DE102006055047A1

DE102006055047A1 - Verfahren zur Herstellung von Dihydroxy-Verbindungen aus Diketo-Verbindungen durch enzymkatalysierte enantioselektive Reduktion

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Publication number: DE102006055047A1
Application number: DE200610055047
Authority: DE
Inventors: Christian Dipl.-Chem. Dr. Peschko; Jürgen Dipl.-Chem. Dr. Stohrer
Original assignee: Wacker Chemie AG
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2006-11-22
Filing date: 2006-11-22
Publication date: 2008-05-29

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymkatalysierten Reduktion von Diketoverbindungen zu den entsprechenden Dihydroxyverbindungen unter Verwendung eines Reaktionsmediums, enthaltend Diketoverbindung, Alkohol-Dehydrogenase, Wasser, Cofaktor, sekundärer Alkohol als Reduktionsmittel, aus dem während der Reduktionsreaktion entstehendes Keton zeitweise oder kontinuierliche, teilweise oder vollständig entfernt wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von organischen Diketoverbindungen zu den entsprechenden chiralen Dihydroxyverbindungen.
Optisch aktive Dihydroxyverbindungen sind wertvolle Synthesebausteine zur Herstellung wichtiger Verbindungen mit pharmakologischer Wirkung und anderen wertvollen Eigenschaften, bzw. als Synthesebausteine chiraler Folgeprodukte. Chirale Dihydroxyverbindungen sind durch klassische chemische Verfahren oft nur schwer und in schlechten Ausbeuten herstellbar, die erforderlichen optischen Reinheiten für Anwendungen im pharmazeutischen oder agrochemischen Bereich sind auf diesem Wege nur schwer zu erreichen. Daher eignen sich zur Herstellung chiraler Dihydroxyverbindungen im zunehmenden Maße biotechnologische Verfahren, wobei die stereoselektive Reaktion von ganzen Mikroorganismen oder mit vollständig oder teilweise gereinigten, isolierten Enzymen durchgeführt werden kann.
Beispielsweise können durch eine Lipase-katalysierte Veresterungsreaktion racemische Diole in die verschiedenen diastereomeren Ester oder Halbester überführt und nach deren Trennung in die jeweiligen chiralen Diole gespalten werden. Von K. Achiwa et al. (Synlett, 1994, S. 289-290) wird ein solches Verfahren zur Gewinnung von (2R,5R)- bzw. (2S,5S)-Hexan-2,5-diol beschrieben. Mit zwei Synthesestufen, mindestens zwei Trenn- bzw. Reinigungsoperationen und chemischen Ausbeuten an chiralen Diolen von jeweils <25 % ist dieses enzymkatalysierte Racemattrennungs-Verfahren technisch aufwändig und nicht kostengünstig durchführbar.
Chirale Diole können auf direkterem Wege durch die enzymkatalysierte, stereoselektive Reduktion von Diketoverbindungen mit prochiralen Carbonylgruppen hergestellt werden. Dabei werden als Katalysatoren beispielsweise Dehydrogenasen und insbesondere Alkohol-Dehydrogenasen (ADH) eingesetzt.
Gebräuchlich für die stereoselektive Reduktion von Ketonen zu chiralen sekundären Alkoholen sind beispielsweise entsprechende Enzyme aus Hefen, aus tierischen Zellen, wie z. B. Pferdeleber, oder aus Bakterien, wie beispielsweise Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis, Rhodococcus erythropolis oder Rhodococcus ruber. Als Cofaktor für den Hydrid-Transfer benötigen diese ADHs beispielsweise NADH (Nikotinamidadenindinukleotid) oder NADPH (Nikotinamidadenindinukleotidphosphat).
Die Alkohol-Dehydrogenasen aus Lactobacillus kefir und Lactobacillus brevis eignen sich insbesondere zur Gewinnung von chiralen (R)-Alkoholen aus Monoketo-Verbindungen. Alkohol-Dehydrogenasen aus Rhodococcus ruber, Rhodococcus erythropolis, Thermoanaerobacter sp. bzw. aus Saccharomyces cerevisiae eignen sich insbesondere zur Gewinnung von chiralen (S)-Alkoholen.
Aus dem Stand der Technik zur Reduktion organischer Ketoverbindungen zu chiralen Alkoholen mit Alkoholdehydrogenasen (ADHs) sind vorwiegend solche Verfahren bekannt, bei denen als Ketoverbindungen Monoketone eingesetzt werden, bzw. solche, bei denen nur eine Ketogruppe der Ausgangsverbindung mit hoher Stereoselektivität und Ausbeute vom Enzym reduziert wird.
So ist in T. Ema et al., Tetrahedron: Asymmetry, 2005 (16), S. 1075-1078 beschrieben, dass bei der Umsetzung von 2,4-Hexandion mit einer rekombinanten ADH aus Saccharomyces cerevisiae und Glucose als Reduktionsmittel ausschließlich eine der beiden Ketonfunktionen reduziert und (5S)-5-Hydroxyhexan-3-on gebildet wird.
In M. Bertau et al., Chimia 54, 2000, S. 503-507 ist beschrieben, dass enzymatische Diketon-Reduktionen nur dann selektiv zu den gewünschten Diolen führen, wenn die enzymatische Umsetzung intrazellulär stattfindet, was den Einsatz ganzer Zellen voraussetzt und eine exakte Prozesssteuerung erfordert, die technisch sehr aufwändig ist. Ansonsten kommt es zur irreversiblen Bildung unerwünschter Nebenprodukte aus den Monohydroxyketon-Zwischenprodukten.
