DE102004052115A1

DE102004052115A1 - Mikroorganismen zur Herstellung von Fettsäureestern, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

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Publication number: DE102004052115A1
Application number: DE102004052115A
Authority: DE
Inventors: Rainer Dr. Kalscheuer; Alexander Prof. Dr. Steinbüchel
Original assignee: Westfaelische Wilhelms Universitaet Muenster
Current assignee: Westfaelische Wilhelms Universitaet Muenster
Priority date: 2004-10-26
Filing date: 2004-10-26
Publication date: 2006-04-27

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroorganismen, die zur Herstellung von Fettsäureestern geeignet sind, sowie Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von mit kurzkettigen Alkoholen veresterten Fettsäuren unter Verwendung dieser Mikroorganismen, die unter anderem als Brennstoffe für Verbrennungsmotoren verwendet werden können.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroorganismen, die zur Herstellung von Fettsäureestern geeignet sind, sowie Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von mit kurzkettigen Alkoholen veresterten Fettsäuren unter Verwendung dieser Mikroorganismen, die unter anderem als Brennstoffe für Verbrennungsmotoren verwendet werden können.
Beschreibung des Standes der Technik
Da die Verwendung von Brennstoffen für Kraftfahrzeuge, die aus Erdöl raffiniert werden, mit hohen Umweltbelastungen verbunden ist und das zur Herstellung dieser Brennstoffe verwendete Erdöl ein immer knapperes Gut ist, wird bereits seid langem an der Entwicklung alternativer Brennstoffe gearbeitet, welche die traditionellen Brennstoffe für Kraftfahrzeuge ersetzen sollen.
Eine Alternative dazu ist die Verwendung von Brennstoffen, die aus pflanzlichen Ölen, tierischem Fett oder Fett aus Algen gewonnen werden. Diese Brennstoffe werden häufig als Biodiesel bezeichnet. Biodiesel haben den Vorteil, dass sie biologisch abbaubar und nicht-toxisch sind und bei der Verbrennung weniger Schadstoffe als herkömmliche Kraftstoffe produzieren.
Dieser Biodiesel entsteht auf Basis der in den Ölen und Fetten (Lipide) hauptsächlich vorhandenen Triglyceride (Bestandteil von mehr als 96%). Diese Triglyceride werden durch eine Basen katalysierte Umesterung mit Methanol oder auch Ethanol bei erhöhten Temperaturen (ca. 70°C) in Fettsäuremethylester bzw. Fettsäureethylester (engl. Abkürzung FAME bzw. FAEE: fatty acid methylene ester bzw. fatty acid ethylene ester) umgewandelt. Dabei entsteht als Nebenprodukt noch Glycerin, das nachträglich durch Phasentrennung und Destillation abgetrennt wird. In anderen Verfahren erfolgt die Umesterung mittels direkter saurer Katalyse oder die Fette und Öle werden erst in die freien Fettsäuren aufgespalten und dann mittels saurer Katalyse zu Estern umgewandelt. Durch diese Umesterung hat das Produkt eine deutlich geringere Viskosität als das Ausgangsprodukt und kann daher ohne Umrüstung der Motoren für die Verbrennungsmotoren der Kraftfahrzeuge verwendet werden.
Als Brennstoffe werden derzeit überwiegend Fettsäuremethyl- und -ethylester verwendet. Es gibt jedoch einige Nachteile bei der oben beschriebenen Herstellung dieser Brennstoffe. Zum einen wird bei der Herstellung der am häufigsten verwendeten Fettsäuremethylester Methanol verwendet. Methanol ist eine hoch toxische, leicht brennbare und sehr flüchtige Flüssigkeit, die leicht von der Haut absorbiert wird. Bei der Verwendung dieser Substanz bei der Herstellung von Fettsäuremethylestern sind daher besondere Sicherheitsvorkehrungen erforderlich. Außerdem wird Methanol selber ausschließlich aus den Rohstoffen CO₂/H₂ oder CO/H₂ hergestellt, die aus der Kohlevergasung stammen oder aus Erdgas und schweren Rückstandsölen gewonnen werden. Das Endprodukt Biodiesel ist also nur zum Teil ein reines Naturprodukt.
Des Weiteren erfordert die Herstellung der Ausgangsstoffe, wie z.B. Pflanzenöl, große Anbauflächen und die Anzucht und Ernte dieser Ausgangsstoffe stellen kostenintensive Schritte dar. Außerdem können bei der Umesterung mittels der oben beschriebenen Verfahren Verunreinigungen und Nebenprodukte im Biodiesel zurückbleiben, welche die Haltbarkeit und Arbeitsleistung der Motoren beeinflussen können (Peterson C.L., et al., 1995, „Performance and durability testing of diesel engines using ethyl and methyl ester fuels", Department of Biological and Agricultural Engineering, Universität Idaho, US, Studie für das National Biodiesel Board).
In DE 198 38 011 C2 wird in Ansätzen ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Biodiesel beschrieben. Dabei werden mittels Mikroorganismen verschiedener Gattungen auf Basis von Molke als einziger assimilierbarer Kohlenstoff- und Stickstoffquelle Triglyceride hergestellt, die anschließend zur Herstellung von Fettsäuremethylestern eingesetzt werden können. Allerdings stellt dieses Verfahren nur eine alternative Quelle für die Ausgangsstoffe der Umesterung zur Verfügung, ohne die oben genannten Problem der Verwendung von Methanol und der bei der Umesterung entstehenden Nebenprodukte zu berücksichtigen.
Demnach besteht im Stand der Technik ein großer Bedarf für ein günstiges und schnelles Herstellungsverfahren mit dem man alternative Brennstoffe für Verbrennungsmotoren von Kraftfahrzeugen herstellen kann.
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch Bereitstellung eines Mikroorganismus mit den Merkmalen gemäß Hauptanspruch.
Detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung
Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus, der zur Herstellung von langkettigen Fettsäuren, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, in der Lage ist, bereit. Dieser Mikroorganismus umfasst oder enthält unter anderem ein Nukleinsäuremolekül, das für eine prokaryotische Acyltransferase kodiert. Ein Mikroorganismus, dessen Stoffwechsel Coenzym-A-aktivierte Fettsäuren und kurzkettige Alkohole, wie z.B. Ethanol, zur Verfügung stellt, kann mit Hilfe der prokaryotischen Acyltransferase langkettige Fettsäuren, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, produzieren. Die Acyltransferase verestert dabei die Coenzym-A-aktivierten Fettsäurereste mit kurzkettigen Alkoholen. „Nukleinsäuremoleküle" im Sinne dieser Erfindung umfassen Nukleinsäuresequenzen (DNA und RNA), welche für die in dieser Erfindung beschriebenen Proteine kodieren.
Organismen, wie z.B. das gram(–) Bakterium E. coli oder Hefen, wie z.B. die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae stellen unter anaeroben Bedingungen Ethanol her. Dieses Ethanol kann zum Beispiel als Substrat für die prokaryotische Acyltransferase bei der Veresterung mit den Fettsäureresten dienen. Dabei entstehen Fettsäureethylester (FAEEs), die als Biodiesel für den Antrieb von Verbrennungsmotoren dienen können. Durch die Bereitstellung eines solchen Mikroorganismus ist erstmalig die mikrobielle Herstellung von Estern langkettiger Fettsäuren, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, möglich. Die Vorteile gegenüber dem Stand der Technik liegen dabei auf der Hand. Die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung können auf Basis einfacher biologisch abbaubarer Rohstoffe, wie zum Beispiel Kohlenhydraten, Stärke, Molke, Fructosan, Xylan, Saccharose, Glycerin, Melasse, Fettsäuren, Hemicellulose und Cellulose, wachsen.
Ein weiterer Vorteil ist, dass die Fettsäuresynthese als auch die anschließende Veresterung im Mikroorganismus stattfindet. Die für die Herstellung des veresterten Produktes benötigen Ausgangsstoffe werden vom Mikroorganismus bereitgestellt. Die Bereitstellung von kurzkettigen Alkoholen ist nicht notwendig, da der Stoffwechsel der Mikroorganismen kurzkettige Alkohole selber produzieren kann. Hefen produzieren zum Beispiel Ethanol sowie zusätzlich auch sogenannte Fuselalkohole, wie Propanol, Isopropanol, Butanol, Isobutanol, Amylalkohol und Isoamylalkohol. Neben der oben bereits beispielhaft genannten Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae können auch viele weitere Hefen, wie z.B. Schizosaccharomyces pombe, Candida shehatae, Pichia stipitis und Pachysolen tannophilus aber auch filamentöse Pilze wie Mucor circinelloides Ethanol produzieren. Ethanol tritt als Gärungsprodukt auch häufig im fermentativen Stoffwechsel von vielen strikt oder fakultativ anaeroben Bakterien in unterschiedlichem Maße auf. Besonders hohe Ethanolmengen werden von dem obligat gärenden, gram(–) Bakterium Zymomonas mobilis produziert. Dahingegen können solventogene Bakterien wie das gram(+), strikt anaerobe Bakterium Clostridium acetobutylicum Butanol sowie im geringen Umfang Isopropanol produzieren. Die von den beispielhaft genannten Mikroorganismen hergestellten kurzkettigen Alkohole können alle zur Herstellung der langkettigen Fettsäuren, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, verwendet werden.
