abgenutzte Organe oder Zellen im tierischen oder menschlichen Körper durch die Zugabe von körpereigenen oder fremden Zellen oder Zellgewebe zu heilen. Dadurch werden normalerweise dem Körper Zellen entnommen und extrakorporal in einer Zellkultur vermehrt. Mit dieser Vorgehensweise ist es z. B. möglich abgenutzte oder verbrauchte Gelenkknorpel oder auch die Synovialmembran in Gelenken zu erneuern.
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Eine weitere Möglichkeit, Erkrankungen zu heilen oder zu mildern, ist die Verabreichung von Stammzellen. Darunter werden derartige Zellen verstanden, welche sich in unterschiedliche Zellarten oder auch Gewebe ausdifferenzieren können. Dabei wird zwischen sogenannten embryonalen Stammzellen und adulten Stammzellen unterschieden, wobei sich erstere in jegliches Gewebe oder in jede beliebige Zelle und damit auch jedes beliebige unterschiedliches Gewebe, entwickeln können, wohingegen die adulten Stammzellen sich bereits soweit entwickelt haben, dass diese nur noch bestimmte festgelegte Zell- oder Gewebearten ausbilden können. Stammzellen verfügen außerdem über die Eigenschaft, sich besonders gut zu vermehren und weisen darüber hinaus das Potential auf, sich zu beliebigen Zelltypen bzw. Gewebe auszudifferenzieren.
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Stammzellen sind bereits zur Therapie von verschiedenen Erkrankungen, insbesonders des blutbildenden Systems verwendet worden, wie beispielsweise zur Behandlung von Leukämie oder auch Morbus Parkinson. Die Gewinnung derartiger Stammzellen, insbesonders der pluripotenten embryonalen Stammzellen wird üblicherweise durch Zerstörung von Embryonen gewonnen. Dies ist jedoch aufgrund der Zuerkennung menschlicher Eigenschaften bereits an frisch befruchteten Eizellen bzw. daraus entstandenen Embryoblasten zugestandenen Schutz auf Unversehrtheit ethisch in Frage gestellt und daher in vielen Ländern verboten. Es ist daher vielfältig versucht worden, derartige Stammzellen auf andere Weise zu gewinnen.
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Eine Vorgehensweise ist dabei beispielsweise die Umprogrammierung bereits völlig ausdifferenzierter Zellen. Dies kann wie im Falle des bekannten Klon-Schafes Dolly durch Übertragung des Zellkerns einer Hautzelle in eine entkernte Eizelle erfolgen. Eine weitere Möglichkeit ist die Gewinnung von Stammzellen aus einem ausdifferenzierten Individuum. Dabei wird davon Gebrauch gemacht, dass sowohl im Knochenmark als auch im Blut Stammzellen existieren, welche noch nicht die Fähigkeit verloren haben, sich zu unterschiedlichen Zelltypen zu entwickeln. Heute wird insbesonders das Blut der Nabelschnur bei der Geburt eines Kindes, welches ja ohnehin verworfen wird, aufgefangen und im tiefgefrorenen Zustand gelagert. Dies wird von vielen Eltern, insbesonders in der Hoffnung durchgeführt, spätere Erkrankungen des Kindes mit Hilfe dieser kryokonservierten Zellen zu therapieren.
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Eine weitere Möglichkeit zur Gewinnung von Stammzellen ist die Entnahme von Knochenmark, insbesonders aus der Hüfte. Die Erfindung hat daher zum Ziel, ein Gewebe, insbesonders für die Eigentransplantation (autologe Transplantation) bereitzustellen, mit welchem das gewünschte Gewebe schnell und sicher und ohne ethische Probleme nach Bedarf bereitgestellt werden kann. Die Erfindung hat außerdem zum Ziel, derartiges Gewebe, insbesonders derartiges autologes Gewebe, für Empfänger wie z. B. Kinder bereitzustellen, welches nach der Transplantation mitwächst und daher nicht permanent ausgetauscht werden muss.
