DE102006034313A1

DE102006034313A1 - Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure

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Publication number: DE102006034313A1
Application number: DE102006034313A
Authority: DE
Inventors: Michael Dr. Geiger; Jörg Dr. Bauer; Petra Dr. Cirpus
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2006-07-21
Filing date: 2006-07-21
Publication date: 2008-01-24
Also published as: AU2007276257A1; EP2046960A1; CA2658273A1; US20090172837A1; WO2008009600A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure (=ARA) oder Eicosapentaensäure (=EPA) oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure vorteilhaft im Samen transgener Pflanzen der Familie der Brassicaceae mit einem Gehalt an ARA oder EPA oder ARA und EPA von mindestens 3 Gew.-%, bezogen auf den Gesamtlipidgehalt der transgenen Pflanze, indem Nukleinsäuren in den Organismus eingebracht werden, die für Polypeptide mit Delta-6-Desaturase-, Delta-6-Elongase- und Delta-5-Desaturaseaktivität codieren, wobei durch die enzymatische Aktivität der eingebrachten Enzyme eine Fettsäure, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Fettsäuren Ölsäure [C18:1Delta9], Linolsäure [C18:2Delta9,12], alpha-Linolensäure [C18:3Delta6,9,12], Icosensäure (20:1Delta11) und Erucasäure [C22:1Delta13] um mindestens 10% gegenüber der nicht-transgenen Wildtyppflanze reduziert wird. Vorteilhaft können weitere Enzyme, ausgewählt aus der Gruppe der Enzyme omega-3-Desaturasen, Delta-12-Desaturasen, Delta-6-Desaturasen, Delta-6-Elongasen, Delta-5-Desaturasen, Delta-5-Elongasen und/oder Delta-4-Desaturasen in die Pflanzen eingebracht werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung Herstellung von Arachidonsäure (= ARA) oder Eicosapentaensäure (= EPA) oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure vorteilhaft im Samen transgener Pflanzen der Familie der Brassicaceae mit einem Gehalt an ARA oder EPA oder ARA und EPA von mindestens 3 Gew.-% bezogen auf den Gesamtlipidgehalt der transgenen Pflanze, indem Nukleinsäuren in den Organismus eingebracht werden, die für Polypeptide mit Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase- und Δ-5-Desaturaseaktivität codieren, wobei durch die enzymatische Aktivität der eingebrachten Enzyme eine Fettsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Fettsäuren Ölsäure [C18:1^Δ9], Linolsäure [C18:2^Δ9,12], α-Linolensäure [C18:3^Δ6,9,12], Icosensäure (20:1^Δ11) und Erucasäure [C22:1^Δ13] um mindestens 10% gegenüber der nicht-transgenen Wildtyppflanze reduziert wird. Vorteilhaft können weitere Enzyme ausgewählt aus der Gruppe der Enzyme ω-3-Desaturasen, Δ-12-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-6-Elongasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-5-Elongasen und/oder Δ-4-Desaturasen in die Pflanzen eingebracht werden.
Bei den eingebrachten Nukleinsäuresequenzen handelt es sich um die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenzen. Bevorzugt werden neben diesen Nukleinsäuresequenzen weitere Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturase- oder Δ-12-Desaturaseaktivität kodieren, in die Pflanzen eingebracht und ebenfalls gleichzeitig exprimiert. Besonders bevorzugt handelt es sich dabei um die in SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenzen.
Vorteilhaft können diese Nukleinsäuresequenzen gegebenenfalls zusammen mit weiteren Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide der Biosynthese des Fettsäure- oder Lipidstoffwechels codieren, in dem Organismus exprimiert werden. Besonders vorteilhaft sind Nukleinsäuresequenzen, die für eine Δ-4-Desaturase- und/oder Δ-5-Elongaseaktivität codieren. Vorteilhaft werden die im Verfahren hergestellten Öle, Lipide oder freien Fettsäuren, die ARA und/oder EPA enthalten, in dem Fachmann bekannten Mengen Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika zugesetzt.
Die Lipidsynthese lässt sich in zwei Abschnitte unterteilen: die Synthese von Fettsäuren und ihre Bindung an sn-Glycerin-3-Phosphat sowie die Addition oder Modifikation einer polaren Kopfgruppe. Übliche Lipide, die in Membranen verwendet werden, umfassen Phospholipide, Glycolipide, Sphingolipide und Phosphoglyceride. Die Fettsäuresynthese beginnt mit der Umwandlung von Acetyl-CoA in Malonyl-CoA durch die Acetyl-COA-Carboxylase oder in Acetyl-ACP durch die Acetyltransacylase. Nach einer Kondensationsreaktion bilden diese beiden Produktmoleküle zusammen Acetoacetyl-ACP, das über eine Reihe von Kondensations-, Reduktions- und Dehydratisierungsreaktionen umgewandelt wird, so dass ein gesättigtes Fettsäuremolekül mit der gewünschten Kettenlänge erhalten wird. Die Produktion der ungesättigten Fettsäuren aus diesen Molekülen wird durch spezifische Desaturasen katalysiert, und zwar entweder aerob mittels molekularem Sauerstoff oder anaerob (bezüglich der Fettsäuresynthese in Mikroorganismen siehe F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli und Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., S. 612–636 und darin enthaltene Literaturstellen; Lengeler et al. (Hrsgb.) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, und die enthaltene Literaturstellen, sowie Magnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522–542 und die enthaltenen Literaturstellen). Die so hergestellten an Phospholipide gebundenen Fettsäuren müssen anschließend für die weiteren Elongationen aus den Phospholipiden wieder in den FettsäureCoA-Ester-Pool überführt werden. Dies ermöglichen Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen. Weiterhin können diese Enzyme die elongierten Fettsäuren wieder von den CoA-Estern auf die Phospholipide übertragen. Diese Reaktionsabfolge kann gegebenenfalls mehrfach durchlaufen werden.
Ferner müssen Fettsäuren anschließend an verschiedene Modifikationsorte transportiert und in das Triacylglycerin-Speicherlipid eingebaut werden. Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Lipidsynthese ist der Transfer von Fettsäuren auf die polaren Kopfgruppen, beispielsweise durch Glycerin-Fettsäure-Acyltransferase (siehe Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5):161–166).
Veröffentlichungen über die Pflanzen-Fettsäurebiosynthese, Desaturierung, den Lipidstoffwechsel und Membrantransport von fetthaltigen Verbindungen, die Betaoxidation, Fettsäuremodifikation und Cofaktoren, Triacylglycerin-Speicherung und -Assqemblierung einschließlich der Literaturstellen darin siehe in den folgenden Artikeln: Kinney, 1997, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 19:149–166; Ohlrogge und Browse, 1995, Plant Cell 7:957–970; Shanklin und Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611–641; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, Hrsgb.: JK Setlow, 18:111–13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31:397–417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34:267–342; Stymne et al., 1993, in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Hrsgb.: Murata und Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150–158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1):1–16.
Im folgenden werden mehrfach ungesättigte Fettsäuren als PUFA, PUFAs, LCPUFA oder LCPUFAs bezeichnet (poly unsaturated fatty acids, PUFA, mehrfach ungesättigte Fettsäuren; long chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA, langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren), im besonderen werden unter PUFA, PUFAs, LCPUFA und LCPUFAs ARA, EPA und/oder Docosahexaensäure (= DHA) verstanden.
Fettsäuren und Triacylglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem, ob es sich um freie gesättigte und ungesättigte Fettsäuren oder um Triacylglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Linol- und Linolensäure sind für Säugetiere essentiell, da sie nicht von diesen selbst hergestellt werden können. Deshalb stellen mehrfach ungesättigte ω-3-Fettsäuren und ω-6-Fettsäuren einen wichtigen Bestandteil der tierischen und menschlichen Nahrung dar. So werden z.B. in der humanen Ernährung Lipide mit ungesättigten Fettsäuren, speziell mehrfach ungesättigten, Fettsäuren bevorzugt. Den mehrfach ungesättigten ω-3-Fettsäuren wird dabei ein positiver Effekt auf den Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Prävention einer Herzerkrankung zugeschrieben. Durch Zugabe dieser ω-3-Fettsäuren zur Nahrung kann das Risiko einer Herzerkrankung, eines Schlaganfalls oder von Bluthochdruck deutlich verringert werden (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet. 88, 100–108).
Auch entzündliche, speziell chronisch entzündliche, Prozesse im Rahmen immunologischer Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis lassen sich durch ω-3-Fettsäuren positiv beeinflussen (Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61, 345–358; Cleland und James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305–2307). Sie werden deshalb Lebensmitteln, speziell diätetischen Lebensmitteln, zugegeben oder finden in Medikamenten Anwendung. ω-6-Fettsäuren wie Arachidonsäure üben bei diesen rheumatischen Erkrankungen eher einen negativen Effekt aus. ARA ist aber für die Entwicklung von Neugeborenen vorteilhaft und wichtig.
ω-3- und ω-6-Fettsäuren sind Vorläufer von Gewebshormonen, den sogenannten Eicosanoiden wie den Prostaglandinen, die sich von der Dihomo-γ-linolensäure, der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure ableiten, und den Thromboxanen und Leukotrienen, die sich von der Arachidonsäure und der Eicosapentaensäure ableiten. Eicosanoide (sog. PG₂-Serie), die aus ω-6-Fettsäuren gebildet werden, fördern in der Regel Entzündungsreaktionen, während Eicosanoide (sog. PG₃-Serie) aus ω-3-Fettsäuren geringe oder keine entzündungsfördernde Wirkung haben.
Mehrfach ungesättigte langkettige ω-3-Fettsäuren wie Eicosapentaensäure (= EPA, C20:5^{Δ5,8,11,14,17}) oder Docosahexaensäure (= DHA, C22:6^{Δ4,7,10,13,18,19}) sind wichtige Komponenten der menschlichen Ernährung aufgrund ihrer verschiedenen Rollen in der Gesundheit, die Aspekte wie die Entwicklung des kindlichen Gehirns, der Funktionalität des Auges, der Synthese von Hormonen und anderer Signalstoffe, sowie die Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Beschwerden, Krebs und Diabetes umfassen (Poulos, A Lipids 30:1–14, 1995; Horrocks, LA und Yeo YK Pharmacol Res 40:211–225, 1999). Es besteht aus diesem Grund ein Bedarf an Produktion mehrfach ungesättigter langkettiger Fettsäuren, wie den vorgenannten.
Aufgrund der heute üblichen Zusammensetzung der menschlichen Nahrung ist ein Zusatz von mehrfach ungesättigten ω-3-Fettsäuren, die bevorzugt in Fischölen vorkommen, zur Nahrung besonders wichtig. So werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Docosahexaensäure (= DHA, C22:6^{Δ4,7,10,13,16,19}) oder Eisosapentaensäure (= EPA, C20:5^{Δ5,8,11,14,17}) Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. Der ungesättigten Fettsäure DHA wird dabei ein positiver Effekt auf die Entwicklung und Aufrechterhaltung von Gehirnfunktionen zugeschrieben. Es besteht aus diesem Grund ein Bedarf an der Produktion mehrfach ungesättigter langkettiger Fettsäuren.
Hauptsächlich werden die verschiedenen Fettsäuren und Triglyceride aus Mikroorganismen wie Mortierella oder Schizochytrium oder aus Ölproduzierenden Pflanzen wie Soja, Raps, Algen wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum und weiteren gewonnen, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride (= Triglyceride = Triglycerole) anfallen. Sie können aber auch aus Tieren wie z.B. Fischen gewonnen werden. Die freien Fettsäuren werden vorteilhaft durch Verseifung hergestellt. Sehr langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie DHA, EPA, Arachidonsäure (= ARA, C20:4^Δ5,8,11,14) Dihomo-γ-linolensaure (C20:3^Δ8,11,14) oder Docosapentaensäure (DPA, C22:5^{Δ7,10,13,16,19}) werden in Ölfruchtpflanzen wie Raps, Soja, Sonnenblume, Färbersaflor nicht synthetisiert. Übliche natürliche Quellen für diese Fettsäuren sind Fische wie Hering, Lachs, Sardine, Goldbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch oder Algen.
Fettsäuren aus Gattungen der Familie Brassicaceae wie Brassica napus oder Brassica rapa werden gerne in der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und/oder Pharmaindustrie genommen. Von Nachteil bei den Ölen dieser Familie ist, dass sie einige Fettsäuren wie α-Linolensäure, Icosensäure oder Erucasäure enthalten, die eher unerwünscht sind, so dass die Öle nicht in beliebigen Mengen verwendet werden können. Andere Fettsäuren, die in den Ölen enthalten sind wie Ölsäure, haben als Nahrungsmittelzusatzstoffe einen eher geringeren Wert.
So wurden in der Familie der Brassicaceae im Gegensatz zu anderen Pflanzenfamilien wie Linaceae, Poaceae oder Leguminosae längerkettige Fettsäuren wie Icosensäure 20:1 und Erucasäure 22:1 nachgewiesen. Die Gehalte der Erucasäure liegen zum Beispiel für Brassica carinata bei 35–48%, für Brassica juncea 18–49%, Brassica napus 45–54%, Crambe abyssinica 55–60%, Eruca sativa 34–47%, Sinapis alba 33–51%, Camelina sativa 3–5%, Raphanus sativa >22%.
Erucasäure sollte in Ölen, die in der menschlichen Ernährung Verwendung finden, nur in sehr geringen Mengen oder gar nicht enthalten sein.
Vorteilhafte Öle, Lipide und/oder Fettsäurekompositionen sollten einen möglichst geringen Anteil an Fettsäuren wie Ölsäure, α-Linolensäure, Icosen- und/oder Erucasäure haben. Vorteilhaft sollten gleichzeitig möglichst hohe Anteile an Fettsäuren wie Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure enthalten sein. Die zur Herstellung verwendeten Pflanzen sollten darüber hinaus möglichst einfach anbaubar sein und es sollten etablierte Aufarbeitungsprozesse für die enthaltenen Öle, Lipide und/oder Fettsäurekompositionen vorhanden sein. Außderm sollte das Herstellverfahren einfach und kostengünstig sein. Weiterhin sollten die Öle, Lipide und/oder Fettsäurekompositionen dieser Pflanzen schon über einen längeren Zeitraum zur Herstellung von Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika und/oder Pharmazeutika in der Industrie verwendet worden sein.
Es bestand daher die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, speziell ARA, EPA und/oder DHA, im Samen transgener Pflanze zu entwickeln, und gleichzeitig die Gehalte an unerwünschten Fettsäuren zu verringern.
Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von von Arachidonsäure (= ARA) oder Eicosapentaensäure (= EPA) oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure in transgenen Pflanzen der Familie der Brassicaceae mit einem Gehalt an ARA oder EPA oder ARA und EPA von mindestens 3 Gew.-% bezogen auf den Gesamtlipidgehalt der transgenen Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst:

a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in die Nutzpflanze, die für eine Δ-6-Desaturase codiert, und
b) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in die Nutzpflanze, die für eine Δ-6-Elongase codiert, und
c) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in die Nutzpflanze, die für eine Δ-5-Desaturase codiert, und
d) Ernten der Nutzpflanze,