Auch Mikroorganismen, deren Stoffwechsel keine kurzkettigen Alkohole oder diese nur in geringen Mengen produzieren, können zur Herstellung von langkettigen Fettsäuren, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, verwendet werden. Daher stellt die vorliegende Erfindung unter anderem einen Mikroorganismus zur Verfügung, der

– ein Nukleinsäuremolekül, das für eine prokaryotische Acyltransferase kodiert,
– ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Pyruvatdecarboxylase kodiert, und
– ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Alkoholdehydrogenase kodiert, umfasst.

Fakultativ anaerobe Bakterien wie die Mikroorganismen aus der Familie der Enterobacteriaceae stellen zwar bei der anaeroben Gärung Ethanol und 2,3-Butandiol her, produzieren diesen jedoch nicht unbedingt in Mengen, die für eine wirtschaftliche, biotechnologische Produktion von mit Ethanol oder 2,3-Butandiol veresterten Fettsäuren erforderlich wären. Durch das Einbringen der weiteren Nukleinsäuren ist es bei diesen Mikroorganismen außerdem möglich, durch die zusätzliche Expression einer Pyruvatdecarboxylase und einer Alkoholdehydrogenase die Produktion des Alkohols sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen durchzuführen.
Die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung produzieren mit kurzkettigen Alkoholen veresterte langkettige Fettsäuren, wobei die langkettigen Fettsäuren gesättigte und einfach sowie mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit Kettenlängen von C₁₀ bis C₂₂ oder bevorzugt mit Kettenlängen von C₁₄ bis C₂₀ umfassen oder aufweisen. In der Natur werden von den Mikroorganismen bei der de-novo-Fettsäurebiosynthese für gewöhnlich Fettsäuren mit Kettenlängen von C₁₄ bis C₁₈ hergestellt. Welche Fettsäuren die Mikroorganismen für die Herstellung des veresterten Produktes verwenden, hängt davon ab, welche Fettsäuren der Stoffwechsel des jeweiligen Mikroorganismus produziert. Marine, psychrophile Bakterien wie Arten der Gattungen Shewanella und Colwellia sowie einige Cyanobakterien produzieren mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Eicosapentaensäure (C_20:5n3), Docosahexaensäure (C_22:6n3) oder Arachidonsäure (C_20:4n6). Oleogene Pilze wie beispielsweise Mortierella-Arten weisen einen besonders hohen Gehalt an solchen mehrfach ungesättigten Fettsäuren auf. Einige Bakterien aus der Gruppe der Actinomyceten wie z.B. Rhodococcus opacus oder Mycobacterium phlei zeichnen sich durch einen ungewöhnlich hohen Gehalt an Fettsäuren mit einer ungeraden Anzahl an Kohlenstoffatomen aus (C₁₃, C₁₅, C₁₇, C₁₉), deren Vorkommen für Bakterien untypisch ist. Für Mycobakterien ist das Auftreten von sehr langkettigen Fettsäuren (C₂₀ bis C₂₄) beschrieben worden. Ein Charakteristikum von Streptomyceten wie Streptomyces coelicolor oder Streptomyces avermitilis ist der hohe Gehalt an iso- und anteiso-methylverzweigten Fettsäuren.
Zum anderen kann die Produktion langkettiger Fettsäuren auch dadurch gesteuert werden, dass dem Kulturmedium des Mikroorganismus bereits verschiedene langkettige Fettsäuren, wie zum Beispiel Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachinsäure, Oleinsäure, Palmitoleinsäure, Linolsäure oder Linolensäure zugefügt werden. Die dem Kulturmedium zugefügten Fettsäuren werden bei der Aufnahme in die Zelle als CoA-Thioester aktiviert und können dann zum einen größtenteils direkt für die Herstellung von mit kurzkettigen Alkoholen veresterten Fettsäuren verwendet werden. Zum anderen werden die CoA aktivierten Fettsäuren auch zu einem geringen Teil zunächst durch β-Oxidation um eine oder mehrere C2-Einheiten verkürzt und dann erst mit einem kurzkettigen Alkohol verestert. In Escherichia coli können beim Hinzufügen von Fettsäuren zum Beispiel sowohl kurzkettige, mittellange als auch langkettige Fettsäuren verwendet werden.
Neben der langkettigen Fettsäure ist für die Verwendung als Brennstoff für Verbrennungsmotoren von Kraftfahrzeugen auch der kurzkettige Alkohol von Bedeutung. Die kurzkettigen Alkohole, die von den Mikroorganismen für die Veresterung verwendet werden, umfassen Alkohole und Isomere dieser Alkohole mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen. Dazu zählen vor allem Alkohole, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Methanol, Ethanol, 2,3-Butandiol, Butanol, Isoamylalkohol, Hexanol, Octanol und Decanol besteht. Besonders bevorzugt sind Alkohole und Isomere dieser Alkohole mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen. Wichtige Grundvoraussetzung für die erfindungsgemäß erzeugten langkettigen Fettsäuren, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, bei der Verwendung als alternativer Brennstoff für Verbrennungsmotoren von Kraftfahrzeugen ist ein niedriger Flammpunkt (100 bis 135°C), eine Dichte (bei 15°C) von 0,875 bis 0,890 kg/l, eine kinematische Viskosität von 4 bis 8 mm²/s (bei 20°C), eine Cetan-Zahl von 54–58 (gibt die Zündwilligkeit des Brennstoffes an. Die Cetan-Zahl von Diesel liegt bei 53. Je größer die Cetan-Zahl, desto besser zündet der Brennstoff) und eine Energiedichte von etwa 8,9 kWh/l. Das Hauptaugenmerk liegt auf der Verringerung der Viskosität des Brennstoffes, um ihn für Verbrennungsmotoren nutzbar zu machen und Verstopfungen oder Ablagerungen in den Motoren zu vermeiden. Weniger gute Werte bei einem Parameter können durch bessere Werte bei anderen Parametern kompensiert werden.
Die vorliegende Erfindung bevorzugt besonders Ethanol als kurzkettigen Alkohol, da der daraus gebildete Fettsäureethylester von der Industrie bereits als Ersatzstoff für Verbrennungsmotoren anerkannt ist (FAEEs) (Peterson, C.L., et al., 1995, siehe oben). Nichtsdestotrotz, können auch die anderen mit Hilfe der erfindungsgemäß bereitgestellten Fettsäureester als Brennstoffe Verwendung finden, solange Sie die dafür genannten Bedingungen erfüllen.
Ansonsten lassen sich die erfindungsgemäß gebildeten Fettsäureester auch als Emollientien in Kosmetika oder pharmazeutischen Produkten wie Cremes, Salben, Haarpflegeprodukte, Lippenstifte, Lotionen oder Sonnenschutzmittel verwenden. So sind beispielsweise Isopropylmyristat, Isoamylmyristat oder ähnliche Fettsäureester häufig Bestandteil der vorgenannten Produkte.
Die erfindungsgemäßen Fettsäureester werden bevorzugt von prokaryotischen oder eukaryotischen Mikroorganismen, besonders bevorzugt von einzelligen prokaryotischen oder eukaryotischen Mikroorganismen hergestellt. Diese Mikroorganismen zeichnen sich durch ihre einfache gentechnische Modifizierbarkeit und ihr schnelles Wachstum aus. Es lassen sich alle Mikroorganismen verwenden, die in der Lage sind auf natürliche Weise oder nach biotechnologischer Modifikation Ethanol zu produzieren und die eine Acyltransferase für die Veresterung der langkettigen Fettsäure mit dem kurzkettigen Alkohol tragen. Unter anderem werden dabei bevorzugt Mikroorganismen verwendet, die Glucose vergären können und dabei auch kurzkettige Alkohole wie Ethanol und 2,3-Butandiol bilden. Dazu gehören die fakultativ anaeroben gram(–) Organismen der Gattung Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Citrobacter, Salmonella, Shigella und Erwinia. Besonders bevorzugt werden Mirkoorganismen oder Mutanten dieser Mikroorganismen, die aus der Gattung Escherichia, Acinetobacter, Zymomonas, Klebsiella, Erwinia, Xanthomonas, Clostridium, Shewanella, Colwellia, Paramecium und der Gruppe der Cyanobakterien, Enterobacteriaceae, Actinomycetes, Ascomycetes, Deuteromycetes und der oleogenen Pilze (Hefen + Hyphenpilze) stammen. Beispiele für Organismen-Gattungen aus den zuvor genannten Gruppen der Ascomycetes und Deuteromycetes sind Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Pichia, Mucor und Pachysolen. Beispielhaft sind dazu die Spezies Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida shehatae, Pichia stipitis, Mucor circinelloides und Pachysolen tannophilus genannt.. Die oleogenen Pilze zeichnen sich durch die Produktion großer Mengen an Triacylglyceriden aus, die sie intrazellulär akkumulieren. Zu den oleogenen Pilzen zählen z.B. Hefen der Gattungen Lipomyces, Cryptococcus, Candida und Rhodotorula sowie Hyphenpilze der Gattungen Cunninghamella, Mortierella, Mucor, Rhizopus, Aspergillus und Penicillium. Viele Mikroorganismen der Gruppe Actinomycetes zeichnen sich zum Beispiel besonders durch ihre Fähigkeit aus, Cellulose, Chitin und andere schwer zersetzliche Naturstoffe abzubauen und sie für die Herstellung der Fettsäuren und TAG's zur Verfügung zu stellen. Die zu den Actinomyceten gehörenden Streptomyceten stellen zum Beispiel das Öl 1,10-Dimethyl-9-decalol her. Weitere Beispiele für Actinomycetes sind die Mikroorganismen der Gattungen Mycobacterium, Rhodococcus und Nocardia, die ebenfalls für die vorliegende Erfindung geeignet sind. Zur systematischen Einordnung der in dieser Erfindung genannten Organismen siehe Hans G. Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie, 7. Auflage, 1992, Thieme Verlag.