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Zu
WO 03/070 922 A1 besteht zu der hier vorgelegten Arbeit der Unterschied, dass dort Chondrocyten und Osteoblasten differenziert wurden. Mit der Zusammensetzung des Mediums in der hier vorgelegten Arbeit, das sich zu dem unten aufgeführten Medium unterscheidet, wurden Myofibroblasten erhalten. Anspruch (6) Medium für Chondrocyten, Seite 7, Zeile 10
| 10 ng/ml | TGF-βIII |
| 6,25 μg/ml | Bovines Insulin |
| 5,35 μg/ml | Selensäure |
| 1,25 μg/ml | Linolensäure |
| 100 μg/ml | Bovines Serum Albumin |
| 100 nM | Natriumpyruvat |
| 100 nM | Dexamethason |
| 50 μg/ml | Ascorbinsäure 2-phosphat |
| 40 μg/ml | Prolin |
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Die Verwendung von TGF hat in dieser Zusammensetzung des Mediums nicht zur Differenzierung von Myofibroblasten geführt. Anspruch (10) Medium für Osteoblasten, Seite 7, Zeile 13
| 0,1 μM | Dexamethason |
| 10 mM | 5-Glycerinphosphat |
| 50 μM | Ascorbinsäure 2-phosphat |
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Zu
WO 2008/1540498 A1 besteht ebenfalls der Unterschied, dass durch die Zusammensetzung des Mediums in der hier vorgelegten Arbeit Myofibroblasten differenziert wurden, während oben wiederum Osteoblasten und Chondrocyten (Anspruch 51) und Adipocyten beschrieben werden. Medium für Osteoblasten, Seite 15, 29
| | DMEM |
| 100 nM | Dexamethason |
| 10% | FKS |
| 50 μM | Ascorbinsäure |
| 10 mM | β-Glycerinphosphat |
Medium für Chondrocyten, Seite 15, 29
| | DMEM |
| 10 ng/ml | TGF |
| 100 nM | Dexamethason |
| 50 μg/ml | Ascorbinsäure |
| 40 μg/ml | L-Prolin |
| 1 × | IST +1 Supplement |
| 1 mM | Natriumpyruvat |
| | h-Transferrin |
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Die Verwendung von TGF hat auch in dieser Zusammensetzung des Mediums nicht zur Differenzierung von Myofibroblasten geführt. Die Angabe der Zusammensetzung für ein entsprechendes Medium zur Differenzierung von Myofibroblasten fehlt in der Patentschrift. Medium für Adipocyten, Seite 29
| | DMEM |
| 10 μg/ml | Insulin |
| 200 μM | Indomethacin |
| 500 μM | 3-Isobutyl-1-methyl-xanthine |
| 10% | FKS |
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Die Aufgabe der Erfindung ist die gezielte Zusammensetzung eines Mediums zur Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen in Myofibroblasten. Dieses Ziel wird durch die in den Ansprüchen definierten Merkmale erreicht.
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Es wurde nämlich erfindungsgemäß gefunden, dass das Ziel dann erreicht werden kann, wenn Stammzellen in einem Medium gezüchtet werden, welches Wachstumsfaktoren enthält, die ausgewählt sind aus Insulin, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), insulinartiger Wachstumsfaktor (IGF), basischer Fibroblastenfaktor (BFGF), Transformierender Wachstumsfaktor (TGF), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) und Erythropoetin oder eines seiner biologisch aktiven Derivate enthält.
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Das erfindungsgemäße Differenzierungsmedium ist ein Nährmedium, insbesonders ein flüssiges Nährmedium, und enthält die für derartige Nährmedien üblichen Bestandteile, d. h. eine für die jeweiligen Zellen verwertbaren Energiequelle, wie beispielsweise organische Stoffe, wie beispielsweise Zucker, Proteinhydrolysate bzw. Aminosäuren und/oder Fettsäuren, sowie andere lebenswichtige Substanzen, wie anorganische Salze, insbesonders Stickstoff, Schwefel und Phosphatquellen.