^Δ9

^Δ9,12

^Δ6,9,12

^Δ11

^Δ13

Unter Wildtyppflanze sind Pflanzen zu verstehen, die die nicht mutierte (nicht veränderte) Form eines Gens oder Allels tragen und mehrheitlich in einer unter natürlichen Bedingungen lebenden Population vorkommt. Unter Wildtyp sind auch sogenannte Nullzygoten zu verstehen. Diese wurden mit einem Gen transformiert, haben dieses jedoch wieder verloren.
Alle vorgenannten Angaben sind Gewichtsprozentangaben und beziehen sich auf den Gehalt der Fettsäuren in der entsprechenden Wildtyppflanze.
Vorteilhaft enthalten die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäuren Arachidonsäure (= ARA) oder Eicosapentaensäure (= EPA) oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure noch weitere Fettsäuren wie mehrfach ungesättigte Fettsäuren, einfach ungesättigte Fettsäuren und ungesättigte Fettsäuren. Vorteilhaft werden gesättigte Fettsäuren mit den im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren wenig oder gar nicht umgesetzt. Unter wenig ist zu verstehen, das im Vergleich zu mehrfach ungesät tigten Fettsäuren die gesättigten Fettsäuren mit weniger als 5% der Aktivität, vorteilhaft weniger als 3%, besonders vorteilhaft mit weniger als 2%, ganz besonders bevorzugt mit weniger als 1; 0,5; 0,25 oder 0,125% umgesetzt werden. Diese hergestellten Fettsäuren können als einziges Produkt im Verfahren hergestellt werden oder in einem Fettsäuregemisch vorliegen.
Bei den im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen handelt es sich um isolierte Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase- und/oder Δ-5-Desaturaseaktivität codieren.
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, oder Δ-5-Desaturaseaktivität codieren, verwendet ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz, oder
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lassen, oder
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide codieren, die auf Aminosäureebene mindestens 40% Identität mit SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 aufweisen und eine Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase- oder Δ-5-Desaturaseaktivität haben.

Vorteilhaft werden im Verfahren weitere Nukleinsäuresequenzen in die Nutzpflanzen eingebracht, die für eine ω-3-Desaturase oder Δ-12-Desaturase oder ω-3-Desaturase und Δ-12-Desaturase codieren.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäuresequenz zusätzlich in die transgene Pflanze eingebracht wird, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturase-Aktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 9 dargestellten Sequenz, oder
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lassen, oder
c) Derivate der in SEQ ID NO: 9 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide codieren, die auf Aminosäureebene mindestens 60% Identität mit SEQ ID NO: 10 aufweisen und eine ω-3-Desaturaseaktivität haben.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäuresequenz zusätzlich in die transgene Pflanze eingebracht wird, die für Polypeptide mit Δ-12-Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 11 dargestellten Sequenz, oder
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lassen, oder
c) Derivate der in SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide codieren, die auf Aminosäureebene mindestens 60% Identität mit SEQ ID NO: 10 aufweisen und eine Δ-12-Desaturaseaktivität haben.