In der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das für eine prokaryotische Acyltransferase aus einem prokaryotischen Mikroorganismus der Gattung Acinetobacter kodiert. Die Mikroorganismen dieser Gattung sind in der Lage, Wachsester (Ester von langkettigen Fettsäuren mit langkettigen Fettalkoholen) sowie in geringem Umfang Triglyceride (TAG's) zu synthetisieren und diese Speicherlipide intrazellulär in Form von unlöslichen cytoplasmatischen Einschlüssen zu akkumulieren (Kalscheuer, R., Steinbüchel, A., The Journal of Biological Chemistry, 2003, Vol.278, Nr.10, S.8075–8082). Zum Beispiel wird das dafür erforderliche Schlüsselenzym WS/DGAT (SEQ ID Nr. 4), das für die Speicherlipidakkumulation in dem Mikroorganismus A. calcoaceticus ADP1 kodiert, durch das Nukleinsäuremolekül wax/dgat kodiert (SEQ ID Nr. 3; GenBank Data Base AF529086). Dieses Enzym verfügt sowohl über Wachsestersynthase- (WS) als auch über Acyl-CoA:Diacylglycerin-Acyltransferase- (DGAT) Aktivität und katalysiert somit die finalen Reaktionsschritte sowohl der Wachsester- als auch der TAG-Biosynthese. Weitere Acyltransferasen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, werden unter Angabe des Homologiegrades und des Organismenstammes aus dem sie isoliert worden sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: WS/DGAT-homologe Proteine in Prokaryoten
Die Erfinder haben überraschend herausgefunden, dass die Acyltransferasefunktion des Enzyms WS/DGAT aus A. calcoaceticus ADP1 (SEQ ID Nr. 4), das durch die Nukleinsäure wax/dgat (SEQ ID Nr. 3) kodiert wird, eine sehr geringe Substratspezifität aufweist. Langkettige Fettalkohole sind das natürliche Substrat dieses Enzyms, was in A. calcoaceticus ADP1 zur Biosynthese von Wachsestern führt. Daneben konnte aber bei in vitro Experimenten gezeigt werden, dass die WS/DGAT auch kurzkettige Alkohole wie zum Beispiel Butanol, Ethanol oder Isoamylalkohol als alternative Substrate verwerten kann (s. 1). Diese Experimente belegen die überraschende Tatsache, dass WS/DGAT nicht nur in der Lage ist, Fettsäureester von langkettigen Alkoholen, d.h. Wachsester, zu synthetisieren, sondern auch Fettsäureester von kurzkettigen Alkoholen. Da das strikt aerobe Bakterium A. calcoaceticus ADP1 jedoch ohne genetische Modifikation nicht in der Lage ist kurzkettige Alkohole, wie z.B. Ethanol, zu synthetisieren, können in diesem Stamm auch keine FAEEs oder ähnliche erfindungsgemäße Fettsäureester produziert werden.
Die Fähigkeit der Acyltransferase des bifunktionalen Enzyms WS/DGAT auch in vivo kurzkettige Alkohole für die Fettsäureestersynthese zu verwenden, wurde mittels der Hefe Saccharomyces cerevisiae überprüft. Dieser Mikroorganismus wurde beispielhaft ausgewählt, da er Fuselalkohole, wie zum Beispiel Ethanol, als Produkt des anaeroben Kohlenhydrat-Stoffwechsels produziert und außerdem genauso wie Escherichia coli bereits als Produktionsstamm für Ethanol im großtechnischen Maßstab genutzt wird (Dien, B.S., Cotta, M.A., Jeffries T.W., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, Vol.63, S.258–266). Jedoch können für diese Ausführungsform auch alle anderen Mikroorganismen verwendet werden, deren Stoffwechsel kurzkettige Alkohole wie zum Beispiel Ethanol herstellen. Für die Experimente wurde die speicherlipidfreie Mutante S. cerevisiae H1246 verwendet (Sandager, L., et al., J. Biol. Chem., 2002, Vol.277, S.6478–6482). Die heterologe Expression von WS/DGAT in S. cerevisiae H1246, welche das Plasmid pESC-URA::wax/dgat (siehe 6) trägt, führte einerseits dazu, dass in der rekombinanten Mutante die Fähigkeit zur TAG-Synthese aufgrund der DGAT-Aktivität der bifunktionalen WS/DGAT wieder hergestellt wurde. Zusätzlich wurde die Akkumulation von FAEEs und Fettsäureisoamylestern (FAIEs) nachgewiesen (siehe 2 und 3).
Somit konnten die Erfinder zum ersten mal demonstrieren, dass unter Ausnutzung der geringen Substratspezifität von WS/DGAT aus A. calcoaceticus ADP1 die Biosynthese von mit kurzkettigen Alkoholen veresterten langkettigen Fettsäuren in eukaryotischen Mikroorganismen möglich ist. Die Vorstufensubstrate für die FAEE-Produktion (Coenzym-A- aktivierte Fettsäuren und kurzkettige Alkohole wie Ethanol und Isoamylalkohol) wurden dabei beim Wachstum auf einem einfachen Substrat, wie zum Beispiel Galaktose, durch den Metabolismus der Wirtszelle bereitgestellt.
Wie bereits erwähnt ermöglicht die vorliegende Erfindung auch die Herstellung von mit kurzkettigen Alkoholen veresterten Fettsäuren mit Mikroorganismen, deren Stoffwechsel keine kurzkettigen Alkohole als Zwischenprodukt oder Endprodukt synthetisiert oder dessen Stoffwechsel die kurzkettigen Alkohole nur in geringen Mengen synthetisiert. Wie bereits zuvor erwähnt umfasst die vorliegende Erfindung daher auch einen Mikroorganismus zur Herstellung von langkettigen Fettsäuren, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, wobei der Mikroorganismus ein Nukleinsäuremolekül, das für eine prokaryotische Acyltransferase kodiert, ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Pyruvatdecarboxylase kodiert, und ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Alkoholdehydrogenase kodiert, umfasst. Um dies zu demonstrieren, wurde ein Nukleinsäuremolekül verwendet (SEQ ID Nr. 7), das für eine Pyruvatdecarboxylase aus einem Mikroorganismus der Gattung Zymomonas (SEQ ID Nr. 8) kodiert und eine Nukleinsäuremolekül (SEQ ID Nr. 5), das für eine Alkoholdehydrogenase aus einem Mikroorganismen der Gattung Zymomonas (SEQ ID Nr. 6) kodiert. Die Mikroorganismen dieser Gattung sind dafür bekannt, dass sie kurzkettige Alkohole wie zum Beispiel Ethanol synthetisieren können (Okamoto, T. et al., Arch Microbiol., 1993, Vol.160, Nr.5, S.333–337).
Eine Übersicht über weitere Alkoholdehydrogenasen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, finden sich in dem Übersichtsartikel von Reid, M. F. und Fewson, C. A. (Critical Reviews in Microbiology, 1994, Vol. 20, S.13– 56). Beispiele für Mikroorganismen, die als Quelle für geeignete Alkoholdehydrogenasen dienen können, sind Bakterien der Gattungen Ralstonia, Pseudomonas und Clostridium sowie zahlreiche Hefen, wie beispielweise Saccharomyces cerevisiae.
Weitere Pyruvatdecarboxylasen, die neben der Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas mobilis für die vorliegende Erfindung geeignet sind, können aus den folgenden Organismen gewonnen werden: : Sarcina ventriculi (Talarico, L. A., et al., Microbiology, 2001, Vol.147, S.2425–2435), Acetobacter pasteurianus (Raj, K. C., et al., Archive of Microbiology, 2001, Vol.176, S.443–451) und Zymobacter palmae (Raj, K. C., et al., Applied and Environmental Microbiology, 2002, Vol.68, S.2869–2876).