In J. Lieser et al., Synth. Commun., 1983 (13), S. 765-767 wird die Bäckerhefe-katalysierte Umsetzung von Hexan-2,5-dion zu (2S,5S)-Hexan-2,5-diol mit Glucose als Reduktionsmittel beschrieben. Die Reaktion wird ohne besondere Kontrolle der Reaktionsparameter durchgeführt, erfordert erhebliche Mengen an Enzym und Reduktionsmittel und liefert das chirale Diol mit einer chemischen Ausbeute von nur 57 % und in einer optischen Reinheit von 95 %ee. Mit einer Raum-Zeit-Leistung von ca. 0.2 mmol L^-1 h^-1 ist das Verfahren für eine kostengünstige Produktion irrelevant. Außerdem ist die erzielte Reinheit des Produktes für zahlreiche Anwendungen zu schlecht.
In A. Liese et al., Organic Process Research & Development, 2002 (6), S. 458-462 wird ein exakt gesteuerter Prozess für die Umsetzung von Hexan-2,5-dion mit lebenden Zellen aus Lactobacillus kefir unter Fermentations-Bedingungen und Glucose als Reduktionsmittel beschrieben. Dabei werden die Reaktanden kontinuierlich zugegeben bzw. die Reaktionsprodukte kontinuierlich über eine Membran abgetrennt, sodass eine durchschnittliche Diol-Konzentration von 0.09 Mol L^-1 vorliegt. Neben ca. 80 % (2R,5R)-Hexan-2,5-diol werden ca. 20 % (5R)-5-Hydroxyhexan-2-on als Nebenprodukt gebildet, das bei den Reaktionsbedingungen nicht weiter zum Diol umgesetzt wird. Die Raum-Zeit-Leistung beträgt ca. 23 mmol L^-1 h^-1. Die Prozessführung ist aufwändig und mit dem Einsatz lebender Zellen aus Lactobacillus kefir auf die Erzeugung von Alkoholen einer Händigkeit beschränkt.
In EP 1 067 195 ist ebenso ein fermentativer Prozess mit ganzen Zellen aus Lactobacillus kefir und Glucose als Reduktionsmittel beschrieben, bei dem Hexan-2,5-dion bis zu 99 % zu (2R,5R)-Hexan-2,5-diol umgesetzt wird. Dazu sind große Mengen an Zellensuspension (90 Vol.-%), sowie ein großer Überschuss an Reduktionsmittel (50 Moläquivalente Glucose) erforderlich und die Raum-Zeit-Leistung (bzgl. (2R,5R)-Hexan-2,5-diol) beträgt ca. 14 mmol L^-1 h^-1. Auch diese Art der Durchführung ist kostspielig und nicht wirtschaftlich.
In W. Kroutil et al., Eur. J. Org. Chem., 2006, S. 1904-1909 ist ein Verfahren für die ADH-Reduktion von Diketonen mit lyophilisierten Zellen aus Rhodococcus ruber beschrieben, bei dem als Reduktionsmittel ein sekundärer Alkohol (2-Propanol) eingesetzt wird. Bei der Umsetzung von verschiedenen α-, β- und γ-Diketone fallen unter diesen Bedingungen Gemische aus Monohydroxyketon und Diol an. Zum Teil bleiben erhebliche Mengen an Diketon nicht umgesetzt zurück, obwohl das Reduktionsmittel in großem Überschuss eingesetzt wurde. Beispielsweise entstehen bei der ADH-Reduktion von 2,5-Hexandion 23 % (2S,5S)-Hexan-2,5-diol und 38 % (5S)-5-Hydroxyhexan-2-on, während 35 % Diketon nicht umgesetzt werden. Aus den Daten ist zu schließen, dass weitere Nebenprodukte gebildet werden. Die vollständige Reduktion beider Ketofunktionen des Substrats in einem Syntheseschritt ist nur für ein α-Diketon (Pentan-2,3-dion) beschrieben.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren für die ADH-katalysierte Reduktion von Diketonen zu chiralen Diolen weisen den Nachteil auf, dass der Verbleib von Monohydroxyketon und die Bildung unerwünschter Nebenprodukte daraus nur verhindert werden kann, wenn die ADH-Reduktion intrazellulär und unter exakt gesteuerten Bedingungen abläuft, was zu schlechten Raum-Zeit-Ausbeuten führt und in der Durchführung aufwändig ist. Bei der Verwendung von sekundärem Alkohol als Reduktionsmittel ist zudem die Selektivität der Diol-Bildung wesentlich schlechter als bei der Verwendung von Zuckern.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein technisch leicht durchführbares Verfahren zur enzymkatalysierten Herstellung von chiralen Diolen aus Diketoverbindungen mit hohem Diketonumsatz bei zugleich hoher Selektivität unter Verwendung von S-selektiven oder R-selektiven Alkoholdehydrogenasen, bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst in einem Verfahren zur enzymkatalysierten Reduktion von Diketoverbindungen zu den entsprechenden Dihydroxyverbindungen unter Verwendung eines Reaktionsmediums, enthaltend Diketoverbindung, Alkohol-Dehydrogenase, Wasser, Cofaktor, sekundärer Alkohol als Reduktionsmittel, aus dem während der Reduktionsreaktion entstehendes Keton zeitweise oder kontinuierlich, teilweise oder vollständig entfernt wird.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung chiraler sekundärer Diole aus Diketonen enthaltend die Schritte