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Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Nährmedium vorzugsweise gepuffert, um einen bestimmten pH-Wert zu stabilisieren. In einer erfindungsgemäßen, bevorzugten Ausführungsform kann das Nährmedium noch weitere Wachstumshilfsstoffe, wie Hormone, Vitamine etc. enthalten. Auch Hemmstoffe, die eine ungewünschte Verseuchung mit nicht gewollten Zelltypen oder Mikroorganismen verhindern, wie beispielsweise Antibiotika oder auch Chioramphenicol, können dem Medium zugesetzt werden. Ein typischer Bestandteil zur Herstellung von Nährmedium ist fötales Kälberserum (FKS). Es kann sowohl hitzedeaktiviert als auch nativ verwendet werden. Welche der beiden Formen im Einzelfall besser geeignet ist, kann mittels einfachen Vorversuchen leicht festgestellt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Serum hitzedeaktiviert. Bei fötalem Kälberserum ist es bevorzugt, dies einer Behandlung zur Beseitigung eventuell vorliegender Prionen zu unterziehen. Derartige prionenentfernende Techniken sind beispielsweise aus der Herstellung von Thymuspräparaten in der pharmazeutischen Industrie bekannt.
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Typische Bestandteile für das erfindungsgemäße Differenzierungsmedium umfassen beispielsweise Penicillin zur Verhinderung von Bakterienwachstum. Dies kann bei besonders rein sterilen Bedingungen auch ohne weiteres weggelassen werden. Ein weiterer zweckmäßiger Bestandteil umfasst Mercaptoethanol zur Förderung der Differenzierung der Zellen, L-Glutamin zur Steigerung der Proliferation und ebenfalls zur Förderung der Differenzierung, Heparin zur Förderung der Proliferation, Ascorbinsäure zur Förderung der Differenzierung sowie optional Cortison. Des Weiteren enthält das Medium nicht essentielle Aminosäuren (NEAA), die als wichtige Synthesebausteine zugesetzt werden.
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Die Konzentrationen der Bestandteile betragen für das L Glutamin 0,1–1 Vol.-%, für das EGF 0,5–7 ng/ml, vorzugsweise 3–6 ng/ml, wobei 5±0,5 ng/ml besonders bevorzugt ist. IGF bzw. IGF-1 liegt zweckmäßigerweise in einer Konzentration von 1–30 ng/ml, insbesonders 10–25 ng/ml vor, wobei 20 ± 2 ng/ml besonders bevorzugt ist. FGF bzw. b-FGF liegt im erfindungsgemäßen Medium zweckmäßigerweise in einer Menge von 1 bis 30 ng/ml vor, wobei 10–25, insbesonders 18–23 bevorzugt ist. Ganz besonders bevorzugt beträgt die Konzentration 20±2 ng/ml. Die Konzentration von TGF-β1 beträgt typischerweise 0,04–10 ng/ml, wobei 0,1–8 ng/ml, insbesonders 1–5 ng/ml bevorzugt ist. Besonders bevorzugt beträgt der Gehalt 2 ng/ml ±0,5. Der Gehalt an TGF-β2 beträgt üblicherweise 0,3–3,0 ng/ml, wobei Mengen von 1±0,5 besonders bevorzugt sind. VEGF ist im erfindungsgemäßen Medium üblicherweise in Mengen von 0,3–50 ng/ml enthalten, wobei Mengen von mindestens 0,4 bevorzugt sind. Besonders bevorzugt beträgt die Konzentration an VEGF 0,5±0,1. Die Konzentration von Epo beträgt typischerweise 0,5–10 I.E./ml, wobei Konzentrationen von 1–8 insbesonders, von 2–5 bevorzugt sind. Besonders bevorzugt sind Epo-Konzentrationen von 3±1 I.E./ml.