In einer Ausführungsform werden die Nukleinsäuremoleküle pdc und adhB (SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 5; Alterthum, F. und Ingram, L.O., Appl. And Environ. Microbiol., August 1989, Vol.55, Nr.8, S.1943–1948), die für eine Pyruvatdecarboxylase (SEQ ID Nr. 8) und eine Alkoholdehydrogenase (SEQ ID Nr. 6) aus Zymomonas mobilis kodieren, verwendet. Dazu wurden diese Nukleinsäuremoleküle mittels des Plasmides pLOI297 (Alterthum, F. und Ingram, L.O., 1989, siehe oben) in Escherichia coli eingebracht. Die Erfindung umfasst daher insbesondere auch die Verwendung von Escherichia coli oder eine Mutante davon für die Herstellung der langkettigen Fettsäuren, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind. E. coli ist besonders gut als Produktionsstamm für die erfindungsgemäßen Fettsäureester geeignet, da er einfach zu vermehren ist und ebenso wie Saccharomyces cerevisia durch seine Einstufung als GRAS-Organismus (generally regarded as safe) bei den zuständigen Behörden für die Zulassung von mittels gentechnischer Organismen hergestellter Produkte, anerkannt ist.
Neben dem Plasmid pLOI297 wurde ebenfalls eine prokaryotische Acyltransferase in E. coli transformiert. In einer Ausführungsform wurde dafür die für das Enzym WS/DGAT aus A. calcoaceticus ADP1 (SEQ ID Nr. 4) kodierende Nukleinsäure wax/dgat (SEQ ID Nr. 3) mittels des Plasmids pBBR1MCS-2::wax/dgat (Kalscheuer, R., Steinbüchel, A., 2003, siehe oben) in E. coli eingebracht. Ein Stamm von E. coli, der sowohl das Plasmid pLOI297 als auch das Plasmid pBBR1MCS-2::wax/dgat umfasst oder beinhaltet und somit die drei relevanten Gene pdc, adhB und wax/dgat gleichzeitig exprimiert, synthetisiert signifikante Mengen an FAEEs während der Kultivierung im Kulturmedium (siehe 4 und 5).
Da es aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes möglich ist, bestimmte Codons durch andere Codons zu ersetzen, welche die gleiche Aminosäure kodieren, ist die Erfindung nicht auf eines der genannten Nukleinsäuremoleküle beschränkt, das für eine Acyltransferase, eine Alkoholdehydrogenase oder eine Pyruvatdecarboxylase kodiert, sondern schließt alle Nukleinsäuremoleküle ein, die für ein derartiges funktionelles Protein kodieren.
Die Erfinder konnten mittels der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal belegen, dass unter Ausnutzung der geringen Substratspezifität der WS/DGAT aus A. calcoaceticus eine Biosynthese von FAEEs auch bei prokaryotischen Mikroorganismen ausgehend von einfachen, nachwachsenden Substraten möglich ist.
Um die Synthese der langkettigen Fettsäuren, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, noch zu steigern, kann dem Kulturmedium der gerade beschriebenen modifizierten E. coli-Zellen eine oder mehrere der bereits zuvor genannten langkettigen Fettsäuren zugesetzt werden. Bei der Zugabe von kurzkettigen Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C₄ bis C₁₀ wird das Fettsäureaufnahmesystem von E. coli bevorzugt durch die Zugabe geringer Mengen an langkettigen Fettsäuren induziert. Auch bei Mikroorganismen anderer Gattungen kann durch die Zugabe von zusätzlichen Fettsäuren in das Kulturmedium der Stoffwechsel dahingehend beeinflusst werden, dass mehr Fettsäureester gebildet werden. Beispielhaft sei dafür die verstärkte Biosynthese von Thiowachsestern in einer Mutante von Acinetobacter calcoaceticus ADP1 während der Kultivierung mit Hexadecanthiol bei Zugabe von Ölsäure genannt (Uthoff, S., et al., Applied and Environmental Microbiology, 2004, im Druck (Manuskript AEM01050-04)). Weitere Beispiele lassen sich für die Synthese von Polyhydroxyfettsäuren (Polyester von 3-Hydroxyfettsäuren) nennen. So lassen sich beispielsweise Polyhydroxyfettsäuren mittlerer Kettenlänge mit Pseudomonas oleovorans (Lageveen, R. G., et al., Applied and Environmental Microbiology, 1988, Vol.54, S.2924–2932) sowie rekombinanten Stämmen von E. coli (Langenbach, S., et al., FEMS Microbiology Letters, 1997, Vol.150, S.103–309) produzieren, wenn bei der Kultivierung Fettsäuren (z.B. Decansäure) zugegeben werden. Hierbei werden Intermediate der Fettsäure-β-Oxidation als Substrate für die Polyhydroxyfettsäure-Bildung abgeführt.
Zusätzlich können die Mikroorganismen auch noch ein Nukleinsäuremolekül umfassen oder enthalten, dass für eine Thioesterase kodiert. Ein Thioesterase katalysiert die hydrolytische Spaltung von Thioesterbindungen in Carboxyl- und Sulfhydrylgruppen bei der Biosynthese der Fettsäuren. Durch das Einbringen eines für eine Thioesterase kodierenden Nukleinsäuremoleküls kommt es zur Deregulation der Fettsäuresynthese, wodurch der so modifizierte Mikroorganismus mehr Fettsäuren bildet als vor der Modifikation. Die heterologe Expression von Thioesterasen in E. coli kann sogar dazu führen, dass ein solch großer Überschuss an Fettsäuren produziert wird, dass diese ins Medium ausgeschieden werden. Durch das vermehrte Bereitstellen von Fettsäuren im Mikroorganismus, kann die Produktion der mit kurzkettigen Alkoholen veresterten Fettsäuren zusätzlich deutlich gesteigert werden.
Am Ende der Biosynthesekette der Fettsäuren stehend, beeinflusst das Einbringen von Thioesterasen in den erfindungsgemäßen Mikroorganismus außerdem die Länge der langkettigen Fettsäuren, in dem es die Acyl-Verlängerung bei der Fettsäuresynthese beeinflusst.
Geeignete Thioesterasen sind zum Beispiel die Thioesterase TesA aus Escherichia coli, die durch die Nukleinsäure tesA kodiert wird (Hyeseon, Cho und Cronan, J.E., The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol.270, Nr.9, S.4216–4219) und die Thioesterase (BTE) aus der Pflanze Umbellularia californica (Voelker, T.A., Davies, H.M., Journal of Bacteriology, 1994, Vol.l76, Nr.23, S.7320–7327). Durch das Einbringen einer Thioesterase in die Wirtszelle fließen folglich mehr C2-Einheiten in die Biosynthese neuer Fettsäuren und die C2-Einheiten werden bei der de-novo-Fettsäuresynthese auf mehrere Fettsäuren mittlerer Länge verteilt, anstatt auf weniger dafür aber längere Fettsäuren. Dadurch stehen am Ende der Synthese mehr Fettsäuren für die Synthese der erfindungsgemäßen Fettsäureester zur Verfügung.
Mit Fettsäuren mittlerer Länge sind Fettsäuren gemeint die gemäß der oben gegebenen Definition für langkettige Fettsäuren im unteren Längenbereich für die langkettigen Fettsäuren liegen. Sie weisen bevorzugt eine Kettenlänge von C₁₀ bis C₁₄.
Neben den Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines dieser Mikroorganismen für die Herstellung von langkettigen Fettsäuren, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind. Dabei umfasst das Verfahren zur Herstellung dieser Mikroorganismen und der mit kurzkettigen Alkoholen veresterten Fettsäuren

– das Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das für eine prokaryotische Acyltransferase, bevorzugt aus Acinetobacter, kodiert, in einen Mikroorganismus,
– das Kultivieren der Mikroorganismen unter dafür geeigneten Bedingungen in einem Kulturmedium, und
– das Isolieren der mit kurzkettigen Alkoholen veresterten Fettsäuren aus den kultivierten Mikroorganismen..

Neben einem Nukleinsäuremolekül, das für eine prokaryotische Acyltransferase kodiert, können in die Zelle des Weiteren die oben bereits beschriebenen Nukleinsäuremoleküle eingebracht werden, die für eine Pyruvatdecarboxylase, eine Alkoholdehydrogenase und gegebenenfalls für eine Thioesterase kodieren.
Das Einbringen der Nukleinsäure in die Zellen kann dabei mit herkömmlichen, im Stand der Technik bereits bekannten Transformationstechniken durchgeführt werden (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY und Ito, H., et al., 1983, J. Bacteriol., Vol.153, S.163–168).