a) Reduktion einer Diketoverbindung zur entsprechenden Dihydroxyverbindung in einem wässrigen Reaktionsmedium, enthaltend Wasser, sekundärer Alkohol als Reduktionsmittel, Alkohol-Dehydrogenase und Cofaktor,
b) Abtrennung von aus dem Reduktionsmittel entstehendem Keton,
c) Isolierung des gebildeten sekundären Diols.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch hohe Raum-Zeit-Leistungen bei zugleich niedrigem Enzymverbrauch, Enantiomeren- bzw. Diastereomerenreinheiten von bis zu 99.9 % bezüglich der hergestellten chiralen Dihydroxyverbindungen und chemische Ausbeuten an chiralen Diolen von bis zu >97 % bezogen auf die eingesetzte Menge an Diketoverbindung aus. Die Verwendung eines Membranreaktors ist nicht erforderlich, ferner ist sowohl eine kontinuierliche Dosierung der Reaktanden als auch eine initiale Beladung zur Prozessführung möglich. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren apparativ sehr einfach und somit großtechnisch und kostengünstig umsetzbar.
Als Diketoverbindungen können allgemein Diketone verwendet werden, bevorzugt solche mit 4 bis 40 C-Atomen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden prochirale Diketone der allgemeinen Formel (I) R¹-C(O)-(A)_n-C(O)-R² (I)eingesetzt, wobei
R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe enthaltend C₁-C₂₀-Alkyl, C₃-C₂₀-Cycloalkyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₁-C₂₀-Heteroaryl, C₂-C₂₀-Alkenyl, C₂-C₂₀-Alkinyl, C₅-C₂₀-Aralkyl, C₅-C₂₀-Alkylaryl und
A ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend C₁-C₂₀-Alkylen, C₃-C₂₀-Cycloalkylen, C₅-C₂₀-Arylen, C₂-C₂₀-Alkinylen, C₁-C₂₀-Heteroarylen, C₂-C₂₀-Alkenylen, C₅-C₂₀-Aralkylen, C₅-C₂₀-Alkylarylen,
oder R¹ und/oder R² miteinander oder mit A zusammen einen oder mehrere Ringe bilden können,
n gleich 0 oder 1 bedeutet
und R¹ und R² und A gegebenenfalls unabhängig voneinander mit einem oder mehreren Resten Z substituiert sein können, wobei
Z ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Fluor, Chlor, Brom, Iod, -CN, -NO₂, -NO, -NR³OR³, -CHO, -SO₃H, -COOH oder -R³ und
R³ für Wasserstoff steht oder die Bedeutung von R¹ haben kann und
in R¹ und R² und A gegebenenfalls unabhängig voneinander eine oder mehrere Methylengruppen durch gleiche oder verschiedene Gruppen Y ersetzt sein können, wobei
Y ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend -CR³=CR³-, -C≡C-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)OC(O)-, -O-, -O-O-, -CR³=N-, -C(O)-NR³-, -N=N-, -NR³-NR³-, -NR³-O-, -NR³-, -P(O)(OR³)O-, -OP(O)(R³)O-, -P(R³)-, -P(O)(R³)-, -S-, -S-S-, -S(O)-, -S(O)₂-, -S(O)NR³-, -S(O)(OR³)O-, -Si(R³)₂-, -Si(R³)₂O-, -Si(R³)(OR³) -OSi(R³)₂O-, -OSi(R³)₂- oder -Si(R³)₂OSi(R³)₂-.
Bevorzugte C₅-C₂₀-Aryl oder C₁-C₂₀-Heteroaryl-Reste für R¹ und R² werden insbesondere ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Phenyl, Naphthyl, Indolyl, Benzofuranyl, Thiophenyl, Pyrrolyl, Pyridinyl, Imidazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Furanyl oder Thiazolyl.
Besonders bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden ausgewählt aus der Klasse der α-Diketone, β-Diketone, γ-Diketone, δ-Diketone und ε-Diketone.
Insbesondere eignen sich als Verbindungen der allgemeinen Formel (I) Butan-2,3-dion, Pentan-2,3-dion, Pentan-2,4-dion, Hexan-2,4-dion, Hexan-2,5-dion, Heptan-2,5-dion, Heptan-3,5-dion, Heptan-2,6-dion, Octan-2,7-dion, Octan-2,6-dion, Octan-3,5-dion, Octan-3,6-dion, 3-Hexen-2,5-dion, 3-Hexin-2,5-dion, 3-Hepten-2,5-dion, 3-Hepten-2,6-dion, 3-Heptin-2,5-dion, 3-Heptin-2,6-dion.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einer Menge von 1 % bis 50 % bezogen auf das Gesamtvolumen eines jeden Reaktionsansatzes eingesetzt, bevorzugt von 3 % bis 25 %, insbesondere von 5 % bis 15 %.
Die aus den eingesetzten Diketonen beim erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Zielprodukte sind allgemein Dihydroxyverbindungen, bevorzugt solche mit 4 bis 40 C-Atomen.
In der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die prochiralen Diketone der allgemeinen Formel (I) zu chiralen Diolen der allgemeinen Formel (II) R¹-C*H(OH)-(A)_n-C*H(OH)-R² (II)umgesetzt, wobei R¹, R², A und n dieselben Bedeutungen haben wie sie für Verbindungen der allgemeinen Formel (I) definiert wurden und C* die Bedeutung eines chiralen Kohlenstoff-Atoms hat und jedes C* jeweils unabhängig von anderen Stereozentren im Molekül die Konfiguration (S) oder (R) haben kann.
Die Reaktionsmischung sollte generell einen pH-Wert von 5 bis 10 haben, bevorzugt ist ein pH-Wert von 6 bis 9.
Die wässrige Phase des Reaktionsmediums enthält bevorzugt einen Puffer, insbesondere einen Kaliumphosphat/Kaliumhydrogenphosphat-, Tris(hydroxymethyl)aminomethan/HCl- oder Triethanolamin/HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise einem pH-Wert von 6 bis 9. Die Pufferkonzentration sollte von 5 mM bis 150 mM betragen.
Zusätzlich kann die wässrige Phase auch Magnesiumionen enthalten, beispielsweise in Form von zugesetztem MgCl₂ in einer Konzentration von 0.2 mM bis 10 mM, bevorzugt 0.5 mM bis 2 mM bezogen auf die eingesetzte Wassermenge. Daneben kann die wässrige Phase weitere Salze, wie beispielsweise NaCl, ZnSO₄, sowie weitere Zusätze, wie beispielsweise Dimethylsulfoxid, Glycerin, Glycol, Ethylenglycol, Sorbitol, Mannitol oder Zucker enthalten.
Als Cofaktor können beispielsweise NADP, NADPH, NAD, NADH oder deren Salze eingesetzt werden. Die Konzentration an Cofaktor in der wässrigen Phase beträgt 0.001 mM bis 5 mM, bevorzugt 0.01 mM bis 0.25 mM, besonders bevorzugt 0.02 mM bis 0.1 mM.
Als Reduktionsmittel wird der wässrigen Phase im Allgemeinen ein sekundärer Alkohol, bevorzugt Isopropanol zugefügt. Die bei jedem Ansatz zugesetzte Alkoholmenge beträgt 1 % bis 60 % bezogen auf das Gesamtvolumen des Ansatzes, bevorzugt 10 % bis 50 %, besonders bevorzugt 25 % bis 50 %.
Geeignete Alkohol-Dehydrogenasen stammen beispielsweise aus Thermoanaerobacter spec., Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis oder Rhodococcus spec.
