DE102006009831B4

DE102006009831B4 - Method and microscope for spatially high-resolution examination of samples

Info

Publication number: DE102006009831B4
Application number: DE200610009831
Authority: DE
Inventors: Dr. Dyba Marcus; Dr. Gugel Hilmar
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2006-03-01
Filing date: 2006-03-01
Publication date: 2013-07-04
Anticipated expiration: 2026-03-02
Also published as: JP2007233370A; DE102006009831A1

Abstract

Verfahren zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe (1) durch ein Objektiv (3, 13) beleuchtet wird und wobei die Probe (1) eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand (Z1, A) in einen zweiten Zustand (Z2, B) überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände (Z1, A; Z2, B) in mindestens einer optischen Eigenschaft voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte, dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich (P) zunächst in den ersten Zustand (Z1, A) gebracht wird und dass mittels eines optischen Signals (4) der zweite Zustand (Z2, B) induziert wird, wobei innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs (P) räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden, und wobei das optische Signal (4) in Form einer Fokuslinie (10) mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle (5) mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima (9) bereitgestellt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokuslinie (10) mittels einer linienförmigen Ausleuchtung in einer zur Pupille (P1) des Objektivs (3, 13) konjugierten Pupillenebene (P3) – Pupillenlinie (14) – und durch Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie (14) erzeugt wird, wobei die Phasenmodulation derart vorgenommen wird, dass entlang der Pupillenlinie (14) ein oder mehrere Phasensprünge eingeführt werden.Method for spatially high-resolution examination of samples, wherein the sample to be examined (1) is illuminated by a lens (3, 13) and wherein the sample (1) comprises a substance that is repeated from a first state (Z1, A) into one second state (Z2, B) is transferable, wherein the first and the second states (Z1, A; Z2, B) differ from one another in at least one optical property, comprising the steps of the substance being detected in a sample region (P) to be detected is first brought into the first state (Z1, A) and that by means of an optical signal (4), the second state (Z2, B) is induced, within the sample area to be detected (P) spatially limited portions are recessed targeted, and wherein the optical signal (4) is provided in the form of a focus line (10) with a cross-sectional profile with at least one intensity zero point (5) with laterally adjacent intensity maxima (9), characterized in that the focal line (10) is produced by means of a line-shaped illumination in a pupil plane (P3) - pupil line (14) conjugate to the pupil (P1) of the objective (3, 13) - and by phase modulation along the pupil line (14), the phase modulation is made such that along the pupil line (14) one or more phase jumps are introduced.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte, dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich zunächst in den ersten Zustand gebracht wird und dass mittels eines optischen Signals der zweite Zustand induziert wird, wobei innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden, und wobei das optische Signal in Form einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima bereitgestellt wird.The invention relates to a method for spatially high-resolution examination of samples, wherein the sample to be examined comprises a substance which can be repeatedly transferred from a first state to a second state, wherein the first and the second states differ from one another in at least one optical property, comprising the steps of first bringing the substance into a first state in a sample region to be detected, and inducing the second state by means of an optical signal, wherein spatially limited partial regions are selectively recessed within the sample region to be detected, and wherein the optical signal in Form of a focus line is provided with a cross-sectional profile with at least one intensity zero point with laterally adjacent intensity maxima.

Des Weiteren betriff die Erfindung ein Mikroskop, insbesondere Laser-Raster Fluoreszenzmikroskop, zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend eine Strahlquelle zur Bereitstellung eines Schaltsignals, mit dem die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich zunächst in den ersten Zustand verbringbar ist, sowie eine weitere Strahlquelle zur Bereitstellung eines optischen Signals, mit dem der zweite Zustand induzierbar ist, derart, dass innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden, wobei das optische Signal eine Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima aufweist.Furthermore, the invention relates to a microscope, in particular laser scanning fluorescence microscope, for spatially high-resolution examination of samples, wherein the sample to be examined comprises a substance which is repeatedly convertible from a first state to a second state, wherein the first and the second States in at least one optical properties differ from each other, comprising a beam source for providing a switching signal with which the substance in a sample area to be detected is first brought into the first state, and a further beam source for providing an optical signal with which the second state inducible is such that within the sample area to be detected spatially limited portions are recessed targeted, the optical signal having a focus line with a cross-sectional profile having at least one intensity zero point with laterally adjacent intensity maxima.

Verfahren und Mikroskope der eingangs genannten Art sind aus der Praxis bekannt. Grundsätzlich ist gemäß dem Abbe'schen Gesetz der räumlichen Auflösung abbildender optischer Verfahren durch die Beugungsgrenze eine theoretische Grenze gesetzt, wobei die Beugungsgrenze von der Wellenlänge des verwendeten Lichts abhängt. Mit den hier in Rede stehenden Verfahren und Mikroskopen lassen sich allerdings räumliche Auflösungen erzielen, die über die nach Abbe bekannte theoretische Beugungsgrenze hinaus verbessert sind.Methods and microscopes of the type mentioned are known from practice. Basically, according to Abbe's law of spatial resolution of imaging optical methods, a theoretical limit is set by the diffraction limit, the diffraction limit depending on the wavelength of the light used. With the methods and microscopes in question, however, spatial resolutions can be achieved which are improved beyond the theoretical diffraction limit known from Abbe.

Bei den bekannten Verfahren werden hierzu in zu untersuchenden Proben Substanzen bereitgestellt, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar sind, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen Eigenschaft voneinander unterscheiden. Bei den meisten bekannten Verfahren handelt es sich bei dem ersten Zustand um einen fluoreszenzfähigen Zustand (im Folgenden Zustand A genannt) und bei dem zweiten Zustand um einen nicht fluoreszenzfähigen Zustand (im Folgenden Zustand B). Nachdem die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich mittels eines Schaltsignals in den fluoreszenzfähigen Zustand A gebracht worden ist, wird mittels eines optischen Signals in räumlich begrenzten Teilbereichen des zu erfassenden Probenbereichs Zustand B induziert und somit eine Unterdrückung der Fluoreszenz von Fluoreszenzmolekülen erzeugt. Der physikalische Prozess der Fluoreszenzunterdrückung kann dabei sehr unterschiedlicher Natur sein. So ist bspw. die stimulierte Emission aus dem zuvor angeregten Zustand oder eine optisch induzierte Strukturänderung der Fluoreszenzmoleküle bekannt.In the known methods, for this purpose substances are provided in samples to be examined, which can be repeatedly transferred from a first state to a second state, wherein the first and the second states differ from one another in at least one optical property. In most known methods, the first state is a fluorescence-capable state (referred to below as state A) and in the second state a non-fluoresceable state (in the following state B). After the substance has been brought into the fluorescence-capable state A in a sample region to be detected by means of a switching signal, state B is induced by means of an optical signal in spatially limited partial regions of the sample region to be detected, thus producing a suppression of the fluorescence of fluorescence molecules. The physical process of fluorescence suppression can be very different in nature. Thus, for example, the stimulated emission from the previously excited state or an optically induced structural change of the fluorescence molecules is known.

Entscheidend ist, dass der durch ein optisches Signal induzierte Übergang von dem ersten in den zweiten Zustand im Probenvolumen in großen Bereichen gesättigt, d. h. vollständig, stattfindet, und in mindestens einem Teilbereich des Probenvolumens gerade nicht stattfindet, indem dort das optische Schaltsignal gezielt nicht eingestrahlt wird. Dieser Effekt kann durch das Erzeugen einer Intensitätsnullstelle des optischen Signals erreicht werden. An der Nullstelle und in deren unmittelbarer Umgebung findet kein Übergang in den zweiten Zustand (im Allgemeinen der nicht fluoreszierende Zustand B) statt, so dass der erste Zustand (im Allgemeinen der fluoreszierende Zustand A) erhalten bleibt. Eine Sättigung des Übergangs A → B durch das optische Signal führt in den beleuchteten Bereichen des zu erfassenden Probenbereichs bereits in naher Umgebung der Intensitäts-Nullstellen zu einem (nahezu) vollständigen Transfer in den Zustand B. Je stärker der Prozess in die Sättigung getrieben wird, d. h. je mehr Energie durch das optische Signal in die Bereiche um die Nullstelle herum eingebracht wird, desto kleiner wird der Bereich mit Fluoreszenzmolekülen im fluoreszenzfähigen Zustand A bzw. allgemein in einem „leuchtfähigen” Zustand. In Abhängigkeit vom Sättigungsgrad in der unmittelbaren Nullstellen-Umgebung kann dieser Bereich prinzipiell beliebig klein gemacht werden. Folglich lassen sich Regionen des Zustands A markieren, die beliebig viel kleiner sind als die kleinsten aufgrund der Beugungsgrenze möglichen Regionen eines aufgebrachten optischen Signals. Wird der Bereich des Zustands A anschließend ausgelesen, z. B. durch Einstrahlen eines Testsignals, so stammt das (Fluoreszenz-)Messsignal aus einem definierten Bereich, der kleiner sein kann als es die Beugungsgrenze zulässt. Wird die Probe auf die beschriebene Art Punkt für Punkt abgerastert, so entsteht ein Bild mit einer Auflösung die besser ist, als es die Beugungstheorie erlaubt.It is crucial that the transition induced by an optical signal from the first to the second state in the sample volume in large areas saturated, d. H. completely, takes place, and in at least a portion of the sample volume just does not take place by there the optical switching signal is not selectively radiated. This effect can be achieved by generating an intensity null of the optical signal. At the zero and in the immediate vicinity, there is no transition to the second state (generally the non-fluorescent state B), so that the first state (generally the fluorescent state A) is maintained. A saturation of the transition A → B by the optical signal leads in the illuminated areas of the sample area to be detected already in the vicinity of the intensity zeros to a (nearly) complete transfer to the state B. The more the process is driven into saturation, d. H. the more energy is introduced by the optical signal in the areas around the zero, the smaller the area with fluorescence molecules in the fluorescent state A or generally in a "luminous" state. Depending on the degree of saturation in the immediate zero environment, this range can in principle be made arbitrarily small. Consequently, regions of state A can be marked which are arbitrarily much smaller than the smallest possible regions of an applied optical signal due to the diffraction limit. If the area of state A is subsequently read, e.g. B. by irradiation of a test signal, the (fluorescence) measurement signal comes from a defined range, which may be smaller than the diffraction limit allows. If the sample is scanned point by point in the described manner, an image is formed with a resolution that is better than the diffraction theory allows.