Das genannte Kulturmedium enthält dabei die bereits oben beschriebenen Kohlenstoff-Quellen, sowie gegebenenfalls Vitamine und andere Supplemente, die zum Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind. Die für das Wachstum der oben beschriebenen Mikroorganismen erforderlichen Kulturmedien sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt und werden zum Beispiel von Schlegel (Hans G. Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie, 1992, siehe oben; Sambrook, J. et al., 1989, siehe oben) beschrieben.
Wie zuvor bereits beschrieben werden die für die Synthese der mit kurzkettigen Alkoholen veresterten langkettigen Fettsäuren mittels eines oder mehrerer Vektoren in den/die Mikroorganismus/Wirtszelle eingebracht. Die in die Zelle eingebrachten Vektoren liegen dabei bevorzugt im Cytoplasma der Wirtszelle vor und werden nicht in das Genom der Wirtszelle eingebaut. Die Nukleinsäuremoleküle können dabei auf einem oder mehreren Vektoren liegend in die Zelle eingebracht werden.
Die Vektoren, welche die Nukleinsäuremoleküle tragen, die für eine prokaryotische Acyltransferase, eine Alkoholdehydrogenase eine Pyruvatdecarboxylase oder eine Thioesterase kodieren, umfassen dabei auch Sequenzelemente, die Informationen hinsichtlich der Regulation von Transkription und/oder Translation enthalten, und diese Elemente "operativ" mit der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz verknüpfen. Eine operative Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der die regulatorischen Sequenzelemente und die proteinkodierende Sequenz derart verbunden sind, dass Genexpression möglich ist. Die genaue Beschaffenheit der zur Genexpression erforderlichen regulatorischen Bereiche kann zwischen verschiedenen Spezies variieren. In der Regel umfassen diese Bereiche jedoch einen Promotor, der in der Regel aus dem Promotor per se besteht, i.e. DNA-Elemente, welche die Transkriptionsinitiation steuern, sowie aus DNA-Elementen, die nach ihrer Transkription in mRNA den Beginn der Translation regulieren. Solche Promotoren können 5' nicht-kodierende Sequenzen einschließen, die an der Initiation von Transkription und Translation beteiligt sind, wie zum Beispiel die –35/–10-Elemente und das Shine-Dalgarno Element in Prokaryonten. Diese Regionen können ferner auch Enhancer- oder Repressorelemente enthalten.
Zusätzlich können auch die 3' nicht-kodierenden Regionen regulatorische Elemente enthalten, die an der Termination der Transkription beteiligt sind. Falls diese Terminationssequenzen in einer speziellen Wirtszelle nicht oder nur unzureichend funktionell sind, können sie durch Signale ersetzt werden, die in der betreffenden Zelle ausreichend funktionell sind.
Ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann demnach eine regulatorische Sequenz, insbesondere eine Promotorsequenz umfassen. Des Weiteren können die genannten Nukleinsäuremoleküle eine Promotorsequenz sowie eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen. Hinsichtlich der Promotorsequenz kann es sich um einen konstitutiven oder einen induzierbaren Promotor handeln. Geeignete prokaryotische Promotoren sind zum Beispiel der lacUV5-Promotor, der GAL1-Promotor oder der T7-Promotor.
Soweit die von den Mikroorganismen gebildeten langkettigen Fettsäuren, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, nicht bereits von der Zelle in das umgebende Medium abgegeben werden, werden die Zellen mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren aufgeschlossen. Dazu gehören chemische, enzymatische als auch physikalisch-mechanische Methoden. Als Beispiel sind der Aufschluss mittels einer Glasperlenmühle, French-Press, Ultraschallbehandlung oder mittels eines Hochdruckhomogenisators genannt.
Die Erfindung umfasst ebenfalls einen Vektor, der

– ein Nukleinsäuremolekül, das für eine prokaryotische Acyltransferase kodiert;
– ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Pyruvatdecarboxylase kodiert; und
– ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Alkoholdehydrogenase kodiert, umfasst oder trägt.

Darüber hinaus umfasst die vorliegende Erfindung auch ein Vektorgemisch aus mindestens zwei oder drei Vektoren, die drei Nukleinsäuren, die jeweils für eine prokaryotische Acyltransferase, eine Pyruvatdecarboxylase oder eine Alkoholdehydrogenase kodieren, tragen, wobei jeder der Vektoren zumindest eine dieser Nukleinsäuren trägt. Die erfindungsgemäßen Vektoren können zusätzlich auch noch ein Nukleinsäuremolekül tragen, das für eine der oben beschriebenen Thioesterasen kodiert.
Neben den Plasmiden können als „Vektor" zum Beispiel auch Phagen, Phagemiden und Cosmide dienen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül in einem Vektor enthalten, insbesondere in einem Expressionsvektor. Ein derartiger Expressionsvektor kann neben den oben bereits beschriebenen regulatorischen Sequenzen und den Nukleinsäuresequenzen, die für eine prokaryotische Acyltransferase, eine Alkoholdehydrogenase, eine Pyruvatdecarboxylase und eine Thioesterase kodieren, Replikations- und Kontrollsequenzen umfassen, die von einem Organismus stammen, der mit dem zur Expression verwendeten Wirt kompatibel ist, sowie weiterhin mindestens einen Selektionsmarker, der einen selektierbaren Phänotyp auf eine transformierte Zelle überträgt. Beispiele für solche Marker sind Resistenzen gegen ein zytotoxisches Agens, wie z.B. ein Antibiotikum, eine Schwermetall oder ein Toxin, eine virale Immunität oder ähnliches. Eine kleine Auswahl geeigneter Marker umfasst Nukleinsäuresequenzen, die dem Mikroorganismus der Erfindung eine Resistenz gegen Belomycin, Gentamycin, Hygromycin, Kanamycin, Ampicillin, Phleomycin, Spectinomycin, Streptomycin, Sulfonamid und Tetracyclin verleihen. Andere Marker umfassen zum Beispiel Nukleinsäuresequenzen, die für eine Alkaline Phosphatase, myc, Hämagglutinin, β-Glucuronidase, Luciferase und GFP kodieren. Eine große Zahl dazu geeigneter Vektoren, z.B. pBluescript, pUC18, pBBR, pESC, pKS, pET oder pcDNA3, ist detailliert beschrieben und kommerziell erhältlich.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung der nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Fettsäureester, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, als Brennstoff für Verbrennungsmotoren.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Ergebnisse der Experimente, welche die Substratspezifität der Acyltransferasefunktion des Enzyms WS/DGAT (SEQ ID Nr. 4) mit primären Alkoholen unterschiedlicher Kettenlänge untersucht. Die Enzymaktivitäten wurden in radiometrischen Enzymtests mit Rohextrakten von E. coli XL1-Blue (pKS::wax/dgat) bestimmt. Die Daten repräsentieren Durchschnitte von drei unabhängigen Experimenten ± Standardabweichungen.
2 bezieht sich auf die Ergebnisse der Experimente zur Biosynthese von Fettsäureethylestern (FAEEs) und Fettsäureisoamylestern (FAIEs) in rekombinanter Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae). In der 2 wird die Speicherlipidakkumulation in einem rekombinanten Stamm von S. cerevisiae dargestellt. Die Zellen wurden für 24 h bei 28°C in Uracil-freiem synthetischen Minimal-Dropout-Medium mit 2% (w/v) Galaktose (Proben 1–3) oder 2% (w/v) Galaktose plus 0,1% (w/v) Ölsäure (Proben 4–6) kultiviert und dünnschichtchromatographisch analysiert. A: Ergosterin; B: Triolein; C: Cholesterylpalmitat; D: Palmitylpalmitat; 1 + 4, S. cerevisiae G175 (pESC-URA); 2 + 5, S. cerevisiae H1246 (pESC-URA); 3 + 6, S. cerevisiae H1246 (pESC-URA::wax/dgat). Die Gesamtlipidextrakte aus 1,5 mg lyophilisierten Zellen wurden jeweils in den Spuren 1–6 appliziert.
3 bezieht sich ebenfalls auf die Ergebnisse der Experimente zur Biosynthese von Fettsäureethylestern (FAEEs) und Fettsäureisoamylestern (FAIEs) in rekombinanter Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae). In 3 werden die Ergebnisse der GC/MS-Analyse von Gesamtlipidextrakten aus S. cerevisiae H1246 (pESC-URA::wax/dgat) dargestellt. Die Zellen wurden für 24 h bei 28°C in Uracil-freiem synthetischem Minimal-Dropout-Medium mit 2% (w/v) Galaktose kultiviert. Gesamtlipidextrakte aus 2,5 mg lyophilisierten Zellen wurden appliziert. Identifizierte Substanzen: 1: Ethylpalmitat (m/z = 284 [C₁₈H₃₆O₂]⁺); 2: Isoamylmyristat (m/z = 298 [C₁₉H₃₈O₂]⁺); 3: Ethylpalmitoleat (m/z = 282 [C₁₈H₃₄O₂]⁺); 4: Ethylstearat (m/z = 312 [C₂₀H₄₀O₂]⁺); 5: Isoamylpalmitat (m/z = 326 [C₂₁H₄₂O₂]⁺); 6: Isoamylpalmitoleat (m/z = 324 [C₂₁H₄₀O₂]⁺); 7: Isoamylstearat (m/z = 354 [C₂₃H₄₆O₂]⁺); 8: Isoamyloleat (m/z = 352 [C₂₃H₄₄O₂]⁺).