Die Alkohol-Dehydrogenase kann im erfindungsgemäßen Verfahren entweder vollständig gereinigt oder teilweise gereinigt eingesetzt werden oder in Zellen enthaltend verwendet werden. Die eingesetzten Zellen können dabei nativ, permeabilisiert oder lysiert vorliegen.
Die Volumenaktivität der eingesetzten Alkohol-Dehydrogenase beträgt von 100 Units/ml (U/ml) bis 10 000 U/ml, bevorzugt etwa 1000 U/ml bis 5000 U/ml. In der wässrigen Phase, die nach Produktextraktion wieder eingesetzt wird, stehen zur Umsetzung von je 1 kg Verbindung der allgemeinen Formel (I) bevorzugt 50 000 bis 1.000 000 U Alkohol-Dehydrogenase (ADH) zur Verfügung. Besonders bevorzugt wird die ADH in der wässrigen Phase mit mehr als 10 U/ml eingesetzt.
Die Temperatur des Reaktionsgemisches beträgt bevorzugt von 0°C bis 60°C, besonders bevorzugt von 20°C bis 40°C.
Im Laufe der Reaktion kann der Reaktionsmischung weiteres Reduktionsmittel, Wasser, Edukt insbesondere in Form von Diketonen der allgemeinen Formel (I), weiteres Enzym bzw. weiterer Cofaktor zugegeben werden.
Je nach Art und Menge der eingesetzten Alkohol-Dehydrogenase und der eingesetzten Verbindung der allgemeinen Formel (I) beträgt die Reaktionszeit zwischen 30 Min. und 150 h, bevorzugt 12 h bis 72 h.
Das durch Oxidation des Reduktionsmittels entstehende Keton wird während oder nach der Umsetzung des Diketons der allgemeinen Formel (I) aus der Reaktionsmischung teilweise oder vollständig entfernt. Dazu wird die Umsetzung des Diketons zeitweise oder andauernd bei einem Druck von <1 bar, bevorzugt bei einem Druck von 20 mbar bis 300 mbar, besonders bevorzugt von 30 mbar bis 150 mbar durchgeführt und flüchtige Bestandteile teilweise oder vollständig aus der Reaktionsmischung destillativ entfernt. Bevorzugt werden der Druck und die Temperatur so gewählt, dass ein möglichst geringer Verlust von Diketon, Monohydroxyketon und Diol, bei einem möglichst hohen Austrag von entstandenem Keton aus der Reaktionsmischung stattfindet.
Ein gegebenenfalls durch die Abtrennung flüchtiger Bestandteile verursachter bzw. durch Verbrauch bei der ADH-Reduktion auftretender Schwund an Reduktionsmittel in der Reaktionsmischung kann durch kontinuierliche oder zeitweise Zugabe von Reduktionsmittel teilweise, vollständig oder überkompensiert werden.
In einer möglichen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Zielprodukt der allgemeinen Formel (II) aus der Reaktionsmischung durch Extraktion mit einem ausreichend hydrophoben organischen Lösemittel isoliert. Daneben können andere, dem Fachmann bekannte Methoden, wie beispielsweise Kristallisation oder Destillation, zur Aufarbeitung des Produktgemisches angewendet werden.
Als organische Lösemittel sind alle mit Wasser nicht mischbaren Lösemittel geeignet, die das gebildete Diol der allgemeinen Formel (II) aus der wässrigen Phase isolieren können.
Bevorzugt werden organische Lösemittel ausgewählt aus der Gruppe der Ester und/oder Ether und/oder Alkane und/oder chlorierten Alkane verwendet.
Besonders bevorzugt werden Ethylacetat, Methylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Tertbutylacetat, Diethylether, Diisopropylether, Dibutylether, Tertbutylmethylether (MTBE), n-Pentan, n-Hexan und n-Heptan, Methylenchlorid, Chloroform oder deren Mischungen verwendet. Ganz besonders bevorzugt wird MTBE verwendet.
Nach der Abtrennung der organischen Extraktionsphase wird diese vorzugsweise destillativ aufgearbeitet, wobei eine Anreicherung des Reaktionsproduktes der allgemeinen Formel (II) erreicht und die teilweise bis vollständige Abtrennung von Nebenprodukten vom Extraktionslösemittel bewirkt wird und dieses erneut zur Extraktion eingesetzt werden kann.
Das destillativ aufbereitete organische Lösemittel kann für den wiederholten bzw. kontinuierlichen Extraktionseinsatz verwendet werden.
Die nach der Extraktion verbleibende wässrige Phase kann im erfindungsgemäßen Verfahren erneut mit Edukt der allgemeinen Formel (I) (Diketoverbindung) und Reduktionsmittel versetzt und inkubiert werden. Dabei können vor der Inkubation erforderlichenfalls zusätzlich Enzym und Cofaktor zugesetzt werden.
Insbesondere eignet sich die erfindungsgemäße Vorgehensweise beim Einsatz von Isopropanol als Reduktionsmittel und zur kontinuierlichen oder zeitweisen destillativen Entfernung von Aceton aus der Reaktionsmischung. Auf diese Weise wird überraschenderweise eine besonders hohe Ausbeute an chiralem Diol der allgemeinen Formel (II) bei geringen Restmengen an Monohydroxyketon bzw. Diketon erreicht.
Durch Aufreinigung der organischen Extraktionslösung enthaltend das Rohprodukt, beispielsweise mittels Feindestillation oder Umkristallisation erhält man das gewünschte Zielprodukt. Die so erhaltenen Diole der allgemeinen Formel (II) zeichnen sich typischerweise durch Ausbeuten >95 % und ee bzw. de >98 % aus.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Herstellung von chiralen Diolen sehr hoher optischer und chemischer Reinheit sowie in hohen Ausbeuten durch die Umsetzung prochiraler Diketone mit Alkoholdehydrogenasen und sekundären Alkoholen als Reduktionsmittel in einem technisch einfach durchführbaren, einstufigen Prozess, der die nahezu vollständige Reduktion beider Ketogruppen der eingesetzten Dione ermöglicht und so den Anteil an Monohydroxyketon-Zwischenprodukten stark verringert. Die sich ergebenden hohen Raum-Zeit-Leistungen an chiralen Diolen und der Einsatz von ADH-Enzymen komplementärer Substratspezifitäten ermöglichen die kostengünstige Herstellung chiraler Diole unterschiedlicher Händigkeiten unter Verwendung von Enzymen.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur enzymkatalysierten Herstellung chiraler Diole ausgehend von prochiralen Diketonen geben dem Fachmann keinerlei Hinweis darauf, dass die Cofaktorregenerierung mit einem sekundären Alkohol als Reduktionsmittel im Zusammenhang mit der Abtrennung von gebildetem Keton zu signifikanten Vorteilen der geschilderten Art führen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:
Beispiel 1a:
Umsetzung von Hexan-2,5-dion zu (2R,5R)-Hexan-2,5-diol mit ADH-LB unter diskontinuierlichem Teilvakuum
Durchführung