Verfahren, der hier beschriebenen Art, bei denen als Unterschied zwischen zwei Zuständen die optische Eigenschaft fluoreszenzfähig/nicht fluoreszenzfähig ausgenutzt wird, sind bspw. aus der DE 103 25 459 A1 und der DE 103 25 460 A1 bekannt. Bei diesen Verfahren werden Fluoreszenzmoleküle mit Hilfe eines optischen Signals von einem Zustand A (fluoreszenzfähig) in einen Zustand B (nicht fluoreszenzfähig) gebracht, wobei bei dem Übergang A → B die Sättigung erreicht wird. Die in dem fluoreszenzfähigen Zustand A verbleibenden Bereiche der Probe resultieren jeweils aus einem eine Nullstelle aufweisenden Intensitätsminimum des eingestrahlten optischen Signals. Die Intensitätsminima sind Teil eines Interferenzmusters. Das Abrastern der Probe erfolgt durch Verschiebung der Intensitätsminima des optischen Signals, wobei die Verschiebung durch Phasenverschiebung der interferierenden Strahlen bewirkt wird.Method, of the kind described here, where as difference between two states The optical property is fluorescent / not exploited fluorescent, are, for example, from the DE 103 25 459 A1 and the DE 103 25 460 A1 known. In these methods, fluorescence molecules are brought from state A (fluorescent) to state B (non-fluorescent) by means of an optical signal, saturation being achieved at transition A → B. The areas of the sample remaining in the fluorescence-capable state A each result from an intensity minimum of the irradiated optical signal having a zero point. The intensity minima are part of an interference pattern. The sample is scanned by shifting the intensity minima of the optical signal, the shift being caused by phase shifting of the interfering beams.

Bei den bekannten Verfahren ist nachteilig, dass durch die interferierenden Strahlen ein Interferenzmuster mit lokalen punktförmigen Intensitätsminima ausgebildet wird. Ein Abrastern der Probe erfordert dementsprechend einen punktuellen Scannvorgang in mindestens zwei Dimensionen, was den Scannvorgang äußerst zeitaufwendig macht.In the known methods, it is disadvantageous that an interference pattern with local punctiform intensity minima is formed by the interfering beams. Scanning the sample accordingly requires a point scan in at least two dimensions, which makes the scanning process extremely time consuming.

Aus der DE 10 2004 034 962 A1 sowie aus der DE 10 2004 034 996 A1 ist jeweils für sich gesehen bereits ein Verfahren zur Probenuntersuchung mit erhöhter Auflösung bekannt, wobei die Probe mit einem ersten und einem zweiten Beleuchtungslicht beleuchtet wird. Das erste Beleuchtungslicht bewirkt eine Anregung der Probe in einen ersten Zustand und das zweite Beleuchtungslicht dient zur induzierten Rückführung des angeregten ersten Zustands in einen zweiten Zustand. Das zweite Beleuchtungslicht weist in der Probe eine linienförmige Intensitätsverteilung auf, wobei das Querschnittsprofil Intensitätsnullstellen mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima aufweist. Erzeugt wird das zweite Beleuchtungslicht durch die Beugung kohärenten Lichts an einer periodischen Struktur. Das resultierende Beleuchtungslicht weist in einer lateralen Strahlrichtung und in axialer Strahlrichtung eine periodische Struktur in Form eines sog. Talbot-Musters auf. Die gleichzeitige Strukturierung in lateraler und axialer Richtung erfolgt durch die interferometrische Überlagerung von drei mindestens in einer Achse ebenen Wellen (–1., 0. und +1. Ordnung). Im einfachsten Fall wird die Erzeugung der drei Ordnungen durch eine Bestrahlung eines Amplitudengitters mit einer ebenen Welle realisiert.From the DE 10 2004 034 962 A1 as well as from the DE 10 2004 034 996 A1 In each case, a method for sample examination with increased resolution is already known, wherein the sample is illuminated with a first and a second illumination light. The first illumination light causes the sample to be excited into a first state and the second illumination light serves to induced the feedback of the excited first state into a second state. The second illumination light has a linear intensity distribution in the sample, wherein the cross-sectional profile has intensity zeros with laterally adjacent intensity maxima. The second illumination light is produced by the diffraction of coherent light on a periodic structure. The resulting illuminating light has a periodic structure in the form of a so-called Talbot pattern in a lateral beam direction and in an axial beam direction. The simultaneous structuring in the lateral and axial directions is effected by the interferometric superposition of three waves which are at least on one axis (-1, 0 and +1 order). In the simplest case, the generation of the three orders is realized by irradiation of an amplitude grating with a plane wave.

Bei dem bekannten Verfahren ist problematisch, dass zwar eine gleichzeitige Strukturierung in lateraler und axialer Richtung realisierbar ist, dass es sich bei der Talbot-Struktur jedoch um ein äußerst komplexes Beleuchtungsmuster handelt, das wenig Flexibilität bietet. Zum einen lässt sich die Breite der Intensitätsminima bzw. -maxima nur schwer verändern. Zum anderen ergibt sich in Abständen der Talbot-Länge ein Versatz der Linienförmigen Struktur, der für viele Anwendungen unbrauchbar ist. Da die Talbot-Länge von der Gitterkonstanten und der eingestrahlten Wellenlänge abhängt, ist bei fest vorgegebener Beleuchtungswellenlänge eine Veränderung zudem nur durch einen Austausch des verwendeten Gitters möglich. Dies ist in der Praxis äußerst aufwändig.In the known method is problematic that, although a simultaneous structuring in the lateral and axial directions can be realized, that it is in the Talbot structure, however, an extremely complex illumination pattern that offers little flexibility. On the one hand, it is difficult to change the width of the intensity minima or maxima. On the other hand, there is an offset of the line-shaped structure at intervals of the Talbot length, which is useless for many applications. Since the Talbot length depends on the lattice constant and the irradiated wavelength, a change is also possible only with an exchange of the grating used at a fixed wavelength of illumination. This is extremely expensive in practice.

Aus der US 2001/0045523 A1 ist für sich gesehen ein hochauflösendes Mikroskop bekannt, bei dem zusätzlich zu einem Anregungslichtstrahl, der mittels einer Schlitzblende und einer zylinderförmigen Linse zu einer Beleuchtungslinie geformt werden kann, ein Quenching-Lichtstrahl vorgesehen ist. Das Quenching-Beleuchtungslicht wird über zwei parallele zylinderförmige Linsen auf zwei parallele Schlitze geführt, so dass eine Doppellinie entsteht, wobei das zentrale Intensitätsminimum mit der Anregungslinie zur Deckung gebracht wird.From the US 2001/0045523 A1 In itself, a high-resolution microscope is known in which a quenching light beam is provided in addition to an excitation light beam which can be formed into a line of illumination by means of a slit diaphragm and a cylindrical lens. The quenching illumination light is guided via two parallel cylindrical lenses on two parallel slits, so that a double line is formed, wherein the central intensity minimum is brought to coincide with the excitation line.

Die DE 101 18 355 B4 zeigt ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung zur Mehrphotonenanregung einer Probe, wobei zur optimalen Ausnutzung der Beleuchtungslichtintensität der nichtlineare Charakter der Mehrphotonenanregung ausgenutzt wird, indem zwei Teilstrahlen unter einem Kippwinkel zueinander ausgerichtet werden, so dass eine durch Interferenz der Teilstrahlen hervorgerufene Intensitätsverteilung Bereiche maximaler Intensität neben Bereichen minimaler Intensität aufweist.The DE 101 18 355 B4 shows a method and a device for multi-photon excitation of a sample, wherein for optimal utilization of the illumination light intensity of the non-linear nature of the Mehrphotonenanregung is exploited by two sub-beams are aligned at a tilt angle to each other, so that caused by interference of the sub-beams intensity distribution areas of maximum intensity in addition to areas having minimal intensity.

Die DE 101 54 699 A1 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zum räumlich eng begrenzten Anregen eines optischen Übergangs. Dabei wird ein Anregungslichtstrahl in einen Fokusbereich der Probe gelenkt und mittels eines Abregungslichtstrahls, der aus zwei entgegengesetzten Richtungen auf die Probe gelenkt wird, in einem Teilbereich des Fokusbereich eines gezielte Abregung der Probe herbeigeführt, Durch die Überlagerung der beiden Abregungslichtstrahlen entsteht ein Interferenzmuster, dessen Phasenlage so eingestellt wird, dass sich an einem Fokuspunkt ein Intensitätsminimum ausbildet.The DE 101 54 699 A1 describes a method and apparatus for spatially limited excitation of an optical transition. In this case, an excitation light beam is directed into a focal region of the sample and brought about by means of a Abregungslichtstrahls, which is directed from two opposite directions to the sample in a portion of the focus area of a targeted de-excitation of the sample, By superimposing the two Abregungslichtstrahlen creates an interference pattern whose phase position is adjusted so that forms an intensity minimum at a focal point.