4 bezieht sich auf die Ergebnisse der Experimente zur Biosynthese von Fettsäureethylestern (FAEEs) in einem rekombinanten Stamm von Escherichia coli. 4 zeigt die Speicherlipidakkumulation in rekombinanten E. coli-Stämmen. Die Zellen wurden für 24 h bei 37°C in LB-Medium mit 2% (w/v) Glukose (Proben 1–3) oder 2% (w/v) Glukose plus 0,1% (w/v) Ölsäure (Proben 4–6) kultiviert und dünnschicht-chromatographisch analysiert. A: Ölsäure; B: Ethyloleat; C: Oleyloleat; 1 + 4, E. coli TOP10 (pL0I297); 2 + 5, E. coli TOP10 (pBBR1MCS-2::wax/dgat); 3 + 6, E. coli TOP10 (pBBR1MCS-2::wax/dgat + pLOI297). Gesamtlipidextrakte aus 1,5 mg lyophilisierten Zellen wurden jeweils in den Spuren 1–6 appliziert.
5 bezieht sich ebenfalls auf die Ergebnisse der Experimente zur Biosynthese von Fettsäureethylestern (FAEEs) in einem rekombinanten Stamm von Escherichia coli. In 5 werden die Ergebnisse der GC/MS-Analyse von isolierten FAEEs aus E. coli TOP10 (pBBR1MCS-2::wax/dgat + pLOI297) dargestellt. Die Zellen wurden für 24 h bei 37°C in LB-Medium mit 2% (w/v) Glukose plus 0,1% (w/v) Ölsäure kultiviert. FAEEs wurden über präparative Dünnschichtchromatographie aufgereinigt. Identifizierte Substanzen: 1: C14:0-Ethylester (m/z = 256 [C₁₆H₃₂O₂]⁺); 2: C14:1-Ethylester (m/z = 254 [C₁₆H₃₀O₂]⁺); 3: C16:0-Ethylester (m/z = 284 [C₁₈H₃₆O₂]⁺); 4: C16:1-Ethylester (m/z = 282 [C₁₈H₃₄O₂]⁺); 5: C18:1-Ethylester (m/z = 310 [C₂₀H₃₈O₂]⁺); 6: C18:2-Ethylester (m/z = 308 [C₂₀H₃₆O₂]⁺).
6 zeigt den in Beispiel 2 verwendeten Vektor pESC-URA::wax/dgat, der die Acyltransferase aus Acinetobacter calcoaceticus ADP1 (wax/dgat) zusammen mit einer künstlichen Kozak-Initiationssequenz trägt. Des Weiteren trägt der Vektor einen Selektionsmarker für Ampicillin (AmpR) sowie einen Gal10 und Gal1 Promotor. Weitere Einzelheiten zur Herstellung des Vektors sind in Beispiel 2 zu finden.
Beispiele
Die in diesen Beispielen verwendeten Organismen und Plasmide werden in Tabelle 2 aufgelistet.
Tabelle 2

C: Bullock, W. O., et al., 1987, BioTechniques, Vol.5, S.376–379
D: Sandager, L., et al., 2002, siehe oben
E: Kalscheuer, R. und Steinbüchel, A., 2003, siehe oben
F: Kalscheuer, R., Steinbüchel, A., 2003, siehe oben
G: Alterthum, F. und Ingram, L.O., 1989, siehe oben
Abkürzungen: TAG, TAG-Ansammlung; SE, Sterinesteransammlung; Ap^r, Ampicillinresistenz.
^a, Scandinavian Biotechnology Research (ScanBi) AB, Alnarp, Sweden.
^b, Stratagene, La Jolla, USA.
^c, Invitrogen, Carlsbad, USA

Die Experimente wurden mittels molekularbiologischer Standardverfahren gemäß Sambrook, J. et al., siehe oben, durchgeführt. Für die PEG vermittelte Transformation von Hefe-Zellen ist das Lithium-Acetat-Verfahren verwendet worden (Ito, H., et al., 1983, siehe oben).
Hefe-Zellen werden bei 28°C in Uracil-freiem synthetischem Minimal-Dropout-Medium, das 0,6% (wt/vol) Hefe-Stickstoff-Basismedium (Difco, Detroit, USA), 0,13 (wt/vol) synthetischen Hefe-Dropout-Zusatz ohne Uracil (Sigma, Deisenhof, Deutschland), 0,0075 (wt/vol) Adeninhemisulfat und 2% (w/v) Glucose oder Galaktose enthält. Rekombinante E. coli Stämme sind in LB-Medium bei 37°C in Gegenwart von Ampicillin (75 mg/l) und Tetracyclin (12,5 mg/l) kultiviert worden. Die Zellen von S. cerevisiae und E. coli wurden aerob in einem 300 ml Erlenmeyerkolben, der mit 50 ml Medium auf einem Orbitalschüttler bei 130 rpm geschüttelt worden ist, kultiviert.
Ausführungsbeispiel 1
Die Substratspezifität der Acyltransferasefunktion der WS/DGAT in bezug auf primäre Alkohole unterschiedlicher Kettenlänge konnte in vitro anhand eines radiometrischen Enzymtests unter Verwendung von Rohextrakten von E. coli XL1-Blue(pKS::wax/dgat) getestet werden. Wie die Ergebnisse in 1 zeigen, ist die Acyltransferaseaktivität der WS/DGAT in der Lage neben langkettigen Fettalkoholen wie Hexadecanol sowohl einfache kurzkettige Alkohole, wie zum Beispiel Ethanol und Butanol, als auch verzweigte kurzkettige Alkohole, wie Isoamylalkohol, als Substrate zu verwerten und mit langkettigen Fettsäuren zu verestern.
Für dieses Experiment wurde der E. coli Stamm XL1-Blue mit dem Plasmid pKS::wax/dgat transformiert und anschließend in LB-Medium für 6 h bei 37°C in Gegenwart des Induktors 1 mM Isopropyl-β-Thiogalactopyranosid (IPTG) kultiviert. Die Zellen wurden danach vom Medium abgetrennt, gewaschen, in 125 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) resuspendiert und mittels Ultraschallbehandlung aufgeschlossen, um das Zellrohextrakt für den radiometrischen Enzymtest zu gewinnen.
Die Acyltransferase-Enzymaktivität der WS/DGRT wurde in einem Gesamtvolumen von 250 μl eines 125 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) durchgeführt. Dieser Puffer enthält 3.75 mM des zu testenden Alkohols, 4.63 mg/ml BSR und 4.72 μM [1-¹⁴C]Palmitoyl-CoA (Spezifische Aktivität 1.961 Bq/pmol). Alkohole und BSA werden als doppelt konzentrierte Stammlösung appliziert, die mittels Ultraschall emulgiert worden ist. Die Reaktion wurde mit dem oben gewonnenen Zellrohextrakt des rekombinanten E. coli-Stammes durchgeführt. 100 μg an Protein wurde in jedem Enzymassay verwendet. Das Enzymassay ist für 30 min bei 35°C inkubiert worden, und die Reaktion wurde durch Extraktion mit 500 μl Chloroform/Methanol (1:1, vol/vol) gestoppt. Nach dem Zentrifugieren wurde die Chloroform-Phase entfernt und die extrahierten Lipide wurden mittels Dünnschichtchromatographie (DC) wie in Beispiel 2 beschreiben aufgetrennt. Die radioaktiv markierten Reaktionsprodukte auf der DC-Platte sind mittels Autoradiographie detektiert worden, und die Radioaktivität ist mittels einer Szintillationszählung gemessen worden.
Ausführungsbeispiel 2
Als Wirtszelle wurde in diesem Beispiel für die heterologe Expression von WS/DGRT aus A. calcoaceticus ADP1 die eukaryotische Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ausgewählt, welche als fakultativ anaerober Mikroorganismus Fuselalkohole, zu denen auch Ethanol gehört, als Gärungsprodukt unter anaeroben Bedingungen bildet.