500 ml einer Lösung von Wasser, Phosphatpuffer (50 mM), Magnesiumchlorid (1 mM bzgl. Wasser), 2-Propanol (50 Vol.-%), 100 U/ml ADH-LB (Rohextrakt), NADP-Dinatriumsalz (0.03 mM) und Hexan-2,5-dion (1.0 M) von pH 6,5 wurde in einen 1000 ml Rundkolben mit Magnetrührer, Innenthermometer und Rückflusskühler gefüllt und bei 40°C und Normaldruck kräftig gerührt. Nach 6, nach 22 und nach 30 Stunden wurden über eine Destillationsbrücke mit Vakuumvorstoß bei einem Druck von 100-120 mbar jeweils 125 ml der Reaktionsmischung abdestilliert und, nach dem Auffüllen der Reaktionsmischung mit jeweils 125 ml 2-Propanol, bei Normaldruck weiter gerührt. Nach 55 Stunden wurde restliches 2-Propanol und Aceton weitgehend destillativ entfernt, die verbliebene Lösung mit 3 × 200 ml Methyltertbutylether (MTBE) extrahiert und das Rohprodukt durch Eindampfen der organischen Phasen isoliert. Mittels Auswaage, GC- und NMR-Spektroskopie wurde die Ausbeute an (2R,5R)-Hexan-2,5-diol und (5R)-5-Hydroxyhexan-2-on bestimmt. Ergebnis