Aus der EP 1 584 918 A2 ist für sich gesehen ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung zur Fluoreszenz-Lebensdauer-Imaging-Nanoskopie bekannt, das/die im Rahmen der STED-Mikroskopie eingesetzt werden können.From the EP 1 584 918 A2 By itself, a method or apparatus for fluorescence lifetime imaging nanoscopy is known, which can be used in the context of STED microscopy.

Der vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie ein Mikroskop der eingangs genannten Art anzugeben, wonach mit konstruktiv einfachen und kostengünstigen Mitteln und gleichzeitig kompakter Bauform ein schnelles Abrastern einer Probe sowie eine flexible Veränderung der linienförmigen Beleuchtung ermöglicht ist.The present invention is now based on the object of specifying a method and a microscope of the type mentioned, which is possible with structurally simple and inexpensive means and at the same time compact design fast scanning of a sample and a flexible change of the linear illumination.

Erfindungsgemäß ist die voranstehende Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Danach ist das Verfahren derart ausgestaltet und weitergebildet, dass die Fokuslinie mittels einer linienförmigen Ausleuchtung in einer zur Pupille des Objektivs konjugierten Pupillenebene – Pupillenlinie – und durch Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie erzeugt wird, wobei die Phasenmodulation derart vorgenommen wird, dass entlang der Pupillenlinie ein oder mehrere Phasensprünge eingeführt werden. According to the invention, the above object is achieved by a method having the features of patent claim 1. Thereafter, the method is configured and developed such that the focal line is generated by means of a line-shaped illumination in a pupil plane conjugated to the pupil of the objective - pupil line - and by phase modulation along the pupil line, wherein the phase modulation is performed in such a way that along the pupil line one or more Phase jumps are introduced.

Die voranstehende Aufgabe ist des Weiteren durch ein Mikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 23 gelöst. Danach ist das Mikroskop gekennzeichnet durch ein optisches Bauteil, das eine Beleuchtungslinie in einer zur Pupille des Mikroskopobjektivs konjugierten Pupillenebene erzeugt, sowie ein phasenmodulierendes Element, das zur Erzeugung des Querschnittsprofils der Fokuslinie ein oder mehrere Phasensprünge entlang der Pupillenlinie einführt.The above object is further achieved by a microscope having the features of claim 23. Thereafter, the microscope is characterized by an optical component which generates a line of illumination in a pupil plane conjugate to the pupil of the microscope objective, and a phase-modulating element which introduces one or more phase jumps along the pupil line to produce the cross-sectional profile of the focal line.

Die Erfindung macht sich den Umstand zunutze, dass ein im Vergleich zu einem Punkt-Scann deutlich schnellerer Linien-Scann möglich ist, wenn der zweite Zustand entlang einer (prinzipiell beliebig) schmalen Linie induziert werden kann. Hierzu wird das optische Signal in Form einer Fokuslinie bereitgestellt, wobei die Fokuslinie ein Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle – zur Konservierung des ersten Zustands entlang einer (prinzipiell beliebig) schmalen Linie – mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima – zur Induzierung des zweiten Zustands in Sättigung – aufweist.The invention makes use of the fact that a significantly faster line scan is possible compared to a point scan if the second state can be induced along a (in principle arbitrary) narrow line. For this purpose, the optical signal is provided in the form of a focus line, wherein the focal line has a cross-sectional profile with at least one intensity zero point - for preserving the first state along a (arbitrarily arbitrary) narrow line - with laterally adjacent intensity maxima - for inducing the second state in saturation.

In erfindungsgemäßer Weise ist dabei erkannt worden, dass sich für das optische Signal ein Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle und seitlich benachbarten Intensitätsmaxima in ganz besonders raffinierter Weise dadurch realisieren lässt, dass zunächst eine sog. Pupillenlinie erzeugt wird, worunter eine linienförmige Ausleuchtung in einer zur Pupille des Objekts konjugierten Pupillenlinie zu verstehen ist. Durch Phasenmodulation entlang der erzeugten Pupillenlinie, konkret durch Einführung von einem oder mehreren Phasensprüngen, kann sodann auf einfache Weise das optische Signal in Form einer Fokuslinie mit dem gewünschten Querschnittsprofil bereitgestellt werden.In accordance with the invention, it has been recognized that a cross-sectional profile with at least one intensity zero point and laterally adjacent intensity maxima can be realized in a particularly sophisticated manner by first generating a so-called pupil line, including a line-shaped illumination in one of the pupil of the object conjugated pupil line is to be understood. By phase modulation along the generated pupil line, specifically by introducing one or more phase jumps, the optical signal in the form of a focus line with the desired cross-sectional profile can then be provided in a simple manner.

In konstruktiver Hinsicht ist dabei vorgesehen, dass die Fokuslinie generiert wird, indem in das Mikroskop ein optisches Bauteil integriert wird, das zunächst eine Beleuchtungslinie in einer zur Pupille des Mikroskopobjektivs konjugierten Pupillenebene erzeugt. Des Weiteren ist ein phasenmodulierendes Element vorgesehen, das zur Erzeugung des Querschnittsprofils der Fokuslinie ein oder mehrere Phasensprünge entlang der Pupillenlinie einführt. Das so generierte Querschnittsprofil weist keine für viele Anwendungen störende Sprünge wie ein Talbot-Muster auf und lässt sich insbesondere durch geeignete Veränderungen der Phasenmodulation flexibel anpassen.In terms of design, it is provided that the focus line is generated by integrating into the microscope an optical component which initially generates a line of illumination in a pupil plane conjugate to the pupil of the microscope objective. Furthermore, a phase-modulating element is provided, which introduces one or more phase jumps along the pupil line to produce the cross-sectional profile of the focus line. The cross-sectional profile generated in this way has no jumps that are troublesome for many applications, such as a Talbot pattern, and can be adapted flexibly in particular by suitable changes in the phase modulation.

das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Mikroskop lassen sich in besonders vorteilhafter Weise in Verbindung mit sehr langlebigen oder zeitlich sogar dauerhaft stabilen ersten und zweiten Zuständen einsetzen. In diesem Fall kann für die Sättigung des Übergangs vom ersten in den zweiten Zustand ein vergleichsweise langer Zeitraum gewählt werden, innerhalb dessen die zur Sättigung notwendige Energie des optischen Signals eingestrahlt wird. Die lokalen Intensitäten zur Übergangssättigung können dadurch sehr gering gewählt werden. Vor allem kann die von einer Strahlquelle des optischen Signal zur Verfügung stehende Gesamtenergie auf großräumige Bereiche im Probenraum verteilt und mehrere Intensitätsnullstellen oder eine ausgedehnte Nullstelle erzeugt werden. Trotz der daraus resultierenden geringen lokalen Intensitäten in der Umgebung der Nullstelle(n) im Vergleich zur Auftragung des Gesamtsignals um nur eine punktförmige Nullstelle herum kann die Sättigung erreicht werden. Dazu muss das Signal nur genügend lange eingestrahlt werden, bis schließlich alle Moleküle in Umgebung der Nullstellen im zweiten Zustand sind. Dies ist ein entscheidender Unterschied zum Fall eines kurzlebigen Zustandes (z. B. im STED-Verfahren mit typischen Lebenszeit von ~1 ns für einen fluoreszenzfähigen Zustand A), wo die zur Sättigung notwendige Energie in so kurzer Zeit eingestrahlt werden muss (deutlich schneller als die Rate A → B), dass die Gesamtleistung der Strahlquelle nur für die Erzeugung einer (oder maximal einiger weniger) lokalen Nullstellen ausreicht. Es lässt sich für konkrete Systeme zeigen, dass im Falle stabiler Zustände (z. B. photochrome Farbstoffe) oder langlebiger Zustände (z. B. Transfer in das Tripletsystem beim GSD-Verfahren, GSD = Ground State Depletion – Grundzustandsentvölkerung) die Leistung preiswerter und kommerzieller Lasersysteme auf so große Bereiche verteilt werden kann, dass mehrere punktförmige Intensitäts-Nullstellen (>> 10) oder ganze Streifen verschwindender Intensität in der Probe erzeugt werden können, in deren unmittelbarer Umgebung nach wie vor die Sättigung erreicht werden kann. Dies ermöglicht eine parallelisierte Bildaufnahme, wenn die Probe mit der Vielzahl von Punkt-Nullstellen oder mit Nullstellen-Linien gleichzeitig abgerastert wird und die Signale gleichzeitig für jede Nullstelle getrennt von einem Detektor erfasst werden. Auf diese Weise lassen sich Mikroskope mit Auflösungen unterhalb der klassischen Beugungsgrenze konstruieren, deren Bildaufnahmegeschwindigkeit im Bereich STED basierten Verfahren liegt und im Vergleich zu Systemen mit einer einzigen lokalen Nullstelle deutlich erhöht ist.The method according to the invention and the microscope according to the invention can be used in a particularly advantageous manner in conjunction with very long-lived or temporally even stable first and second states. In this case, for the saturation of the transition from the first to the second state, a comparatively long period can be selected, within which the energy of the optical signal required for saturation is radiated. The local intensities for transition saturation can be chosen very small. Above all, the total energy available from a beam source of the optical signal can be distributed over large-scale regions in the sample space and a plurality of intensity zeros or an extended zero point can be generated. Despite the resulting low local intensities in the vicinity of the zero (s) compared to the application of the total signal around only a point-shaped zero point saturation can be achieved. For this purpose, the signal must be irradiated only long enough, until finally all molecules in the vicinity of the zeros are in the second state. This is a decisive difference to the case of a short-lived state (eg in the STED method with a typical lifetime of ~ 1 ns for a fluoresceable state A), where the energy required for saturation must be radiated in such a short time (much faster than the rate A → B) that the total power of the beam source is sufficient only for the generation of one (or at most a few) local zeros. It can be shown for concrete systems that in the case of stable states (eg photochromic dyes) or long-lived states (eg transfer into the triplet system in the GSD process, GSD = ground state depletion), the performance is cheaper and less expensive commercial laser systems can be distributed over such large areas that multiple punctiform intensity zeroes (>> 10) or entire bands of vanishing intensity can be generated in the sample, in the immediate vicinity of which saturation can still be achieved. This allows parallelized image acquisition when the sample is scanned simultaneously with the plurality of point zeros or with zeros lines and the signals are simultaneously detected for each null separately from a detector. In this way, microscopes with resolutions below the classical diffraction limit can be constructed, the image acquisition speed of which is in the range of STED-based methods and is significantly increased compared to systems with a single local zero.