Für die Experimente wurde die speicherlipidfreie Vierfachmutante Stamm H1246 (lro1Δ, dga1Δ, are1Δ, are2Δ) von S. cerevisiae G175 eingesetzt (Sandager, L., et al., 2002, siehe oben). Während Wildtypen von S. cerevisiae TAG und Sterylester als intrazelluläre Speicherlipide synthetisieren, ist die Vierfachmutante S. cerevisiae H1246 dazu nicht mehr in der Lage und somit frei von lipophilen Speicherstoffen. Die heterologe Expression von WS/DGAT in S. cerevisiae H1246, welche das Plasmid pESC-URA::wax/dgat trägt, führte beim Wachstum auf Galaktose als Kohlenstoffquelle einerseits dazu, dass in der rekombinanten Mutante die Fähigkeit zur TAG-Synthese aufgrund der DGAT-Aktivität der bifunktionalen WS/DGAT wieder hergestellt wurde. Daneben konnte zusätzlich die Akkumulation von FAEEs und Fettsäureisoamylestern (FAIEs) nachgewiesen werden (2 und 3). Die GC/MS Analysen des Gesamtlipidextraktes von rekombinanten Hefe-Stämmen zeigen, das FAIEs und FAEEs nur im Stamm S. cerevisiae H1246, der das Plasmid pESC-URA::wax/dgat enthält, hergestellt worden sind. Im Wildtyp-Stamm S. cerevisiae G175 und in der Mutante S. cerevisiae H1246, die nur die Vektorkontrolle (pESC-URA) enthielt, konnten keine FAIEs und FAEEs nachgewiesen werden.
Isoamylalkohol ist ein für die Bäckerhefe typischer Fuselalkohol, der als Produkt des anaeroben Aminosäurestoffwechsels gebildet wird, und neben Ethanol ebenfalls von der heterolog exprimierten WS/DGAT als Substrat in vivo genutzt werden kann. Somit ist erstmals demonstriert worden, dass unter Ausnutzung der geringen Substratspezifität von WS/DGAT aus A. calcoaceticus ADP1 die Biosynthese von FAEEs in einem eukaryotischen Mikroorganismus möglich ist. Die Vorstufensubstrate für die FAEE-Produktion (Coenzym-A-aktivierte Fettsäuren + Ethanol) werden dabei beim Wachstum auf einem einfachen Substrat (z.B. Galaktose) durch den Metabolismus der Wirtszelle bereitgestellt.
Das in diesem Beispiel verwendete Plasmid pESC-URA::wax/dgat wird wie folgt hergestellt. Für die Expression in der Hefe wurde die für WS/DGAT (SEQ ID Nr. 4) kodierende wax/dgat (SEQ ID Nr. 3) aus dem Plasmid pKS::wax/dgat (Kalscheuer R., Steinbüchel A., 2003, siehe oben) amplifiziert. Für die PCR wurde dabei das Oligonukleotid 5'-AAAGGATCCACTATGCGCCCATTACATCCGATT-3' (SEQ ID NO: 2, ATG Startcodon ist fettgedruckt) als 5'-Primer verwendet, wodurch eine BamHI Restriktionsschnittstelle (unterstrichen) und eine Kozak-Translationsinitionssequenz (Kozak M., 1987, Nucleic Acid. Res., Vol.15, S.8125–8148 Kozak M., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, S.8301–8305) in die Nukleinsäure eingeführt worden sind. Mittels des 3'-Primers 5'-TTTGTCGACTTAATTGGCTGTTTTAATATCTT-3' (SEQ ID NO: 1) wurde eine SalI Restriktionsschnittstelle (unterstrichen) in die Nukleinsäuresequenz eingefügt. Das 1,5 kbp große PCR-Produkt ist in den mit BamHI-SalI restringierten Vektor pESC-URA (Stratagene, La Jolla, USA) colinear zum GAL1 Promotor (mit Galaktose induzierbar) kloniert worden. Rekombinante Hefen sind in Uracil-freiem synthetischem Minimal-Dropout-Medium mit 2% (w/v) Galactose für 24 h bei 28°C kultiviert worden. Die Zellen sind anschließend gewaschen und in 125 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) resuspendiert worden. Das Rohextrakt wurde durch den Aufschluss der Zellen mit einer French-Press erhalten.
Die Analyse der Fette wurde mittels Dünnschichtchromatographie wie von Kalscheuer, R. und Steinbüchel, A. (2003, siehe oben) beschrieben, durchgeführt. Als Lösungsmittelsystem wurde Hexan:Diethyleter:Essigsäure im Verhältnis 90:7,5:1 vol/vol/vol für die TAG, Sterylester, Fettsäureisoamylester bzw. -ethylester und die Fettsäureanalyse verwendet. Triolein, Ergosterin, Palmitylpalmitat und Cholesterylpalmitat wurden bei der Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Deutschland) bezogen und als Referenzsubstanzen für die Fettanalyse verwendet.
Die Fettsäureanalyse der gesamten Zellen wurde mittels Gaschromatographie (GC) gemäß der Beschreibung von Timm, A. und Steinbüchel, A. (1990, Appl. Environ. Microbiol., Vol.56, S.3360–3367) durchgeführt. Dafür wurden 5 bis 7,5 mg an lyophilisierten Zellen für 4 h bei 100°C einer Methanolyse in Gegenwart von 15% (vol/vol) in Methanol suspendierter Schwefelsäure ausgesetzt. Die dabei gewonnenen Fettsäureester sind in einer GC unter Verwendung eines Agilent 6850 Gaschromatographen (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland), der mit einer BP21 Kapillarsäule (50 m × 0,22 mm, Filmdicke 250 nm, SGE, Darmstadt, Deutschland) bestückt ist, und einem Flammenionisationsdetektor (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) analysiert worden. Eine 2 μl Probe der organischen Phase ist nach der Split-Injektion (1:20) analysiert worden. Wasserstoff (konstanter Fluss, 0,6 ml/min) ist in diesem Experiment als Trägergas verwendet worden. Die Temperatur des Injektors und des Detektors lagen bei 250°C bzw. 275°C. Das folgende Temperaturprogramm ist gefahren worden: 120°C für 5 min, Erhöhung der Temperatur um 3°C/min bis auf 180°C, anschließende Erhöhung der Temperatur um 10°C/min bis auf 220°C und dann halten der Temperatur von 220°C für 31 min. Die Substanzen wurden aufgrund ihrer Retentionszeit mit dem Standard eines Fettsäuremethylesters verglichen.
Die vermeintlichen TAG's, Fettsäureethylester und Fettsäureisoamylester sind mittels einer präparativen Dünnschichtchromatographie auf gereinigt worden. Für die direkte Gewinnung der Proben aus dem Chromatogramm ist ein ChromeXtract (ChromAn, Leipzig, Deutschland) verwendet worden. Die Strukturen der Probesubstanzen sind mittels Elektronenspray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) in einem Kationen-Modus auf einem QUATTRO LCZ (Waters-Micromass, Manchester, UK) mit Nanosprayeinlass oder mittels gekoppelter Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) bestimmt worden.
GC/MS Analysen isolierter Lipide oder von Gesamtlipidextrakten ganzer Zellen, die in Chloroform gelöst worden sind, sind auf einem Serie 6890 GC-System, dass mit einem Serie 5973 EI MSD (Hewlett Packard, Waldbronn, Deutschland) ausgerüstet ist, durchgeführt worden. Eine 3 μl Probe der organischen Phase ist nach der splitlosen Injektion unter Verwendung einer BP21 Kapillarsäule (50 m × 0,22 mm, Filmdicke 250 nm, SGE, Darmstadt, Deutschland) analysiert worden. Helium ist als Trägergas verwendet worden (konstanter Fluss, 0,6 ml/min). Die Temperatur des Injektors und des Detektors lagen bei 250°C bzw. 240°C. Das folgende Temperaturprogramm ist gefahren worden: 120°C für 5 min, Erhöhung der Temperatur um 3°C/min bis auf 180°C, anschließende Erhöhung der Temperatur um 10°C/min bis auf 220°C und dann Halten der Temperatur von 220°C für 31 min. Die Substanzen wurden anhand ihres Massenspektrums identifiziert. Die Daten wurden mittels des NIST-Mass Spectral Search Program (Stein, S., et al., 1998, The NIST Mass Spectral Search Program, Windows-Software Version 1.6d) analysiert.
Ausführungsbeispiel 3
Als Wirtszelle wurde in diesem Beispiel für die heterologe Expression von WS/DGAT aus A. calcoaceticus ADP1 (SEQ ID Nr. 4) ein rekombinanter Stamm von E. coli ausgewählt. Das fakultativ anaerobe, gram(–) Enterobakterium E. coli bildet unter anaeroben Bedingungen über gemischte Säuregärung nur geringe Mengen an Ethanol. Rekombinante Stämme von E. coli, welche die Gene für die Pyruvatdecarboxylase (pdc) und Alkoholdehydrogenase II (adhB) aus Zymomonas mobilis heterolog exprimieren, können jedoch sehr große Mengen an Ethanol unter aeroben und anaeroben Bedingungen produzieren (Alterthum, F., Ingram, L. O., 1989, siehe oben).