Diese vorgenannten Δ-12-Desaturasesequenzen können allein oder in Kombination mit den ω3-Desaturasesequenzen mit den im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, die für Δ-6-Desaturasen, Δ-6-Elongasen und/oder Δ-5-Desaturasen codieren verwendet werden.
Vorteilhaft werden die Nukleinsäuren im vegetativen oder reproduktiven Gewebe exprimiert.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen führen neben einer Erniedrigung unerwünschter Fettsäuren zu einer Steigerung des ARA- oder EPA- oder ARA- und EPA-Gehalts in den Pflanzen. In den transgenen Pflanzen kann dadurch im Verfahren eine Erhöhung des ARA- oder EPA- oder ARA- und EPA-Gehalts auf bis zu mehr als 8%, vorteilhaft bis zu mehr als 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% oder 20%, besonders vorteilhaft auf mehr als 21%, 22%, 23%, 24% oder 25%, bezogen auf den gesamten Lipidgehalt der Pflanze erreicht werden, Bei den vorgenannten Prozentwerten handelt es sich um Gewichtsprozentangaben.
Zur weiteren Steigerung der Ausbeute im beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Ölen und/oder Triglyceriden mit einem vorteilhaft gegenüber ölen und/oder Triglyceriden aus Wildtyp-Pflanzen erhöhten Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, vor allem von ARA, EPA oder deren Mischungen, kann es vorteilhaft sein, die Menge des Ausgangsstoffs für die Fettsäuresynthese zu steigern. Dies kann beispielsweise durch das Einbringen einer Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit der Aktivität einer Δ-12-Desaturase kodiert, und deren Co-Expression in dem Organismus erreicht werden.
Dies ist besonders vorteilhaft in Öl-produzierenden Pflanzen der Gattung Brassica, z.B. Raps, Rübsen oder Sareptasenf, die einen hohen Ölsäuregehalt, aber nur einen geringen Gehalt an Linolsäure aufweisen.
Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zusätzlich eine Nukleinsäuresequenz in die transgene Pflanze eingebracht, die für ein Polypeptid mit Δ-12-Desaturaseaktivität kodiert.
Vorteilhaft setzen die im erfingungsgemäßen Verfahren verwendeten Δ-12-Desaturasen Ölsaure (C18:1^Δ9) zu Linolsäure (C18:2^Δ9,12) oder C18:2^Δ6,9 zu C18:3^Δ6,9,12 (Gammalinolensäure = GLA), den Ausgangssubstanzen für die Synthese von ARA und/oder EPA um. Vorteilhaft setzen die verwendeten Δ-12-Desaturasen Fettsäuren gebunden an Phospholipide oder CoA-Fettsäureester, vorteilhaft gebunden an CoA-Fettsäureester, um. Dies führt, wenn vorher ein Elongationsschritt stattgefunden hat, vorteilhaft zu höheren Ausbeuten an Syntheseprodukten, da die Elongation in der Regel an CoA-Fettsäureestern erfolgt, während die Desaturierung überwiegend an den Phospholipiden oder an den Triglyceriden erfolgt. Ein Ausstausch, der eine weitere möglicherweise limitierende Enzymreaktion erfoderlich machen würde, zwischen den CoA-Fettsäureestern und den Phospholipiden oder Triglyceriden ist somit nicht erforderlich.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens werden alle Nukleinsäuresequenzen auf einem gemeinsamen rekombinanten Nukleinsäuremolekül in die Pflanzen eingebracht werden, wobei jede Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines eigenen Promotors steht kann und es sich bei diesem eigenen Promotor um einen samenspezifischen Promotor handelt kann.
Die Erfindung kann aber nicht nur mit den im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleinsäuren erfolgreich umgesetzt werden, vielmehr können auch von diesen Sequenzen bis zu einem gewissen Grad abweichende Sequenzen, die für Proteine mit der im Wesentlichen gleichen enzymatischen Aktivität kodieren, eingesetzt werden. Hierbei handelt es sich um Nukleinsäuren, die zu den im Sequenzprotokoll spezifizierten Sequenzen einen bestimmten Identitäts- oder Homologiegrad aufweisen. Unter im wesentlichen gleiche enzymatische Aktivität sind Proteine zu verstehen, die mindestens 20%, 30%, 40%, 50% oder 60%, vorteilhaft mindestens 70%, 80%, 90% oder 95%, besonders vorteilhaft mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% der enzymatischen Aktivität der Wildtyp-Enzyme aufweisen.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie oder Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nukleinsäuren werden die Sequenzen untereinander geschrieben (z.B. können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingefügt werden, um ein optimales Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure zu erzeugen). Die Aminosäurereste oder Nukleotide an den entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest oder das gleiche Nukleotid wie die entsprechende Stelle in der anderen Sequenz belegt wird, dann sind die Moleküle an dieser Position identisch. Sind an derselben Position unterschiedliche Aminosäuren, die aber diegleichen Eigenschaften aufweisen, z.B. zwei hydrophobe Aminosäuren, so sind sie homolog oder ähnlich. Die prozentuale Identität oder Homologie zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an Positionen, die den Sequenzen gemeinsam oder homolog sind (d.h.% Identität = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen × 100).
Die Identität wurde über den gesamten Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenzbereich berechnet. Für den Vergleich verschiedener Sequenzen stehen dem Fachmann eine Reihe von Programmen, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen, zur Verfügung. Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Für die Sequenzvergleiche wurde das Programm PileUp verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351–360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151–153) oder die Programme Gap und BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443–453 (1970) und Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482–489 (1981)], die im GCG Software-Packet [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)] enthalten sind. Die oben in Prozent angegebenen Sequenzidentitätswerte wurden mit dem Programm GAP über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000 und Average Mismatch: 0.000. Diese Einstellungen wurden, falls nicht anders angegeben, immer als Standardeinstellungen für Sequenzvergleiche verwendet.
Der Fachmann erkennt, dass innerhalb einer Population DNA-Sequenzpolymorphismen, die zu Änderungen der Aminosäuresequenz der im Verfahren verwendeten Polypeptide führen, auftreten können. Diese natürlichen Varianten bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5% in der Nukleotidsequenz des Δ-6-Desaturase-, Δ-5-Desaturase- und/oder Δ-6-Elongase-Gens. Sämtliche und alle dieser Nukleotidvariationen und daraus resultierende Aminosäurepolymorphismen in der Δ-6-Desaturase, Δ-5-Desaturase und/oder Δ-6-Elongase, die das Ergebnis natürlicher Variation sind und die die enzymatische Aktivität nicht wesentlich verändern, sollen im Umfang der Erfindung enthalten sein.
Unter wesentlicher enzymatischer Aktivität der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Δ-6-Desaturase Δ-6-Elongase oder Δ-5-Desaturase ist zu verstehen, dass sie gegenüber den durch die Sequenz und deren Derivate kodierten Proteinen/Enzymen im Vergleich noch eine enzymatische Aktivität von mindestens 10%, bevorzugt von mindestens 20%, besonders bevorzugt von mindestens 30%, 40%, 50% oder mind. 60% und am meisten bevorzugt von mindestens 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% aufweisen und damit am Stoffwechsel von Verbindungen, die zum Aufbau von Fettsäuren, Fettsäureestern wie Diacylglyceriden und/oder Triacylglyceriden in einer Pflanze oder Pflanzenzelle benötigt werden oder am Transport von Molekülen über Membranen teilnehmen können.
Ebenfalls im Umfang der Erfindung enthalten sind Nukleinsäuremoleküle, die unter stringenten Bedingungen mit dem komplementären Strang der hier verwendeten Δ-12-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, ω-3-Desaturase- und/oder Δ-6-Elongase-Nukleinsäuren hybridisieren. Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen", wie hier verwendet, soll Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60% homolog zueinander sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65%, 70%, 80% oder 90%, bevorzugt mindestens etwa 91%, 92%, 93%, 94% oder 95% und besonders bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder stärker zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und z.B. in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6, beschrieben.
Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (qsodium chloride/sodium citrate = SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C. Dem Fachmann ist bekannt, dass sich diese Hybridisierungsbedingungen je nach dem Typ der Nukleinsäure und, wenn beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers unterscheiden. Die Hybridisierungstemperatur liegt beispielsweise unter "Standard-Hybridisierungsbedingungen" je nach dem Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Falls organisches Lösungsmittel, zum Beispiel 50% Formamid, im obengenannten Puffer vorliegt, beträgt die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride zum Beispiel 0,1 × SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise 30°C bis 45°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride zum Beispiel 0,1 × SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise 45°C bis 55°C. Die vorstehend genannten Hybridisierungstemperaturen sind für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie die für eine bestimmte Nukleinsäure erforderlichen Hybridisierungsbedingungen anhand von Lehrbüchern, wie etwa Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laborstory, 1989; Harnes und Higgins (Hrsgb.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford, bestimmt werden können.
Durch Einbringen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül erzeugt werden, das für eine Δ-12-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Desaturase, ω-3-Desaturase und/oder Δ-6-Elongase mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen kodiert. Mutationen können in eine der Sequenzen durch Standardtechniken, wie stellenspezifische Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäurereste hergestellt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausge tauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten, (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in einer Δ-12-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Desaturase, ω-3-Desaturase und/oder Δ-6-Elongase wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. Alternativ können bei einer anderen Ausführungsform die Mutationen zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der für die Δ-12-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-5-Desaturase, ω-3-Desaturase und/oder Δ-6-Elongase kodierenden Sequenz eingebracht werden, z.B. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können durch rekombinante Expression nach der hier beschriebenen Δ-12-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, ω-3-Desaturase- und/oder Δ-6-Elongase-Aktivität durchmustert werden, um Mutanten zu identifizieren, die die Δ-12-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, ω-3-Desaturase- und/oder Δ-6-Elongase-Aktivität beibehalten haben.
Die im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren ARA oder EPA oder ARA und EPA sind vorteilhaft in als Ester wie Membranlipiden wie Phospholipide oder Glycolipide und/oder Triacylglyceriden gebunden, können aber auch als freie Fettsäuren oder aber gebunden in Form anderer Fettsäureester in den Organismen vorkommen. Dabei können sie als "Reinprodukte" oder aber vorteilhaft in Form von Mischungen verschiedener Fettsäuren oder Mischungen unterschiedlicher Glyceride vorliegen.
Die in den Triacylglyceriden gebundenen verschieden Fettsäuren lassen sich dabei von kurzkettigen Fettsäuren mit 4 bis 6 C-Atomen, mittelkettigen Fettsäuren mit 8 bis 12 C-Atomen oder langkettigen Fettsäuren mit 14 bis 24 C-Atomen ableiten, bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren besonders bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren LCPUFAs von C₁₈-, C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuren, ganz besonders bevorzugt sind die langkettigen Fettsäuren LCPUFAs von C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuren wie ARA, EPA oder deren Kombination.
Unter dem Begriff "Glycerid" wird ein mit ein, zwei oder drei Carbonsäureresten verestertes Glycerin verstanden (Mono-, Di- oder Triglycerid). Unter "Glycerid" wird auch ein Gemisch an verschiedenen Glyceriden verstanden. Das Glycerid oder das Glyceridgemisch kann weitere Zusätze, z.B. freie Fettsäuren, Antioxidantien, Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine und/oder andere Substanzen enthalten.
Unter einem "Glycerid" im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens werden ferner vom Glycerin abgeleitete Derivate verstanden. Dazu zählen neben den oben beschriebenen Fettsäureglyceriden auch Glycerophospholipide und Glyceroglycolipide. Bevorzugt seien hier die Glycerophospholipide wie Lecithin (Phosphatidylcholin), Cardiolipin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylserin und Alkylacylglycerophospholipide beispielhaft genannt.
Unter Phospholipiden im Sinne der Erfindung sind zu verstehen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin und/oder Phosphatidylinositol vorteilhafterweise Phosphatidylcholin.
Die im Verfahren hergestellten Fettsäureester können aus den Pflanzen, die für die Herstellung der Fettsäureester verwendet wurden, in Form eines Öls oder Lipids beispielsweise in Form von Verbindungen wie Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide wie Glycosphingolipide, Phospholipide wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol oder Diphosphatidylglycerol, Monoacylglyceride, Diacylglyceride, Triacylglyceride oder sonstige Fettsäureester wie die AcetylCoenzymA-Ester isoliert werden. Vorteilhaft werden sie in der Form ihrer Diacylglyceride, Triacylglyceride und/oder in Form der Phospholipide wie z.B. dem Phosphatidylcholin isoliert, besonders bevorzugt in der Form der Triacylglyceride. Neben diesen Estern sind die im Verfahren hergestellten Fettsäuren auch als freie Fettsäuren oder gebunden an andere Verbindungen in den Pflanzen enthalten. In der Regel liegen die verschiedenen vorgenannten Verbindungen (Fettsäureester und frei Fettsäuren) in den Organismen in einer ungefähren Verteilung von 80 bis 90 Gew.-% Triglyceride, 2 bis 5 Gew.-% Diglyceride, 5 bis 10 Gew.-% Monoglyceride, 1 bis 5 Gew.-% freie Fettsäuren, 2 bis 8 Gew.-% Phospholipide vor, wobei sich die Summe der verschiedenen Verbindungen zu 100 Gew.-% ergänzt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren bzw. in den erfindungsgemäßen Verfahren (der singular soll im Sinne der Erfindung und der hier dargestellten Offenbarung den plural umfassen und umgekehrt) werden die hergestellten LCPUFAs mit einem Gehalt von mindestens 3, 5, 6, 7 oder 8 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 16, 17, 18, 19 oder 20 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 21, 22, 23, 24 oder 25 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 26, 27, 28, 29 oder 30 Gew.-% bezogen auf die gesamten Fettsäuren in den transgenen Organismen vorteilhaft im Samen der transgenen Pflanzen hergestellt. Dabei werden vorteilhaft C₁₈- und/oder C₂₀-Fettsäuren, die in den Wirtsorganismen vorhanden sind, zu mindestens 10%, vorteilhaft zu mindestens 20%, besonders vorteilhaft zu mindestens 30%, ganz besonders vorteilhaft zu mindestens 40% in die entsprechenden Produkte wie ARA, EPA oder deren Mischungen umgesetzt. Vorteilhaft werden die Fettsäuren in gebundener Form hergestellt.
Vorteilhaft werden dabei im Verfahren mehrfach ungesättigte C₂₀-Fettsäuren mit vier oder fünf Doppelbindungen im Molekül mit einem Gehalt von zusammen allen derartigen Fettsäuren von mindestens 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Gew.-%, vorteilhaft zu mindestens 21, 22, 23, 24 oder 25 Gew.-%, besonders vorteilhaft von mindestens 26, 27, 28, 29 oder 30 Gew.-% bezogen auf die gesamten Fettsäuren in den Samen der transgenen Pflanzen hergestellt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ARA mit einem Gehalt von mindestens 3, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 11, 12, 13, 14 oder 15 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 16, 17, 18, 19 oder 20 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 21, 22, 23, 24 oder 25 Gew.-%, am meisten bevorzugt von mindestens 26 Gew.-%, bezogen auf den gesamten Lipidgehalt in den Samen der transgenen Pflanzen, hergestellt.
EPA wird im erfindungsgemäßen Verfahren mit einem Gehalt von mindestens 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 oder 1 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 2, 3, 4 oder 5 Gew.-%, bevorzugt von mindestens 6, 7, 8, 9 oder 10 Gew.-%, besonders bevorzugt von mindestens 11, 12, 13, 14 oder 15 Gew.-% und am meisten bevorzugt von mindestens 16 Gew.-%, bezogen auf den gesamten Lipidgehalt in den Samen der transgenen Pflanzen, hergestellt.
Mit Hilfe der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren lassen sich diese ungesättigten Fettsäuren an sn1-, sn2- und/oder sn3-Position der vorteilhaft hergestellten Triglyceride bringen. Da im erfindungsgemäßen Verfahren von den Ausgangsverbindungen Linolsäure (C18:2) bzw. Linolensäure (C18:3) mehrere Reaktionsschritte durchlaufen werden, fallen die Endprodukte des Verfahrens wie beispielsweise Arachidonsäure (ARA) oder Eicosapentaensäure (EPA) nicht als absolute Reinprodukte an, es sind immer auch geringe Spuren der Vorstufen im Endprodukt enthalten. Sind in dem Ausgangsorganismus bzw. in der Ausgangspflanze beispielsweise sowohl Linolsäure als auch Linolensäure vorhanden, so liegen die Endprodukte wie ARA oder EPA in der Regel als Mischungen vor. Vorteilhaft sollten in den Endprodukten ARA oder EPA nur geringe Mengen, der jeweils anderen Endprodukte vorhanden sein. In einem EPA haltigen Lipid und/oder Öl sollten deshalb weniger als 15, 14, 13, 12 oder 11 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 10, 9, 8, 7, 6 oder 5 Gew.-%, besonders vorteilhaft weniger als 4, 3, 2 oder 1 Gew.-% ARA enthalten sein. Auch in einem ARA haltigen Lipid und/oder Öl sollten deshalb weniger als 15, 14, 13, 12 oder 11 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 10, 9, 8, 7, 6 oder 5 Gew.-%, besonders vorteilhaft weniger als 4, 3, 2 oder 1 Gew.-% EPA enthalten sein.
Die Vorstufen sollten vorteilhaft nicht mehr als 20 Gew.-%, bevorzugt nicht mehr als 15 Gew.-%, besonders bevorzugt nicht als 10 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 5 Gew.-% bezogen auf die Menge des jeweilige Endprodukts betragen. Vorteilhaft werden in einer transgenen Pflanze als Endprodukte nur ARA oder EPA im erfindungsgemäßen Verfahren gebunden oder als freie Säuren hergestellt. Werden die Verbindungen ARA und EPA gleichzeitig hergestellt, werden sie vorteilhaft in einem Verhältnis von mindestens 1:6 (EPA:ARA), vorteilhaft von mindestens 1:8, bevorzugt von mindestens 1:10, besonders bevorzugt von mindestens 1:12 in der Pflanze hergestellt.
Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, enthalten vorteilhaft 6 bis 15% Palmitinsäure, 1 bis 6% Stearinsäure; 7–85% Ölsäure; 0,5 bis 8% Vaccensäure, 0,1 bis 1% Arachinsäure, 7 bis 25% gesättigte Fettsäuren, 8 bis 85% einfach ungesättigte Fettsäuren und 60 bis 85% mehrfach ungesättigte Fettsäuren jeweils bezogen auf 100% und auf den Gesamtfettsäuregehalt der Organismen.
Weiterhin enthalten die Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, vorteilhaft Fettsäuren ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren Erucasäure (13-Docosaensäure), Sterculinsäure (9,10-Methylene octadec-9-enonsäure), Malvalinsäure (8,9-Methylen Heptadec-8-enonsäure), Chaulmoogrinsäure (Cyclopenten-dodecansäure), Furan-Fettsäure (9,12-Epoxy-octadeca-9,11-dienonsäure), Vernonsäure (9,10-Epoxyoctadec-12-enonsäure), Tarinsäure (6-Octadecynonsäure), 6-Nonadecynonsäure, Santalbinsäure (t11-Octadecen-9-ynoic acid), 6,9-Octadecenynonsäure, Pyrulinsäure (t10-Heptadecen-8-ynonsaure), Crepenyninsäure (9-Octadecen-12-ynonsäure), 13,14-Dihydrooropheinsäure, Octadecen-13-ene-9,11-diynonsäure, Petroselensäure (cis-6-Octadecenonsäure), 9c,12t-Octadecadiensäure, Calendulasäure (8t10t12c-Octadecatriensäure), Catalpinsäure (9t11t13c-Octadecatriensäure), Eleosterinsäure (9c11t13t-Octadecatriensäure), Jacarinsäure (8c10t12c-Octadecatriensäure), Punicinsäure (9c11t13c-Octadecatriensäure), Parinarinsäure (9c11t13t15c-Octadecatetraensäure), Pinolensäure (all-cis-5,9,12-Octadecatriensäure), Laballensäure (5,6-Octadecadienallensäure), Ricinolsäure (12-Hydroxyölsäure) und/oder Coriolinsäure (13-Hydroxy-9c,11t-Octadecadienonsaure). Die vorgenannten Fettsäuren kommen in den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemischen in der Regel vorteilhaft nur in Spuren vor, das heißt sie kommen bezogen auf die Gesamtfettsäuren zu weniger als 30%, bevorzugt zu weniger als 25%, 24%, 23%, 22% oder 21%, besonders bevorzugt zu weniger als 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% oder 5%, ganz besonders bevorzugt zu weniger als 4%, 3%, 2% oder 1% vor. In einer weiteren bevorzugten Form der Erfindung kommen diese vorgenannten Fettsäuren bezogen auf die Gesamtfettsäuren zu weniger als 0,9%; 0,8%; 0,7%; 0,6%; oder 0,5%, besonders bevorzugt zu weniger als 0,4%; 0,3%; 0,2%; 0,1% vor. Vorteilhaft enthalten die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Fettsäureester bzw. Fettsäuregemische weniger als 0,1% bezogen auf die Gesamtfettsäuren und/oder keine Buttersäure, kein Cholesterin, keine Clupanodonsäure (= Docosapentaensäure, C22:5^{Δ4,8,12,15,21}) sowie keine Nisinsäure (Tetracosahexaensäure, C236^{Δ3,8,12,15,18,21}).
Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bzw. im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen kann eine Steigerung der Ausbeute an mehrfach ungesättigten Fettsäuren, vor allem an ARA und EPA von mindestens 50, 80 oder 100%, vorteilhaft von mindestens 150, 200 oder 250%, besonders vorteilhaft von mindestens 300, 400, 500, 600, 700, 800 oder 900%, ganz besonders vorteilhaft von mindestens 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 oder 1500% gegenüber der nicht transgenen Ausgangspflanze beispielsweise einer Pflanze wie Brassica juncea oder Brassica napus beim Vergleich in der GC-Analyse siehe Beispiele erreicht werden.
Vorteilhaft sollten die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Lipide und/oder Öle einen hohen Anteil von ungesättigten Fettsäuren vorteilhaft von mehrfach ungesättigten Fettsäuren von mindestens 30, 40 oder 50 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 60, 70 oder 80 Gew.-% bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt in den Samen der transgenen Pflanzen betragen.
Alle gesättigten Fettsäuren zusammen sollten vorteilhaft in den für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt verwendeten Pflanzen nur einen geringen Anteil ausmachen. Unter geringen Anteil ist in diesem Zusammenhang ein Anteil in GC-Flächeneinheiten von weniger als 15%, 14%, 13%, 12%, 11% oder 10%, bevorzugt von weniger als 9%, 8%, 7% oder 6% zu verstehen.
Weiterhin sollten die im Verfahren vorteilhaft als Wirtspflanzen, die die über verschiedene Methoden eingebrachten im Verfahren verwendeten Gene zur Synthese der mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten, vorteilhaft einen höheren Ölanteil als Proteinanteil im Samen haben, vorteilhafte Pflanzen haben einen Öl-/Proteingehaltverhältnis von 5 zu 1, 4 zu 1, 3 zu 1, 2 zu 1 oder 1 zu 1. Dabei sollte der Ölgehalt bezogen auf das Gesamtgewicht des Samens in einem Bereich von 15–55%, vorteilhaft zwischen 25–50%, besonders vorteilhaft zwischen 35–50% liegen.
Für das Verfahren vorteilhafte Wirtspflanzen sind solche, die einen hohen Anteil an Ölsäure, das heißt von mindestens 40, 50, 60 oder 70 Gew.-% bezogen auf den gesamten Fettsäuregehalt der Pflanze haben, im Vergleich zu Linolsäure und/oder Linolensäure in den Lipiden und/oder Ölen besonders im Triglycerid haben wie z.B. Brassica napus, Brassica alba, Brassica hirta, Brassica nigra, Brassica juncea oder Brassica carinata.
Für das Verfahren verwendete Pflanzen sollten vorteilhaft einen Gehalt an Erucasäure von weniger als 2 Gew.-% bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt der Pflanze haben. Auch sollte der Gehalt an gesättigten Fettsäuren C16:0 und/oder C18:0 vorteilhaft geringer als 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, oder 10 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 9, 8, 7, 6 oder 5 Gew.-% bezogen auf den gesamten Fettsäuregehalt der Pflanze sein. Vorteilhaft sollten auch längere Fettsäuren wie C20:0 oder C22:1 gar nicht oder in nur geringen Mengen vorteilhaft geringer als 4, 3, 2 oder 1 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 oder 0,1 Gew.-% bezogen auf den gesamten Fettsäuregehalt der Pflanze in den im Verfahren verwendeten Pflanzen vorhanden sein. Typischerweise ist in den für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Pflanzen kein oder nur in geringen Mengen C16:1 als Fettsäure enthalten. Unter geringen Mengen sind vorteilhaft Gehalte an Fettsäuren zu verstehen, die geringer als 4, 3, 2 oder 1 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 oder 0,1 Gew.-% bezogen auf den gesamten Fettsäuregehalt der Pflanze sind.
Auch chemisch reine mehrfach ungesättigte Fettsäuren oder Fettsäurezusammensetzungen sind nach den vorbeschriebenen Verfahren darstellbar. Dazu werden die Fettsäuren oder die Fettsäurezusammensetzungen aus den Pflanzen vorteilhaft den Pflanzensamen in bekannter Weise beispielsweise über aufbrechen der Samen wie Mahlen und anschließender Extraktion, Destillation, Kristallisation, Chromatographie oder Kombinationen dieser Methoden isoliert. Diese chemisch reinen Fettsäuren oder Fettsäurezusammensetzungen sind für Anwendungen im Bereich der Lebensmittelindustrie, der Kosmetikindustrie und besonders der Pharmaindustrie vorteilhaft.
Als Pflanzen für das erfindungsgemäße Verfahren kommen prinzipiell alle Pflanzen der Familie Brassicaceae in Frage, die in der Lage sind Fettsäuren zu synthetisieren wie alle wie die Gattungen Brassica, Camelina, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis z.B. die Gattungen und Arten Brassica alba, Brassica carinata, Brassica hirta, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Raps], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Camelina sativa, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Futterrübe] oder Arabidopsis thaliana.
Für die erfindungsgemäßen beschriebenen Verfahren ist es vorteilhaft in die Pflanze zusätzlich zu den unter Verfahrensschritt (a) bis (c) eingebrachten Nukleinsäuren sowie den ggf. eingebrachten Nukleinsäuresequenzen, die für die ω-3-Desaturasen und/oder die für die Δ-12-Desaturasen codieren, zusätzlich weitere Nukleinsäuren einzubringen, die für Enzyme des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels codieren.
Im Prinzip können alle Gene des Fettsäure– oder Lipidstoffwechsels vorteilhaft in Kombination mit der(den) erfinderischen Δ-5-Elongase(n), Δ-6-Elongase(n) und/oder ω-3-Desaturase(n) [im Sinne dieser Anmeldung soll der Plural den Singular und umgekehrt beinhalten] im Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren verwendet werden vorteilhaft werden Gene des Fettsäure– oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]–Desaturase(n), Acyl–ACP–Thioesterase(n), Fettsäure–Acyl–Transferase(n), Acyl-CoA: Lysophospholipid-Acyltransferasen, Fettsäure–Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A–Carboxylase(n), Acyl–Coenzym A–Oxidase(n), Fettsäure–Desaturase(n), Fettsäure–Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid–Synthasen, Hydroperoxid–Lyasen oder Fettsäure–Elongase(n) in Kombination mit der Δ-5-Elongase, Δ-6-Elongase und/oder ω-3-Desaturase verwendet. Besonders bevorzugt werden Gene ausgewählt aus der Gruppe der Δ-4-Desaturasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desatuasen, Δ-9-Desaturasen, Δ-12-Desaturasen, Δ-6-Elongasen oder Δ-9-Elongasen in Kombination mit den vorgenannten Genen für die Δ-5-Elongase, Δ-6-Elongase und/oder ω-3-Desaturase verwendet, wobei einzelne Gene oder mehrere Gene in Kombination verwendet werden können.
Vorteilhaft werden die erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen oder deren Derivat oder Homologe, die für Polypeptide codieren, die noch die enzymatische Aktivität der durch Nukleinsäuresequenzen codierten Proteine besitzen, einzeln oder in Kombination in Expressionskonstrukte cloniert und diese zum Einbringen und zur Expression in Pflanzen verwendet. Diese Expressionskonstrukte ermöglichen durch ihre Konstruktion eine vorteilhafte optimale Synthese der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens einer transgenen Pflanze, die die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen enthält, wobei die Pflanze mit einer Nukleinsäuresequenz, die für die Δ-12-Desaturase, Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-6-Elongase und/oder ω-3-Desaturase codiert, einem Genkonstrukt oder einem Vektor wie nachfolgend beschrieben, allein oder in Kombination mit weiteren Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine des Fettsäure- oder Lipidsstoffwechsels codieren, transformiert wird. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der Öle, Lipide oder freien Fettsäuren aus dem Samen der Pflanze.
Unter Anzucht ist beispielsweise die Kultivierung im Falle von Pflanzenzellen, -gewebe oder -organe auf oder in einem Nährmedium oder der ganzen Pflanze auf bzw. in einem Substrat beispielsweise in Hydrokultur, Blumentopferde oder auf einem Ackerboden zu verstehen.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind Genkonstrukte, die die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, die für eine Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase oder Δ-6-Elongase codieren, enthalten, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem oder mehreren Regulationssignalen verbunden ist. Zusätzlich können weitere Biosynthesegene des Fettsäure– oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl–ACP–Thioesterase(n), Fettsäure–Acyl–Transferase(n), Acyl-CoA: Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure–Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A–Carboxylase(n), Acyl–Coenzym A–Oxidase(n), Fettsäure–Desaturase(n), Fettsäure–Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid–Synthasen, Hydroperoxid–Lyasen oder Fettsäure–Elongase(n) im Genkonstrukt enthalten sein. Vorteilhaft sind zusätzlich Biosynthesegene des Fettsäure– oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe der Δ-12-Desaturase oder ω-3-Desaturase enthalten.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine mit Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase- oder Δ-6-Elongase-Aktivität kodieren, werden vorteilhaft allein oder bevorzugt in Kombination in einer Expressionskassette (= Nukleinsäurekonstrukt), die die Expression der Nukleinsäuren in einer Pflanze ermöglicht, in die Pflanze eingebracht. Es kann im Nukleinsäurekonstrukt mehr als eine Nukleinsäuresequenz einer enzymatischen Aktivität wie z.B. einer Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase oder Δ-6-Elongase enthalten sein.
Zum Einbringen der Nukleinsäuren in die Genkonstrukte werden die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren vorteilhaft einer Amplifikation und Ligation in bekannter Weise unterworfen. Vorzugsweise geht man in Anlehnung an das Protokoll der Pfu-DNA-Polymerase oder eines Pfu/Taq-DNA-Polymerasegemisches vor. Die Primer werden unter Berücksichtigung der zu amplifizierenden Sequenz ausgewählt. Zweckmäßigerweise sollten die Primer so gewählt werden, dass das Amplifikat die gesamte kodogene Sequenz vom Start- bis zum Stop-Kodon umfasst. Im Anschluss an die Amplifikation wird das Amplifikat zweckmäßigerweise analysiert. Beispielsweise kann nach gelelektrophoretischer Auftrennung eine quantitative und qualitative Analyse erfolgen. Im Anschluss kann das Amplifikat nach einem Standardprotokoll gereinigt werden (z.B. Qiagen). Ein Aliquot des gereinigten Amplifikats steht dann für die nachfolgende Klonierung zur Verfügung.
Geeignete Klonierungsvektoren sind dem Fachmann allgemein bekannt. Hierzu gehören insbesondere Vektoren, die in mikrobiellen Systemen replizierbar sind, also vor allem Vektoren, die eine effiziente Klonierung in Hefen oder Pilzen gewährleisten, und die die stabile Transformation von Pflanzen ermöglichen. Zu nennen sind insbesondere verschiedene für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignete, binäre und co-integrierte Vektorsysteme. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest die für die Agrobakterium-vermittelte Transformation benötigten vir-Gene sowie die T-DNA begrenzenden Sequenzen (T-DNA-Border) beinhalten. Vorzugsweise umfassen diese Vektorsysteme auch weitere cis-regulatorische Regionen wie Promotoren und Terminatorsequenzen und/oder Selektionsmarker, mit denen entsprechend transformierte Organismen identifiziert werden können. Während bei co-integrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf wenigstens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene, aber keine T-DNA und ein zweiter T-DNA, jedoch kein vir-Gen trägt. Dadurch sind letztere Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium zu replizieren. Zu diesen binären Vektoren gehören Vektoren der Serien pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Erfindungsgemäß werden bevorzugt Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV und pCAMBIA verwendet. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451.
Für die Vektorpräparation können die Vektoren zunächst mit Restriktionsendonuklease(n) linearisiert und dann in geeigneter Weise enzymatisch modifiziert werden. Im Anschluss wird der Vektor gereinigt und ein Aliquot für die Klonierung eingesetzt. Bei der Klonierung wird das enzymatisch geschnittene und erforderlichenfalls gereinigte Amplifikat mit ähnlich präparierten Vektorfragmenten unter Einsatz von Ligase verbunden. Dabei kann ein bestimmtes Nukleinsäurekonstrukt bzw. Vektor- oder Plasmidkonstrukt einen oder auch mehrere kodogene Genabschnitte aufweisen. Vorzugsweise sind die kodogenen Genabschnitte in diesen Konstrukten mit regulatorischen Sequenzen funktional verknüpft. Zu den regulatorischen Sequenzen gehören insbesondere pflanzliche Sequenzen wie Promotoren und Terminatorsequenzen. Die Konstrukte lassen sich vorteilhafterweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli und Agrobacterium tumefaciens, unter Selektionsbedingungen stabil propagieren und ermöglichen einen Transfer von heterologer DNA in Pflanzen oder Mikroorganismen.
Unter der vorteilhaften Verwendung von Klonierungsvektoren können die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren in Pflanzen eingebracht werden und damit bei der Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie denjenigen, die veröffentlicht und dort zitiert sind: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225. Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren und/oder Vektoren lassen sich damit zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Pflanzen verwenden, so dass diese bessere und/oder effizientere Produzenten von PUFAs werden.
Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die eine Veränderung des Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase- oder Δ-6-Elongase-Proteins möglich ist, so dass die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in einer Pflanze aufgrund dieses veränderten Proteins direkt beeinflusst werden kann. Die Anzahl oder Aktivität der Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase- oder Δ-6-Elongase-Proteine oder -Gene kann erhöht werden, so dass größere Mengen der Genprodukte und damit letztlich größere Mengen der Verbindungen der allgemeinen Formel I hergestellt werden. Auch eine de novo Synthese in einer Pflanze, der die Aktivität und Fähigkeit zur Biosynthese der Verbindungen vor dem Einbringen des/der entsprechenden Gens/Gene fehlte, ist möglich. Entsprechendes gilt für die Kombination mit weiteren Desaturasen oder Elongasen oder weiteren Enzymen aus dem Fettsäure- und Lipidstoffwechsel. Auch die Verwendung verschiedener divergenter, d.h. auf DNA-Sequenzebene unterschiedlicher Sequenzen kann dabei vorteilhaft sein bzw. die Verwendung von Promotoren, die eine andere zeitliche Genexpression z.B. abhängig vom Reifegrad eines Samens oder Öl-speichernden Gewebes ermöglichen.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen werden vorteilhaft in einer Expressionskassette, die die Expression der Nukleinsäuren in Pflanzen ermöglicht, eingebracht.
Dabei werden die Nukleinsäuresequenzen, die für die Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase oder Δ-6-Elongase kodieren, mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und Proteine ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren binden und dadurch die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen können die natürlichen Regulationselemente dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch so verändert worden sein, dass ihre natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweiser auch eine oder mehrere sogenannte "Enhancer-Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatorsequenzen.
Die Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase- oder Δ-6-Elongase-Gene können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein. Vorteilhaft liegt nur jeweils eine Kopie der Gene in der Expressionskassette vor. Dieses Genkonstrukt oder die Genkonstrukte können zusammen in der Wirtspflanze exprimiert werden. Dabei kann das Genkonstrukt oder die Genkonstrukte in einem oder mehreren Vektoren inseriert sein und frei in der Zelle vorliegen oder aber im Genom inseriert sein. Es ist vorteilhaft für die Insertion weiterer Gene im Wirtsgenom, wenn die zu exprimierenden Gene zusammen in einem Genkonstrukt vorliegen.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Es ist im Prinzip möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das neue Verfahren zu verwenden. Es ist ebenfalls möglich und vorteilhaft, zusätzlich oder alleine synthetische Promotoren zu verwenden, besonders wenn sie eine Samen-spezifische Expression vermitteln, wie z.B. die in WO 99/16890 beschriebenen.
Um einen besonders hohen Gehalt an PUFAs vor allem in transgenen Pflanzen zu erzielen, sollten die PUFA-Biosynthesegene vorteilhaft samenspezifisch in Ölsaaten exprimiert werden. Hierzu können Samenspezifische Promotoren verwendet werden, bzw. solche Promotoren, die im Embryo und/oder im Endosperm aktiv sind. Samenspezifische Promotoren können prinzipiell sowohl aus dikotyledonen als auch aus monokotyledonen Pflanzen isoliert werden. Im folgenden sind bevorzugte Promotoren aufgeführt: USP (= unknown seed Protein) und Vicilin (Vicia faba) [Bäumlein et al., Mol. Gen Geriet., 1991, 225(3)], Napin (Raps) [ US 5,608,152 ], Conlinin (Lein) [ WO 02/102970 ], Acyl-Carrier Protein (Raps) [ US 5,315,001 und WO 92/18634 ], Oleosin (Arabidopsis thaliana) [ WO 98/45461 und WO 93/20216 ], Phaseolin (Phaseolus vulgaris) [ US 5,504,200 ], Bce4 [ WO 91/13980 ], Leguminosen B4 (LegB4-Promotor) [Baumlein et al., Plant J., 2,2, 1992], Lpt2 und Ipt1(Gerste) [ WO 95/15389 u. WO95/23230 ], Samenspezifische Promotoren aus Reis, Mais u. Weizen [ WO 99/16890 ], Amy32b, Amy 6-6 und Aleurain [ US 5,677,474 ], Bce4 (Raps) [ US 5,530,149 ], Glycinin (Soja) [ EP 571 741 ], Phosphoenol-Pyruvatcarboxylase (Soja) [ JP 06/62870 ], ADR12-2 (Soja) [ WO 98/08962 ], Isocitratlyase (Raps) [ US 5,689,040 ] oder α-Amylase (Gerste) [ EP 781 849 ].
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89–108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor ( WO 95/19443 ), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397–404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Um eine stabile Integration der Biosynthesegene in die transgene Pflanze über mehrere Generation sicherzustellen, sollte jede der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase oder Δ-6-Elongase kodieren, unter der Kontrolle eines eigenen, bevorzugt eines von den anderen Promotoren verschiedenen, Promotors exprimiert werden, da sich wiederholende Sequenzmotive zur Instabilität der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen führen können. Die Expressionskassette ist dabei vorteilhaft so aufgebaut, dass einem Promotor eine geeignete Schnittstelle, vorteilhaft in einem Polylinker, zur Insertion der zu exprimierenden Nukleinsäure folgt und gegebenenfalls eine Terminatorsequenz hinter dem Polylinker liegt. Diese Abfolge wiederholt sich mehrfach, bevorzugt drei-, vier-, fünf-, sechs- oder siebenmal, so dass bis zu sieben Gene in einem Konstrukt zusammengeführt werden und zur Expression in die transgene Pflanze eingebracht werden können. Vorteilhaft wiederholt sich die Abfolge bis zu viermal. Die Nukleinsäuresequenzen werden zur Expression über eine geeignete Schnittstelle beispielsweise im Polylinker hinter den Promotor inseriert. Vorteilhaft hat jede Nukleinsäuresequenz ihren eigenen Promotor und gegebenenfalls ihre eigene Terminatorsequenz. Derartige vorteilhafte Konstrukte sind beispielsweise in DE 101 02 337 oder DE 101 02 338 offenbart. Es ist aber auch möglich, mehrere Nukleinsäuresequenzen hinter einem gemeinsamen Promotor und ggf. vor einer gemeinsamen Terminatorsequenz zu inserieren. Dabei ist die Insertionsstelle bzw. die Abfolge der inserierten Nukleinsäuren in der Expressionskassette nicht von entscheidender Bedeutung, das heißt eine Nukleinsäuresequenz kann an erster oder letzter Stelle in der Kassette inseriert sein, ohne dass dadurch ihre Expression wesentlich beeinflusst wird. Es können in der Expressionskassette vorteilhaft unterschiedliche Promotoren wie beispielsweise der USP-, LegB4 oder DC3-Promotor und unterschiedliche Terminatorsequenzen verwendet werden. Es ist aber auch möglich, nur einen Promotortyp in der Kassette zu verwenden, was jedoch zu unerwünschten Rekombinationsereignissen führen kann.