Im Rahmen einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass ein Phasensprung im Pupillenmittelpunkt eingeführt wird. Dieser Phasensprung wird in weiter vorteilhafter Weise so gewählt, dass er der Länge eines halben Wellenzugs entspricht, so dass die eine Hälfte der Linie um einen halben Wellenzug verzögert wird. Auf diese Weise entsteht in der Fokalebene eine Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil, das sich aus einer Intensitätsnullstelle mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima zusammensetzt. Alternativ ist es möglich, entlang der Pupillenlinie mehrere Phasensprünge um vorzugsweise jeweils einen halben Wellenzug einzuführen, so dass im Ergebnis ebenfalls die Hälfte der Gesamtlinie, d. h. die Hälfte der Lichtmenge, die durch die Pupille gestrahlt wird, im Vergleich zur anderen Hälfte um einen halben Wellenzug verzögert ist. In a particularly preferred embodiment, it is provided that a phase jump is introduced in the pupil center. This phase jump is chosen in a further advantageous manner so that it corresponds to the length of half a wave train, so that one half of the line is delayed by half a wave train. In this way, a focal line with a cross-sectional profile is formed in the focal plane, which is composed of an intensity zero point with laterally adjacent intensity maxima. Alternatively, it is possible to introduce a plurality of phase jumps along the pupil line, preferably in each case half a wave train, so that, as a result, half of the total line, ie half the amount of light that is radiated through the pupil, by half a wave train compared to the other half is delayed.

Im Hinblick auf eine konstruktiv einfache Ausführung kann vorgesehen sein, dass die Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie mittels eines in einem Zwischenbild der Pupille angeordneten räumlichen Phasenmodulators auf Flüssigkeitsbasis realisiert wird. Alternativ ist die Einfügung eines optischen Bauteils mit einer phasenverzögernden optischen Beschichtung denkbar. Prinzipiell können alle phasenverzögernden Elemente, wie Substrate mit dielektrischen Beschichtungen, Phasenmodulatoren auf Basis von Flüssigkristallen oder achromatische Phasenfilter eingesetzt werden. Idealerweise ist die Optik mit der phasenverzögernden Eigenschaft in oder nahe einer Pupillenebene angeordnet.With regard to a structurally simple embodiment, it can be provided that the phase modulation along the pupil line is realized by means of a liquid-based spatial phase modulator arranged in an intermediate image of the pupil. Alternatively, the insertion of an optical component with a phase-retarding optical coating is conceivable. In principle, all phase-retarding elements, such as substrates with dielectric coatings, phase modulators based on liquid crystals or achromatic phase filters can be used. Ideally, the optic with the phase-retarding feature is located in or near a pupil plane.

Im Hinblick auf eine konstruktiv einfache Bauform kann vorgesehen sein, dass die Pupillenlinie durch Fokussieren eines Beleuchtungslichtstrahls einer Beleuchtungslichtquelle mit einer Zylinderlinse oder einer Powell-Linse erzeugt wird. Alternativ kann die Pupillenlinie durch Abbilden einer Spaltblende in die Pupillenebene erzeugt werden. Denkbar ist auch der Einsatz holographischer Elemente.With regard to a structurally simple design it can be provided that the pupil line is produced by focusing an illumination light beam of an illumination light source with a cylindrical lens or a Powell lens. Alternatively, the pupil line can be created by imaging a slit diaphragm into the pupil plane. The use of holographic elements is also conceivable.

In besonders vorteilhafter Weise wird die Pupillenlinie mittels eines Achrogate-Filters in den Strahlengang eingekoppelt. In bevorzugter Weise könnte die Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie dann mittels zusätzlich phasenverzögernder Schichten auf dem Filter, beispielsweise in Form von dielektrischen Beschichtungen, realisiert werden.In a particularly advantageous manner, the pupil line is coupled into the beam path by means of an achrogate filter. In a preferred manner, the phase modulation along the pupil line could then be realized by means of additional phase-retarding layers on the filter, for example in the form of dielectric coatings.

Im Hinblick auf eine besonders kompakte Bauform könnten das optische Bauteil zur Erzeugung der Pupillenlinie und das phasenmodulierende Element als bauliche Einheit ausgeführt sein. Im Hinblick auf eine hohe Flexibilität können das optische Bauteil zur Erzeugung der Pupillenlinie und das phasenmodulierende Element auch jeweils als separate Einheiten an unterschiedlichen Positionen im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet sein.With regard to a particularly compact design, the optical component for generating the pupil line and the phase-modulating element could be designed as a structural unit. In view of a high degree of flexibility, the optical component for generating the pupil line and the phase-modulating element can also be arranged in each case as separate units at different positions in the illumination beam path.

Zur Sicherstellung einer kohärenten linienförmigen Beleuchtung der Pupille des Mikroskopobjektivs ist die Beleuchtungslichtquelle zur Erzeugung des optischen Signals bevorzugt als Laserlichtquelle ausgeführt.To ensure a coherent linear illumination of the pupil of the microscope objective, the illumination light source for generating the optical signal is preferably designed as a laser light source.

In besonders vorteilhafter Weise ist das Licht des optischen Signals senkrecht zur Pupillenlinie polarisiert, um auf diese Weise Depolarisierungseffekte weitestgehend auszuschließen.In a particularly advantageous manner, the light of the optical signal is polarized perpendicular to the pupil line, in order to exclude as far as possible depolarization effects.

Im Rahmen einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Fokuslinie nacheinander in unterschiedlichen Raumrichtungen erzeugt. Dabei kann es sich beispielsweise um orthogonal zueinander orientierte Raumrichtungen handeln. Entsprechend kann vorgesehen sein, dass das gesamte zu erfassende Probevolumen nacheinander in jeder der Raumrichtungen abgerastert wird. Anschließend können die aufgenommenen Einzelbilder mathematisch zu einem Gesamtbild zusammengeführt werden, wodurch eine Auflösungserhöhung in mehr als einer Richtung realisiert ist.In a particularly preferred embodiment, the focus line is generated successively in different spatial directions. These may be, for example, mutually orthogonal spatial directions. Accordingly, it can be provided that the entire sample volume to be detected is scanned one after the other in each of the spatial directions. Subsequently, the recorded individual images can be mathematically combined to form an overall image, whereby an increase in resolution is realized in more than one direction.

Es kann vorgesehen sein, dass der Übergang von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand mittels Mehr-Photonen-Absorption realisiert wird. Alternativ oder zusätzlich kann das Auslesen eines von der Probe ausgehenden Messsignals mittels Mehr-Photonen-Anregung realisiert werden. Eine derartige Ausgestaltung bietet sich insbesondere bei speziellen Anwendungen an, beispielsweise wenn es gilt, ein Bleichen der Probe zu verhindern.It can be provided that the transition from the first state to the second state is realized by means of multi-photon absorption. Alternatively or additionally, the readout of a measuring signal emanating from the sample can be realized by means of multi-photon excitation. Such a configuration is particularly suitable for special applications, for example, when it comes to prevent bleaching of the sample.

Im Rahmen einer weiter bevorzugten Ausführung ist vorgesehen, dass das optische Signal und ein Testsignal zum Auslesen der ersten Zustände jeweils mittels gepulster Lichtquellen erzeugt werden. Dabei erweist sich eine Synchronisation der gepulsten Lichtquellen als vorteilhaft.Within the scope of a further preferred embodiment, it is provided that the optical signal and a test signal for reading out the first states are respectively generated by means of pulsed light sources. In this case, a synchronization of the pulsed light sources proves to be advantageous.

Die Beleuchtungslichtquelle zum Erzeugen des optischen Signals kann mit mindestens einer weiteren Lichtquelle kombiniert sein, wobei die weitere Lichtquelle zum Auslesen des von der Probe ausgehenden Messsignals und/oder zur Erzeugung eines Schaltsignals zum Induzieren des ersten Zustandes dienen könnte. Insbesondere könnte die weitere Lichtquelle die Probe ganz oder teilweise ausleuchten, wobei eine linienförmige Ausleuchtung bevorzugt ist.The illumination light source for generating the optical signal may be combined with at least one further light source, wherein the further light source could be used to read out the measurement signal emanating from the sample and / or to generate a switching signal to induce the first state. In particular, the further light source could illuminate the sample completely or partially, with a line-shaped illumination being preferred.