• Diol-Ausbeute:	480 mmol (96 %)
• (2R,5R)-Hexan-2,5-diol:	>99 %ee; >99 %de
• Hydroxyketon-Ausbeute:	15 mmol (3 %)
• (5R)-5-Hydroxyhexan-2-on:	>99 %ee
• Nichtumgesetztes Diketon:	5 mmol (1 %)
• Raum-Zeit-Leistung (Diol):	17.5 Molm^-3h^-1

Vergleichsbeispiel 1b:
Umsetzung von Hexan-2,5-dion zu (2R,5R)-Hexan-2,5-diol mit ADH-LB bei Normaldruck
Durchführung

500 ml einer Lösung von Wasser, Phosphatpuffer (50 mM), Magnesiumchlorid (1 mM bzgl. Nasser), 2-Propanol (50 Vol.-%), 100 U/ml ADH-LB (Rohextrakt), NADP-Dinatriumsalz (0.03 mM) und Hexan-2,5-dion (1.0 M) von pH 6,5 wurde in einem 1000 ml Rundkolben mit Magnetrührer, Innenthermometer und Rückflusskühler gefüllt und bei 40°C und Normaldruck kräftig gerührt. Nach 55 Stunden wurde restliches 2-Propanol und Aceton weitgehend destillativ entfernt, die verbliebene Lösung mit 3 × 200 ml Methyl-tertbutylether (MTBE) extrahiert und das Rohprodukt durch Eindampfen der organischen Phasen isoliert. Mittels Auswaage, GC- und NMR-Spektroskopie wurde die Ausbeute an (2R,5R)-Hexan-2,5-diol und (5R)-5-Hydroxyhexan-2-on bestimmt. Ergebnis

• Diol-Ausbeute:	200 mmol (40 %)
• (2R,5R)-Hexan-2,5-diol:	>99 %ee; >99 %de
• Hydroxyketon-Ausbeute:	245 mmol (49 %)
• (5R)-5-Hydroxyhexan-2-on:	>99 %ee
• Nichtumgesetztes Diketon:	50 mmol (10 %)
• Raum-Zeit-Leistung (Diol):	7.27 Molm^-3h^-1

Beispiel 2a:
Umsetzung von Hexan-2,5-dion zu (2S,5S)-Hexan-2,5-diol mit ADH-T unter diskontinuierlichem Teilvakuum
Durchführung

500 ml einer Lösung von Wasser, Phosphatpuffer (50 mM), Magnesiumchlorid (1 mM bzgl. Wasser), 2-Propanol (50 Vol.-%), 30 U/ml ADH-T (Rohextrakt), NADP-Dinatriumsalz (0.03 mM) und Hexan-2,5-dion (1.0 M) von pH 6,5 wurde in einen 1000 ml Rundkolben mit Magnetrührer, Innenthermometer und Rückflusskühler gefüllt und bei 40°C und Normaldruck kräftig gerührt. Nach 3, nach 18 und nach 26 Stunden wurden über eine Destillationsbrücke mit Vakuumvorstoß bei einem Druck von 100-120 mbar jeweils 125 ml der Reaktionsmischung abdestilliert und, nach dem Auffüllen der Reaktionsmischung mit jeweils 125 ml 2-Propanol, bei Normaldruck weiter gerührt. Nach 32 Stunden wurde restliches 2-Propanol und Aceton weitgehend destillativ entfernt, die verbliebene Lösung mit 3 × 200 ml Methyltertbutylether (MTBE) extrahiert und das Rohprodukt durch Eindampfen der organischen Phasen isoliert. Mittels Auswaage, GC- und NMR-Spektroskopie wurde die Ausbeute an (2S,5S)-Hexan-2,5-diol und (5S)-5-Hydroxyhexan-2-on bestimmt. Ergebnis

• Diol-Ausbeute:	485 mmol (97 %)
• (2S,5S)-Hexan-2,5-diol:	>99 %ee; >99 %de
• Hydroxyketon-Ausbeute:	<15 mmol (<3 %)
• (5S)-5-Hydroxyhexan-2-on:	>99 %ee
• Nichtumgesetztes Diketon:	<5 mmol (<1 %)
• Raum-Zeit-Leistung (Diol):	30.3 Molm^-3h^-1

Vergleichsbeispiel 2b:
Umsetzung von Hexan-2,5-dion zu (2S,5S)-Hexan-2,5-diol mit ADH-T bei Normaldruck
Durchführung

500 ml einer Lösung von Wasser, Phosphatpuffer (50 mM), Magnesiumchlorid (1 mM bzgl. Wasser), 2-Propanol (50 Vol.-%), 30 U/ml ADH-T (Rohextrakt), NADP-Dinatriumsalz (0.03 mM) und Hexan-2,5-dion (1.0 M) von pH 6,5 wurde in einen 1000 ml Rundkolben mit Magnetrührer, Innenthermometer und Rückflusskühler gefüllt und bei 40°C und Normaldruck kräftig gerührt. Nach 24 Stunden wurde restliches 2-Propanol und Aceton weitgehend destillativ entfernt, die verbliebene Lösung mit 3 × 200 ml Methyl-tertbutylether (MTBE) extrahiert und das Rohprodukt durch Eindampfen der organischen Phasen isoliert. Mittels Auswaage, GC- und NMR-Spektroskopie wurde die Ausbeute an (2S,5S)-Hexan-2,5-diol und (5S)-5-Hydroxyhexan-2-on bestimmt. Ergebnis