Wie oben beschrieben sollte die Transkription der eingebrachten Gene vorteilhaft durch geeignete Terminatorsequenzen am 3'-Ende der eingebrachten Biosynthesege ne (hinter dem Stopcodon) abgebrochen werden. Verwendet werden kann hier z.B. die OCS1-Terminatorsequenz. Wie auch für die Promotoren, so sollten für jedes Gen unterschiedliche Terminatorsequenzen verwendet werden.
Das Genkonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene umfassen, die in die Pflanzen eingebracht werden sollen. Es ist möglich und vorteilhaft, in die Wirtspflanzen Regulationsgene, wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche durch ihre Enzymaktivität in die Regulation eines oder mehrerer Gene eines Biosynthesewegs eingreifen, einzubringen und zu exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein.
Weiterhin können vorteilhaft im Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt weitere Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels enthalten sein, diese Gene können aber auch auf einem oder mehreren weiteren Nukleinsäurekonstrukten liegen. Vorteilhaft werden als Biosynthesegen des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ein Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]–Desaturase(n), Acyl–ACP–Thioesterase(n), Fettsäure–Acyl-Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure-Synthase(n), Fettsäure–Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A–Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A–Oxidase(n), Fettsaure–Desaturase(n), Fettsaure–Acetylenase(n), Lipoxygenase(n), Triacylglycerol–Lipase(n), Allenoxid–Synthase(n), Hydroperoxid-Lyase(n) oder Fettsäure–Elongase(n) oder Kombinationen davon verwendet.
Besonders vorteilhafte Nukleinsäuresequenzen sind Biosynthesegene des Fettsäure– oder Lipidstoffwechsels ausgewählt aus der Gruppe der Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase, Δ-8-Desaturase, Δ-4-Desaturase, Δ-9-Desaturase, Δ-5-Elongase und/oder Δ-9-Elongase.
Dabei können die vorgenannten Nukleinsäuren bzw. Gene in Kombination mit anderen Elongasen und Desaturasen in Expressionskassetten, wie den vorgenannten, kloniert werden und zur Transformation von Pflanzen mit Hilfe von Agrobakterium eingesetzt werden.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. Die Expressionskassetten können prinzipiell direkt zum Einbringen in die Pflanze verwendet werden oder aber in einen Vektor eingebracht werden.
Diese vorteilhaften Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, enthalten die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase oder Δ-6-Elongase kodieren, oder ein Nukleinsäurekonstrukt, das die verwendete Nukleinsäure allein oder in Kombination mit weiteren Biosynthesegenen des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels wie den Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen, Δ-8-Desaturasen, Δ-9-Desaturasen, Δ-4-Desaturasen, Δ-5-Elongasen und/oder Δ-9-Elongasen enthält.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, die an es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (z.B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung). Andere Vektoren werden vorteilhaft beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben Expressionsvektoren, die für DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch auch andere Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren, die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen. Ferner soll der Begriff "Vektor" auch andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, wie Phagen, Viren, wie SV40, CMV, TMV, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA, umfassen.
Die im Verfahren vorteilhaft verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren umfassen die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren oder das beschriebene Genkonstrukt in einer Form, die sich zur Expression der verwendeten Nukleinsäuren in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere Regulationssequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression verwendeten Wirtszellen, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfassen. In einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbunden", dass die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die Regulationssequenz(en) gebunden ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist und sie aneinander gebunden sind, so dass beide Sequenzen die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen (z.B. in einem In-vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird).
Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese Regulationssequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, einschließlich der Literaturstellen darin. Regulationssequenzen umfassen solche, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, die die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann weiß, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, der gewünschten Expressionsstärke des Proteins usw., abhängen kann.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens können die Δ-12-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, ω-3-Desaturasen, Δ-6-Elongasen und/oder Δ-5-Desaturasen in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3):239–251 und darin zitierte Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z.B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195–1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und die funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktive Terminatorsequenzen sind geeignet.
Da die Regulation der Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptionsebene beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbundene Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693–8711).
Das zu exprimierende Gen muss, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise auslöst. Nutzbare Promotoren sind konstitutive Promotoren (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195–2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285–294), 19S CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913 ) oder konstitutive Pflanzenpromotoren, wie der in US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco.
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch wie oben beschrieben über einen chemisch induzierbaren Promotor erreichen (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89–108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor ( WO 95/19443 ), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397–404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignet, beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1-Gen-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361–366), der hitzeinduzierbare hsp80-Promotor aus Tomate ( US 5,187,267 ), der kälteinduzierbare Alpha-Amylase-Promotor aus Kartoffel ( WO 96/12814 ) oder der durch Wunden induzierbare pinil-Promotor ( EP-A-0 375 091 ).
Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Fettsäure-, Lipid- und Ölbiosynthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napin-Promotor aus Raps ( US 5,608,152 ), der Conlinin-Promotor aus Lein ( WO 02/102970 ), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459–67), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis ( WO 98/45461 ), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris ( US 5,504,200 ), der Bce4-Promotor aus Brassica ( WO 91/13980 ) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233–9) sowie Promotoren, die die samenspezifische Expression in monokotyledonen Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der Ipt2- oder Ipt1-Gen-Promotor aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder die in WO 99/16890 beschriebenen Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin-Gen.
Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, welche die plastidenspezifische Expression herbeiführen, da Plastiden das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer sowie einige Endprodukte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete Promotoren sind der virale RNA-Polymerase-Promotor, beschrieben in WO 95/16783 und WO 97/06250 , und der clpP-Promotor aus Arabidopsis, beschrieben in WO 99/46394 .
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das neue Verfahren liegen beispielsweise in Promotoren vor, wie den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285–294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor vor. In diesem Zusammenhang vorteilhaft sind ebenfalls induzierbare Promotoren, wie die in EP–A-0 388 186 (Benzylsulfonamid-induzierbar), Plant J. 2, 1992:397–404 (Gatz et al., Tetracyclininduzierbar), EP–A-0 335 528 (Abzisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar) beschriebenen Promotoren. Weitere geeignete Pflanzenpromotoren sind der Promotor von cytosolischer FBPase oder der ST-LSI- Promotor der Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), der Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase-Promotor aus Glycine max (Genbank-Zugangsnr. U87999) oder der in EPA-0 249 676 beschriebene nodienspezifische Promotor. Besonders vorteilhafte Promotoren sind Promotoren, welche die Expression in Geweben ermöglichen, die an der Fettsäurebiosynthese beteiligt sind. Ganz besonders vorteilhaft sind samenspezifische Promotoren, wie der ausführungsgemäße USP Promotor aber auch andere Promotoren wie der LeB4-, DC3, Phaseolin- oder Napin-Promotor. Weitere besonders vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, die für monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden können und in US 5,608,152 (Napin-Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Oleosin-Promotor aus Arobidopsis), US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica), von Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992:233–239 (LeB4-Promotor aus einer Leguminose) beschrieben sind, wobei sich diese Promotoren für Dikotyledonen eignen. Die folgenden Promotoren eignen sich beispielsweise für Monokotyledonen Ipt-2– oder Ipt-1–Promotor aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ), Hordein-Promotor aus Gerste und andere, in WO 99/16890 beschriebene geeignete Promotoren.
Es ist im Prinzip möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das neue Verfahren zu verwenden. Es ist ebenfalls möglich und vorteilhaft, zusätzlich oder alleine synthetische Promotoren zu verwenden, besonders wenn sie eine Samenspezifische Expression vermitteln, wie z.B. beschrieben in WO 99/16890 .
Um einen besonders hohen Gehalt an PUFAs vor allem in transgenen Pflanzen zu erzielen, sollten die PUFA-Biosynthesegene vorteilhaft samenspezifisch in Ölsaaten exprimiert werden. Hierzu können Samen-spezifische Promotoren verwendet werden, bzw. solche Promotoren die im Embryo und/oder im Endosperm aktiv sind. Samenspezifische Promotoren können prinzipiell sowohl aus dikotolydonen als auch aus monokotolydonen Pflanzen isoliert werden. Derartige vorteilhafte Promotoren sind weiter oben aufgeführt z.B. der USP-, Vicilin-, Napin-, Oleosin-, Phaseolin-, Bce4-, LegB4-, Lpt2-, Ipt1-, Amy32b-, Amy 6-6-, Aleurain- oder Bce4-Promotor.
Darüber hinaus sind auch chemisch induzierbaren Promotor vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren nutzbar.
Weitere vorteilhafte Promotoren, die vorteilhaft zur Expression in Soya geeignet sind, sind die Promotoren der β-Conglycinin-α-Untereinheit, der β-Conglycinin-β-Untereinheit, des Kunitz-Trypsininhibitors, des Annexin, des Glysinin, des Albumin 2S, des Legumin A1, des Legumin A2 und der des BD30.
Besonders vorteilhafte Promotoren sind der USP-, LegB4-, Fad3-, SBP-, DC-3- oder Cruciferin820 Promotor.
Vorteilhafte Regulationssequenzen, die für die Expression der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen benutzt werden, sind Terminatoren für die Expression vorteilhaft in Soya sind der Leg2A3', Kti3', Phas3', BD30 3' oder der AIS3'.
Besonders vorteilhafte Terminatoren sind der A7T-, OCS-, LeB3T- oder cat-Terminator.
Um eine stabile Integration der Biosynthesegene in die transgene Pflanze über mehrere Generation sicherzustellen, sollte, wie oben beschrieben, jede der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-6-Elongase und/oder Δ-5-Desaturase codieren, unter der Kontrolle eines eigenen bevorzugt eines unterschiedlichen Promotors exprimiert werden, da sich wiederholende Sequenzmotive zu Instabilität der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen führen können. Das Genkonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene umfassen, die in die Pflanze eingebracht werden sollen.
Die zur Expression der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren vorteilhaft genutzten regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen.
Diese vorteilhaften Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, enthalten die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, die für die Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-6-Elongase und/oder Δ-5-Desaturase codieren, oder ein Nukleinsäurekonstrukt, die die verwendeten Nukleinsäure allein oder in Kombination mit weiteren Biosynthesegenen des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels wie den Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferasen, ω-3-Desaturasen, Δ-4-Desaturasen, Δ-5-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-8-Desatuasen, Δ-9-Desaturasen, Δ-12-Desaturasen, ω3-Desaturasen, Δ-5-Elongasen, Δ-6-Elongasen und/oder Δ-9-Elongasen.
Wie hier verwendet und beschrieben, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist.
Die verwendeten rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von Δ-12-Desaturasen, ω-3-Desaturasen, Δ-6-Desaturasen, Δ-6-Elongasen und/oder Δ-5-Desaturasen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen gestaltet sein. Dies ist vorteilhaft, da häufig Zwischenschritte der Vektorkonstruktion der Einfachheithalber in Mikroorganismen durchgeführt werden. Beispielsweise können die Δ-12-Desaturase-, ω-3-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase- und/oder Δ-5-Desaturase-Gene in bakteriellen Zellen, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A., et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8:423–488; van den Hondel, C.A.M.J.J., et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi", in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsgb., S. 396–428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F., et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology. 1, 3:239–251), Ciliaten der Typen: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Desaturaseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella und Stylonychia, insbesondere der Gattung Stylonychia lemnae, mit Vektoren nach einem Transformationsverfahren, wie beschrieben in WO 98/01572 , sowie bevorzugt in Zellen vielzelliger Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.:583–586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S.71–119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225 (und darin zitierte Literaturstellen)) exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden ferner erörtert in Goeddel, Gene Expression Technolo-gy: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, zum Beispiel unter Verwendung von T7-Promotor-Regulationssequenzen und T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten, vorteilhaft zu einfachen Detektion der enzymatischen Aktivität z.B. zum Nachweis der Desaturase- oder Elongaseaktivität, erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, welche die Expression von Fusions- oder nicht-Fusionsproteinen steuern. Typische Fusions-Expressionsvektoren sind u.a. pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B., und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.
Beispiele für geeignete induzierbare nicht-Fusions-E. coli-Expressionsvektoren sind u.a. pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301–315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technologe: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60–89). Die Zielgenexpression vom pTrc-Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pET 11d-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten viralen RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gn1-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt.
Andere in prokaryotischen Organismen geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt, diese Vektoren sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, die pBR-Reihe, wie pBR322, die pUC–Reihe, wie pUC18 oder pUC19, die M113mp–Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 or pBdCl, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist der Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYeDesaturasecl (Baldari et al. (1987) Embo J. 6:229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30:933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113–123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie den filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsgb., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsgb., S. 396–428: Academic Press: San Diego]. Weitere geeignete Hefevektoren sind beispielsweise pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23.
Die oben genannten Vektoren bieten nur einen kleinen Überblick über mögliche geeignete Vektoren. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und sind zum Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsgb. Pouwels, P.H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren sind geeignet.
Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptionsebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbunden Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693–8711).
Die Pflanzengenexpression muss wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt. Nutzbare Promotoren sind konstitutive Promotoren (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195–2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285–294), 19S CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913 ) oder Pflanzenpromotoren, wie der in US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285–423 und darin zitierte Literaturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch wie oben beschrieben über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89–108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor ( WO 95/19443 ), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397–404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1-Gen-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361–366), der hitzeinduzierbare hsp80-Promotor aus Tomate ( US 5,187,267 ), der kälteinduzierbare Alpha-Amylase-Promotor aus Kartoffel ( WO 96/12814 ) oder der durch Wunden induzierbare pinII-Promotor ( EP-A-0 375 091 ).
Es sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Fettsäure-, Lipid- und Ölbiosynthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps ( US 5,608,152 ), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3):459–67), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis ( WO 98/45461 ), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris ( US 5,504,200 ), der Bce4-Promotor aus Brassica ( WO 91/13980 ) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2):233–9) sowie Promotoren, welche die samenspezifische Expression in Monokotyledonen-Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der Ipt2- oder Ipt1-Gen-Promotor aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin-Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum-Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin-Gen).
Insbesondere kann die multiparallele Expression der im Verfahren verwendeten Δ-5-Desaturase, Δ-6-Desaturase, Δ-12-Desaturase, ω-3-Desaturase oder Δ-6-Elongase gewünscht sein. Die Einführung solcher Expressionskassetten kann über eine simultane Transformation mehrerer einzelner Expressionskonstrukte erfolgen oder bevorzugt durch Kombination mehrerer Expressionskassetten auf einem Konstrukt. Auch können mehrere Vektoren mit jeweils mehreren Expressionskassetten transformiert und auf die Wirtszelle übertragen werden. Im Sinne der Erfindung ist es auch möglich Gene in unterschiedliche Pflanzen einzubringen und diese durch Kreuzung zu kombinieren.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment, beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285–423 und darin zitierte Literaturstellen).
"Transgen" bzw. "Rekombinant" im Sinne der Erfindung bedeutet bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette (= Genkonstrukt) oder einem Vektor enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassette oder Vektor alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommenen Konstruktionen, in denen sich entweder