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Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Stammzellen können aus den vom Stand der Technik her bekannten Stammzellquellen, wie z. B. Knochenmark oder dem Blut gewonnen werden. Wird Blut aus dem peripheren Blutsystem eines ausdifferenzierten Patienten verwendet, dann wird dieser vorher mit einem entsprechenden Stammzellen-stimulierenden Mittel behandelt. Ein bekanntes Mittel hierzu ist beispielsweise der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF). Mit diesem ist es möglich, innerhalb einer kurzen Zeit von 4 bis 5 Tagen die Stammzellenkonzentration im peripheren Blutsystem um ca. das 100-fache zu steigern. Zweckmäßigerweise werden die Stammzellen aus Knochenmark und/oder der Nabelschnur, d. h. Blut und/oder Nabelschnurgewebe (Whartonsche Sulze), gewonnen, wobei frisches oder kryokonserviertes Nabelschnurblut bevorzugt ist. Die Aufbereitung bzw. Aufkonzentrierung der Stammzellen erfolgt ebenfalls mittels an sich bekannten Verfahren, wie z. B. dem Immobilisieren mit auf seine spezifischen Oberflächenantigene gerichteten Antikörpern und/oder einer sogenannten negativen Entfernung von ungewünschten, parallel vorliegenden Zellen. Eine weitere Möglichkeit zur Aufkonzentrierung steht in einer Dichtezentrifugation, in der sich die jeweiligen Zelltypen entsprechend ihres spezifischen Gewichtes in einer entsprechenden Zentrifugationsschicht anhäufen.
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Bei der Gewinnung von Stammzellen aus dem Blut werden diese vorzugsweise aus dem Buffy-Coat gewonnen. Anschließend erfolgt eine Anreicherung von mesenchymalen Stammzellen, beispielsweise durch eine negative Selektion mit einem Antikörpercocktail, die gegen andere im Blut vorliegenden Zellen gerichtet sind, so dass diese von den verbleibenden Stammzellen abgetrennt werden können. Anschließend erfolgt eine Dichtezentrifugation. Nach einer derartigen Aufkonzentrierung der Zellen, insbesondere der mesenchymalen Stammzellen, werden diese direkt in das erfindungsgemäße Differenzierungsmedium überführt und darin bis zur Differenzierung zu Myofibroblasten kultiviert. Dies erfolgt in den üblichen Zellkulturschalen.
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Eine weitere Möglichkeit:
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Alternativ werden die Zellen vor ihrer weiteren Differenzierung zuerst in StemSpan-Medium expandiert, bzw. vermehrt. Das StemSpan-Medium. wird ggf. zusammen mit einem StemSpan Cytokine Cocktail (CC) 100 verwendet, aus dem die Zellen auch nach 15 und mehr Tagen geerntet werden können.
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Ein typisches StemSpan-Medium enthält Rinder Serum Albumin, Human rekombinantes Insulin, Humanes Transferrin (Eisen gesättigt), 2-Mercaptoäthanol, L-Glutamin, Iscove's modified Dulbecco's Medium (IMDM).
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Ein StemSpan Cytokine Cocktail (CC) 100 enthält nach Zugabe zum Expansions-Grundmedium 100 ng/ml rh Flt-3 Lingand, 100 ng/ml rh Stem Cell Factor, 20 ng/ml rh Interleukin-3, 20 ng/ml rh Interleukin-6.
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Derartige Medien sind besonders zur Kultivierung und Expansion von humanen Hämatopoietischen Zellen, einschließlich CD34 Zellen, Stammzellen und Progenitorzellen geeignet. Dafür werden beispielsweise eine 10 cm Petrischale mit zwei 35 mm Schälchen gestückt, wovon eines mit 3 ml sterilem Wasser gefüllt und ohne Deckel hineingestellt wird. Dies dient der Befeuchtung der Kammer. In das zweite Schälchen gibt man ca. 6 Mill. Stammzellen in 2 ml StemSpan-Medium und läßt die Zellen 5–7 Tage ruhen. Während dieser Zeit vermehren sich die Zellen in der Suspension und bilden schwebende Sphaeroide. Nach ca. einer Woche erntet man die Sphaeroide, wäscht sie 1 × mit modifiziertem Iscove's Medium + 2% FKS, zentrifugiert für 10 min bei 200 g und überführt die Zellen in das erfindungsgemäße Differenzierungsmedium. Dies kann in üblichen Petrischalen oder auch in entsprechenden Fermentierungsgefäßen erfolgen.