• Diol-Ausbeute:	215 mmol (43 %)
• (2S,5S)-Hexan-2,5-diol:	>99 %ee; >99 %de
• Hydroxyketon-Ausbeute:	235 mmol (47 %)
• (5S)-5-Hydroxyhexan-2-on:	>99 %ee
• Nichtumgesetztes Diketon:	50 mmol (10 %)
• Raum-Zeit-Leistung (Diol):	17.92 Molm^-3h^-1

Beispiel 3a:
Umsetzung von Octan-3,6-dion zu (3S,6S)-Octan-3,6-diol mit ADH-T unter diskontinuierlichem Teilvakuum
Durchführung

500 ml einer Lösung von Wasser, Phosphatpuffer (50 mM), Magnesiumchlorid (1 mM bzgl. Wasser), 2-Propanol (50 Vol.-%), 30 U/ml ADH-T (Rohextrakt), NADP-Dinatriumsalz (0.03 mM) und Octan-3,6-dion (1.0 M) von pH 6,5 wurde in einen 1000 ml Rundkolben mit Magnetrührer, Innenthermometer und Rückflusskühler gefüllt und bei 40°C und Normaldruck kräftig gerührt. Nach 3, nach 18 und nach 26 Stunden wurden über eine Destillationsbrücke mit Vakuumvorstoß bei einem Druck von 100-120 mbar jeweils 125 ml der Reaktionsmischung abdestilliert und, nach dem Auffüllen der Reaktionsmischung mit jeweils 125 ml 2-Propanol, bei Normaldruck weiter gerührt. Nach 34 Stunden wurde restliches 2-Propanol und Aceton weitgehend destillativ entfernt, die verbliebene Lösung mit 3 × 200 ml Methyltertbutylether (MTBE) extrahiert und das Rohprodukt durch Eindampfen der organischen Phasen isoliert. Mittels Auswaage, GC- und NMR-Spektroskopie wurde die Ausbeute an (3S,6S)-Octan-3,6-diol und (6S)-6-Hydroxyoctan-3-on bestimmt. Ergebnis

• Diol-Ausbeute:	480 mmol (96%)
• (3S,6S)-Octan-3,6-diol:	>99 %ee; >99 %de
• Hydroxyketon-Ausbeute:	15 mmol (3 %)
• (6S)-6-Hydroxyoctan-3-on:	>99 %ee
• Nichtumgesetztes Diketon:	5 mmol (1 %)
• Raum-Zeit-Leistung (Diol):	28.24 Molm^-3h^-1

Vergleichsbeispiel 2b:
Umsetzung von Octan-3,6-dion zu (3S,6S)-Octan-3,6-diol mit ADH-T bei Normaldruck
Durchführung

500 ml einer Lösung von Wasser, Phosphatpuffer (50 mM), Magnesiumchlorid (1 mM bzgl. Wasser), 2-Propanol (50 Vol.-%), 30 U/ml ADH-T (Rohextrakt), NADP-Dinatriumsalz (0.03 mM) und Octan-3,6-dion (1.0 M) von pH 6,5 wurde in einen 1000 ml Rundkolben mit Magnetrührer, Innenthermometer und Rückflusskühler gefüllt und bei 40°C und Normaldruck kräftig gerührt. Nach 26 Stunden wurde restliches 2-Propanol und Aceton weitgehend destillativ entfernt, die verbliebene Lösung mit 3 × 200 ml Methyl-tertbutylether (MTBE) extrahiert und das Rohprodukt durch Eindampfen der organischen Phasen isoliert. Mittels Auswaage, GC- und NMR-Spektroskopie wurde die Ausbeute an (3S,6S)-Octan-3,6-diol und (6S)-6-Hydroxyoctan-3-on bestimmt. Ergebnis

• Diol-Ausbeute:	170 mmol (34 %)
• (3S,6S)-Octan-3,6-diol:	>99 %ee; >99 %de
• Hydroxyketon-Ausbeute:	260 mmol (52 %)
• (6S)-6-Hydroxyoctan-3-on:	>99 %ee
• Nichtumgesetztes Diketon:	70 mmol (14 %)
• Raum-Zeit-Leistung (Diol):	13.1 Molm ^-3h^-1