Zudem könnte die Fokuslinie des optischen Schaltsignals mit einer weiteren Linie räumlich überlagert sein. In besonders vorteilhafter Weise ist die räumliche Überlagerung derart gewählt, dass die Intensitäts-Nullstelle der Fokuslinie des optischen Signals mit dem Maximum einer Linie zum Auslesen des von der Probe ausgehenden Messsignals räumlich überlagert ist. Je nach Anwendung kann dabei jeder Linie eine eigene Scanneinrichtung, vorzugsweise in Form eines Scannspiegels, zugeordnet sein, oder die Linien werden gemeinsam mit einer einzigen Scanneinrichtung gescannt.In addition, the focus line of the optical switching signal could be spatially superposed with another line. In a particularly advantageous manner, the spatial superposition is selected such that the intensity zero point of the focal line of the optical signal is spatially superimposed with the maximum of a line for reading out the measurement signal emanating from the sample. Depending on the application can do it each line has its own scanning device, preferably in the form of a scanning mirror, or the lines are scanned together with a single scanning device.

Um die Geschwindigkeitsvorteile bei der Bilderzeugung voll auszunutzen, wird die Scannrichtung in idealer Weise auf die jeweilige Verlaufsrichtung der Pupillenlinie abgestimmt. In weiter vorteilhafter Weise kann eine Liniendetektion des von der Probe ausgehenden Messsignals mittels eines Zeilendetektors durchgeführt werden. Der Zeilendetektor kann beispielsweise als CCD-Zeile ausgeführt sein, Der Einsatz eines EMCCDs oder einer APD (Avalanche Photodiode) ist ebenfalls denkbar.In order to make full use of the speed advantages in the image generation, the scanning direction is ideally matched to the respective course direction of the pupil line. In a further advantageous manner, a line detection of the measuring signal emanating from the sample can be carried out by means of a line detector. The line detector can be designed, for example, as a CCD line. The use of an EMCCD or an APD (avalanche photodiode) is likewise conceivable.

Im Hinblick auf eine Erhöhung der Auflösung auch entlang der optischen Achse ist die Detektorzeile bevorzugt konfokal zur Fokuslinie angeordnet. Konkret kann die Detektorzeile dabei in Detektionsrichtung hinter den Scanneinrichtungen (descannte Detektion) oder vor den Scanneinrichtungen (nicht descannte Detektion) angeordnet sein.With regard to increasing the resolution along the optical axis as well, the detector row is preferably arranged confocally to the focal line. Specifically, the detector line can be arranged in the detection direction behind the scanning devices (descanned detection) or in front of the scanning devices (non-descanned detection).

In besonders vorteilhafter Weise wird das beschriebene Mikroskop zum optisch induzierten Übergang von Farbstoffmolekülen zwischen verschiedenen Molekülzuständen eingesetzt, die sich in mindestens einer optischen Eigenschaft voneinander unterscheiden, So kann das Mikroskop beispielsweise zum Induzieren eines Übergangs zwischen den Zuständen einer Trans-Cis-Isomerisierung oder zum Schalten von photochromen Farbstoffen eingesetzt werden. Des Weiteren ist ein Einsatz zum Transfer von Farbstoffmolekülen in deren Triplettzustand im Rahmen eines GSD-Verfahrens (Ground State Depletion) möglich. Schließlich bietet sich die Durchführung von TED-Verfahren an.In a particularly advantageous manner, the described microscope is used for the optically induced transition of dye molecules between different molecular states that differ in at least one optical property. For example, the microscope can induce a transition between the states of a trans-cis isomerization or switching be used by photochromic dyes. Furthermore, a use for the transfer of dye molecules in their triplet state in the context of a GSD method (ground state depletion) is possible. Finally, the implementation of TED method offers.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Mikroskops zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Probe zu verweisen. In Verbindung mit Erläuterungen der bevorzugten Ausführungsbeispiele anhand der Zeichnungen werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigenThere are now various possibilities for designing and developing the teaching of the present invention in an advantageous manner. For this purpose, on the one hand to the subordinate claims, on the other hand to refer to the following explanation of preferred embodiments of the method and the microscope according to the invention for spatially high-resolution examination of sample. In conjunction with explanations of the preferred embodiments with reference to the drawings, generally preferred embodiments and developments of the teaching are explained. In the drawing show

1 in einer schematischen Darstellung ein zyklisches Beleuchtungsschema eines Verfahrens zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, 1 1 is a schematic illustration of a cyclic lighting scheme of a method for spatially high-resolution examination of samples;

2 in einer schematischen Darstellung die Erzeugung einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit einem einzigen Intensitätsmaximum, 2 in a schematic representation, the generation of a focus line with a cross-sectional profile with a single intensity maximum,

3 in einer schematischen Darstellung die erfindungsgemäße Erzeugung einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitäts-Nullstelle mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima, 3 1 shows a schematic representation of the generation according to the invention of a focal line with a cross-sectional profile with at least one intensity zero point with laterally adjacent intensity maxima,

4 in einer schematischen Darstellung den Aufbau eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops und 4 in a schematic representation of the structure of a first embodiment of a microscope according to the invention and

5 in einer schematischen Darstellung den Aufbau eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops. 5 in a schematic representation of the structure of a second embodiment of a microscope according to the invention.

1 zeigt schematisch einen zyklischen Beleuchtungsvorgang, wie er zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben jenseits der beugungslimitierten Auflösungsgrenze eingesetzt wird. Gemäß 1a wird zunächst im gesamten zu erfassenden Probenraum P eine in der Probe 1 bereitgestellte Substanz, die wiederholt von einem ersten Zustand Z1 in einen zweiten Zustand Z2 überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände Z1, Z2 in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, mittels eines Schaltsignals 2 in den ersten Zustand Z1 gebracht. Im konkret dargestellten Ausführungsbeispiel handelt es bei dem ersten Zustand Z1 um einen fluoreszierenden Zustand A und bei dem zweiten Zustand Z2 um einen nicht fluoreszierenden Zustand B. Bei der in der Probe 1 bereitgestellten Substanz handelt es sich in dem konkret dargestellten Beispiel um eine photochrome Substanz, deren Moleküle durch Bestrahlung mit Licht einer ersten Wellenlänge, dem Schaltsignal 2, in den fluoreszenzfähigen Zustand A gebracht werden. Dies geschieht in idealer Weise durch Beleuchtung durch ein Objektiv 3 mit einer einfachen Beleuchtungslinie des Schaltsignals 2 im Probenraum P, wie es für sich gesehen aus dem Stand der Technik bekannt ist. Alternativ kann die Probe 1 auch im gesamten Probenraum P bestrahlt werden. 1 schematically shows a cyclic lighting process, as it is used for spatially high-resolution examination of samples beyond the diffraction-limited resolution limit. According to 1a is first in the entire to be detected sample space P in the sample 1 provided substance which is repeatedly transferred from a first state Z1 in a second state Z2, wherein the first and the second states Z1, Z2 differ in at least one optical properties of each other, by means of a switching signal 2 brought into the first state Z1. In the specific embodiment shown, the first state Z1 is a fluorescent state A and the second state Z2 is a non-fluorescent state B. In the case of the sample in the sample 1 Provided substance in the example shown specifically is a photochromic substance whose molecules are irradiated by light of a first wavelength, the switching signal 2 be brought into the fluorescent state A This is done ideally by illumination through a lens 3 with a simple illumination line of the switching signal 2 in the sample space P, as is known per se from the prior art. Alternatively, the sample 1 be irradiated throughout the sample space P.

Im Falle der Grundzustands-Entvölkerung (Ground State Depletion, GSD) findet der Übergang in den fluoreszenzfähigen (Singlet)-Zustand üblicherweise spontan statt. Das Einstrahlen optischer Schaltsignale erübrigt sich somit in diesem Fall, es müssen lediglich Wartezeiten von typischerweise 1 bis 100 μs (teilweise auch ein wenig länger) berücksichtigt werden.In the case of ground state depletion (GSD), the transition to the fluorescent (singlet) state usually occurs spontaneously. The irradiation of optical switching signals is thus unnecessary in this case, it must only waiting times of typically 1 to 100 microseconds (sometimes a little longer) are taken into account.

In einem nächsten Schritt – dargestellt in 1b – wird Licht einer anderen Wellenlänge, das sogenannte optische Signal 4, auf den zu erfassenden Probenbereich P aufgebracht. Dies geschieht in Form einer Doppellinie 9 mit dazwischen liegender Intensitäts-Nullstelle 5. Das optische Signal 4 induziert gesättigt den Übergang A → B in allen mit Licht des optischen Signals 4 beleuchteten Bereichen 6. Mit anderen Worten verbleibt lediglich in unmittelbarer Umgebung der Intensitäts-Nullstelle 5 ein eng definierter Bereich der Substanz im Zustand A. Dieser verbleibende Bereich der Substanz in Zustand A kann viel kleiner sein als die beugungslimitierten Strukturen. Die Größe des im Zustand A verbleibenden Bereichs hängt ganz maßgeblich von der Qualität des Intensitätsminimums 5 und damit vom erreichten Sättigungsgrad des Übergangs A → B ab.In a next step - shown in 1b - becomes light of a different wavelength, the so-called optical signal 4 applied to the sample area P to be detected. This happens in the form of a double line 9 with intervening Intensity zero 5 , The optical signal 4 induces saturated transition A → B in all with light of the optical signal 4 illuminated areas 6 , In other words, it remains only in the immediate vicinity of the intensity zero point 5 a narrowly defined region of the substance in state A. This remaining region of the substance in state A can be much smaller than the diffraction-limited structures. The size of the area remaining in state A depends very much on the quality of the intensity minimum 5 and thus from the achieved saturation level of the transition A → B.