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Bei beiden zuvor angeführten Vorgehensweisen wird nach einer Ausdifferenzierung, beispielsweise nach 1 bis 10, insbesondere 2 bis 6 Tage, wobei 3 bis 5, insbesondere 4+/–0,5 Tage besonders bevorzugt sind, das Medium gewechselt und die nicht adhärenten, überschüssigen Zellen in entsprechende Kulturschalen überführt und weitergezüchtet. Bei Konfluenz werden die Zellen abgelöst und mit für den Zelltyp üblichem Medium gefüttert, wie beispielsweise Fibroblasten-Medium der Firma Promocell; Bestellnummer C-23010; das Supplement enthält Insulin, Fibroblasten-Wachstumsfaktor; außerdem Zugabe von 5–10% Serum.
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Die Zellen werden im Brutschrank bei einem CO2-Gehalt von 5–5, 7–6% kultiviert. Der CO2-Gehalt richtet sich nach dem verwendeten Medium.
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Darüber hinaus kann auch noch ein RPMI-Medium verwendet werden, welches weniger die Vermehrung der Zellen fördert, jedoch diese derart konditioniert, dass sie nach Transferieren in eine neue Kulturschale, die das erfindungsgemäße Differenzierungsmedium enthält, besonders gut differenzieren.
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Im Rahmen der Erfindung wurde auch gefunden, dass sich mit diesen Zellen Prothesen beschichten lassen. So ist es beispielsweise mit der erfindungsgemäßen Methode möglich, Herzklappen zu beschichten, welche dann mit dem Empfänger der Prothese weiterwachsen. Dies ist insbesonders bei kleinen Kindern von Vorteil. Erfindungsgemäß wurde auch gefunden, dass beispielsweise bei derartigen Prothesen, bei denen auf entsprechende Patches oder andere Strukturen, wie beispielsweise künstliche Gitterstrukturen erfindungsgemäß erhaltene Zellen aufgebracht werden, diese Prothesen bei mehrmaligem Beschichten mit der Zellsuspension dickes haltbares Bindegewebe ausbildet.
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Darüber hinaus lässt sich ein derartiges Bindegewebe beispielsweise mit Endothelzellen beschichten, welche mit einem entsprechenden Medium einen endothelialen Überzug ausbilden. Überraschenderweise wurde auch gefunden, dass bei anschließendem Wachstum eines derartigen Bindegewebes sogar neue Blutgefäße ausgebildet werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es daher auch möglich, künstliche biologische Blutgefäße zu synthetisieren bzw. zu gewinnen.
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Die Erfindung soll im Folgenden an einem Beispiel näher erläutert werden.
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Die Konzentrationsangaben „mM” beziehen sich auf mMol/l.
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Gewinnung der Zellen:
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20 ml Nabelschnurblut werden zu 2 ml einer Lösung gegeben, die PBS und 2 mM EDTA und 200 U Heparin pro ml Blut oder 0,6% einer ACD-A-Lösung, bestehend aus 2,2% Tri-Natriumcitrat-Dihydrat, 0,8% Zitronensäure-Monohydrat, sowie 2,5% a-D(+)-Glukose enthält.