Für die Biosynthese von FAEEs in E. coli wurden die Gene pdc und adhB aus Z. mobilis (SEQ ID Nr. 7 und 5), lokalisiert auf dem Plasmid pLOI297 (Alterthum, F., Ingram, L. O., 1989, siehe oben) sowie das für die WS/DGAT aus A. calcoaceticus ADP1 kodierenden Gen wax/dgat (SEQ ID Nr. 3), lokalisiert auf dem Plasmid pBBR1MCS-2::wax/dgat (Kalscheuer, R., Steinbüchel, A., 2003, siehe oben), eingesetzt. Für die Experimente wurde der E. coli Stamm TOP10 zunächst mit dem Plasmid pBBR1MCS-2::wax/dgat, dem Plasmid pLOI297 oder mit beiden Plasmiden transformiert. Die rekombinanten E. coli TOP10 Stämme wurden anschließend in LB-Medium, welches 2% (wt/vol) Glukose und 0,1% (wt/vol) Ölsäure enthielt, in Schikanekolben für 24 h bei 37 °C auf einem Orbitalschüttler bei 180 rpm unter aeroben Bedingungen kultiviert. Das Medium enthielt außerdem den Induktor 1 mM Isopropyl-β-Thiogalactopyranosid (IPTG) sowie geeignete Antibiotika (75 μg/ml Ampicillin und/oder 50 μg/ml Kanamycin). Nach Zellernte wurden die Zellen lyophilisiert und anschließend auf die gebildeten Fette hin analysiert.
Wie durch dünnschichtchromatographische und GC/MS Analyse festgestellt werden konnte, waren die rekombinanten Stämme, die nur eines der Plasmide pBBR1MCS-2::wax/dgat und pLOI297 enthielten, nicht in der Lage, unter diesen Kultivierungsbedingungen signifikante Mengen an FAEEs zu synthetisieren. Nur der rekombinante Stamm, der sowohl das Plasmid pLOI297 als auch das Plasmid pBBR1MCS-2::wax/dgat beinhaltete und somit die drei relevanten Gene pdc, adhB und wax/dgat gleichzeitig exprimierte, akkumulierte signifikante Mengen an FAEEs während der Kultivierung auf LB-Medium, welches 2% (wt/vol) Glukose und 0,1% (wt/vol) Ölsäure enthielt (4 und 5). Auf LB-Medium ohne Zugabe von Glukose oder Ölsäure oder auf LB-Medium, welches nur 2% (wt/vol) Glukose enthielt, konnten keine signifikanten Mengen an FAEEs nachgewiesen werden, während auf LB-Medium, welches nur 0,1% (wt/vol) Ölsäure enthielt, sehr geringe Mengen an FAEEs detektierbar waren. Damit ist erstmals demonstriert worden, dass unter Ausnutzung der geringen Substratspezifität von WS/DGAT aus A. calcoaceticus ADP1 eine Biosynthese von FAEEs auch in Ethanol-produzierenden prokaryotischen Mikroorganismen möglich ist. Die Vorstufensubstrate für die FAEE-Produktion (Coenzym-A-aktivierte Fettsäuren und Ethanol) wurden dabei durch den Metabolismus des gentechnisch veränderten Stammes beim Wachstum auf einfachen, nachwachsenden Substraten (Glukose und Fettsäuren) bereitgestellt.
Die Analyse der Fette mittels Dünnschichtchromatographie wurde wie von Kalscheuer, R. und Steinbüchel, A. (2003, siehe oben) beschrieben, durchgeführt. Als Lösungsmittelsystem wurde Hexan:Diethyleter:Essigsäure im Verhältnis 90:7,5:1 vol/vol/vol für die Fettsäureethylesteranalyse verwendet. Ölsäure, Ethyloleat und Oleyloleat wurden bei der Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Deutschland) bezogen und als Referenzsubstanzen für die Fettanalyse verwendet.
Die vermeintlichen Fettsäureethylester sind mittels einer präparativen Dünnschichtchromatographie aufgereinigt worden. Die Strukturen der Probesubstanzen sind mittels gekoppelter Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) bestimmt worden.
Die GC/MS Analyse der isolierten Lipide wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.
Sequenzliste

Claims

Ein Mikroorganismus, der umfasst: – ein Nukleinsäuremolekül, das für eine prokaryotische Acyltransferase kodiert, – ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Pyruvatdecarboxylase kodiert, und – ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Alkoholdehydrogenase kodiert.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül für eine prokaryotische Acyltransferase aus einem Mikroorganismen der Gattung Acinetobacter kodiert.
Mikroorganismus nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Nukleinsäuremolekül, das für die Acyltransferase kodiert, wax/dgat aus Acinetobacter calcoaceticus ist.
Mikroorganismus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nukleinsäuremolekül für eine Pyruvatdecarboxylase aus einem Mikroorganismen der Gattung Zymomonas kodiert.
Mikroorganismus nach Anspruch 4, wobei das Nukleinsäuremolekül, das für die Pyruvatdecarboxylase kodiert, pdc aus Zymomonas mobilis ist.
Mikroorganismus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nukleinsäuremolekül für eine Alkoholdehydrogenase aus einem Mikroorganismen der Gattung Zymomonas kodiert.
Mikroorganismus nach Anspruch 6, wobei das Nukleinsäuremolekül, das für die Alkoholdehydrogenase kodiert, adhB aus Zymomonas mobilis ist.
Mikroorganismus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Mikroorganismus ein prokaryotischer oder eukaryotischer Mikroorganismus ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus den Gattungen Escherichia, Acinetobacter, Zymomonas, Klebsiella, Erwinia, Xanthomonas, Clostridium, Shewanella, Colwellia, Paramecium und der Gruppe der Cyanobakterien, Enterobacteriacea, Actinomycetes, Ascomycetes, Deuteromycetes und der oleogenen Pilze oder Mutanten davon besteht.
Mikroorganismus nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli oder eine Mutante davon ist.
Ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung langkettiger Fettsäuren, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, wobei das Verfahren – das Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das für eine prokaryotische Acyltransferase, bevorzugt aus Acinetobacter, kodiert, in einen Mikroorganismus, – das Kultivieren der Mikroorganismen unter dafür geeigneten Bedingungen in einem Kulturmedium, und – das Isolieren der mit kurzkettigen Alkoholen veresterten Fettsäuren aus den kultivierten Mikroorganismen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei man das Nukleinsäuremolekül wax/dgat aus Acinetobacter calcoaceticus einbringt.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei neben dem Nukleinsäuremolekül, das für eine prokaryotische Acyltransferase kodiert, zusätzlich ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Pyruvatdecarboxylase kodiert, und ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Alkoholdehydrogenase kodiert, in die Zelle eingebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei man das für die Pyruvatdecarboxylase kodierende Nukleinsäuremolekül von einem prokaryotischen Mikroorganismus der Gattung Zymomonas einbringt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei man das Nukleinsäuremolekül pdc aus Zymomonas mobilis einbringt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei man das für die Alkoholdehydrogenase kodierende Nukleinsäuremolekül aus einem prokaryotischen Mikroorganismus der Gattung Zymomonas einbringt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei man das Nukleinsäuremolekül adhB aus Zymomonas mobilis einbringt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei man die Nukleinsäuremoleküle mittels eines oder mehrerer Vektoren in die Zelle einbringt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 18, wobei man den Mikroorganismus aus der Gruppe auswählt, die aus prokaryotischen und eukaryotischen Mikroorganismen besteht.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei man den Mikroorganismus aus der Gruppe auswählt, die aus Mikroorganismen der Gattung Escherichia, Acinetobacter, Zymomonas, Klebsiella, Erwinia, Clostridium, Shewanella, Colwellia, Paramecium und der Gruppe der Cyanobakterien, Enterobacteriaceae, Actinomycetes, Ascomycetes, Deuteromycetes und der oleogenen Pilze oder Mutanten davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei man als Mikroorganismus Escherichia coli oder eine Mutante davon verwendet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 21, wobei man dem Kulturmedium zusätzlich langkettige Fettsäuren zusetzt, wobei die langkettigen Fettsäuren gesättigte oder einfach oder mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit Kettenlängen von C₁₀ bis C₂₂ sind.
Verwendung der nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 22 erhaltenen Fettsäureester, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, als Brennstoff für Verbrennungsmotoren.
Verwendung der nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 22 erhaltenen Fettsäureester, die mit kurzkettigen Alkoholen verestert sind, als Emollientien in Kosmetika oder pharmazeutischen Produkten.
Ein Vektor, der trägt: – ein Nukleinsäuremolekül, das für eine prokaryotische Acyltransferase kodiert; – ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Pyruvatdecarboxylase kodiert; und – ein Nukleinsäuremolekül, das für eine Alkoholdehydrogenase kodiert.
Ein Vektorgemisch aus mindestens zwei oder drei Vektoren, die drei Nukleinsäuren, die jeweils für eine prokaryotische Acyltransferase, eine Pyruvatdecarboxylase oder eine Alkoholdehydrogenase kodieren, tragen, wobei jeder der Vektoren zumindest eine dieser Nukleinsäuren trägt.