In 1c ist schematisch der Auslesevorgang des Zustands A dargestellt. Dazu wird ein optisches Testsignal 7 so in den zu erfassenden Probebereich P eingestrahlt, dass der gemäß 1b präparierte Bereich, in dem die Substanz in Zustand A verblieben ist, erfasst wird. Das Testsignal 7 wird in bevorzugter Weise ebenfalls linienförmig eingestrahlt. Dabei wird eine einfache Linie mit einem Maximum erzeugt, wobei das Maximum mit der Intensitäts-Nullstelle 5 des optischen Signals 4 räumlich überlagert wird. Dementsprechend kann auch die Detektion bevorzugt linienförmig erfolgen, bspw. durch einen konfokal angeordneten Zeilendetektor, beispielsweise in Form einer CCD-Zeile.In 1c is schematically illustrated the readout process of the state A. This is an optical test signal 7 so irradiated in the sample area P to be detected that according to 1b prepared area in which the substance remains in state A, is detected. The test signal 7 is also irradiated in a linear manner in a preferred manner. In this case, a simple line is generated with a maximum, the maximum with the intensity zero point 5 of the optical signal 4 spatially superimposed. Accordingly, the detection can preferably be linear, for example by a confocal line detector, for example in the form of a CCD line.

Der in den 1a bis c dargestellte Zyklus wird wiederholt, wobei das Linienmuster bei jeder Wiederholung etwas weiter geschoben wird. Auf diese Weise lässt sich der gesamte zu erfassende Probenbereich P mit einer Auflösung im Subdiffraktionsbereich abbilden.The in the 1a to c is repeated, with the line pattern pushed a little further at each repetition. In this way, the entire sample area P to be detected can be imaged with a resolution in the subdiffraction area.

2 zeigt schematisch die Erzeugung einer einzelnen Linienstruktur des Beleuchtungslichts zum Auslesen der Zustände A, d. h. einer einfachen Linie mit einem Maximum, das – wie oben ausgeführt – mit der Intensitäts-Nullstelle 5 der Fokuslinie 10 des optischen Signals 4 überlagert werden kann. Gemäß 2a wird das Beleuchtungslicht durch eine geeignete Optik 11 zunächst linienförmig in einer zur Fokusebene FE konjugierten Ebene FE abgebildet. Mittels einer Abbildungslinse 12 wird die Beleuchtungslinie kohärent in die Pupillenebene PE eines Objektivs 13 fokussiert, mit dem das Beleuchtungslicht in die Probe 1 fokussiert wird. im dargestellten Beispiel verläuft die Beleuchtungslinie in x-Richtung. Dementsprechend wird die Pupille PE – wie in 2b gezeigt – zentralsymmetrisch linienförmig in y-Richtung ausgeleuchtet (Pupillenlinie 14). In der Fokusebene FE des Objektivs 13 entsteht dabei – wie in 2c gezeigt – ebenfalls eine linienförmige Lichtstruktur, die senkrecht zur Pupillenlinie 14 in x-Richtung steht (Fokuslinie 15) und eine Abbildung der Linie in der zur Fokusebene FE konjugierten Ebene FE' darstellt. Der Querschnitt der Fokuslinie 15 hat eine beugungsbegrenzte Ausdehnung, wenn die Pupillenlinie 14 den gesamten Pupillendurchmesser erfasst. Die Querschnittsausdehnung der Fokuslinie 15 ist beugungsbegrenzt etwa 1,4fach größer als die einer beugungsbegrenzten Punktquelle (Airy-Scheibe). 2 schematically shows the generation of a single line structure of the illumination light for reading the states A, ie a simple line with a maximum, which - as stated above - with the intensity zero point 5 the focus line 10 of the optical signal 4 can be superimposed. According to 2a the illumination light is through a suitable optics 11 initially imaged linearly in a plane FE to the focal plane FE. By means of an imaging lens 12 the illumination line becomes coherent in the pupil plane PE of a lens 13 focused, with which the illumination light into the sample 1 is focused. In the example shown, the illumination line runs in the x direction. Accordingly, the pupil PE - as in 2 B shown - centrally symmetrical line in the y-direction illuminated (pupil line 14 ). In the focal plane FE of the lens 13 arises here - as in 2c also shown a linear light structure perpendicular to the pupil line 14 in x-direction (focus line 15 ) and an image of the line in the plane FE 'conjugate to the focal plane FE'. The cross section of the focus line 15 has a diffraction-limited extension when the pupil line 14 recorded the total pupil diameter. The cross-sectional dimension of the focus line 15 is diffraction-limited about 1.4 times larger than that of a diffraction-limited point source (Airy disk).

Die in 2 lediglich schematisch angedeutete Optik 11 kann in verschiedenen Farmen realisiert sein. So kann eine linienförmige Beleuchtung von FE' bzw. der Pupille PE beispielsweise durch Abbildung einer Spaltblende oder durch Fokussieren eines aufgeweiteten Beleuchtungslichtstrahls mittels einer Zylinderlinse oder einer Powell-Linse erreicht werden. Die Verwendung einer Powell-Linse bietet den Vorteil, dass die erzeugte linienförmige Lichtstruktur eine besonders homogene Lichtverteilung aufweist. Eine weitere Variante ist die Beleuchtung über einen nur linienförmig reflektierenden Strahlteiler, der in einer zur Pupillenebene PE konjugierten Ebene des Mikroskops angeordnet ist. Entscheidend für die Erzeugung einer linienförmigen Beleuchtung der Probe 1 in x-Richtung (20) ist prinzipiell nur die kohärente linienförmige Beleuchtung der Pupille PE in y-Richtung (2b).In the 2 only schematically indicated optics 11 can be realized in different farms. Thus, a linear illumination of FE 'or of the pupil PE can be achieved, for example, by imaging a slit or by focusing an expanded illuminating light beam by means of a cylindrical lens or a Powell lens. The use of a Powell lens offers the advantage that the generated line-shaped light structure has a particularly homogeneous light distribution. A further variant is the illumination via a beam divider which only reflects in a linear manner and which is arranged in a plane of the microscope conjugate to the pupil plane PE. Crucial for the generation of a linear illumination of the sample 1 in X direction ( 20 ) is in principle only the coherent linear illumination of the pupil PE in the y-direction ( 2 B ).

3 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel zur Erzeugung einer erfindungsgemäßen Fokuslinie 10 mit zentraler Nullstelle 5 im Querschnitt und seitlich begrenzenden Maxima 9. Dazu wird eine Phasenmodulation des optischen Signals 4 entlang der Pupillenlinie 14 realisiert. in 3a ist die linienförmige Ausleuchtung der Pupille PE dargestellt. Entlang der Pupillenlinie 14 ist im Pupillenmittelpunkt ein Phasensprung von einer halben Wellenlänge eingeführt, so dass die eine Hälfte der Linie 14 gegenüber der anderen Hälfte der Linie 14 um einen halben Wellenzug verzögert ist. Dies ist in 3a durch die unterschiedlich schraffierten Bereiche angedeutet. Diese Phasenmodulation hat zur Folge, dass in der Fokalebene FE eine Doppellinie 9 mit zentraler Intensitäts-Nullstelle 5 entsteht, wie dies in 3b dargestellt ist. Prinzipiell können auch andere Phasenmodulationen zu Strukturen mit einem derartigen Zentralminimum führen. So erzeugt jede zentralsymmetrische Phasenmodulation, welche die Eigenschaft hat, das 50% der Pupillenlinie 14 um einen halben Wellenzug verzögert werden, eine orthogonal zur Pupillenlinie 14 ausgerichtete Fokuslinie 10 mit einem Zentralminimum im Querschnittsprofil. Allerdings wird der Querschnitt der Fokuslinie 10 dabei komplizierter und damit im Allgemeinen aus mehreren Maxima und Minima bestehen. 3 schematically shows an embodiment for generating a focus line according to the invention 10 with central zero 5 in cross-section and laterally limiting maxima 9 , For this purpose, a phase modulation of the optical signal 4 along the pupil line 14 realized. in 3a the line-shaped illumination of the pupil PE is shown. Along the pupil line 14 is introduced at the pupillary center a phase jump of half a wavelength, so that one half of the line 14 opposite the other half of the line 14 delayed by half a wave train. This is in 3a indicated by the differently hatched areas. This phase modulation has the consequence that in the focal plane FE a double line 9 with central intensity zero 5 arises, as in 3b is shown. In principle, other phase modulations can lead to structures with such a central minimum. Thus, each center-symmetric phase modulation having the property produces 50% of the pupil line 14 delayed by half a wave, one orthogonal to the pupil line 14 aligned focus line 10 with a central minimum in the cross-sectional profile. However, the cross section becomes the focus line 10 more complicated and thus generally consist of several maxima and minima.

Wie in 3a durch die dargestellten Pfeile angedeutet, ist das Licht senkrecht zur Pupillenlinie 14, d. h. in x-Richtung, polarisiert. Auf diese Weise wird erreicht, dass in der Eintrittspupille 14 nur Polarisationsvektoren mit reiner Tangentialkomponente auftreten. Beim Durchlaufen nachfolgender Optiken depolarisieren diese wesentlich schwächer in z-Richtung, d. h. in Strahlrichtung, als beispielsweise Polarisationsvektoren mit (in Bezug auf die Pupille) radialen Komponenten.As in 3a indicated by the illustrated arrows, the light is perpendicular to the pupil line 14 , ie in the x-direction, polarized. In this way it is achieved that in the entrance pupil 14 only polarization vectors with pure tangential component occur. When passing through subsequent optics depolarize this much weaker in the z-direction, ie in the beam direction, as for example Polarization vectors with (in relation to the pupil) radial components.