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In einer alternativen Ausführungsform wird aus dem so erhaltenen Blut mittels Zentrifugation ein Buffy-Coat hergestellt und die obere Hälfte des Plasmas abgenommen. Dann wird das Buffy-Coat mit den gewünschten Zellen abgenommen und nach gegebenenfalls nochmaliger Reinigung mit einem RosetteSep Antikörpercocktail (RosetteSep Human Mesenchymal Stem Cell Enrichment Cocktail) der Firma CellSystems, Deutschland, St. Katharinen, versetzt und nach vorsichtigem Mischen 20 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Mit diesem Test werden die Stammzellen durch bispezifische Antikörper gegen die Oberflächen-Antigene (CD3, CD14, CD19, CD38, CD66b) auf den hämatopoietischen Zellen und dem Glykophorin A auf den roten Blutkörperchen selektiert. Nach einer Verdünnung 1: 4 mit Hank's Lösung und 1 mM EDTA und 2% fötalem Kälberserum, werden 15 ml Biocoll (Dichte 1,077 g/ml) in einem 50 ml Röhrchen, vorsichtig mit der Probe überschichtet. Nach einer Zentrifugation mit 400 g für 35 min wird der Überstand abpipettiert und verworfen. Die gesuchten mononuklearen Zellen sind in der Interphase enthalten und werden in neue Röhrchen überführt. Anschließend werden die Zellen gewaschen (2 × Hank's Lösung und 1 mM EDTA und 2% FKS, sowie 1 × Iscove's modifiziertem Medium und 2% FKS bei 200 g jeweils 10 min), der Überstand entfernt und der Niederschlag in sogenanntem Iscove's modifiziertem Medium und 2% fötalem Kälberserum aufgenommen und resuspendiert. Die so erhaltenen Zellen werden direkt in das erfindungsgemäße Differenzierungsmedium überführt und darin bis zur Differenzierung zu Myofibroblasten kultiviert. Halben Mediumwechsel alle 3–4 Tage durchführen, d. h. Überstand mit nicht adhärenten Zellen nicht verwerfen, sondern in neue Kulturschalen überführen und ebenso weiterkultivieren. Bereits nach einigen Tagen (2–4) bilden sich spindelförmige Zellen. Danach reicht es aus, alle 3–4 Tage einen halben Mediumwechsel durchzuführen. Nach etwa 1 bis 2 Wochen beginnt die Differenzierung der Zellen zu Myofibroblasten. Bei Konfluenz werden diese abgelöst, (z. B. mittels Trypsin) und in ein entsprechendes Kulturgefäß überführt.
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Eine weitere Möglichkeit der zuvor angeführten Vorgehensweise:
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Alternativ hierzu werden die isolierten Zellen zur Vermehrung in einem geeigneten Medium vorinkubiert, wie beispielsweise StemSpan-Medium plus Supplement CC100 (serumfrei, enthalt Methylcellulose) sowie optional plus LDL (10 μg/ml). Nach ausreichender Vermehrung werden diese in ein neues StemSpan-Medium überführt und mehrere Tage (3 bis 7) ruhen gelassen. Während dieser Zeit vermehren sich die Zellen in der Suspension und bilden schwebende Sphaeroide, welche geerntet und 1 × in Iscove's modifiziertem Medium und 2% FKS gewaschen werden (200 g, 10 min) und dann zur Differenzierung im erfindungsgemäßen Differenzierungsmedium in eine entsprechende Zellkulturschale überführt werden.
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Zudem ist es auch möglich, die Zellen in einem RPMI 1640-Medium mit h-Glutamin und 10% FKS zu vermehren. Danach werden die so geernteten Zellen 1x in Iscoves modifiziertem Medium und 2% FKS gewaschen (200 g, 10 Minuten) und dann in das erfindungsgemäße Differenzierungsmedium überführt. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, das Medium während dieser Zeit zu wechseln, um eventuell nicht adhärente überschüssige Zellen in neue Kulturschalen zu überführen und dort weiter zu züchten. Bereits nach einigen Tagen (2 bis 4) bilden sich spindelförmige Zellen. Danach reicht es aus, alle 3 bis 4 Tage das Medium auszutauschen. Nach etwa 1 bis 2 Wochen beginnt die Differenzierung der Zellen. Bei Konfluenz werden diese abgelöst, (z. B. mittels Trypsin) und in ein entsprechendes Kulturgefäß überführt.
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Nach Abschluss der Differenzierung werden dann die Zellen mit üblichen Fibroblastenmedium weiter gefüttert.
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Kultivierung von Endothelzellen:
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Vergleichsbeispiel aus dem Stand der Technik.
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Ein Teil der gewonnenen mononukleären Zellen (also vom selben Spender) wurde in einem anderen geeigneten Medium kultiviert, um die Zellen zu Endothelzellen zu differenzieren. Das hier verwendete Medium setzt sich wie folgt zusammen: dem Basalmedium und einem Supplement, das Insulin, basischen Fibroblastenwachstumfaktor (FGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und fötales Kälberserum enthält. Das Medium ist mit der Bestellnummer C-22162 von der Firma Promocell, Heidelberg, erhältlich. Nach der Differenzierung wurden die gewonnenen Endothelzellen im handelsüblichen Endothelzell-Medium der Firma Promocell, Bestellnummer C-22010 weiter kultiviert.