Claims

Verfahren zur Herstellung chiraler sekundärer Diole aus Diketonen enthaltend die Schritte a) Reduktion einer Diketoverbindung zur entsprechenden Dihydroxyverbindung in einem wässrigen Reaktionsmedium, enthaltend Wasser, sekundärer Alkohol als Reduktionsmittel, Alkohol-Dehydrogenase und Cofaktor, b) Abtrennung von aus dem Reduktionsmittel entstehendem Keton, c) Isolierung des gebildeten sekundären Diols.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten Diketone aus 4 bis 40 C-Atomen bestehen.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass prochirale Diketone der allgemeinen Formel (I) R¹-C(O)-(A)_n-C(O)-R² (I)zu chiralen Diolen der allgemeinen Formel (II) R¹-C*H(OH)-(A)_n-C*H(OH)-R² (II)umgesetzt werden, wobei C* die Bedeutung eines chiralen Kohlenstoff-Atoms hat und jedes C* jeweils unabhängig von anderen Stereozentren im Molekül die Konfiguration (S) oder (R) haben kann, wobei R¹ und R² unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe enthaltend C₁-C₂₀-Alkyl, C₃-C₂₀-Cycloalkyl, C₅-C₂₀-Aryl, C₁-C₂₀-Heteroaryl, C₂-C₂₀-Alkenyl, C₂-C₂₀-Alkinyl, C₅-C₂₀-Aralkyl, C₅-C₂₀-Alkylaryl und n gleich 0 oder 1 bedeutet und A ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend C₁-C₂₀-Alkylen, C₃-C₂₀-Cycloalkylen, C₅-C₂₀-Arylen, C₂-C₂₀-Alkinylen, C₁-C₂₀-Heteroarylen, C₂-C₂₀-Alkenylen, C₅-C₂₀-Aralkylen, C₅-C₂₀-Alkylarylen, oder R¹ und/oder R² miteinander oder mit A zusammen einen oder mehrere Ringe bilden können, und R¹ und R² und A gegebenenfalls unabhängig voneinander mit einem oder mehreren Resten Z substituiert sein können, wobei Z ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Fluor, Chlor, Brom, Iod, -CN, -NO₂, -NO, -NR³OR³, -CHO, -SO₃H, -COOH oder -R³ und R³ für Wasserstoff steht oder die Bedeutung von R¹ haben kann und in R¹ und R² und A gegebenenfalls unabhängig voneinander eine oder mehrere Methylengruppen durch gleiche oder verschiedene Gruppen Y ersetzt sein können, wobei Y ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend -CR³=CR³-, -C≡C-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)OC(O)-, -O-, -O-O-, -CR³=N-, -C(O)-NR³-, -N=N-, -NR³-NR³-, -NR³-O-, -NR³-, -P(O)(OR³)O-, -OP(O)(R³)O-, -P(R³)-, -P(O)(R³)-, -S-, -S-S-, -S(O)-, -S(O)₂-, -S(O)NR³-, -S(O)(OR³)O-, -Si(R³)₂-, -Si(R³)₂O-, -Si(R³)(OR³)-, -OSi(R³)₂O-, -OSi(R³)₂- oder -Si(R³)₂OSi(R³)₂-.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichent, dass die C₅-C₂₀-Aryl oder C₁-C₂₀-Heteroaryl-Reste für R¹ und R² ausgewählt werden aus der Gruppe enthaltend Phenyl, Naphthyl, Indolyl, Benzofuranyl, Thiophenyl, Pyrrolyl, Pyridinyl, Imidazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Furanyl oder Thiazolyl.
Verfahren nach Anspruch 3 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ausgewählt werden aus der Klasse der α-Diketone, β-Diketone, γ-Diketone, δ-Diketone und ε-Diketone.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) aus der Gruppe gewählt werden enthaltend Butan-2,3-dion, Pentan-2,3-dion, Pentan-2,4-dion, Hexan-2,4-dion, Hexan-2,5-dion, Heptan-2,5-dion, Heptan-3,5-dion, Heptan-2,6-dion, Octan-2,7-dion, Octan-2,6-dion, Octan-3,5-dion, Octan-3,6-dion, 3-Hexen-2,5-dion, 3-Hexin-2,5-dion, 3-Hepten-2,5-dion, 3-Hepten-2,6-dion, 3-Heptin-2,5-dion, 3-Heptin-2,6-dion.
Verfahren nach Anspruch 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in einer Menge von 1 % bis 50 % bezogen auf das Gesamtvolumen eines jeden Reaktionsansatzes eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Cofaktor NADP, NADPH, NAD, NADH oder deren Salze in einer Konzentration an Cofaktor in der wässrigen Phase von 0.001 mM bis 5 mM eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Reduktionsmittel Isopropanol in einem Verhältnis von 1 % bis 60 % bezogen auf das Gesamtvolumen des Ansatzes eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur des Reaktionsgemisches 0°C bis 60°C beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Alkohol-Dehydrogenasen aus der Gruppe enthaltend Thermoanaerobacter spec., Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis oder Rhodococcus spec., entweder vollständig oder teilweise gereinigt oder in nativen, permeabilisierten oder lysierten Zellen eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumenaktivität der eingesetzten Alkohol-Dehydrogenase 100 Units/ml (U/ml) bis 10000 U/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass je nach Art und Menge der eingesetzten Alkohol-Dehydrogenase und der eingesetzten Verbindung der allgemeinen Formel (I) die Reaktionszeit zwischen 30 Min. und 150 h beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass im Laufe der Reaktion der Reaktionsmischung weiteres Reduktionsmittel, Wasser, Edukt, weiteres Enzym und/oder weiterer Cofaktor zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung des Zielprodukts der allgemeinen Formel (II) aus der Reaktionsmischung durch Destillation oder Extraktion erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösemittel für die Extraktion des gebildeten Diols der allgemeinen Formel (II) aus der wässrigen Phase eines oder mehrere organische Lösemittel aus der Gruppe der Ester, Ether, Alkane und chlorierte Alkane eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösemittel Verbindungen aus der Gruppe enthaltend Ethylacetat, Methylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Tertbutylacetat, Diethylether, Diisopropylether, Dibutylether, Tertbutylmethylether (MTBE), n-Pentan, n-Hexan und n-Heptan, Methylenchlorid, Chloroform eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Abtrennung der organischen Extraktionsphase diese destillativ aufgearbeitet wird.