4 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops. Bei der in 4a dargestellten Ausführungsform wird kohärentes Beleuchtungslicht einer Strahlquelle 16 durch eine geeignete Optik 11 linienförmig in eine Zwischenbildebene ZB3 des Mikroskops fokussiert. Die Linie verläuft dabei in x-Richtung. Die Optik 11 zur Realisierung einer linienförmigen Lichtstruktur ist als Zylinderlinse 17 ausgeführt. Das Zwischenbild ZB3 wird über eine Linse 18 in die zur Pupille P1 des Mikroskopobjektivs 13 konjugierte Pupillenebene P2 abgebildet, wo die Lichtverteilung linienförmig in y-Richtung verläuft. 4 schematically shows an embodiment of a microscope according to the invention. At the in 4a illustrated embodiment, coherent illumination light of a beam source 16 through a suitable optics 11 focussed in an intermediate image plane ZB3 of the microscope. The line runs in the x-direction. The optics 11 to realize a linear light structure is as a cylindrical lens 17 executed. The intermediate image ZB3 is transmitted via a lens 18 into the pupil P1 of the microscope objective 13 Conjugated pupil plane P2 shown where the light distribution is linear in the y-direction.

In der Pupillenebene P3 des Mikroskops ist ein Strahlteiler 19 mit einer streifen, förmigen Reflexionsschicht RS angeordnet. Der Strahlteiler 19 ist nur im Bereich der Linie RS reflektierend, so dass das rückwärts Orts zu detektierende Messsignal 8, welches die gesamte Pupillenebene P3 ausleuchtet, fast vollständig transmittiert wird.In the pupil plane P3 of the microscope is a beam splitter 19 arranged with a strip, shaped reflection layer RS. The beam splitter 19 is reflective only in the area of the line RS, so that the backward location to be detected measurement signal 8th , which illuminates the entire pupil plane P3, is almost completely transmitted.

Die Pupille P3 wird durch Optiken 20 und 18 auf einen Y-Scanner 21 abgebildet, der den Strahl zur Bildaufnahme in y-Richtung scannen kann. Dieser befindet sich ebenfalls in der Pupillenebene P2. Die weitere Abbildung erfolgt über das Scannokular 22 in ein Zwischenbild ZB1, wo wieder ein Lichtstreifen in x-Richtung entsteht. Dieser wird über die Tubuslinse 23 und das Objektiv 13 in die Fokusebene FE im Probenraum abgebildet. In der Pupille P1 des Objektivs 13 entsteht dabei eine linienförmige Lichtverteilung in y-Richtung analog zur Pupillenebene P3, in der sich der Strahlteiler 19 befindet. In der Fokalebene FE entsteht ein (beugungsbegrenzter) Beleuchtungsstreifen analog zur Zwischenbildebene ZB3.The pupil P3 is made by optics 20 and 18 on a Y-scanner 21 imaged, which can scan the beam for image acquisition in the y-direction. This is also located in the pupil plane P2. The further imaging is done via the scan eyepiece 22 in an intermediate image ZB1, where again a light strip in the x-direction is formed. This is via the tube lens 23 and the lens 13 imaged in the focal plane FE in the sample space. In the pupil P1 of the lens 13 In this case, a line-shaped light distribution in the y-direction arises analogously to the pupil plane P3, in which the beam splitter 19 located. In the focal plane FE creates a (diffraction-limited) illumination strip analogous to the intermediate image plane ZB3.

Zur Erzeugung der Fokuslinie 10 mit zentraler Intensitäts-Nullstelle 5 und seitlichen Intensitäts-Maxima 9 wird erfindungsgemäß eine Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie 14 durchgeführt In dem dargestellten Ausführungsbeispiel wird dazu in der Pupille P3 ein Phasensprung eingeführt, indem ein Teil des Strahlteilers 19 mit einer phasenverzögernden Struktur PV versehen wird, welche die Phase des Lichts um einen halben Wellenzug verzögert. Die hier transparent ausgeführte Beschichtung PV deckt dabei wie in 4b gezeigt – die eine Hälfte der über den gesamten Pupillendurchmesser verlaufenden Reflexionsschicht RS ab. Beim Durchlaufen der Beschichtung PV wird das Licht aufgrund des Brechungsindex der Schicht verzögert gegen das Licht, das unbeschichtete Stellen (also Luft) durchläuft. Die Beschichtung PV kann z. B. aus einem Dielektrikum wie Magnesiumfluorit oder Siliziumdioxid hergestellt sein und auf die Reflexionsschicht RS aufgedampft werden. Auch eine Struktur basierend auf einer Flüssigkristall-Schicht ist denkbar.To generate the focus line 10 with central intensity zero 5 and lateral intensity maxima 9 According to the invention, a phase modulation along the pupil line 14 In the illustrated embodiment, for this purpose, a phase jump is introduced in the pupil P3, by a part of the beam splitter 19 is provided with a phase-retarding structure PV, which delays the phase of the light by half a wave train. The transparent PV coating here covers as in 4b shown - one half of the over the entire pupil diameter extending reflection layer RS. When passing through the coating PV, the light is delayed due to the refractive index of the layer against the light that passes through uncoated areas (ie air). The coating PV can z. B. be made of a dielectric such as magnesium fluoride or silicon dioxide and vapor-deposited on the reflective layer RS. Also, a structure based on a liquid crystal layer is conceivable.

Eine alternative Realisierung wäre die Einfügung eines phasenverzögernden Elements in einer weiteren Pupillenebene, die durch weitere Abbildungslinsen erzeugt werden kann (hier nicht dargestellt). In dieser weiteren Pupillenebene könnten dann phasenverzögernde Elemente, wie Substrate mit dielektrischen Beschichtungen, Phasenmodulatoren auf Basis von Flüssigkristallen oder achromatische Phasenfilter angeordnet werden. Entscheidend ist nur die Einführung einer Optik mit der beschriebenen phasenverzögernden Eigenschaft, wobei diese in idealer Weise in oder nahe einer Pupillenebene angeordnet ist.An alternative implementation would be the insertion of a phase-retarding element in another pupil plane, which can be generated by further imaging lenses (not shown here). Phase-retarding elements such as substrates with dielectric coatings, phase modulators based on liquid crystals or achromatic phase filters could then be arranged in this further pupil plane. The decisive factor is only the introduction of an optical system with the described phase-delaying property, which is ideally located in or near a pupil plane.

Das Detektionslicht (im Allgemeinen Fluoreszenz) wird als Messsignal 8 durch das Objektiv 13, die Tubuslinse 23, das Scann-Okular 22, den Scanner 21 (Descanned Detection), die Linsen 18 und 20, einen Filter 24 zur spektralen Filterung und eine Detektorlinse 25 auf einen konfokal angeordneten Zeilendetektor 26 abgebildet. Auch eine Non-Descanned-Detektion ist denkbar, wobei dabei der Detektor 26 zwischen Scanner 21 und Objektiv 13 angeordnet wäre.The detection light (generally fluorescence) is used as a measurement signal 8th through the lens 13 , the tube lens 23 , the scanning eyepiece 22 , the scanner 21 (Descanned Detection), the lenses 18 and 20 , a filter 24 for spectral filtering and a detector lens 25 on a confocal arranged line detector 26 displayed. Even a non-descanned detection is conceivable, while the detector 26 between scanners 21 and lens 13 would be arranged.

In 5 ist – schematisch – eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mikroskops dargestellt, wobei der Aufbau konzeptionell dem Aufbau des Mikroskops gemäß 4 ähnelt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind die Strahlverläufe nicht dargestellt. In der Pupillenebene P3, die linienförmig ausgeleuchtet wird (Pupillenlinie 14 in y-Richtung), ist – im Unterschied zur Ausführung gemäß 4 – kein Strahlteiler 19 angeordnet, der gleichzeitig als (räumlicher) Strahlteiler und als phasenverzögendes Element fungiert. Vielmehr sind beide Funktionen separiert, indem der Strahlteiler 19 nunmehr ausschließlich als räumlicher Strahlteiler fungiert, wohingegen die Phasenverzögerung durch eine zusätzlich eingeführte phasenverzögernde Optik 27 erfolgt. Bei der phasenverzögernden Optik 27, die ebenfalls in oder nahe der Pupille P3 angeordnet ist, kann es sich wiederum um ein Substrat handeln, das räumlich strukturiert mit einer phasenverzögernden, transparenten Beschichtung PV (Dielektrikum) versehen ist. In der in 5b dargestellten Ausführung ist die Optik 27 kreisförmig ausgebildet, wobei der in negativer y-Richtung liegende Halbkreis mit der phasenverzögernden Beschichtung PV versehen ist. Des Weiteren kommen wieder Phasenmodulatoren auf Basis von Flüssigkristallen oder achromatische Phasenfilter, Arrays mit beweglichen Mikrospiegeln oder andere deformierbare Spiegel in Frage. Als Strahlteiler 19 zur Trennung von Beleuchtungslicht und Detektionslicht kommt ein konventioneller dichroitischer Strahlteiler 28, bspw. in Form eines Kantenfilters, zum Einsatz. Der dichroitische Strahlteiler 28 ist der phasenverzögernden Optik 27 nachgeschaltet.In 5 is shown - schematically - another embodiment of a microscope according to the invention, the structure conceptually according to the structure of the microscope according to 4 similar. For reasons of clarity, the beam paths are not shown. In the pupil plane P3, which is illuminated linearly (pupil line 14 in the y-direction), unlike the embodiment according to FIG 4 - no beam splitter 19 arranged, which acts simultaneously as a (spatial) beam splitter and phase-delaying element. Rather, both functions are separated by the beam splitter 19 now acts exclusively as a spatial beam splitter, whereas the phase delay by an additionally introduced phase-delay optics 27 he follows. In the phase-delay optics 27 , which is also arranged in or near the pupil P3, may in turn be a substrate, which is spatially structured with a phase-retarding transparent coating PV (dielectric). In the in 5b illustrated embodiment is the optics 27 formed circular, wherein the lying in the negative y-direction semicircle is provided with the phase-retardant coating PV. Furthermore, phase modulators based on liquid crystals or achromatic phase filters, arrays with movable micromirrors or other deformable mirrors are possible again. As a beam splitter 19 A conventional dichroic beam splitter is used to separate illuminating light and detection light 28 , for example in the form of an edge filter used. The dichroic beam splitter 28 is the phase-delay optics 27 downstream.