a) die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, oder
b) eine mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
c) (a) und (b)

US 5,565,350

WO 00/15815

Unter transgenen Pflanzen im Sinne der Erfindung ist daher zu verstehen, dass sich die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom der Pflanze befinden, wobei die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden können. Transgen bedeutet aber auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom der Pflanze sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenz verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Bevorzugte transgene Pflanzen sind Ölsamen- oder Ölfruchtpflanzen und speziell deren verschiedene Pflanzenteile.
Hierzu gehören auch Pflanzenzellen und bestimmte Gewebe, Organe und Teile von Pflanzen in all ihren Erscheinungsformen, wie Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, Kalli, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe und Zeltkulturen, das von der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet ist und/oder dazu verwendet werden kann, die transgene Pflanze hervorzubringen.
Transgene Pflanzen bzw. vorteilhaft deren Samen, die die im erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren, insbesondere ARA, EPA und/oder deren Mischungen enthalten, können vorteilhaft direkt vermarktet werden ohne dass die synthetisierten Öle, Lipide oder Fettsäuren isoliert werden müssen. Unter Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren sind ganze Pflanzen sowie alle Pflanzenteile, Pflanzenorgane oder Pflanzenteile wie Blatt, Stiel, Samen, Wurzel, Knollen, Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, Kalli, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe, Zellkulturen, die sich von der transgenen Pflanze abgeleiten und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen. Der Samen umfasst dabei alle Samenteile wie die Samenhüllen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe.
Grundsätzlich eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, insbesondere von ARA, EPA und/oder deren Mischungen in pflanzlichen Zeltkulturen und anschließender Gewinnung der Fettsäuren aus den Kulturen. Dabei kann es sich insbesondere um Suspensions- oder Kalluskulturen handeln.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen können aber auch aus den Pflanzen vorteilhaft aus den Pflanzensamen in Form ihrer Öle, Fett, Lipide und/oder freien Fettsäuren isoliert werden. Durch dieses Verfahren hergestellte mehrfach ungesättigten Fettsäuren lassen sich durch Ernten der Pflanzen bzw. Pflanzensamen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld ernten.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Verfahren ferner den Schritt des Gewinnens der Öle, Lipide oder freien Fettsäuren aus der Pflanze oder aus der Kultur. Bei der Kultur kann es sich beispielsweise um eine Treibhaus- oder Feldkultur einer Pflanze handeln.
Das Isolieren der Öle, Lipide oder freien Fettsäuren kann über Pressen oder Extraktion der Pflanzenteile bevorzugt der Pflanzensamen, erfolgen. Dabei können die Öle, Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren durch sogenanntes kalt schlagen oder kalt pressen ohne Zuführung von Wärme durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile speziell die Samen leichter aufschließen lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die so vorbehandelten Samen können anschließend gepresst werden oder mit Lösungsmittel wie warmen Hexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel wieder entfernt.
Danach werden die so erhaltenen Produkte, die die mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten, weiter bearbeitet, das heißt raffiniert. Dabei werden zunächst beispielsweise die Pflanzenschleime und Trübstoffe entfernt. Die sogenannte Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise chemisch/physikalisch durch Zugabe von Säure wie Phosphorsäure erfolgen. Anschließend werden die freien Fettsäuren durch Behandlung mit einer Base beispielsweise Natronlauge entfernt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen Lauge mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe zu entfernen werden die Produkte einer Gleichung mit beispielsweise Bleicherde oder Aktivkohle unterzogen. Zum Schluss wird das Produkt noch beispielsweise mit Wasserdampf desodoriert.
Die nach dem Pressen erhaltenen erfindungsgemäßen Öle, Lipide, Fettsäuren oder Fettsäuregemische werden als sogenannte Rohöle bezeichnet. Diese enthalten noch die gesamten Öl- und/oder Lipidkomponenten, sowie Verbindungen, die in diesen löslich sind. Derartige Verbindunge sind die verschiedenen Tocopherole wie α-Tocopherol, β-Tocopherol, γ-Tocopherol und/oder δ-Tocopherol oder Phytosterole wie Brassicasterol, Campesterol, Stigmasterol, β-Sitosterol, Sitostanol, Δ⁵-Avenasterol, Δ⁵,24-Stigmastadienol, Δ⁷-Stigmastenol oder Δ⁷-Avenasterol. Diese Verbindungen sind in einem Bereich von 1 bis 1000 mg/100 g vorteilhaft von 10 bis 800 mg/100 g Lipid oder Öl enthalten. Auch Triterpene wie Germaniol, Amyrin, Cycloartanol und andere können in diesen Lipiden und Ölen enthalten sein. Diese Lipide und/oder Öle enthalten die im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie ARA, EPA und/oder DHA gebunden in polaren und unpolaren Lipiden wie Phospholipiden z.B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Galactolipiden, Monoglyceride, Diglyceride oder Triglyceride um nur einige zu nennen. Auch Lysophospholipide können in den Lipiden und/oder Ölen vorkommen. Diese Komponenten der Lipide und/oder Öle können durch geeignete Methoden voneinander getrennt werden. Nicht enthalten in diesen Rohölen ist Cholesterol.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung des Öls, Lipids, der Fettsäuren und/oder der Fettsäurezusammensetzung in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika. Die erfindungsgemäßen Öle, Lipide, Fettsäuren oder Fettsäuregemische können in der dem Fachmann bekannten Weise zur Abmischung mit anderen Ölen, Lipiden, Fettsäuren oder Fettsäuregemischen tierischen Ursprungs wie z.B. Fischölen verwendet werden. Typisch für derartige Fischöle kurzkettige Fettsäuren wie C12:0, C14:0, C14:1, verzweigtkettiges C15:0, C15:0, C16:0 oder C16:1. Auch mehrfach ungesättige C16-Fettsäuren wie C16:2, C16:3 oder C16:4, verzweigtkettiges C17:0, C17:1, verzweigtkettiges C18:0 und C19:0 sowie C19:0 und C19:1 kommen im Fischöl vor. Derartige Fettsäuren sind typisch für Fischöle und werden nur selten oder gar nicht in pflanzlichen Ölen gefunden. Wirtschaftlich relevante Fischöle sind z.B. Anchovissöl, Menhadneöl, Tunfischöl, Sardinenöl, Heringsöl, Markrelenöl, Walöl und Lachsöl. Diese Lipide und/oder Öle tierischen Ursprungs können zum Abmischen mit den erfindungsgemäßen Ölen in Form von Rohölen, das heißt in Form von Lipiden und/oder Ölen, die noch nicht aufgereinigt wurden, verwendet werden oder aber es können verschieden aufgereinigte Fraktionen zum Abmischen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Öle, Lipide, Fettsäuren oder Fettsäuregemische können in der dem Fachmann bekannten Weise zur Abmischung mit anderen Ölen, Lipiden, Fettsäuren oder Fettsäuregemischen tierischen Ursprungs wie z.B. Fischölen verwendet werden. Auch diese Öle, Lipide, Fettsäuren oder Fettsäuregemische, die aus pflanzlichen und tierischen Bestandteilen bestehen, können zur Herstellung von Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika verwendet werden.
Unter dem Begriff "Öl", "Lipid" oder "Fett" wird ein Fettsäuregemisch verstanden, das ungesättigte, gesättigte, vorzugsweise veresterte Fettsaure(n) enthält. Bevorzugt ist, dass das Öl, Lipid oder Fett einen hohen Anteil an mehrfach ungesättigten freien oder vorteilhaft veresterten Fettsäure(n), insbesondere Linolsäure, γ-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure, α-Linolensäure, Stearidonsäure oder Eicosatetraensäure hat. Vorzugsweise ist der Anteil an ungesättigten veresterten Fettsäuren ungefähr 30%, mehr bevorzugt ist ein Anteil von 50%, noch mehr bevorzugt ist ein Anteil von 60%, 70%, 80%, 85% oder mehr. Zur Bestimmung kann z.B. der Anteil an Fettsäure nach Überführung der Fettsäuren in die Methylestern durch Umesterung gaschromatographisch bestimmt werden. Das Öl, Lipid oder Fett kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, z.B. Palmitin-, Palmitolein-, Stearin-, Ölsäure etc., enthalten. Insbesondere kann je nach Ausgangspflanze der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in dem Öl oder Fett schwanken.
Bei den im Verfahren hergestellten mehrfach ungesättigte Fettsäuren handelt es sich wie oben beschrieben beispielsweise um Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglycerin, Diacylglycerin, Triacylglycerin oder sonstige Fettsäureester.
Aus den so im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Lipiden, Phospholipiden oder Triacylglyceriden lassen sich die enthaltenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine Alkalibehandlung beispielsweise wäßrige KOH oder NaOH oder saure Hydrolyse vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol oder über eine enzymatische Abspaltung freisetzen und isolieren über beispielsweise Phasentrennung und anschließender Ansäuerung über z.B. H₂SO₄. Die Freisetzung der Fettsäuren kann auch direkt ohne die vorhergehend beschriebene Aufarbeitung erfolgen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die hergestellten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den im Verfahren verwendeten Pflanzen prinzipiell auf zwei Arten erhöht werden. Es kann entweder der Pool an freien mehrfach ungesättigten Fettsäuren und/oder der Anteil der über das Verfahren hergestellten veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren erhöht werden. Vorteilhaft wird durch das erfindungsgemäße Verfahren der Pool an veresterten mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den transgenen Organismen erhöht.
Vorteilhaft stammen alle die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen aus einem eukaryontischen Organismus wie einer Pflanze, einem Mikroorganismus wie einer Alge oder einem Tier. Bevorzugt stammen die Nukleinsäuresequenzen aus der Ordnung Salmoniformes, Xenopus oder Ciona, Algen wie Mantoniella, Crypthecodinium, Euglena oder Ostreococcus, Pilzen wie der Gattung Phytophtora oder von Diatomeen wie den Gattungen Thalassiosira oder Phaeodactylum.
Vorteilhaft im Verfahren verwendbare Nukleinsäuren stammen aus Bakterien, Pilzen, Diatomeen, Tieren wie Caenorhabditis oder Oncorhynchus oder Pflanzen wie Algen oder Moosen wie den Gattungen Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Mantoniella, Ostreococcus, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Borago, Phaeodactylum, Crypthecodinium, speziell aus den Gattungen und Arten Oncorhynchus mykiss, Xenopus laevis, Ciona intestinalis, Thalassiosira pseudonona, Mantoniella squamata, Ostreococcus sp., Ostreococcus tauri, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Borago officinalis, Phaeodactylum tricornutum, Caenorhabditis elegans oder besonders vorteilhaft aus Oncorhynchus mykiss, Euglena gracilis, Thalassiosira pseudonana oder Crypthecodinium cohnii.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiele
Beispiel 1: Allgemeine Klonierungsverfahren:
Die Klonierungsverfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und die Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laborstory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.
Beispiel 2: Sequenzanalyse rekombinanter DNA:
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA74, 5463–5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Kettenreaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu exprimierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.
Beispiel 3: Klonierung von Expressionsplasmiden zur Samen-spezifischen Expression in Pflanzen
Die folgenden beschriebenen allgemeinen Bedingungen gelten für alle nachfolgenden Versuche, wenn nicht anders beschrieben.
Erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden für die folgenden Beispiele Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV und pCAMBIA. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Verwendung gibt Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451. Verwendet wurde ein pGPTV-Derivat wie in DE 102 05 607 beschrieben. Dieser Vektor unterscheidet sich von pGPTV durch eine zusätzlich eingefügte AscI-Restriktionsschnittstelle.
Ausgangspunkt der Klonierung war der Klonierungsvektor pUC19 (Maniatis et al.). Im ersten Schritt wurde das Conlinin-Promotor-Fragment mit folgenden Primern amplifiziert:
CnI1 C 5': gaattcggcgcgccgagctcctcgagcaacggttccggcggtatagagttgggtaattcga
CnI1 C 3': cccgggatcgatgccggcagatctccaccattttttggtggtgat
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