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Die Herstellung von künstlichem Gewebe:
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Mit den so erhaltenen Zellen wurde eine künstliche Gitterstruktur (Patches) beschichtet. Dabei wurde in einem ersten Schritt ein etwa 3 cm3 großes Patch mit 4 Millionen Myofibroblasten in 1 ml Fibroblastenmedium beschichtet. Zuerst wurde die Zellsuspension auf der Oberseite angebracht und eine halbe Stunde ruhen gelassen. Am nächsten Tag wurde die Unterseite des Patches wie am Vortag die Oberseite beschichtet. Dieses ober- und unterseitige Beschichten wurde in den darauffolgenden Tagen jeweils wiederholt und im Brutschrank insgesamt 10 Tage mit einem üblichen Fibroblastenmedium bedeckt weiter inkubiert.
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Anschließend wurden die so erhaltenen Zellschichten mit Endothelzellen beschichtet. Dabei wurden 2,4 Millionen Zellen in 1 ml Endothelmedium aufgenommen und auf der Oberseite des Patches aufgetragen. Ab diesem Schritt wird der beschichtete Patch in Endothelzellmedium kultiviert. Der Vorgang wurde für die Unterseite am nächsten Tag wiederholt. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, diesen Vorgang gegebenenfalls sowohl für Ober- als auch für Unterseite ein oder mehrfach zu wiederholen. Meist reicht jedoch ein ein- oder zweimaliges Beschichten aus. Eine weitere Inkubation für mindestens 10 Tage ergab ein ausdifferenziertes Gewebe, wie dies in der beiliegenden 1 gezeigt ist. Eine Antikörperuntersuchung des so erhaltenen Bindegewebes zeigte für das Gewebeinnere α-Actin, Kollagen IV, SMC-Myosin, Desmin und Fibrinogen als Oberflächenmarker. An den Endothelzellen konnte mittels spezifischen Antikörpern der Willebrand-Faktor (vWF), CD31, Connexin-43, E-Selectin, VE-Cadherin-5 nachgewiesen werden.
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Wahlweise können Differenzierungsmedium 1 oder 2 für die Differenzierung von Stammzellen zu Myofibroblasten eingesetzt werden
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Differenzierungsmedium I für Myofibroblasten
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- DMEM/Ham's F12 +
- 20% Fötales Kälberserum, 40 min hitzeinaktiviert (je nach Testergebnis kann auch natives FKS verwendet werden)
- 1% 200 mM L-Glutamin
- 1% β-Mercaptoethanol (aus Gebrauchslösung: 7 μl β-Mercaptoethanol ad 10 ml PBS, sterilfiltrieren)
- 1% nicht essentielle Aminosäuren (NEAA 100×)
- Penicillin/Streptomycin (optional)
- Insulin 5 μg/ml
- Epidermaler Wachstumsfaktor 5 ng/ml
- Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-1 20 ng/ml
- Basischer Fibroblastenfaktor 20 ng/ml
- Transformierender Wachstumsfaktor-β2 1,5 ng/ml
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Differenzierungsmedium II für Myofibroblasten
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- IMDM plus L-Glutamin
- Epidermaler Wachstumsfaktor 5,0 ng/ml
- Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor 0,5 ng/ml
- Basischer Fibroblastenfaktor 10 ng/ml
- R3 IGF-1 20 ng/ml
- Ascorbinsäure 1 μg/ml
- Heparin 22,3 μg/ml
- Fötales Kälberserum 10%, 40 min hitzeinaktiviert
- Erythropoetin α (2000 I.E./ml) 1,5 μl/ml
- Penicillin Streptomycin (optional)
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Bezugszeichenliste
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1 zeigt die Vaskularisierung der in vitro generierten Bindegewebsstrukturen:
a) Bindegewebe, Myofibroblasten b) Endothelschicht
b) Gefäßlumen (20 × Vergrößerung)
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2 zeigt die Vaskularisierung der in vitro generierten Bindegewebsstrukturen:
c) Bindegewebe, Myofibroblasten b) Endothelschicht
d) Gefäßlumen (40 × Vergrößerung)