Hinsichtlich weiter vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Mikroskops werde zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.With regard to further advantageous embodiments of the method according to the invention and of the microscope according to the invention reference is made to avoid repetition to the general part of the specification and to the appended claims.

Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränkt.Finally, it should be expressly understood that the embodiments described above are only for the purpose of discussion of the claimed teaching, but this is not limited to the embodiments.

Claims

Method for spatially high-resolution examination of samples, wherein the sample to be examined ( 1 ) through a lens ( 3 . 13 ) and the sample ( 1 ) comprises a substance that is repeatedly convertible from a first state (Z1, A) to a second state (Z2, B), wherein the first and the second states (Z1, A; Z2, B) are in at least one optical property differ from one another, comprising the steps of first bringing the substance in a sample region (P) to be detected into the first state (Z1, A) and by means of an optical signal ( 4 ) the second state (Z2, B) is induced, wherein within the sample region (P) to be detected spatially limited subregions are deliberately recessed, and wherein the optical signal ( 4 ) in the form of a focus line ( 10 ) having a cross-sectional profile with at least one intensity zero point ( 5 ) with laterally adjacent intensity maxima ( 9 ), characterized in that the focus line ( 10 ) by means of a line-shaped illumination in one of the pupil (P1) of the objective ( 3 . 13 ) conjugated pupil plane (P3) - pupil line ( 14 ) And by phase modulation along the pupil line ( 14 ), wherein the phase modulation is performed in such a way that along the pupil line ( 14 ) one or more phase jumps are introduced.

A method according to claim 1, characterized in that a phase jump is introduced in the pupil center.

A method according to claim 2, characterized in that the introduced phase jump corresponds to the length of half a wave train.

Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that along the pupil line ( 14 ) several phase jumps are introduced by half a wave train.

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the phase modulation along the pupil line ( 14 ) is realized by means of a liquid-based spatial phase modulator arranged in an intermediate image of the pupil (P1).

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the phase modulation along the pupil line ( 14 ) by means of an optical component arranged in an intermediate image of the pupil (P1) ( 19 . 27 ) is realized with phase-retarding optical coating (PV).

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the phase modulation along the pupil line ( 14 ) is realized by means of a in an intermediate image of the pupil (P1) arranged optical component, wherein the component first generates a phase jump by total reflection and then a reflection on a metal layer.

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the phase modulation along the pupil line ( 14 ) is realized by means of an optical element arranged in an intermediate image of the pupil (P1), the element having one or more deformable and / or movable mirrors and / or mirror elements.

Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that the pupil line ( 14 ) by focusing an illumination light beam of an illumination light source with a cylindrical lens ( 17 ) or a Powell lens.

Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that the pupil line ( 14 ) is produced by imaging a slit diaphragm in the pupil plane.

Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that the pupil line ( 14 ) is generated by means of holographic elements,

Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that the pupil line ( 14 ) is coupled by means of an Achrogate filter in the beam path.

Method according to claim 12, characterized in that the phase modulation along the pupil line ( 14 ) is realized by means of additional Phasenverzögernder layers on the Achrogate filter.

Method according to one of claims 1 to 13, characterized in that as Illumination light source for providing the optical signal ( 4 ) a laser is used.

Method according to one of claims 1 to 14, characterized in that the light of the optical signal ( 4 ) perpendicular to the pupillary line ( 14 ) is polarized.

Method according to one of claims 1 to 15, characterized in that the focus line ( 10 ) is generated successively in different spatial directions.

A method according to claim 16, characterized in that the sample area to be detected (P) several times each corresponding to the respective spatial direction of the focus line ( 10 ) is scanned.

A method according to claim 17, characterized in that the individual images are mathematically combined to form an overall image.

Method according to one of claims 1 to 18, characterized in that the transition from the first state (Z1, A) to the second state (Z2, B) is realized by means of multi-photon absorption.

Method according to one of claims 1 to 19, characterized in that the reading of the sample ( 1 ) outgoing measuring signal ( 8th ) is realized by means of multi-photon excitation.

Method according to one of claims 1 to 20, characterized in that the optical signal ( 4 ) and a test signal ( 7 ) are generated for reading the first state (Z1, A) by means of pulsed light sources.

A method according to claim 21, characterized in that the pulsed light sources are synchronized.

Microscope, in particular laser scanning fluorescence microscope, for spatially high-resolution examination of samples and in particular for carrying out a method according to one of claims 1 to 22, wherein the sample to be examined ( 1 ) comprises a substance which is repeatedly convertible from a first state (Z1, A) to a second state (Z2, B), wherein the first and second states (Z1, A; Z2, B) are in at least one optical property differ from each other, comprising a beam source for providing a switching signal ( 2 ), with which the substance in a sample region (P) to be detected can first be brought into the first state (Z1, A), as well as an additional beam source ( 16 ) for providing an optical signal ( 4 ), with which the second state (Z2, B) is inducible, such that within the sample region (P) to be detected spatially limited subregions are deliberately recessed, wherein the optical signal ( 4 ) a focus line ( 10 ) having a cross-sectional profile with at least one intensity zero point ( 5 ) with laterally adjacent intensity maxima ( 9 ), characterized by an optical component ( 11 ), which has a line of illumination in one of the pupil (P1) of the microscope objective ( 3 . 13 ) conjugated pupil plane (P3) - pupil line ( 14 ) - and a phase-modulating element ( 19 . 27 ), which is used to generate the cross-sectional profile of the focus line ( 10 ) one or more phase jumps along the pupil line ( 14 ).

Microscope according to claim 23, characterized in that the optical component ( 11 ) for generating the pupil line ( 14 ) and the phase modulating element ( 19 . 27 ) are designed as a structural unit.

Microscope according to claim 23, characterized in that the optical component ( 11 ) for generating the pupil line ( 14 ) and the phase modulating element ( 19 . 27 ) are each arranged as separate units in the illumination beam path.

Microscope according to one of Claims 23 to 25, characterized in that the phase-modulating element ( 19 . 27 ) is embodied as a liquid-based spatial phase modulator arranged in an intermediate image of the pupil (P1) or as a phase-retarding dielectric coating (PV) optical component.

Microscope according to one of claims 23 to 26, characterized in that the optical component ( 11 ) for generating the pupil line ( 14 ) as a cylindrical lens ( 17 ) and / or designed as a Powell lens and / or as a holographic element.

Microscope according to one of claims 23 to 27, characterized in that the illumination light source for generating the optical signal ( 4 ) is designed as a laser.

Microscope according to one of claims 23 to 28, characterized in that the illumination light source for generating the optical signal ( 4 ) with at least one further light source for reading out the sample ( 1 ) outgoing measuring signal ( 8th ) or to induce the first state ( 21 , A) is combined.

Microscope according to claim 29, characterized in that the further light source is the sample ( 1 ) wholly or partially, preferably linear, illuminated.

Microscope according to one of claims 23 to 30, characterized in that the focus line ( 10 ) of the optical signal ( 4 ) is spatially superimposed with another line.

Microscope according to claim 31, characterized in that the intensity zero point ( 5 ) of the focus line ( 10 ) of the optical signal ( 4 ) with the maximum of a line ( 15 ) for reading the from the sample ( 1 ) outgoing measuring signal ( 8th ) is spatially superimposed.

Microscope according to claim 31 or 32, characterized in that each line ( 10 . 15 ) own scanning device ( 21 ), preferably in the form of a scanning mirror.

Microscope according to claim 33, characterized in that the scanning direction is aligned with the course direction of the pupil line ( 14 ) matches.

Microscope according to one of Claims 23 to 34, characterized by a line detector ( 26 ) for line detection of the sample ( 1 ) outgoing measuring signal ( 8th ).

Microscope according to claim 35, characterized in that the line detector ( 26 ) as CCD line, as EMCCD or as APD.

Microscope according to claim 35 or 36, characterized in that the line detector ( 26 ) confocal to the focus line ( 10 ) is arranged.

Microscope according to one of Claims 35 to 37, characterized in that the line detector ( 26 ) in the detection direction behind the scanning device (s) ( 21 ) or in front of the scanning device (s) ( 21 ) is arranged.

Use of a microscope according to one of claims 23 to 38 for the optically induced transition of dye molecules between different molecular states which differ from one another in at least one optical property.