5,00 μl Template cDNA
5,00 μl 10x Puffer (Advantage-Polymerase) + 25mM MgCl₂
5,00 μl 2mM dNTP
1,25 μl je Primer (10 pmol/μl)
0,50 μl Advantage-Polymerase (Clontech)

Reaktionsbedingungen der PCR:

Anlagerungstemperatur: 1 min 55°C
Denaturierungstemperatur: 1 min 94°C
Elongationstemperatur: 2 min 72°C
Anzahl der Zyklen: 35

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym EcoRI und dann für 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Der Klonierungsvektor pUC19 wurde in gleicher Weise inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der 2668 bp große, geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-Cn11-C wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Im nächsten Schritt wurde der OCS-Terminator (Genbank Accession V00088; De Greve, H., Dhaese, P., Seurinck, J., Lemmers, M., Van Montagu, M. and Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmidencoded octopine synthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499–511 (1982)) aus dem Vektor pGPVT-USP/OCS
( DE 102 05 607 ) mit den folgenden Primern amplifiziert:
OCS_C 5': aggcctccatggcctgctttaatgagatatgcgagacgcc
OCS_C 3': cccgggccggacaatcagtaaattgaacggag
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym StuI und dann für 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Der Vektor pUC19-CnI1-C wurde 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-CnI1C_OCS wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Im nächsten Schritt wurde der CnI1-B Promotor durch PCR mittels folgender Primer amplifiziert:
CnI1-B 5': aggcctcaacggttccggcggtatag
CnI1-B 3': cccggggttaacgctagcgggcccgatatcggatcccattttttggtggtgattggttct
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym StuI und dann für 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Der Vektor pUC19-CnI1-C wurde 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-CnI1C_CnI1B_OCS wurde durch Sequenzierung verifiziert.
In einem weiteren Schritt wurde der OCS-Terminator für CnI1B eingefügt. Dazu wurde die PCR mit folgenden Primer durchgeführt:
OCS2 5': aggcctcctgctttaatgagatatgcgagac
OCS2 3': cccgggcggacaatcagtaaattgaacggag
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym StuI und dann für 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Der Vektor pUC19-CnI1C_CnI1B_OCS wurde für 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-CnI1C_CnI1B_OCS2 wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Im nächsten Schritt wurde der CnI1-A Promotor durch PCR mittels folgender Primer amplifiziert:
CnI1-B 5': aggcctcaacggttccggcggtatagag
CnI1-B 3': aggccttctagactgcaggcggccgcccgcattttttggtggtgattggt
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym StuI inkubiert. Der Vektor pUC19-CnI1-C wurde für 12 h bei 25°C mit dem Restriktionsenzym SmaI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-CnI1C_CnI1B_CnI1A_OCS2 wurde durch Sequenzierung verifiziert.
In einem weiteren Schritt wurde der OCS-Terminator für CnI1A eingefügt. Dazu wurde die PCR mit folgenden Primer durchgeführt:
OCS2 5': ggcctcctgctttaatgagatatgcga
OCS2 3': aagcttggcgcgccgagctcgtcgacggacaatcagtaaattgaacggaga
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym StuI und dann für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym HindIII inkubiert. Der Vektor pUC19-CnI1C_CnI1B_CnI1A_OCS2 wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym StuI und für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym HindIII inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-CnI1C_CnI1B_CnI1A_OCS3 wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Das Plasmid pUC19-CnI1C_CnI1B_CnI1A_OCS3 wurde im nächsten Schritt zur Klonierung der Δ6-, Δ5-Desaturase und Δ6-Elongase verwendet. Dazu wurde die Δ6-Desaturase aus Phytium irregulare ( WO02/26946 ) mit folgenden PCR-Primern amplifiziert:
D6Des(Pir) 5': agatctatggtggacctcaagcctggagtg
D6Des(Pir) 3': ccatggcccgggttacatcgctgggaactcggtgat
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym BglII und dann für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym NcoI inkubiert. Der Vektor pUC19-CnI1C_CnI1B_CnI1A_OCS3 wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym BglII und für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym NcoI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-CnI1_d6Des(Pir) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Das Plasmid pUC19-CnI1_d6Des(Pir) wurde im nächsten Schritt zur Klonierung der Δ5-Desaturase aus Thraustochytrium ssp. ( WO02/26946 ) verwendet. Dazu wurde die Δ5-Desaturase aus Thraustochytrium ssp. mit folgenden PCR-Primern amplifiziert:
D5Des(Tc) 5': gggatccatgggcaagggcagcgagggccg
D5Des(Tc) 3': ggcgccgacaccaagaagcaggactgagatatc
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym BamHI und dann für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym EcoRV inkubiert. Der Vektor pUC19-CnI1_d6Des(Pir) wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym BamHI und für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym EcoRV inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Das Plasmid pUC19-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc) wurde im nächsten Schritt zur Klonierung der Δ6-Elongase aus Physcomitrella patens ( WO01/59128 ) verwendet, wozu diese mit folgenden PCR-Primern amplifiziert wurde:
D6Elo(Pp) 5': gcggccgcatggaggtcgtggagagattctacggtg
D6Elo(Pp) 3': gcaaaagggagctaaaactgagtgatctaga
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde zuerst für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym NotI und dann für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym XbaI inkubiert. Der Vektor pUC19-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc) wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym NotI und für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym XbaI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Ausgehend von pUC19-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) wurde der binäre Vektor für die Pflanzentransformation hergestellt. Dazu wurde pUC19-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym AscI inkubiert. Der Vektor pGPTV wurde in gleicher Weise behandelt. Anschließend wurden das Fragment aus pUC19-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) und der geschnittene pGPTV-Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pGPTV-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Ein weiteres Konstrukt, pGPTV-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co), fand Verwendung. Dazu wurde ausgehend von pUC19-CnI1C_OCS mit folgenden Primern amplifiziert:
CnI1_OCS 5': gtcgatcaacggttccggcggtatagagttg
CnI1_OCS 3': gtcgatcggacaatcagtaaattgaacggaga
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym SaiI inkubiert. Der Vektor pUC19 wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym SalI inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Produkt und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-CnI1_OCS wurde durch Sequenzierung verifiziert.
In einem weiteren Schritt wurde das Δ12-Desaturase-Gen aus Calendula officinalis ( WO01/85968 ) in pUC19-CnI1_OCS kloniert. Dazu wurde d12Des(Co) mit folgenden Primern amplifiziert:
D12Des(Co) 5': agatctatgggtgcaggcggtcgaatgc
D12Des(Co) 3': ccatggttaaatcttattacgatacc
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl):

Reaktionsbedingungen der PCR:

Das PCR-Produkt wurde für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym BglII und anschließend für 2 h bei gleicher Temperatur mit NcoI inkubiert. Der Vektor pUC19-CnI1_OCS wurde in gleicher Weise inkubiert. Anschließend wurden das PCR-Fragment und der geschnittene Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-CnI1_D12Des(Co) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Das Plasmid pUC19-CnI1_D12Des(Co), sowie das Plasmid pUC19-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp) wurden für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym SalI inkubiert. Anschließend wurde das Vektor-Fragment sowie der Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und Vektor-Fragment ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pUC19-CnI1_ d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Ausgehend von pUC19-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) wurde der binäre Vektor für die Pflanzentransformation hergestellt. Dazu wurde pUC19-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) für 2 h bei 37°C mit dem Restriktionsenzym AscI inkubiert. Der Vektor pGPTV wurde in gleicher Weise behandelt. Anschließend wurden das Fragment aus pUC19-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)D6Elo(Pp)_D12Des(Co) und der geschnittene pGPTV-Vektor durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die entsprechenden DNA-Fragmente ausgeschnitten. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mittels Qiagen Gel Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Anschließend wurden Vektor und PCR-Produkt ligiert. Dazu wurde das Rapid Ligation Kit von Roche verwendet. Das entstandene Plasmid pGPTV-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Ein weiterer für die Pflanzentransformation geeigneter Vektor ist pSUN2. Um die Zahl der im Vektor enthaltenen Expressionskassetten auf mehr als vier zu erhöhen wurde dieser Vektor in Kombination mit dem Gateway-System (Invitrogen, Karlsruhe) verwendet. Dazu wurde in den Vektor pSUN2 gemäss Herstellerangaben die Gateway-Kassette A wie folgendermassen beschrieben, eingefügt:
Der pSUN2 Vektor (1 μl) wurde 1 h mit dem Restriktionsenzym EcoRV bei 37° inkubiert. Anschliessend wurde die Gateway-Kassette A (Invitrogen, Karlsruhe) in den geschnittene Vektor ligiert mittels des Rapid Ligation Kits von Roche, Mannheim. Das entstandene Plasmid wurde in E. coli DB3.1 Zellen (Invitrogen) transformiert. Das insolierte Plasmid pSUN-GW wurde anschliessend durch Sequenzierung verifiziert.
Im zweiten Schritt wurde die Expressionskassette aus pUC19-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) mittels AscI ausgeschnitten und in den in gleicherweise behandelten Vektor pSUN-GW ligiert.
Beispiel 4: Erzeugung von transgenen Pflanzen
a) Erzeugung transgener Brassicapflanzen (verändert nach Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8:238–242)
Zur Erzeugung transgener Rapspflanzen können binäre Vektoren in Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 oder Escherichia coli genutzt (Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Zur Transformation von Rapspflanzen (Var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Deutschland), wird eine 1:50 Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie in Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) mit 3% Saccharose (3MS-Medium) benutzt. Petiolen oder Hypokotyledonen frisch gekeimter steriler Rapspflanzen (zu je ca. 1 cm²) werden in einer Petrischale mit einer 1:50 Agrobakterienverdünnung für 5–10 Minuten inkubiert. Es folgt eine 3-tägige Colnkubation in Dunkelheit bei 25°C auf 3MS-Medium mit 0,8% Bacto-Agar. Die Kultivierung wird nach 3 Tagen mit 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/l Claforan (Cefotaxime-Natrium), 50 mg/l Kanamycin, 20 mikroM Benzylaminopurin (BAP) und 1,6 g/l Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse werden auf MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt. Bilden sich nach drei Wochen keine Wurzeln, so wurde als Wachstumshormon 2-Indolbuttersäure zum Bewurzeln zum Medium gegeben.
Regenerierte Sprosse werden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten, nach Bewurzelung in Erde überführt und nach Kultivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer oder im Gewächshaus angezogen, zur Blüte gebracht, reife Samen geerntet und auf Elongase-Expression wie Δ-6-Elongaseaktivität oder ω-3-Desaturaseaktivität mittels Lipidanalysen untersucht. Linien mit erhöhten Gehalten an C20- und C22 mehrfachungesättigten Fettsäuren können so identifiziert werden.
b) Herstellung von transgenen Camelina Pflanzen
Agrobacterium tumefaciens Stamm C58 wurde mittels Elektroporation mit dem PUFA-Vektor 81, 191 and 192 transformiert. Eine Inokulation von Explantaten von Camelina Keimlingen (Alter > 1 Woche), die auf MS medium angezogen wurden, mit Agrobkakterien wurde durchgeführt. Nach zwei Wochen Kokultivierung wurden die Pflanzen gewaschen um Agrobakterien zu entfernen, und anschließend auf Regenerationsmedium mit optimierten BaP und NAA überführt. Nach weitern zwei Tagen Regeneration wurden optimierte Mengen an Kanamycinn zugefügt. Dieser Selektionsdruck wurde 12 Tage aufrecht erhalten. Die Sprossregeneration wurde durch Transfer zu Kanamycinfreiem BaP enthaltenem Medium initiiert. Sprossebildung wurden nach > 3 Wochen nach Inokulation abgeschlossen und die Wurzelbildung auf Medium mit NAA induziert. Sprosse wurden nach Bewurzelung in Erde überführt und in einer Klimakammer oder im Gewächshaus angezogen, zur Blüte gebracht, reife Samen geerntet und auf Elongase-Expression wie Δ-6-Elongaseaktivität oder ω-3-Desaturaseaktivität mittels Lipidanalysen untersucht. Linien mit erhöhten Gehalten an mehrfachungesättigten Fettsäuren können so identifiziert werden.
Beispiel 5: Lipidextraktion aus Samen:
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet wird und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. der Lipide oder einer Fettsäure) untersucht werden. Diese Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89–90 und S. 443–613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laborstory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469–714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22): 12935–12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145 beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide – Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952)–16 (1977) u.d.T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Zusätzlich zur Messung des Endproduktes der Fermentation ist es auch möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamteffizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (z.B. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen), Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion üblicher Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P.F. Stanbury, Hrsgb., IRL Press, S. 103–129; 131–163 und 165–192 (ISBN: 0199635773) und darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.
Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; TAG, Triacylglycerin; TLC, Dünnschichtchromatographie).
Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäureprodukten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in: Advances an Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, Oily Press, Dundee, 119–169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren, Lipide 33:343–353).
Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2% Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten Öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester werden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC-Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d.h. Sigma), definiert werden.
Pflanzenmaterial wird zunächst mechanisch durch Mörsern homogenisiert, um es einer Extraktion zugänglicher zu machen.
Dann wird 10 min auf 100°C erhitzt und nach dem Abkühlen auf Eis erneut sedimentiert. Das Zellsediment wird mit 1 M methanolischer Schwefelsäure und 2% Dimethoxypropan für 1 h bei 90°C hydrolysiert und die Lipide transmethyliert. Die resultierenden Fettsäuremethylester (FAME) werden in Petrolether extrahiert. Die extrahierten FAME werden durch Gasflüssigkeitschromatographie mit einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0,32 mm) und einem Temperaturgradienten von 170°C auf 240°C in 20 min und 5 min bei 240°C analysiert. Die Identität der Fettsäuremethylester wird durch Vergleich mit entsprechenden FAME-Standards (Sigma) bestätigt. Die Identität und die Position der Doppelbindung kann durch geeignete chemische Derivatisierung der FAME-Gemische z.B. zu 4,4-Dimethoxyoxazolin-Derivaten (Christie, 1998) mittels GC-MS weiter analysiert werden.

Beispiel 6: Analyse der Samen von den erzeugten transgenen Pflanzen Entsprechend Beispiel 5, wurden die Samen der Pflanzen, die mit den Konstrukten pGPTV-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co), pSUN-5G und pSUN-8G transformiert wurden, analysiert. Im Vergleich zu Kontroll-Pflanzen, die nicht transformiert wurden (Wildtyp-Kontrolle, WT) konnte eine deutliche Veränderung im Fettsäurespektrum festgestellt werden. Damit konnte gezeigt werden, dass die transformierten Gene funktionell sind. Tabelle 1 fasst die Ergebnisse zusammen. Tabelle 1:

Linien	Fettsäuren
	16:0	18:0	18:1	18:2	GLA	18:3	SDA	ARA	EPA
WT Kontrolle	5,6	6,5	31,7	41,7	nd	12,1	nd	nd	nd
1424_Ko82_4	6,6	1,5	8,9	10,5	42,2	3,1	2,8	17,2	0,2
1424_Ko82_5	6,1	1,5	11,0	9,0	40,6	2,9	4,0	15,0	1,5
1424_Ko82_6	5,7	1,6	15,5	10,6	37,1	3,0	3,2	14,6	0,2
1424_Ko82_7	5,4	2,0	20,4	10,7	32,6	3,5	3,2	12,1	1,0
1424_Ko82_8	5,4	1,4	15,1	12,5	39,9	2,6	2,4	12,2	0,7
1424_Ko82_9	6,0	1,8	25,0	9,9	29,7	2,2	2,5	10,2	0,8
1424_Ko82_10	5,7	1,3	10,1	10,3	42,5	2,6	3,5	13,9	1,1
1424_Ko82_11	5,4	1,4	15,7	11,3	38,2	2,6	2,8	14,1	1,0

Die Analyse der Samen mit dem Konstrukt pSUN-5G zeigt dabei Linien, die eine deutliche Erhöhung des Gehaltes an Arachidonsäure verglichen mit dem Konstrukt pGPTV-CnI1_d6Des(Pir)_d5Des(Tc)_D6Elo(Pp)_D12Des(Co) haben. Dabei konnten Linien mit bis zu 25% ARA erhalten werden. Die Ergebnisse dieser Linie sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tab. 2: Fettsäureanalytik von transgenen Samen, die mit dem Konstrukt pSUN-5G transformiert wurden.

Linien	Fettsäuren
	16:0	18:0	18:1	18:2 LA	18:3 GLA	18:3 ALA	18:4 SDA	20:3 HGLA	ARA	EPA
WT	5,2	2,3	34,2	37,9	0,0	11,6	0,0	0,0	0,0	0,0
16-1-2	4,2	1,6	20,1	21,5	25,9	4,1	1,8	1,7	8,9	0,8
16-1-3	5,8	2,3	9,9	14,6	33,6	3,1	2,2	2,2	16,0	1,4
16-1-8	5,0	2,8	11,1	12,6	34,9	2,2	1,8	2,6	16,3	1,2
16-2-1	4,9	1,6	14,5	17,4	32,9	3,5	2,0	1,6	12,3	1,0
16-2-5	5,5	3,3	12,9	13,8	32,9	2,9	2,2	1,4	15,4	1,4
16-4-2	5,8	2,5	18,8	14,7	32,0	3,5	2,3	1,2	12,0	1,2
16-4-3	5,9	2,0	19,7	15,0	32,0	3,8	2,4	1,1	11,4	1,2
16-7-2	6,2	4,4	14,3	10,2	30,7	2,0	2,1	1,7	19,4	1,9
16-7-3	5,0	2,5	21,6	13,6	30,7	2,1	1,8	1,5	12,6	1,1
16-7-4	5,3	4,1	18,8	19,5	23,1	4,2	2,2	2,9	11,3	1,4
16-7-5	7,4	1,8	4,2	6,8	33,7	1,8	2,7	2,6	25,8	2,6

Beispiel 7: Analyse von transgenem Samenmaterial von Camelina sativa, L

Die Extraktion von Samen transgener Camelina sativa Pflanzen tranformiert mit PUFA 81 (enthaltend:Δ6Des(Pir) SEQ ID NO: 1_Δ5Des(Tc) SEQ ID NO: 3_Δ6Elo(Pp) SEQ ID NO: 5_Δ12Des(Co) SEQ ID NO: 11). sowie die gaschromatographische Analyse wurde wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Analysen. Dabei wurden die verschiedenen Fettsäuren in Flächenprozent angegeben. Für Camelina sativa konnte erstmals die Synthese von langkettigen-mehrfach ungesättigte Fettsäuren gezeigt werden. Überraschenderweise konnte durch die Einbringung des Syntheseweges für die Produktion von langkettigen-mehrfach ungesättigte Fettsäuren der Gehalt an Erucasäure (22:1) und Icosensäure (20:1) deutlich gesenkt werden, obwohl am direkten Syntheseweg für Erucasäure wie er bei Mietkiewska, et al., Plant Phys 2004 oder Katavic et al., 2002 Europ. Journal of Biochem beschrieben ist, nichts verändert wurde Tabelle 3: Gaschromatographische Analyse von Samenmaterial von Camelina sativa, L.. Die einzelnen Fettsäuren sind in Flächenprozent angegeben.

	16:0	18:0	18:1Δ9	18:1Δ11	18:2	γ18:3	α18:3
PUFA81_1	9,4	4,6	3,5	1,1	8,0	26,6	9,5
PUFA81_2	12,7	4,4	4,8	0,9	19,3	15,9	18,0
PUFA81_3	13,1	4,7	4,2	1,2	17,1	18,1	13,1
PUFA81_4	9,2	3,2	3,7	1,1	5,8	23,7	10,8
PUFA81_6	8,1	4,8	1,1	0,0	9,3	19,9	14,6
PUFA81_7	8,0	3,3	4,3	0,9	7,8	21,1	13,7
PUFA81_8	7,9	3,7	5,0	1,2	8,5	19,9	16,1
PUFA81_9	8,0	3,5	4,6	1,1	7,3	21,9	13,1
PUFA81_10	8,2	3,9	7,2	1,5	9,1	20,4	15,2
PUFA81_16	8,0	3,4	4,7	0,8	8,4	22,0	14,8
PUFA81_20	8,7	3,2	5,9	1,4	8,1	21,8	14,3
wt_1	5,7	2,3	12,6	0,7	12,1	n.n.	41,6
wt_2	6,6	1,9	10,1	0,9	14,3	n.n.	42,4
wt_3	5,6	1,9	8,9	0,8	15,0	n.n.	43,1
wt_4	6,1	2,0	9,4	0,9	15,3	n.n.	42,9
wt_5	6,3	2,2	10,6	0,9	15,9	n.n.	41,3
wt_6	6,2	2,4	7,5	0,8	14,8	n.n.	43,2
	18:4	20:0	20:1	20:3 (11,14,17)	20:4 (ARA) (5,8,11,14)	20:5 (EPA) (5,8,11,14,17)	22:1
PUFA81_1	10,6	2,5	7,4	1,0	9,2	3,3	1,6
PUFA81_2	5,3	2,9	0,5	0,7	6,7	1,8	3,1
PUFA81_3	8,9	2,7	0,4	0,6	7,9	3,4	1,9
PUFA81_4	12,1	2,0	9,8	1,4	8,3	3,3	2,8
PUFA81_6	11,7	3,6	10,1	1,5	6,3	3,0	3,1
PUFA81_7	11,1	2,7	9,1	1,4	7,6	3,3	3,0
PUFA81_8	11,8	2,6	9,5	1,7	6,3	3,1	0,1
PUFA81_9	11,3	2,4	7,7	1,4	8,8	3,7	2,3
PUFA81_10	10,7	2,1	8,0	1,1	6,0	2,7	1,7
PUFA81_16	8,4	1,8	12,8	1,6	6,1	2,1	2,4
PUFA81_20	10,1	1,5	10,3	1,3	6,3	2,7	2,1
wt_1	n.n.	1,4	14,2	1,7	n.n.	n.n.	3,7
wt_2	n.n.	1,2	13,1	2,1	n.n.	n.n.	3,2
wt_3	n.n.	1,4	12,9	2,0	n.n.	n.n.	4,0
wt_4	n.n.	1,3	12,3	1,9	n.n.	n.n.	3,4
wt_5	n.n.	1,5	12,5	1,7	n.n.	n.n.	3,3
wt_6	n.n.	1,9	12,3	1,9	n.n.	n.n.	3,9

Äquivalente:
Der Fachmann erkennt oder kann viele Äquivalente der hier beschriebenen erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen, indem er lediglich Routineexperimente verwendet. Diese Äquivalente sollen von den Patentansprüchen umfasst sein. SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure (= ARA) oder Eicosapentaensäure (= EPA) oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure in transgenen Pflanzen der Familie der Brassicaceae mit einem Gehalt an ARA oder EPA oder ARA und EPA von mindestens 3 Gew.-% bezogen auf den Gesamtlipidgehalt der transgenen Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Verfahrensschritte umfasst: a) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in die Nutzpflanze, die für eine Δ-6-Desaturase codiert, und b) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in die Nutzpflanze, die für eine Δ-6-Elongase codiert, und c) Einbringen mindestens einer Nukleinsäuresequenz in die Nutzpflanze, die für eine Δ-5-Desaturase codiert, und d) Ernten der Nutzpflanze, wobei durch die enzymatische Aktivität der unter den Schritten (a) bis (c) eingebrachten Enzyme eine Fettsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Fettsäuren Ölsäure [C18:1^Δ9], Linolsäure [C18:2^Δ9,12], α-Linolensäure [C18:3^Δ6,9,12] Icosensäure [C20:1^Δ11] und Erucasäure [C22:1^Δ13] um mindestens 10 % gegenüber der nicht-transgenen Wildtyppflanze reduziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, oder Δ-5-Desaturaseaktivität codieren, ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Sequenz, oder b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide codieren, die auf Aminosäureebene mindestens 40% Identität mit SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 aufweisen und eine Δ-6-Desaturase-, Δ-6-Elongase-, oder Δ-5-Desaturaseaktivität haben.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich in die Nutzpflanzen eine Nukleinsäuresequenz eingebracht wird, die für eine ω-3-Desaturase oder Δ-12-Desaturase oder ω-3-Desaturase und Δ-12-Desaturase codieren.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit ω-3-Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 9 dargestellten Sequenz, oder b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von den in SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 9 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide codieren, die auf Aminosäureebene mindestens 60% Identität mit SEQ ID NO: 10 aufweisen und eine ω-3-Desaturaseaktivität haben.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit Δ-12-Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 11 dargestellten Sequenz, oder b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von den in SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lassen, oder c) Derivate der in SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide codieren, die auf Aminosäureebene mindestens 60% Identität mit SEQ ID NO: 10 aufweisen und eine Δ-12-Desaturaseaktivität haben.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren im vegetativen Gewebe exprimiert werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure in den Nutzpflanzen vorwiegend als Ester in Phospholipiden oder Triacylglyceriden gebunden vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure vorwiegend als Ester in den Phospholipiden gebunden vorliegt und wobei die Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure mit einem Gehalt von mindestens 10 Gew.-% bezogen auf die Gesamtlipide in den Phosholipidester vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure vorwiegend als Ester in den Triacylglyceriden gebunden vorliegt und wobei die Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure mit einem Gehalt von mindestens 10 Gew.-% bezogen auf die Gesamtlipide in den Triacylglyceridestern vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zu den Fettsäuren Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure eine Fettsäure ausgewählt aus der Gruppe der Fettsäuren bestehend aus γ-Linolensäure [C18:3^Δ9,12,15] und Dihomo-γ-Linolensäure [C20:3^Δ6,9,12,15] um mindestens 10% gegenüber der nicht-transgenen Wildtyppflanze erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nutzpflanze eine Öl-produzierende Pflanze, eine Gemüse-, Salat- oder Zierpflanze ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Arachidonsäure oder Eicosapentaensäure oder Arachidonsäure und Eicosapentaensäure aus den Nutzpflanzen in Form ihrer Öle, Lipide oder freien Fettsäuren isoliert werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzliche weitere Biosynthesegene des Fettsäure– oder Lipidstoffwechsels enthält ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]–Desaturase(n), Acyl–ACP–Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl–Transferase(n), Acyl-CoA:Lysophospholipid-Acyltransferase(n), Fettsäure–Synthase(n), Fettsäure–Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl–Coenzym A–Oxidase(n), Fettsäure–Desaturase(n), Fettsaure–Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol–Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid–Lyasen oder Fettsäure–Elongase(n) in die Nutzpflanzen eingebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das zusätzliche Biosynthesegene des Fettsäure– oder Lipidstoffwechsels ausgewählt ist aus der Gruppe der Δ-4-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-6-Desaturase-, Δ-8-Desaturase-, Δ-9-Desaturase-, Δ-12-Desaturase-, Δ-6-Elongase- oder Δ-9-Elongase.
Verwendung von Ölen, Lipiden oder freien Fettsäuren hergestellt gemäß Anspruch 12 zur Herstellung von Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika.